CN101475974B - 一种培养基及用该培养基发酵生产腺苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种培养基及用该培养基发酵生产腺苷的方法。其特征是每升该培养基中含有葡萄糖110～160g，腐植酸钾0.2～0.4g，麸皮水解液5～10mL，玉米浆干粉3～5g，硫酸铵6～10g，CaCO3 2～6g，KH2PO4 2～4g，MgSO4 0.5～1.5g，MnCl2 0.005～0.015g，硫酸铁0.005～0.015g，腺嘌呤0.2～0.6g和尿素3～6g，其余为水。将枯草芽孢杆菌ATCC 21616菌株用固体斜面培养基培养得到斜面菌种，然后将斜面菌种接种到液体种子培养基上培养，得到的液体种子接种到上述本发明培养基上，摇床振荡摇瓶发酵或通气搅拌发酵罐发酵培养得到腺苷。本发明操作简单，原材料成本低廉，得到的腺苷含量至少在7g/L，最高达14g/L以上，为腺苷大规模生产开辟了一条新途径。

Description

一种培养基及用该培养基发酵生产腺苷的方法
技术领域
本发明涉及一种生物培养基，具体来说涉及一种新的发酵生产腺苷的培养基，以及用这种培养基发酵生产腺苷的方法。
背景技术
腺苷(Adenosine)学名为腺嘌呤核苷(9-β-D-Ribofuranosyl adenine)，是一种遍布人体细胞的内源性嘌呤核苷，也是三磷酸腺苷(ATP)的降解产物。腺苷具有扩血管，扩张冠脉，触发或介导心脏缺血预适应，减轻心脏再灌注损伤等作用，是用于心脏保护的重要的药物。另外腺苷还是合成其它抗病毒和抗癌的核苷类药物如嘌呤霉素、高瓜氨基腺苷、赖氨酰氨基腺苷、琥珀酰-5′-腺苷酸、s-腺苷蛋氨酸、腺苷乙硫氨酸和抗病毒腺苷如阿糖腺苷、单磷酸阿糖腺苷(Ara-Amp)、ATP、环腺苷酸等的中间体。另外随着腺苷下游研发工作的深入，一些新的用途还在不断地被开发出来，例如治疗恶性肿瘤药物8-氯腺苷等，因此腺苷的产业具有广阔的市场和发展前景。
目前腺苷的合成主要采用生物合成法和化学合成法，其中生物合成法又包括发酵法和RNA降解法。化学合成法主要采用2，8-二氯嘌呤、2-甲基硫代腺苷、5-胺-4-氰基-1-咪唑-D-核糖呋喃或其衍生物、2’，3’，5’-三乙酰基次黄苷、肌苷、次黄嘌呤为起始原料，由于起始原料价格太高，使化学合成法难以用在大规模生产上。RNA降解法主要是在生产ATP的过程中降解RNA获得腺苷原料，而ATP本身就得依赖进口，加上得到的RNA产量非常有限，因此使腺苷的生产成本过于昂贵，同样不适于大规模生产。发酵法主要是采用含有酵母粉，表面活性剂吐温80的发酵培养基对芽孢杆菌进行发酵，最终积累腺苷10.37g/L(高淑红，毛利斯，陈长华，等.表面活性剂对Bacillus sp.ATCC 21616合成腺苷的影响[J].工业微生物，2008，38(2)：42.46.)，或采用含有酵母粉，酵母粉的发酵培养基对自行选育的腺苷发生菌进行发酵，最终积累腺苷10g/L(柏建新，张一平，朱晓宏，等.微生物发酵生产腺苷的研究[J].食品与发酵工业，2001，27(3)：16-20.)，或采用含有酵母粉，十六烷基三甲基溴化铵的发酵培养基对腺苷产生菌ATCC 21616进行发酵，最终积累腺苷3.6g/L(汪泽，乔宾福，袁勤生.十六烷基三甲基溴化铵对枯草杆菌(B.subtilis)黄嘌呤缺陷型菌株产生腺苷的影响[J].工业微生物，2001，31(1)：34-36.)。按照目前国内腺苷原料的市场价格为60～70万元/吨计，采用发酵法生产腺苷的成本最低，如果最终积累腺苷能达到10g/L以上，提取总收率80％以上，则生产成本便可控制在20万元/吨以下。但是由于目前的发酵培养基无一例外都添加了价格昂贵的酵母粉，并且腺苷产量都很难达到10g/L以上，再加上操作繁琐，增加了发酵过程中产生污染杂菌的几率。因而目前的发酵法也都未能用于大规模工业生产。因此如何高效率低成本地获得腺苷成为我国目前一个比较重要的研究课题。
发明内容
本发明的目的在于开发出一种新的发酵生产腺苷的培养基；另一目的是开发出一种用这种培养基发酵生产腺苷的方法。
我们通过将葡萄糖，腐植酸钾，麸皮水解液，玉米浆干粉，硫酸铵，CaCO3，KH2PO4，MgSO4，MnCl2，硫酸铁，腺嘌呤和尿素混合，得到发酵生产腺苷的培养基，然后将腺苷产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21616菌株接种于上述发酵培养基，发酵得到的腺苷含量在7g/L以上，且生产成本低廉，从而实现了本发明的目的。
本发明发酵生产腺苷的培养基，其特征是每升培养基中含有葡萄糖110～160g，腐植酸钾0.2～0.4g，麸皮水解液5～10mL，玉米浆干粉3～5g，硫酸铵6～10g，CaCO32～6g，KH2PO42～4g，MgSO40.5～1.5g，MnCl20.005～0.015g，硫酸铁0.005～0.015g，腺嘌呤0.2～0.6g和尿素3～6g，其余为水，pH为6.8～7.2。
所述的麸皮水解液是将麸皮与水按质量比1∶20混合，调节pH至1.0，并在0.25MPa压力下加热水解，过滤取滤液得到，所述的麸皮可以从市场上买到，每100g麸皮一般含有蛋白质14～16g，碳水化合物28～32g，脂肪3.5～4.5g，水分15～15g，膳食纤维30～35g，灰份4～5g，胡萝卜素115～125μg，视黄醇当量18～22μg，维生素B1 0.26～0.34mg，维生素B2 0.26～0.34mg，烟酸12～13mg，维生素E 4.3～4.7mg，钾860～865mg，钠11.5～12.8mg，钙200～210mg，镁378～390mg，铁9.4～10.5mg，锰10.4～11.4mg，锌5.5～6.5mg，铜0.48～0.58μg，磷677～687mg，硒7.05～7.15μg，所述的玉米浆干粉可以从市场上购得，每100g玉米浆干粉一般含有蛋白质41～45g，氨基酸3.8～4.2g，还原糖1.8～2.4g，总磷3.5～3.8g，溶磷1.1～1.6g，酸度9～12g，乳酸12～13g，总灰份18～22g，铁0.045～0.07g，重金属0.0080～0.0086g。
本发明发酵生产腺苷的培养基用通常的方法制备，是将各组分用水溶解后混合，并用水定容至规定体积(比如制备1L培养基，则各组分按以上比例用水溶解后混合，用水定容至1L)，并用质量分数5％NaOH调节pH至6.8～7.2而得到。
用本发明所述培养基发酵生产腺苷的方法，其特征包括以下的步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21616菌株在固体斜面培养基上培养，30～34℃培养18～36小时，再于4℃冷藏1～5天，得到斜面菌种；
(2)将斜面菌种接种到液体种子培养基，于30～34℃的温度下摇床培养，得到液体种子；
(3)将液体种子接种到上述本发明发酵生产腺苷的培养基中，于32～37℃的温度下摇床振荡摇瓶发酵培养72～96小时得到腺苷，或者于32～38℃通气搅拌发酵罐发酵培养60～84h，其中在发酵10～18小时后调节培养基的pH值在5.9～6.6，控制排气中的二氧化碳浓度在体积分数1％～5％，当排出中二氧化碳的浓度突然下降到体积分数0.2％时停止发酵，得到腺苷。
步骤(1)所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21616菌株保藏于美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection)，简称ATCC(地址：Manassas，VA 20108，P.O.Box 1549，USA)，编号为：ATCC 21616，该菌株可以从市场上购得；所述的固体斜面培养基pH值6.7～7.2，每升培养基中含有蛋白胨3～5g，牛肉膏12～16g，酵母膏5～9g，鸟苷0.03～0.07g，琼脂15～22g，其余为水。
步骤(2)所述的液体种子培养基pH值6.8～7.2，每升培养基中含有葡萄糖18～22g，酵母膏8～12g，蛋白胨8～12g，尿素3～5g，玉米浆4～8g，其余为水；所述的摇床培养是采用摇床振幅65～75cm，转速80～110r/min，培养时间可以是18～24小时。
步骤(3)所述的液体种子在发酵生产腺苷的培养基中的接种量最好是质量分数5％～10％，所述的摇床振荡可以是冲程65～80mm，转速90～140r/min的往复式摇床振荡，所述的通气搅拌发酵罐发酵培养中每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比可以是1∶0.1～1.0，在发酵10～18小时后用10％～16％氨水调节培养基的pH在5.9～6.6。
本发明操作简单，原材料成本低廉，得到的腺苷含量至少在7g/L，最高可达14g/L以上，因此本发明为腺苷的大规模生产开辟了一条新的途径。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
将购得的麸皮100g与2000g水混合，调节pH至1.0，并在0.25MPa压力下加热水解，过滤取滤液得到麸皮水解液。
将葡萄糖110g，腐植酸钾0.2g，麸皮水解液5mL，玉米浆干粉3g，硫酸铵6g，CaCO32g，KH2PO42g，MgSO40.5g，MnCl20.005g，硫酸铁0.005g，腺嘌呤0.2g和尿素3g，加自来水溶解混合至1L，用5％NaOH调节上述溶液的pH为6.8，得到腺苷发酵培养基。
实施例2：
将购得的麸皮100g与2000g水混合，调节pH至1.0，并在0.25MPa压力下加热水解，过滤取滤液得到麸皮水解液。
将葡萄糖140g，腐植酸钾0.3g，麸皮水解液8mL，玉米浆干粉4g，硫酸铵8g，CaCO34g，KH2PO43g，MgSO41.0g，MnCl20.01g，硫酸铁0.01g，腺嘌呤0.4g和尿素4.5g，加自来水溶解混合至1L，用5％NaOH调节上述溶液的pH为7.0，得到腺苷发酵培养基。
实施例3：
将购得的麸皮100g与2000g水混合，调节pH至1.0，并在0.25MPa压力下加热水解，过滤取滤液得到麸皮水解液。
将葡萄糖160g，腐植酸钾0.4g，麸皮水解液10mL，玉米浆干粉5g，硫酸铵10g，CaCO36g，KH2PO44g，MgSO41.5g，MnCl20.015g，硫酸铁0.015g，腺嘌呤0.6g和尿素6g，加自来水溶解混合至1L，用5％NaOH调节上述溶液的pH为7.2，得到腺苷发酵培养基。
实施例4：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21616菌株在固体斜面培养基(pH值6.7，蛋白胨3g，牛肉膏12g，酵母膏5g，鸟苷0.03g，琼脂15g，加自来水溶解混合至1L)上培养，30℃培养36小时，再冷藏于4℃3天，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2面积的菌种刮下，转接到装有20mL液体种子培养基(pH值6.8，葡萄糖18g，酵母膏8g，蛋白胨8g，尿素3g，玉米浆4g，加自来水溶解混合至1L)的500mL三角瓶(0.07MPa灭菌10min.)中，于30℃往复式摇床(振幅65cm、摇床转速80r/min)振动培养18小时，得到液体种子。
将1mL液体种子接种入装有20mL实施例1的本发明培养基的500mL摇瓶中，于32℃，冲程65mm，转速90r/min的往复式摇床振荡培养72小时，停止发酵。
采用纸层析法测定发酵液中腺苷含量：发酵液4000r/min离心10min后，用微量进样器取20μL离心上清液轻轻点在新华3号滤纸(长30cm×宽2cm)底部(离底边约1.5cm)，用电吹干，悬挂浸入展层液中约0.5cm，展层液为正丁醇，乙酸和水按体积比4∶1∶1混合的溶剂，展层析7～8小时后，取出，烘干，用短波紫外分析仪观察紫外吸收斑点，剪下斑点，用pH为1的盐酸溶液10mL浸泡2小时，于波长260nm处用紫外分光光度计测定光密度(OD260nm)。以点样体积20μL为例，腺苷含量＝(OD260nm×浸泡体积×分子量)÷(摩尔消光系数×点样体积)＝(OD260nm×10×267.24)÷(14.3×103×20×10-3)＝OD260nm×9.344g/L。测出本实施例得到的发酵液中腺苷含量为8.34g/L。
实施例5：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21616菌株在固体斜面培养基(pH值7.2，蛋白胨5g，牛肉膏16g，酵母膏9g，鸟苷0.07g，琼脂22g，加自来水溶解混合至1L)上培养，34℃培养18小时，再冷藏于4℃1天，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2面积的菌种刮下，转接到装有20mL液体种子培养基(pH值7.0，葡萄糖20g，酵母膏10g，蛋白胨10g，尿素4g，玉米浆6g，加自来水溶解混合至1L)的500mL三角瓶(0.07MPa灭菌10min)中，于32℃往复式摇床(振幅75cm、摇床转速100r/min)振动培养24小时，得到液体种子。
将2mL液体种子接种入装有20mL实施例2的本发明培养基的500mL摇瓶中，于32℃，冲程75mm，转速120r/min的往复式摇床振荡培养84小时，停止发酵。
根据实施例4的方法，算出本实施例得到的发酵液中腺苷含量为14.60g/L。
实施例6：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21616菌株在固体斜面培养基(pH值7.0，蛋白胨4g，牛肉膏14g，酵母膏7g，鸟苷0.05g，琼脂20g，加自来水溶解混合至1L)上培养，32℃培养30小时，再冷藏于4℃5天，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2面积的菌种刮下，转接到装有20mL液体种子培养基(pH值7.2，葡萄糖22g，酵母膏12g，蛋白胨12g，尿素5g，玉米浆8g，加自来水溶解混合至1L)的500mL三角瓶(0.07MPa灭菌10min)中，于34℃往复式摇床(振幅70cm、摇床转速110r/min)振动培养22小时，得到液体种子。
将1.5mL液体种子接种入装有20mL实施例3的本发明发酵培养基的500mL摇瓶中，于37℃，冲程80mm，转速140r/min的往复式摇床振荡培养96小时，停止发酵。
根据实施例4的方法，算出本实施例得到的发酵液中腺苷含量为12.11g/L。
实施例7：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21616菌株在固体斜面培养基(pH值7.0，蛋白胨4g，牛肉膏14g，酵母膏7g，鸟苷0.05g，琼脂20g，加自来水溶解混合至1L)上培养，32℃培养30小时，再冷藏于4℃3天，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2面积的菌种刮下，转接到装有20mL液体种子培养基(pH值7.2，葡萄糖18g，酵母膏8g，蛋白胨8g，尿素3g，玉米浆4g，加自来水溶解混合至1L)的500mL三角瓶(0.07MPa灭菌10min)中，于30℃往复式摇床(振幅65cm、摇床转速80r/min)振动培养18小时，得到液体种子。
将1.25L液体种子接种到装有25L实施例1的本发明培养基的40L发酵罐中(接种前120℃灭菌8分钟，)，通风量(即每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比)为1∶0.1，32℃发酵培养，当发酵进行至18小时，用10％氨水控制发酵过程中培养基的pH在6.6，发酵排气中二氧化碳的浓度控制在体积分数1％，发酵84h后排出中二氧化碳的浓度突然下降到体积分数0.2％，停止发酵，得到腺苷。按实施例4的方法测得发酵液中腺苷含量为7.26g/L。
实施例8：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21616菌株在固体斜面培养基(pH值7.2，蛋白胨5g，牛肉膏16g，酵母膏9g，鸟苷0.07g，琼脂22g，加自来水溶解混合至1L)上培养，34℃培养18小时，再冷藏于4℃1天，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2面积的菌种刮下，转接到装有20mL液体种子培养基(pH值7.0，葡萄糖20g，酵母膏10g，蛋白胨10g，尿素4g，玉米浆6g，加自来水溶解混合至1L)的500mL三角瓶(0.07MPa灭菌10min)中，于32℃往复式摇床(振幅75cm、摇床转速100r/min)振动培养24小时，得到液体种子。
将2.5L液体种子接种到装有25L实施例2的本发酵培养基的40L发酵罐中(接种前120℃灭菌12分钟，)，通风量(即每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比)为1∶0.6，36℃发酵培养，当发酵进行至12小时，用16％氨水控制发酵过程中培养基的pH在6.0，发酵排气中二氧化碳的浓度控制在体积分数4％，发酵72h后排出中二氧化碳的浓度突然下降到体积分数0.2％，停止发酵，得到腺苷。按实施例4的方法测得发酵液中腺苷含量为13.44g/L。
实施例9：
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21616菌株在固体斜面培养基(pH值6.7，蛋白胨3g，牛肉膏12g，酵母膏5g，鸟苷0.03g，琼脂15g，加自来水溶解混合至1L)上培养，30℃培养36小时，再冷藏于4℃2天，得到斜面菌种。
用接种针将斜面上约1cm2面积的菌种刮下，转接到装有20mL液体种子培养基(pH值6.8，葡萄糖22g，酵母膏12g，蛋白胨12g，尿素6g，玉米浆8g，加自来水溶解混合至1L)的500mL三角瓶(0.07MPa灭菌10min)中，于32℃往复式摇床(振幅70cm、摇床转速110r/min)振动培养22小时，得到液体种子。
将1.875L液体种子接种到装有25L实施例3的本发明培养基的40L发酵罐中(接种前120℃灭菌12分钟，)，通风量(即每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比)为1∶1.0，38℃发酵培养，当发酵进行至10小时，用13％氨水控制发酵过程中培养基的pH在5.9，发酵排气中二氧化碳的浓度控制在体积分数5％，发酵60h后排出中二氧化碳的浓度突然下降到体积分数0.2％，停止发酵，得到腺苷。按实施例4的方法测得发酵液中腺苷含量为11.21g/L。

Claims (2)

1.一种发酵生产腺苷的培养基，其特征是每升培养基中含有葡萄糖110～160g，腐植酸钾0.2～0.4g，麸皮水解液5～10mL，玉米浆干粉3～5g，硫酸铵6～10g，CaCO32～6g，KH2PO42～4g，MgSO40.5～1.5g，MnCl20.005～0.015g，硫酸铁0.005～0.015g，腺嘌呤0.2～0.6g和尿素3～6g，其余为水，pH为6.8～7.2，所述的麸皮水解液是将麸皮与水按质量比1∶20混合，调节pH至1.0，并在0.25MPa压力下加热水解，过滤取滤液得到。
2.一种用权利要求1所述的培养基发酵生产腺苷的方法，其特征包括以下的步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21616菌株在固体斜面培养基上培养，30～34℃培养18～36小时，再于4℃冷藏1～5天，得到斜面菌种，所述的固体斜面培养基pH值6.7～7.2，每升培养基中含有蛋白胨3～5g，牛肉膏12～16g，酵母膏5～9g，鸟苷0.03～0.07g，琼脂15～22g，其余为水；
(2)将斜面菌种接种到液体种子培养基，于30～34℃的温度下摇床培养，得到液体种子，所述的液体种子培养基pH值6.8～7.2，每升培养基中含有葡萄糖18～22g，酵母膏8～12g，蛋白胨8～12g，尿素3～5g，玉米浆4～8g，其余为水，所述的摇床培养是采用摇床振幅65～75cm，转速80～110r/min，培养时间是18～24小时；
(3)将液体种子接种到权利要求1所述的培养基中，于32～37℃的温度下摇床振荡摇瓶发酵培养72～96小时得到腺苷，或者于32～38℃通气搅拌发酵罐发酵培养60～84h，其中在发酵10～18小时后调节培养基的pH值在5.9～6.6，控制排气中的二氧化碳浓度在体积分数1％～5％，当排出中二氧化碳的浓度突然下降到体积分数0.2％时停止发酵，得到腺苷，所述的液体种子在发酵生产腺苷的培养基中的接种量是质量分数5％～10％，所述的摇床振荡是冲程65～80mm，转速90～140r/min的往复式摇床振，所述的通气搅拌发酵罐发酵培养中每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积比是1∶0.1～1.0，在发酵10～18小时后用10％～16％氨水调节培养基的pH在5.9～6.6。
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