CN1082094A - 有机硫分子的生物催化脱硫 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有机硫分子的液体石油脱 硫方法。本方法取决于使用的含水生物催化剂，在优 选的实施方案中，该含水生物催化剂含有微生物的基 本无细胞提取物，该微生物在功能上表达能选择性裂 解甚至含硫杂环中的有机碳-硫键的酶，其中提取物 有由微生物表达的大比例所述酶的总活性。在该生 物催化剂和液体石油之间形成乳液，优选微乳液。特 别优选的是可逆的微乳液，原因是在处理结束后，容 易回收脱硫的液体石油。本发明特别适于含有相对 大量的不易处理的有机硫分子如二苯并噻吩的液体 石油的脱硫。

Description

硫是几乎普遍存在于矿物燃料中的有害元素，其以无机硫（例如黄铁矿）和有机硫（例如，存在于各种烃分子包括如硫醇、二硫化物、砜、硫醇类、硫醚、噻吩和其他更复杂形式中的硫原子或硫部分）两种形式出现。有机硫量可占液体石油如原油和许多石油馏分总硫量的近似于100%。原油一般可含有接近约5wt%至约0.1wt%有机硫。从波斯湾地区和委内瑞拉（Cerro  Negro）得到的那些原油尤其具有高含量有机硫。Monticello，D.J.和J.J.Kilbane的“Practical  Considerations，in  Biodesulfurization  of  Petroleum”，IGT′S  3rd  Intl.Symp.on  Gas，oil，Coal，and  Env.Biotech.，（1990，12月3-5日）New  Orleans，LA，和Monticello，D.J.和W.R.Finnerty，（1985）Ann.Rev.Microbiol.39：371-389。
矿物燃料中存在的硫与管路、泵送和炼油设备的腐蚀有关，并与过早毁坏燃机有关。硫还使在精制和燃烧矿物燃料中使用的催化剂污染或中毒。另外，大气中排放的硫燃烧产物如二氧化硫会形成已知为酸雨的酸沉积物。酸雨对水生动物和森林生态系及对于位于燃烧设施的下风的农业地区都具有持续的有害影响。Monticello，D.J.和W.R.Finnerty，（1985）Ann.Rev.Microbiol.39：371-389。为了解决这些问题，已提出了在燃烧之前或在燃烧之后立即对矿物燃料脱硫的几种方法。
用于预燃烧去硫的一种技术是加氢脱硫法（HDS）。这种技术适用于其中硫主要以有机硫而非黄铁矿形式存在的流体矿物燃料的脱硫。因此，HDS对处理石油馏分或精制中间产品、液态发动机燃料等是有用的。HDS方法包括将含硫的矿物燃料与氢气在催化剂，通常是钴或钼-铝氧化物或其混合物存在下，在高温和高压下进行反应。HDS法更具体地描述在Shih，S.S.等人“Deep Desulfurization of Distillate Components”，文摘号264B AICHE Chicago Annual Meeting，1990年11月12日发表（全文可向American Institute of Chemical Engineers;Shih等人函索），Gary，J.H.和G.E.Handwerk，（1975）Petroleum Refining：Technology and Economics，Marcel Dekker，Inc.，New York，114-120页和Speight，J.G.，（1981）The Desulfurization of Heavy Oils and Residue，Marcel Dekker，Inc.，New York，119-127页。HDS是基于有机硫还原转化成硫化氢（H2S），腐蚀性的气体产物通过汽提从矿物燃料中除去。已知高含量或持续量硫化氢使化学HDS催化剂失活或中毒，使高硫含量的矿物燃料的脱硫复杂化。
也已知HDS处理特殊类型的矿物燃料和精制馏分的效力是变化的，因为可含硫原子或硫部分的烃分子具有较大的化学差异。某些类型的有机硫分子是活泼的并可易于通过HDS脱硫;其他类型的有机硫是不易处理的，并抑制通过HDS处理的脱硫作用。对于HDS处理通常是活泼的这些类型的有机硫分子包括硫醇、硫醚和二硫化物。相反，含硫的芳族杂环（即在其芳族环结构上含有一个或多个硫原子的芳族分子）是主要类型的抗HDS的有机含硫分子。一般地，使用HDS对这些不易处理的分子的间接的脱硫仅是在如此极端的温度和压力下进行，以使矿物燃料或精制馏分中的有价值烃类能开始变质。参见Shih等人的文章。
认识到HDS的这些和其他缺点，许多研究者已进行开发商业上可行的微生物脱硫技术（MDS）。MDS一般描述为利用适宜细菌的代谢过程使矿物燃料脱硫。因此，MDS一般包括温和（例如室温或生理）条件，不包括对于HDS所需要的极值温度和压力。一般也考虑到生物脱硫剂在适宜条件下可再生或自身补充的优点。
某些矿物化学营养细菌物种，尤其是氧化亚铁硫杆菌，可以由黄铁矿（无机）的硫氧化成水溶硫酸盐得到代谢过程的能量，这种发现促使努力开发适于煤、矿物燃料（其中已知黄铁矿一般是主要的）脱硫的一种MDS技术。例如Detz，C.M.和G.Barvinchak的美国专利4，206，288，（1980公开）描述了一种基于氧化亚铁硫杆菌的自动生长代谢特性的煤浆的微生物脱硫的需氧发酵方法。最近，Madgavkar，A.M.的美国专利4，861，723（1989公开）提出了一种连续的氧化亚铁硫杆菌基的MDS方法，使粒状煤脱硫并制备一种纯净燃烧脱硫的煤-水混合物。除了这种方法外，还未发现用于煤脱硫的商业可行的MDS方法，部分是由于脱硫发酵步骤所需的时间（几天至几周）的原故。
如上所述，以氧化亚铁硫杆菌为煤介的MDS技术被限制于处理其中主要是无机硫的而不是有机硫的矿物燃料。在开发适用于其中有机硫是主要的矿物燃料脱硫的MDS技术方面的进展已是有希望的。已报导了几种细菌能使含硫烃分解代谢（代谢地分解）为水可溶的硫产物。在这个领域的一个早期报导描述了一种循环分解代谢MDS过程，其使用人工培养的氧化硫杆菌，Thiophyso  volutans或排硫杆菌作为微生物试剂，kirshenbaum，T.的美国专利2，975，103（1961公开）。其后，Monticello，D.J.和W.R.Finnerty，（1985）Ann.REV.Microbiol.39：371-389和Hartdegan，F.J.等人（1984年5月）Chem.Eng.Progress  63-67，报导的这样的MDS方法是，通过微生物的作用绝大部分仅仅易发生烃基体的代谢消耗，而不是选择性硫或特殊硫现象。另外，以上描述的对于HDS活泼的这类有机硫分子最易进行分解代谢的MDS。
虽然Monticello和Finnerty报导了几种细菌，尤其是恶臭假单胞菌（Pseudomonas  Putida）和产碱假单胞菌（P.alcaligenes）），介绍其能够使不易HDS的芳族含硫杂环脱硫，但这种反应也难免发生作为碳源的这些分子的消耗。因此，在分解代谢的MDS中，有价值的可燃烧的烃损失掉。Monticello和Finnerty另外指出，从含硫杂环的分解代谢MDS得到的水可溶的硫产物是小的有机分子而不是无机硫离子。见于这些发现，作者断定MDS技术的商业可行性是受限制的。Monticello，D.J.和W.R.Finnerty，（1985）Ann.Rev.Microbiol，39：371-389。
以上描述的脱硫技术没有一种提供从不易处理的有机分子如含硫的杂环脱除硫而没有伴随不可接受的已处理的（脱硫的）产物的燃料值的降低的商业上可行的方法。因此积极从事于炼制和制造石油燃料产品的那些人的兴趣已变成集中在需要发现这样一种脱硫方法。这种需要部分是由于来源于那样的不同地区如中东（在那里，在含硫的芳族杂环中存在约40%的总有机硫量）和西部得克萨斯（其中这种分子含有多至约70%的总硫量）的原油中HDS不易处理的分子占优势，和部分是由于关于含硫矿物燃料燃烧的环境控制的严格性增加。
本发明涉及含有有机硫分子的液体石油脱硫的方法。本方法取决于所使用的含水的催化剂，该催化剂能够选择性地裂解甚至在含硫杂环中的有机碳-硫键。在本文描述的发明中，在这种催化剂和将被脱硫的液体石油之间形成一种乳液。然后，该乳液在足以引起甚至在含硫杂环中的有机碳-硫键的催化裂解的条件下培育足够的时间，以便大量的催化裂解发生，由此，液体石油的有机硫含量显著降低。因此，本发明的方法制得一种脱硫的液体石油，通过该方法就意味着液体石油显著地降低了有机硫含量，尤其是基本上没有了含硫杂环。
在优选的实施方案中，本发明取决于使用的含水的生物催化剂，在温和的温度和压力条件下该生物催化剂能进行选择性的氧化裂解碳-硫键，甚至于在含硫杂环中的碳-硫键。在本文描述的发明中，特别优选的是含水的生物催化剂包含一种实在地微生物无细胞提取物，该微生物功能上表达一种能够选择性地裂解在含硫杂环中的有机碳-硫键的酶，其中该提取物有大比例的由微生物表达的所述酶的总活性。特别适宜的这种酶源包括例如玫瑰色红球菌（Rhodococcus  rhodocrous  bacteria）的培养物，ATCC  NO.53968，或其衍生物，其中功能表达的酶是一种胞外被膜结合的酶，该酶控制选择硫、氧化裂解含硫杂环中的有机碳-硫键。含有胞外被膜和膜断片的提取物因而含有大比例的由这样的衍生物表达的总酶活性。如本文中使用的述语“胞外被膜”意思是含有细菌细胞壁和/或细胞膜。
另外，本发明优选的实施方案包括形成微乳状液，其意思是形成的乳液其中分散的或不连续相的液滴的平均直径低于约1μm。优选使用最小体积的含水生物催化剂，这样就形成其中有机相（液体石油）是连续相，含水生物催化剂是分散的或不连续相的微乳液。特别优选的是微乳液是可逆的，在培育期后，因此便于分离水相和有机相。在另一个实施方案中，水相（生物催化剂）和有机相是在足以在其间形成可逆胶团的条件下混合。在培育期后，将可逆胶团暴露在足以破坏他们的条件下，因而得到容易分离的水相和有机相。因此，本文描述的发明预计快速回收脱硫的液体石油。
本发明的特殊优点是对液体石油提供生物催化脱硫，而不是简单的微生物分解代谢。结果，本发明能显著地使更多的液体石油转化成燃烧干净的燃料产物。第一方面这是由于本发明的脱硫方法不需要使得含有相对高含量的含硫有机分子的原油或石油馏分暴露在足以降解有价值的可燃烧的烃的苛刻HDS条件下。第二方面，该优点也归于本发明的脱硫作用的进行是不需要将被处理的液体石油暴露到能够破坏燃料的烃基体（常规的MDS的不合乎需要的结果）的活微生物中。
本发明的另一优点是可以在许多地方和/或位置很容易地汇集到现有的石油提取、运输、储存、炼制或加工设备中。本发明使用的制备方法的位置和地段大部分要由所考虑的对于需要BDS处理的液体石油的特殊类型和体积所确定。
图1是二苯并噻吩的结构示意图，其是典型的不易HDS的含硫杂环。
图2是二苯并噻吩通过氧化和还原途径的裂解和其最终产物的示意图。
图3是按建议的微生物代谢“4S”途径使二苯并噻吩的选择性硫氧化的分步示意图。
图4是说明本发明的生物催化脱硫方法的流程图。
本文描述的方法是一种液体石油脱硫的方法，其液体石油中硫的有机形式包括大比例总硫量的液体。因此，本发明适用于石油馏分或炼制中间产物、液体发动机燃料等等的脱硫。
本发明公开的方法有两方面独特性：首先，它提供了从液体石油中去除有机硫而不依赖苛刻的化学或物理化学条件，象按照常规的HDS处理脱硫所需的那些条件;第二点是，它提供了从液体石油中催化除去有机硫，而不需使液态基质经过漫长的和可能的有害发酵步骤，象在典型的MDS方法中所遇到的情况。因为本发明依赖于催化作用（在优选的实施方案中是依赖于生物催化作用），并不依赖普通微生物代谢活性，因此本文所指的是生物催化脱硫方法（BDS）。
不希望限制本发明的BDS过程的基础机理，认为生物催化作用是通过至少一种蛋白质催化剂（一般指作酶）进行，该催化剂具有一定程度的生物体系的选择特性，作用到含硫有机基质分子上。此处所有的述语“酶”意思是包括足以产生BDS活性的元素的生物组合物。因此“酶”包括一种或多种蛋白质催化剂与可能需要的这样的辅酶、辅助因子或辅助反应试剂，以使通过有机碳-硫键的裂解发生从有机分子中选择性释放硫。本发明的关键在于它依赖于使用的能选择性裂解甚至在芳烃分子中的碳-硫键的生物催化剂。在优选的实施方案中，生物催化裂解是通过氧化途径进行。
生物体系的本质是对某些类型的含硫有机分子表现出一定的选择性或专一性。如上所述，通常在液体石油中存在多种多样的这类分子，包括具有非芳族碳-硫（例如硫醚）键、芳族碳-硫键或其两者的普通类型的分子。目前，具有芳族碳-硫键的分子指的是“含有硫的杂环”。这些分子的特征在于在芳族环结构本身上存在一个或多个硫原子，而不是作为它的取代基。本发明的生物催化剂是特别有用的，它不同于通常的微生物脱硫试剂，它能选择性的裂解甚至芳族碳-硫键。因此，其特别适用于液体石油的脱硫，该液体石油中含硫的杂环包括大比例总有机硫含量。这种液体石油在本文中作为“基质”液体石油，并用于说明本发明的优点和应用。
含硫的杂环通常是不易HDS和MDS处理的，其以简单的单环形式（例如，噻吩，具有组成C4H4S的五元环化合物）或更复杂的多缩合环形式（例如二环化合物苯并噻吩，C8H6S）出现。用通常技术将这些分子脱硫的难度一般随着结构复杂度的增加而增加。已知如图1所示的分三部分的含硫杂环缩合环二苯并噻吩（DBT;C12H8S）特别不易常规的HDS处理，因而在燃料产物中可能存在大比例的HDS后的残留有机硫。烷基取代的DBT微生物甚至用常规脱硫方法更难处理，并且在增加苛刻度的条件下甚至通过重复HDS过程也不可能除去。参见Shih等人的文章。另外，DBT和其衍生物可计算出在某些原油（例如，科威特和西部德克萨斯的原油）中有大百分数的总有机硫。由于这些原因，DBT一般被作为开发新脱硫方法中的典型的不易处理的含硫分子。Monticello，D.J.和W.R.Finnerty，（1985）Ann.Rev.Microbiol.39：371-389。因此，DBT的脱硫尤其是本发明的主要内容;DBT在本文中作为液体基质石油的生物催化脱硫的优选例子。
曾报导过非常少的天然存在的细菌或其他微生物细菌能有效地使DBT降解或脱硫。最近，Stevens，S.E.和W.D.Burgess的美国专利4，851，350（1989颁发）报导了用酵母菌Hansenula  sydowiorum，H.Ciferrii，H.lynferdii，和真菌白色隐球菌（Cryptococcus  albidus）从富有机硫土壤中分离硫，据说在48小时内能除去多于60%的DBT中的硫。然而，Stevens和Burgess没有讨论所观察到的活性的可能的机理，也没有公开在H.sydowiorun存在下从DBT得到的含硫产物是否类似于在常规的分解代谢MDS方法中观察到的那样。应该注意到，能全部降解DBT的生物体在事实上似乎是很少的。例如，Gundlach，E.R.等人（1983）Science221：122-129中讲述了当DBT和相关的复杂杂环化合物释放到环境中时，其往往持续很长时间而没有显著的生物降解。另外，本发明者没有发现以前有关通过细菌或其他微生物有机体的基本无细胞溶胞产物或萃取物而使含硫杂环脱硫的任何报导。
一些研究者已报导了将天然存在的细菌遗传改变为具有已获得的能分解代谢DBT的变种菌株。Hartdegan，F.J.等人（1984年5月）Chem.Eng.Progress  63-67。在很大程度上，这些变种生物对DBT进行非特殊脱硫（通过裂开碳-硫键），并以小的有机断裂产物的形式释放硫。因此，DBT的部分有价值的燃料（即烃基质）通过微生物作用（这是在常规MDS技术下的代谢活性）而损失掉。Isbister和Doyle报导了好像能从DBT中选择性裂解硫的假单胞菌（Pseudomonas）的变种菌株的衍生物，美国专利4，562，156（1985颁发）。然而他们没有阐明引起这种所观察到的活性的机理。如图2所示，至少有两种可能的路线（氧化和还原），其导致通过裂开碳-硫键，从DBT中选择性释放硫。
Kilbane最近报导，混合的细菌培养物的诱变，产生一种细菌团，其好像能通过氧化途径选择性从DBT中解离出硫。Resour.Cons.Recycl.3：69-79（1990）。该培养物由从天然源如污水淤渣、石油炼厂废水、园中土壤、煤焦油污染的土壤等得到的细菌组成，并在DBT存在下，在连续脱除硫的条件下保存。然后将该培养物暴露到化学诱变剂1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍中。通过产生的微生物团DBT代谢的主要代谢产生是2-羟基联苯：无机硫被释放出，而原来分子的烃部分基本上保持不损伤。
从菌团中分离出玫瑰色红球菌（Rhodococcus  rhodocrous）菌株。ATCC  NO.53968的该菌株是用于本方法的特别优选的生物催化活性源，其作用是表示一种酶，该酶能使得选择性氧化甚至从DBT和已知存在于液体石油中的有关的含硫杂环中释放硫。Kilbane在美国专利5，104，801（1992颁发）中详细地描述了该菌株的分离和特性，其讲述的内容引为本文的参考文献。在美国专利5，002，888（1991颁发）中，Kilbane描述了另一种选择有机硫的微生物，Bacillus  sphuericus，ATcc  NO.53969，从在Resour.Cons.Recycl.3：69-79中描述的混合培养物中的分离和特征。
已建议该“4S”反应路径作为产生这些产物的机理，在图3中描述了该途径。“4S”符号指的是所建议途径中的活性硫中间体：DBT-亚砜、DBT-砜、DBT磺酸盐和释放出的水可溶产物、无机硫酸盐。因此，在该生物催化途径中，该分子的烃部分保持不受损伤，但是通过断裂两个碳-硫键，该硫杂原子留在DBT中间的五元环处。在图3中，表示出了该反应途径的理论上的烃产物：二羟基联苯。然而在实践中，使用ATCC  NO.53968培养物可观察到2-羟基联苯。参见Kilbane，J.J.（1990）Resour.Cons.Recycl.3：69-79。
一般说来，本发明所用的生物催化剂是从微生物的含水培养物中得到的，该微生物的作用表示一种酶，该酶能选择性裂开甚至在含硫杂环中的有机碳-硫键。该生物催化剂特别优选的来源包括R.rhodocrous  ATCC  NO.53968培养物，其是在足以产生或保持生物催化活性的功能表达的条件下制备的，一般的如在美国专利5，104，801中所述。取决于这种特别优选的生物催化剂的本发明的实施方案示意描绘在图4中，现在将加以介绍。然而，应该注意到在优选实施方案中，本发明的范围和精神包括使用在功能上表达本文定义的BDS活性的任意微生物。本发明不限于依赖ATCC  NO.53968生物催化剂，可以接受的是与另一种BDS活性的微生物源一起使用，全不超出常规的试验。
一开始制备生物催化剂（图4中的10），其可以包含适宜的未受损的ATCC NO.53968微生物（4）的悬浮液，其溶胞产物（6）或其真实地无细胞提取物或馏分（8），其有显著量的所述微生物表达的总BDS活性。对功能的表达BDS的ATCC NO.53968微生物的适宜的制备条件包括在室温下在无硫无机盐介质（例如4g/LK2PO4，4g/L Na2HPO4，2g/L NH4Cl，0.2g/L MgCl.6H2O，0.001g/L Ca2C1.2H2O和0.001g/L FeCl3.6H2O存在下、在含有无硫的可吸收的碳源如甘油、苯甲酸酯、乙酸酯、葡萄糖、乙醇、异丁醇或蔗糖的情况下发酵。为了产生最高的生物催化活性，重要的是提供给ATCC NO.53968细菌的唯一的硫源包括由其通过BDS活性由微生物作用可以得到可吸收硫的那种形式的有机硫化合物。因此，ATCC NO.53968培养基优选的是补充含硫杂环源如噻吩、苯并噻吩、优选的DBT型化合物或其衍生物。适宜的有机硫源包括液体石油，其含有有机硫分子，其中大量的是含硫杂环。
在ATCC  NO.53968细菌发酵之前，调节上述介质的pH从约5到约8，更优选的是在约6到约7之间，并在发酵过程中，将其保持在此pH范围内。细菌培养条件还包括通常在室温下的发酵。优选温度从约15℃至约34℃，约28℃至约32℃的温度考虑是特别优选的。培养物的生长是用常规方法监视的（例如比浊法），直到细菌达到每ml培养基所需密度。
通过常规方法（包括例如沉降或离心）可以从培养基中分离出ATCC  NO.53968细菌培养物，并再悬浮于新培养基或其他适宜的不含可吸收（即水可溶的，无机的）硫源的缓冲液中。在该阶段，培养物（4）可被稀释或浓缩至每ml细胞的预定密度。
培养物（4）可任意地直接用作生物催化剂10的一种来源。然而，反过来，本发明的乳液可由制备的活或不能生活的未受损的ATCC  NO.53968的微生物4（如实施例1和2中的）来生产（在图4的16），优选的是从其中制备基本无未触动的细胞的溶胞微生物（6）的BDS活性悬浮液。任意溶胞方法，不论是常规的技术还是根据常规技术改进的技术都可使用，只要决定着BDS活性的酶保持其功能。例如ATCC  NO.53968细菌可以经过一个或多个冷冻-解冻周期、用适宜的洗涤剂和/或离液序列高的试剂处理、使用法国吐丝器加工，或更优选的是可通过常规方法包括使用浴器或浸渍探测近距离声波定位器和在冰浴中培育进行声处理。用这种方法可制得本发明的微乳液，其中微乳化的液滴最小尺寸不受未触动的单个ATCC  NO.53968细菌的尺寸的限制。
特别优选的是制备BDS活性的微生物源的基本无细胞的含水提取物（8），其中提取物有由微生物功能表达的大比例的总BDS活性。在某些合适的微生物中，BDS活性酶可以功能表达为与胞外被膜有关的酶。关于ATCC  NO.53968微生物和其功能衍生物，以前在U.S.S.N.07/486，597中公开的是BDS活性看起来是由与未触动细菌的外部细胞膜和/或细胞壁有关的酶产生的。公开在本文实施例中的结果包括支持该假定的第一手有效证据。因此，制备包含细胞膜和细胞膜断片的ATCC  NO.53968的基本无细胞提取物，并发现其含有大比例被该微生物功能表达的总BDS活性。
在本发明的BDS方法中，适于用作生物催化剂10的无细胞提取物（8）可用标准方法制备，例如用离心分离、硫酸铵分离、过滤、生物亲和性或免疫亲和性沉淀、凝胶渗透色谱、液相色谱、高压液相色谱、反相液相色谱、制备电泳、等电点聚焦等等。例如在实施例3中描述了离心分离步骤，其中表明了大比例的ATCC  NO.53968表达的BDS活性与声振的“细胞碎片”部分、溶解的细菌细胞有关。该部分包括细胞壁断片和/或外部细胞膜，将溶解的ATCC  NO.53968细胞在6，000×g离心5分钟后得到该部分为片状物。
如图2所示，虽然，通过氧化或还原途径可以进行选择性裂解含硫杂环中的有机碳-硫键，但是已表明与由微生物如ATCC  NO.53968和其衍生物表达的BDS活性有关的膜使得DBT转化成2-羟基联苯，因此涉及消耗氧，参见美国专利5，104，801、U.S.S.N.07/486，597和图3。由此可见，本发明的BDS方法是在需氧而不是厌氧的条件下进行。
若需要，生物催化活性的含水源（图4中10）和/或基质液体石油与适宜的氧源14接触，该氧源包括例如空气、富氧空气、纯氧、或氧饱和的全氟化碳（PFCS）。含水生物催化剂或基质液体石油中溶解的氧量通过在其中搅拌、混合、鼓泡或喷入氧源14而增加，直至达到所需浓度的溶解氧。为此，考虑优选用该方法增加至少基质液体石油中溶解的氧的量，因此，利用在有机非水的液体中的氧的较大的溶解度。
BDS活性的含水源10在下文中指的是水相，（任选的加氧的）基质液体石油12指的是有机相。本发明的方法包括在水相和有机相（图4中16）之间形成乳液，优选微乳液。换句话说，制得了两相体系，其中相互不溶混的水相（10）和有机相（12）是紧密的相互分布，其是以不连续的球滴（液滴）或细分层的薄层形式分布。尤其是依据体系中存在的每相的相对体积，水相或有机相或其两者可以为乳液16的连续相。一般优选的是水相体积最小的乳液;因此，油包水的乳液是特别优选的。因此，在以下讨论中，除非另有说明外，指的是含水液滴分散在有机相中的油包水乳液，有机相是连续相。也将假设一般水相10的密度将超过有机相12的密度。
已指出，本文中描述的方法可使用未触动微生物（4）作为含水的生物催化剂源（10）来完成。事实上，在本发明的该实施方案中，在油包水乳液中的水滴的最小直径和在双连续乳液中的最小层间距离都受到微生物自身尺寸的限制。因此形成了具有液滴直径或内层间距相当于约1μm的乳液。
在优选的实施方案中，其中生物催化剂源包括基本无细胞制备的溶解微生物（6）或，在特别优选的实施例中其中含水生物催化剂是含有大比例的由衍生物源表达的总BDS活性的基本无细胞提取物（8），油或水滴的尺寸或内层间距的尺寸都受此限制。因此，优选的实施例的微乳液16可包括比未触动微生物的尺寸显著小的含水液滴。因此，具有液滴直径或内层间距小于约1μm的微乳液是本发明所需的。液滴直径或内层间距在毫微米范围是优选的，原因是在所给出的微乳液体系的表面积-体积比和其中的液滴直径之间存在相反关系。因此，在具有非常小的液滴尺寸的微乳液中，将含水的生物催化剂与有机液相石油基质进行非常紧密的接触，结果观察到脱硫率增加。对于观察到的脱硫率这一结果，被认为部分是由于降低了碰撞分配有机硫分子进入水相，或相反的生物催化剂进入有机相。对于特殊微乳液的最佳液滴直径或内层间距将依赖于几个参数，包括所使用的生物催化剂的浓度和比活性，还有存在于体系中的溶解的氧的浓度和含硫杂环的浓度。根据本发明描述的方法，对所给出的液态石油基质脱硫的最佳条件可以通过途径试验来确定。
本发明的乳液或微乳液（16）可用各种方法制备。当然在制备微乳液16的过程中，生物催化剂10的功能不能消弱或损害这是必需的。例如，适宜的微乳液的制备是通过使水相和有机相同时通过小孔或系列孔或洞（例如网状物或筛子），因此在混合相中产生细紊流，使它们紧密相互混合，因此形成微乳液16。然而，紊流不能太强。以免引起剪切或生物催化剂的变性。另外，这些相可加入容器中并混合、搅拌或振动直至形成微乳液16。可通过机械方法，流体方法、或使用通常的浴或探针近距离声波定位装置的超声方法施以足以形成微乳液的振动。
在许多实施方案中，需要通过将表面活性剂17加入混合相中而加速乳液或微乳液16的形成。表面活性剂是表面活性的物质，其改变了表面或内表面的物理化学性质，特别是通过降低表面或内表面的张力。一般，表面活性剂包括亲水和疏水两部分，因此其溶于水和有机液体两者中。本发明适宜的表面活性剂包括例如吐温80
Figure 931087376_IMG1
（Sigma Chemicals），K.-I.Lee和T.F.Yen，J.（1990）Chem.Tech.Biotechnol.48：71-79，和五乙二醇十二烷醚，K.M.Larsson等人（1990）Biotechnol.Bioeng.36：135-141。生物表面活性剂如由某些衍生物制备的那些也可用于本发明中。J.C.Bertrand（1983）biotechnol.Lett.5（8）：567-572。在某些实施方案中，含有BDS活性源的微生物也可以产生其本身的生物表面活性剂，参见例如S.E.Stevens和W.D.Burgess的美国专利4，851，350（1989颁发）。
已经指出了其中水相体积为最小的乳液是优选的，并且油包水乳液和微乳液是特别优选的。本发明的另一个特别优选的实施方案包括在16形成的可逆胶束，其类似于油包水体系但具有更多规定的薄膜表面结构。在可逆胶束体系中不希望根据该实施方案限定结构细节，细胞膜断片被认为变的与一种或多种类型的非离子表面活性剂有关，其包括可逆胶束结构的“表面”（即在水和有机相之间的内表面）。用该方法，决定着观察到的BDS活性的酶可在双相体系内通向基质分子的最佳位置处使用，另外使观察的脱硫速度中的扩散作用减少到最小。制备可逆胶束的适宜方法描述在K.-I.Lee和T.F.Yen，J.（1990）Chem.Tech.Biotechnol.48：71-79。
一旦乳液或微乳液16在含水的生物催化剂10和需要BDS处理的有机液体石油基质12之间形成，就将其在足以发生生物催化裂解甚至在含硫杂环中的有机碳-硫键的条件下培育（18）。一般，适宜的条件包括在室温和压力下培育。培育18可在大于液体石油基质的凝固点和低于生物催化剂失效的温度间的任意温度下进行。在某些实施方案中，培育温度还由微生物的热稳定性进一步规定。例如，在某些表面活性剂存在下形成的微乳液，若温度低于或高于临界值将自发地分离成不连续的水相和有机相。对温度敏感的微乳液描述在K.M.Larsson等人（1990）Biotechnol.Bioeng.36：135-141。使用ATCC  NO.53968生物催化剂的乳液和微乳液优选在约10℃至约42℃温度下培育，约28℃和32℃之间的温度考虑是特别优选的，可得到高脱硫率。
在培育18过程中，若需要，在紊流条件下可连续或断续地保持乳液或微乳液16。使用微乳液的优点是不需要混合，这将进一步增强了本文公开的方法和权利要求的方法的经济方面的可需性。例如通过机械、流体或超声方法可产生紊流，只要生物催化剂不要由此暴露于非常苛刻的条件下而引起剪切或变性。对于特殊体系，例如在流体有机基质中存在高浓度含硫杂环，这就需要连续混合或搅拌微乳液。用这种方法，人们可确信生物催化剂是保持在BDS富基质（而水是富反应产物）的局部环境中。
本发明的BDS方法的培育步骤（18）进行足够长的时间，以产生大量的生物催化裂解。培育时间将取决于几种参数，包括使用的生物催化剂的浓度和比活性、存在于体系中的溶解的氧的浓度和含硫杂环的浓度、在BDS处理过程中混合或紊流的温度和程度，和BDS进行的规模。在绝大部分情况下它也将取决于所需的液体石油脱硫的程度。优选的是，取决于ATCC  NO.53968生物催化剂的本发明的实施方案的培育时间将基本不长于约1或两天。当使用该生物催化剂时，在培育时间为约16小时（参见实施例2）后，可以观察到显著的脱硫作用。培育时间不应太长，以至发生不需要的付反应，然而培育时间持续超过BDS活性明显失效的那一点（例如，一旦含硫杂环的浓度对于脱硫反应变的太小就不能朝着释放硫的方向进行）不是优选的。仅通过途径试验就可以确定根据本发明描述的方法对所给定的液体石油基质的所需的脱硫程度的适宜培育时间。
使用本领域技术人员很容易使用的常规方法，通过检测液体石油生物催化脱硫的进程就可以确定适宜的培育条件和时间。例如，在液体有机石油基质与本发明的生物催化剂混合之前，从其中采集原始样品。然后，可以在所需的时间间隔从培育混合物（乳液或微乳液）中采集样品。对于特殊类型和体积的液体石油的BDS处理可以绘制时间曲线，并可用以计算所需的最佳培育条件和时间。一般优选的是从脱硫的液体石油中收集BDS后的样品，以确认脱硫到所需程度。
特殊的基质有机硫化合物如DBT和相关的杂环化合物中的硫的消失情况可通过以下方法检测，如使用气相色谱并配以适宜的标准X射线荧光检测器（GC/XRF）、火焰光度检测器（GC/FDP）、离子捕集检测器（GC/ITD）、质谱仪（GC/MS）、核磁共振谱仪（GC/NMR）、红外光谱仪（GC/IR）、或原子发射光谱仪（GC/AES，也叫做火焰光谱仪），连同一种或多种适宜的分子标准物。让操作者直接目测从可燃的烃中硫原子的消失的情况的方法是优选的。因此，特别优选的是X射线荧光和火焰光谱检测系统。
在没有前面的选择的有机硫化合物的气相色谱分离的情况下，也可以使用以上的检测系统来测定在矿物燃料基质中总有机硫的减少的情况。另外，对于本发明目的，检测系统如X射线荧光和火焰光谱法是优选的，因为它们使人们直接目测硫原子的消失情况。若使用该型式的快速分析方法，重要的是要确保被测的硫实际上是有机硫。因此。生物催化反应的任意累积的水可溶硫产物（如硫酸盐）必须在分析之前从样品中分离出去。
一旦达到生物催化脱硫的所需程度，一般将需要从本发明的乳液、微乳液或可逆胶束中回收脱硫的流体石油（图4中22）。因此，在优选的实施方案中，使用可逆的或不稳定的微乳液。因此，暴露于特殊条件和试剂下就分离（在20）成基本不连续的水相和有机相的微乳液被认为是合乎理想的，在现有技术中已知的那些如“mousses”的不可逆微乳液不是优选的。
足以引起相分离20的准确条件或试剂将取决于形成的特殊乳液的组分和性质。例如，一些乳液体系将自发地分离成水相和有机相，除非连续地进行搅拌或紊流。这样的乳液通过将其在固定的条件下维持发生分离的足够长时间就改变方向。其他乳液和微乳液对于存在的水相和有机相的相对体积是敏感的。这些微乳液可通过例如加入过量的含水液体就会倒转。在这些情况中，优选的是加入无水可溶硫的液体，这样在生物催化过程中产生的水可溶硫（如硫酸盐）将被萃取至水相中。
还有其他类型的微乳液通过用化学试剂处理可以倒转。例如，可使用增加水和有机相之间的界面张力的脱乳化试剂以引起单独的含水液滴或可逆胶束凝聚，导致水相液滴的沉淀和沉积。若使用表面活性剂（17）制备微乳液，脱乳化试剂可以是一种使表面活性剂丧失其性能（例如使其变得在水相或有机相中都可溶）的物质。
然而另一类的乳液或微乳液当暴露于特殊的物理条件下可引起倒转。例如，K.M.Larsson等人（1990）Biotechnol.Bioeng.36：135-141描述了温度敏感的微乳液体系，其中相分离在加热或冷却至特定温度下发生。在非离子表面活性剂五乙二醇十二烷醚存在下形成的微乳液情况中，已报导从27.5℃冷却至18℃含有多于水相4倍量体积的有机相的油包水微乳液发生相分离（Larsson等人，139页）。
在某些实施方案中，不稳定的或可逆的微乳液的相分离20的速率可通过以下方法加速，例如离心该微乳液来促进水相液滴的凝聚和沉积。另外，可向微乳液中加入具有可湿表面的粒状固体，由此提供水相凝聚的成核中心。于是，粒状固体的沉积与水相的沉积同时发生。
根据本发明制备的可逆胶束当暴露于特殊条件下可被破坏，实质上如以上描述的与油包水微乳液的倒转相关。适宜的破坏条件仅可通过途径试验就可确定。
不考虑以上描述的所使用的本发明的实施方案，相分离20的产物将是脱硫的液体石油（22）和水相（24），水相通常含有生物催化剂和因生物催化脱硫的结果而从液体石油基质中释放出的无机硫。
现在通过以下代表性实施例进一步说明本发明。
实施例1
在标准体系中用乳化剂Triton  N-101进行生物催化脱硫。
通过将DBT稀释至十六烷中成为DBT为3%或有机硫为0.52%的最终浓度而制备标准基质液体石油。5个培养瓶，指定为A-E，分别装有10ml基质液体石油样品。向瓶A中加入30ml无硫无机盐介质。瓶B-E中加入了30ml在无硫无机盐中的R.rhodocrous  ATCC  NO.53968的悬浮液。之后，将培养瓶调节到下表1中所示的商业乳化剂Triton N-101（Dow CHemical Co.）的最终浓度。将这些培养瓶保持在30℃下并在250rpm振动40小时，之后，回收油相样品并用标准方法分析硫含量。此研究结果列于下表1中。
表1：在含乳化剂Triton  N-101的标准体系中生物催化脱硫
生物催化剂  乳化剂  %硫  %脱硫
-  -  0.513  -
+  -  0.485  5.07±0.005
+  0.05%  0.486  5.07±0.005
+  0.10%  0.487  5.07±0.005
+  0.50%  0.473  7.89±0.009
这些结果表明，生物催化脱硫可在商业乳化剂Triton N-101存在下进行。该研究进一步证明生物催化脱硫的程度可依赖于形成的适宜乳化剂而显著增强。
实施例2
在乳液中渣油燃料油的增加性能的生物催化脱硫
向标有A-E的六个培养瓶中加入渣油燃料油。向瓶A和D中加入无硫的无机盐介质。向瓶B、C、E和F中加入在无硫无机盐介质中的R.rhodocrousATCC  NO.53968的悬浮液。向瓶A、C、D和F中进一步加入乳化剂，使足以在渣油燃料油和水相之间形成适宜的乳液。之后，将瓶A、B和C强力搅拌16小时，瓶D、E和F强力搅拌24小时。在该培育期之后，用标准方法分析被处理的油的硫百分含量。该结果列于表2中，其中相对于起始原料（未处理的渣油燃料油，4.76%S）的硫百分含量计算每个样品的脱硫百分数。
表2：加入乳化剂对渣油燃料油的生物催化脱硫的影响
生物催化剂  处理时间  乳化剂  %硫  %脱硫
-  16小时  +  5.06  -
+  16小时  -  4.88  无
+  16小时  +  3.30  31%
-  24小时  +  5.58  -
+  24小时  -  4.84  无
+  24小时  +  3.60  25%
这些结果表明，当在有机（基质）和水相（生物催化剂）之间形成适宜的乳液时，可增强生物催化脱硫作用。该研究结果可解释为与这样的假设即油和水相的密切接触限制了基质液体石油的生物催化脱硫的速率是一致的。
实施例3
使用无细胞提取物生物催化脱硫
用标准发酵法制备R.rhodocrous  ATCC  NO.53968培养物。通过使用装有16mm直径的探针的MSE标记的近距离声波定位器进行声振使未触动细菌细胞断裂或溶解。通过跟踪可溶蛋白质出现的情况（使用标准Bradford蛋白质分析仪器，根据制造商的指导如由BioRad出售的）来检测细胞溶解的进程。在4-6个声振周期（其中每个周期包括30秒声振，接着在融冰中培育30秒）后观察从未触动的ATCC  NO.53968细菌的浓缩悬浮液中最多蛋白质的释放情况（表明最大溶解）。
然后，通过离心分离将制备的溶解的细菌分成几部分。以6000×g离心分离5分钟后，得到片状“细胞碎片”部分（含有细胞壁断片）。这部分被证明含有生物催化脱硫活性，如通过对存在的2-羟基联苯（2-HBP）的Gibb的分析，观察到的由ATCC  NO.53968的DBT氧化生物催化脱硫的烃产物而确定的。Gibb的分析步骤如下：
细胞或细胞部分收割
在室温下，在Sorvall GSA或SS 34转筒中以8000×g离心分离细胞或胞外被膜部分20分钟。得到的片状物在pH为8.0的0.05M磷酸盐缓冲液中洗涤，并再悬浮于相同的缓冲液中。回收样品并以1∶10或1∶20稀释于磷酸盐缓冲液，在600nm测定悬浮液的光吸收率。之后，调节体积到得到具有A600多于3.0，优选约4.0的悬浮液。通过回收样品，将其以1∶10稀释，并使其A600在0.300-0.400范围内来确定这一浓度。
BDS培育，在能提供足够用于搅拌/充气体积的小瓶或大直径试验管中进行酶反应。所有反应都超过约5ml。对于每个反应，对于每ml细胞/胞外被膜悬浮液加入大约1mg  DBT（向25ml反应物中加入5mM  DBT，需要23mg  DBT;因此，反应物被调节到含有约5mM酶基质）。将反应混合物移入30℃水浴中，并在200rpm进行搅拌。值得注意的是在BDS活性方面存在起始滞后;因此，时间为零的样品被认为是任选的。在培育1，2和3小时后，从每个反应混合物中取出1.5ml样品并在Eppendorf  microfuge中以约12000rpm压4分钟。将产生的1毫升上清液样品移入1.5mlEppendorf瓶中用于分析。发现，若需要，在分析之前，这些上清液样品可在4℃下贮存几天。
Gibb分析  将0.1g  Gibb试剂（2，6-二氯醌-4-氯亚酰胺（由Sigma  Chemical  Co.得到的）溶于试验瓶的10ml无水乙醇中，迅速将瓶包裹在箔中避光。每天配制新的该溶液。向含有1.0ml的调到pH为8.0的上清液的每个Eppendorf瓶中加入10μlGibb试剂。在室温下培育30分钟后，通过测定被分析混合物在610nm处相对于含磷酸盐缓冲液而不是上清液的样品的A610的吸光度的增加来检测Gibb试剂和2-HBP之间的反应出现的兰色产物。结果表示当每单位的细胞物质（一个单位的细胞物质被定义为当悬浮于水中时产生A600为1.0的细胞/胞外被膜悬浮的量）每小时的吸光度。
该研究结果总结在表3中
表3：通过未触动细胞、溶解的细胞和无细胞部分的生物催化脱硫
生物催化剂  每单位细胞物质每小时  测定次数
吸光度(610nm)的变化
洗涤的未触动细胞  0.085±0.007  n=4
冷冻-解冻的25溶解细胞  0.060±0.001  n=2
(未馏分的)
声振溶解的细胞(细胞碎片部分)  0.035±0.002  n=2
这些结果说明在“细胞碎片部分”发现由ATCC  NO.53968微生物表达的大比例的总生物催化脱硫活性，细胞碎片部分含有内细胞膜和细胞壁断片。不需要限定对于所观察到的结果起作用的酶的位置、结构或同一性，以上存在的数据被认为表明了至少该特殊微生物，起脱硫作用的酶生物催化剂是一种胞外被膜（含有细菌细胞壁和细胞膜）组分。

Claims (27)

1、一种含有机硫分子的液体石油的脱硫方法，通过使用能选择性裂解甚至在含硫杂环中的有机碳-硫键的含水催化剂，包括的步骤为：
(a)在液体石油和含水催化剂之间形成乳液；和
(b)在足以引起有机碳-硫键催化裂解的条件下培育乳液足够时间，使大量催化裂解发生，由此，液体石油的有机硫含量显著降低，因此制得脱硫的液体石油。
2、权利要求1的方法，其中含水的催化剂是生物催化剂，其含有功能上表达可选择性裂解甚至含硫杂环中的有机碳-硫键的酶的微生物的培养物。
3、权利要求2的方法，其中酶控制所述键的氧化裂解。
4、权利要求3的方法，其中酶控制所述键的选择性硫的氧化裂解。
5、权利要求3的方法，其中微生物是Rhodococcus  rhodocrous  ATCC  53968或其衍生物。
6、权利要求1的方法，其中含水催化剂是生物催化剂，其含有功能上表达能够选择性裂解甚至在含硫杂环中的有机碳-硫键的酶的微生物的基本无细胞提取物，另外其中的提取物有大比例由微生物表达的所述酶的总活性。
7、权利要求6的方法，其中基本无细胞提取物含有与酶相关的胞外被膜和胞外被膜断片。
8、权利要求7的方法，其中酶控制所述键的氧化裂解。
9、权利要求8的方法，其中酶控制所述键的选择性硫氧化裂解。
10、权利要求8的方法，其中在功能上表达酶的微生物是Rhodococcus  rhodocrous  ATCC  53968或其衍生物。
11、权利要求1的方法，其中乳液的连续相是水相。
12、权利要求1的方法，其中乳液包括双连续的水相和有机相。
13、权利要求1的方法，其中乳液的连续相是有机相。
14、权利要求1的方法，其中乳液是可逆的，该方法包括另外的步骤：
（e）将乳液暴露在足以倒转所述乳液的条件下，由此得到含生物催化剂的水相和含脱硫的液体石油的有机相;和
（f）从水相中分离出脱硫的液体石油。
15、一种含有机硫分子的液体石油的脱硫方法，通过使用含水的生物催化剂，该催化剂包括在功能上表达能够选择性裂解甚至含硫杂环中的有机碳-硫键的酶的微生物的基本无细胞提取物，其中提取物有被微生物表达的大比例所述酶的总活性，该方法包括的步骤为：
（a）在液体石油和含水生物催化剂之间形成微乳液;和
（b）在足以使甚至含硫杂环中的有机碳-硫键的生物催化裂解发生的条件下培育微乳液足够时间，使大量生物催化裂解发生，由此液体石油中的有机硫含量显著降低，因此制得脱硫的流体石油。
16、权利要求15的方法，其中基本无细胞提取物包括与酶有关的胞外被膜和胞外被膜断片。
17、权利要求16的方法，其中酶控制所述键的氧化裂解。
18、权利要求17的方法，其中酶控制所述键的选择性硫氧化裂解。
19、权利要求17的方法，其中在功能上表达酶的微生物是Rhodococcus  rhodocrous  ATCC  53968或其衍生物。
20、权利要求15的方法，其中微乳液的连续相是水相。
21、权利要求15的方法，其中微乳液由双连续的水相和有机相组成。
22、权利要求15的方法，其中微乳液的连续相是有机相。
23、权利要求15的方法，其中微乳液是可逆的，该方法包括另外的步骤：
（e）将微乳液暴露在足以倒转所述微乳液的条件下，由此得到含有生物催化剂的水相和含脱硫的液体石油的有机相;和
（f）从水相中分离出脱硫的液体石油。
24、一种含有有机硫分子的液体石油的脱硫方法，通过使用提供含有微生物的基本无细胞胞外被膜或含胞外被膜断片的提取物的含水生物催化剂，其中微生物在功能上表达能选择性裂解甚至含硫杂环中的有机碳-硫键的与膜有关的酶，其中提取物有由微生物表达的大比例所述酶的总活性，该方法包括的步骤为：
（a）在液体石油中形成含水生物催化剂的可逆胶束：和
（b）在足以使甚至含硫杂环中的有机碳-硫键发生生物催化裂解的条件下培育可逆胶束足够时间，使大量生物催化裂解发生，由此液体石油中的有机硫含量显著降低，因此制得脱硫的流体石油。
25、权利要求24的方法，其中酶控制所述键的选择性硫的氧化裂解。
26、权利要求24的方法，其中在功能上表达酶的微生物是Rhodococcus  rhodocrous  ATCC  53968或其衍生物。
27、权利要求24的方法，还包括另外的步骤：
（e）将可逆胶束暴露在足以破坏他们的条件下，由此得到含有生物催化剂的水相和含脱硫的液体石油的有机相;和
（f）把脱硫的液体石油与水相分离。
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