JP2002522098A - 化石燃料の脱硫化用の改良された微生物触媒 - Google Patents
化石燃料の脱硫化用の改良された微生物触媒Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 化石燃料に含まれる硫黄を除く。
【解決手段】 基礎塩栄養素及び硫黄を欠く同化可能な炭素源を含む液体培地中で微生物培養菌ＣＤＴ−４又はＣＤＴ−４ｂと燃料をインキュベーションすることにより硫黄を含む液体化石燃料から硫黄を除く。
Description
【０００１】
本発明は、燃料の炭化水素値の付随する代謝なしに化石燃料を脱硫する分離か
つ純粋にされた微生物、並びにこれらの微生物を使用する方法に関する。
つ純粋にされた微生物、並びにこれらの微生物を使用する方法に関する。
【０００２】
硫黄は、化石燃料に普遍的に生ずる。石油では、それは炭素及び水素の次の第
三の最も豊富な要素であり、さらにそれは粗製及び精製された燃料の両者の望ま
しくない成分である。石油中の硫黄は、精製工程中物質特に金属の腐食の問題の
原因になる。さらに、硫黄含有燃料の燃焼は、酸性雨の原因になる大気中の二酸
化硫黄の汚染を生じさせる。その結果、精製された燃料の硫黄含量及び硫黄の発
生に対する厳重な規制が、米国や他の国において採用されてきている。
三の最も豊富な要素であり、さらにそれは粗製及び精製された燃料の両者の望ま
しくない成分である。石油中の硫黄は、精製工程中物質特に金属の腐食の問題の
原因になる。さらに、硫黄含有燃料の燃焼は、酸性雨の原因になる大気中の二酸
化硫黄の汚染を生じさせる。その結果、精製された燃料の硫黄含量及び硫黄の発
生に対する厳重な規制が、米国や他の国において採用されてきている。
【０００３】 現在使用されているほとんどの燃料脱硫法は、化学的及び／又は物理的な工程
である。これらの工程の多く例えば水素化脱硫は、概して水素及び高温高圧を要
し、そして水素化触媒は、しばしば反応中形成される硫化水素により阻害される
。方法は、そのため、高価なものになり勝ちである。その上、化石燃料中の硫黄
の或るフラクション、特に芳香族硫黄例えばベンゾチオフェン及びジベンゾチオ
フェンは、水素化脱硫に対して抵抗性がある。それゆえ、精製された燃料の硫黄
含量を低下させる追加の処理が、しばしば必要となる。
である。これらの工程の多く例えば水素化脱硫は、概して水素及び高温高圧を要
し、そして水素化触媒は、しばしば反応中形成される硫化水素により阻害される
。方法は、そのため、高価なものになり勝ちである。その上、化石燃料中の硫黄
の或るフラクション、特に芳香族硫黄例えばベンゾチオフェン及びジベンゾチオ
フェンは、水素化脱硫に対して抵抗性がある。それゆえ、精製された燃料の硫黄
含量を低下させる追加の処理が、しばしば必要となる。
【０００４】 さらに、低硫黄石油の世界の供給は減少しつつあり、より多い硫黄含量を有す
る重質原油及びオイルシェールへの関心が高まりつつある。これらの熟成したオ
イルは、安定なジベンゾチオフェンの形の高濃度の抵抗性のある硫黄を有する。
事実、ジベンゾチオフェンは、しばしば、堆積物が熟成し（ｍａｔｕｒｅ）かつ
部分的に変更した高硫黄原油中の主なチオフェン性化合物であり、例えば、いく
らかのテキサス原油は７０％以内の有機硫黄を含む（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ｌ．
及びＢｒｉｅｒｌｅｙ，Ｃ．Ｌ．編、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒ
ｅｃｏｖｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０中のＦ
ｏｇｈｔ，Ｊ．Ｍ．ら、ｐ．３８２）。 特に高硫黄含量石油の生物脱硫は、理論的に、より低い温度及び圧力の要件に
よるコストの有利さ並びに硫黄除去の精妙な特異性の可能性のために、水素化脱
硫に代わる魅力的な代替手段である。（レビューとして、上記のＦｏｇｈｔ、ｐ
ｐ．３７９−４０７。）
る重質原油及びオイルシェールへの関心が高まりつつある。これらの熟成したオ
イルは、安定なジベンゾチオフェンの形の高濃度の抵抗性のある硫黄を有する。
事実、ジベンゾチオフェンは、しばしば、堆積物が熟成し（ｍａｔｕｒｅ）かつ
部分的に変更した高硫黄原油中の主なチオフェン性化合物であり、例えば、いく
らかのテキサス原油は７０％以内の有機硫黄を含む（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ｌ．
及びＢｒｉｅｒｌｅｙ，Ｃ．Ｌ．編、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒ
ｅｃｏｖｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０中のＦ
ｏｇｈｔ，Ｊ．Ｍ．ら、ｐ．３８２）。 特に高硫黄含量石油の生物脱硫は、理論的に、より低い温度及び圧力の要件に
よるコストの有利さ並びに硫黄除去の精妙な特異性の可能性のために、水素化脱
硫に代わる魅力的な代替手段である。（レビューとして、上記のＦｏｇｈｔ、ｐ
ｐ．３７９−４０７。）
【０００５】 早くも１９５３年に、ＺｏＢｅｌｌは、硫黄を減少させる微生物例えばＤｅｓ
ｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ及びＳｐｏｒｏｖｉｂｒｉ
ｏにより生成されるヒドロゲナーゼを含む微生物的触媒例えばヒドロゲナーゼの
使用によって水素還元可能な化合物の還元及び除去により石油炭化水素から硫黄
が除去されることを示唆していた（米国特許第２６４１５６４号）。一つの態様
では、彼は、還元段階用の水素が、炭水化物に対するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、
Ａｅｒｏｂａｃｔｏｒ又は他の微生物の作用によりその場で生成されることを示
唆した（上記、４欄、７５行−６欄、２５行）。後の研究者は、硫黄を減少させ
る細菌が、電気化学的に供給される電子を使用して石油から硫黄を除くことを確
認した（例えば、Ｋｉｍら、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２
：７５７−７６０に記載されたＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉ
ｃａｎｓ Ｍ６）。
ｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ及びＳｐｏｒｏｖｉｂｒｉ
ｏにより生成されるヒドロゲナーゼを含む微生物的触媒例えばヒドロゲナーゼの
使用によって水素還元可能な化合物の還元及び除去により石油炭化水素から硫黄
が除去されることを示唆していた（米国特許第２６４１５６４号）。一つの態様
では、彼は、還元段階用の水素が、炭水化物に対するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、
Ａｅｒｏｂａｃｔｏｒ又は他の微生物の作用によりその場で生成されることを示
唆した（上記、４欄、７５行−６欄、２５行）。後の研究者は、硫黄を減少させ
る細菌が、電気化学的に供給される電子を使用して石油から硫黄を除くことを確
認した（例えば、Ｋｉｍら、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２
：７５７−７６０に記載されたＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉ
ｃａｎｓ Ｍ６）。
【０００６】 脱硫のテストのために候補となる微生物を選択するのに未置換の低分子量のモ
デル化合物を使用する妥当性は、石炭及び石油中のその多量さ及び化学的及び物
理的な脱硫におけるその抵抗性のために、不確かなままであるが、ジベンゾチオ
フェン（以下ＤＢＴと略す）は、石油の生物脱硫を研究するのにモデルとして有
用になってきている（Ｆｏｕｇｈｔ、上記、ｐｐ．３８７−３８８）。ＤＢＴは
、異なる代謝経路により細菌で代謝される。一つの経路では、炭素ＤＢＴの一部
は、炭素−硫黄結合の開裂なしに代謝される（上記）。この経路は、分子の有機
構造の一部が破壊されそして炭素−硫黄結合の開裂が生じないことから、化石燃
料のクリーニングの観点から望ましくない。
デル化合物を使用する妥当性は、石炭及び石油中のその多量さ及び化学的及び物
理的な脱硫におけるその抵抗性のために、不確かなままであるが、ジベンゾチオ
フェン（以下ＤＢＴと略す）は、石油の生物脱硫を研究するのにモデルとして有
用になってきている（Ｆｏｕｇｈｔ、上記、ｐｐ．３８７−３８８）。ＤＢＴは
、異なる代謝経路により細菌で代謝される。一つの経路では、炭素ＤＢＴの一部
は、炭素−硫黄結合の開裂なしに代謝される（上記）。この経路は、分子の有機
構造の一部が破壊されそして炭素−硫黄結合の開裂が生じないことから、化石燃
料のクリーニングの観点から望ましくない。
【０００７】 ＤＢＴ代謝の他の経路も炭素を破壊するものであるが、炭素−硫黄結合の開裂
が生じ、亜硫酸塩及び硫酸塩を放出する。例えば、ＤＯと表示されるＢｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は、炭素、エネルギー及び硫黄の唯一の源としてＤＢＴを
代謝して亜硫酸塩を放出することが報告されている（ｖａｎ Ａｆｆｅｒｄｅｎ
ら、１９９０、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：３２４−３２８）。Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ Ｋ３ｂは、同様な経路によりＤＢＴスルホンを代謝し
たが、イリノイＮｏ．６石炭から酸化された有機硫黄を除くことができなかった
（Ｄａｈｌｂｅｒｇ、Ｍ．Ｄ．ら、１９９３、Ｆｕｅｌ ７２：１６４５−１６
５０）。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓは、ＤＢＴを酸
化して硫酸塩を形成すると報告されているが（Ｋａｒｇｉ、Ｆ．及びＲｏｂｉｎ
ｓｏｎ、Ｊ．Ｍ．１９８６、Ｆｕｅｌ ６５：３９７−３９９）、この代謝の有
機生成物は測定されず、代謝が炭素を破壊するかどうかは不確かであった。微生
物は有機硫黄を石炭から４４％除くと報告されているが、イノキュレートされて
いないコントロールについての結果は報告されていない。
が生じ、亜硫酸塩及び硫酸塩を放出する。例えば、ＤＯと表示されるＢｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は、炭素、エネルギー及び硫黄の唯一の源としてＤＢＴを
代謝して亜硫酸塩を放出することが報告されている（ｖａｎ Ａｆｆｅｒｄｅｎ
ら、１９９０、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：３２４−３２８）。Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ Ｋ３ｂは、同様な経路によりＤＢＴスルホンを代謝し
たが、イリノイＮｏ．６石炭から酸化された有機硫黄を除くことができなかった
（Ｄａｈｌｂｅｒｇ、Ｍ．Ｄ．ら、１９９３、Ｆｕｅｌ ７２：１６４５−１６
５０）。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓは、ＤＢＴを酸
化して硫酸塩を形成すると報告されているが（Ｋａｒｇｉ、Ｆ．及びＲｏｂｉｎ
ｓｏｎ、Ｊ．Ｍ．１９８６、Ｆｕｅｌ ６５：３９７−３９９）、この代謝の有
機生成物は測定されず、代謝が炭素を破壊するかどうかは不確かであった。微生
物は有機硫黄を石炭から４４％除くと報告されているが、イノキュレートされて
いないコントロールについての結果は報告されていない。
【０００８】 炭素環構造の破壊なしにＤＢＴから硫黄を除く微生物は、化石燃料の脱硫への
応用の可能性について最も見込みがあるように思われる。ＩｓｂｉｓｔｅｒとＫ
ｏｂｙｌｉｎｓｋｉとは、ＤＢＴから硫酸塩とジヒドロキシビフェニルとを生成
するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの菌株を記載している（寄託番号３９３８１号とし
てＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託されている、Ｉｓｂｉｓｔｅｒ、Ｊ．Ｄ．及びＤｏｙ
ｌｅの米国特許第４５６２１５６号）。Ｉｓｂｉｓｔｅｒは、次にジフェニルス
ルフィドを酸化しそして石炭中の有機硫黄に作用するが、チオフェン性硫黄を除
かないように思われるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ菌株ＣＢ２（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ
．＃５３５１５）を述べている（米国特許第４８０８５３５号）。
応用の可能性について最も見込みがあるように思われる。ＩｓｂｉｓｔｅｒとＫ
ｏｂｙｌｉｎｓｋｉとは、ＤＢＴから硫酸塩とジヒドロキシビフェニルとを生成
するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの菌株を記載している（寄託番号３９３８１号とし
てＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託されている、Ｉｓｂｉｓｔｅｒ、Ｊ．Ｄ．及びＤｏｙ
ｌｅの米国特許第４５６２１５６号）。Ｉｓｂｉｓｔｅｒは、次にジフェニルス
ルフィドを酸化しそして石炭中の有機硫黄に作用するが、チオフェン性硫黄を除
かないように思われるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ菌株ＣＢ２（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ
．＃５３５１５）を述べている（米国特許第４８０８５３５号）。
【０００９】 選択的突然変異法後の分離は、突然変異種Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄ
ｏｃｈｒｏｕｓ菌株ＩＧＴＳ８（Ｋｉｌｂａｎｅの米国特許第５１０４８０１号
）の開発を導きだし、それは、分子の炭素環を破壊しない経路を経てＤＢＴを代
謝しそして化石燃料の脱硫用の微生物の使用の可能性に重大な関心を招く生物で
ある。この生物は、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され（寄託番号５３９６８号）、そ
して化石燃料の脱硫への応用の可能性のあるものと考えられる最も広く研究され
た細菌である。この生物は、ＤＢＴを硫黄の唯一の源として代謝し、２−ヒドロ
キシビフェニル又は２、２´−ジヒドロキシビフェニルの何れかを生成物として
形成し（上記；Ｇａｌｌａｇｈｅｒ、Ｊ．Ｒ．ら、１９９３、ＦＥＭＳ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０７：３１−３６；及びＯｌｓｏｎ、Ｇ．Ｊ．１９
９３、Ｆｕｅｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌ．４０：１０３−１１
４）、分子の炭化水素部分をそのままに残す。ＤＢＴにおける炭素−硫黄結合は
生ずるが、硫黄は溶液中に蓄積されず、それは明らかに生合成のために細胞によ
り直ぐに使用される（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ、上記）。
ｏｃｈｒｏｕｓ菌株ＩＧＴＳ８（Ｋｉｌｂａｎｅの米国特許第５１０４８０１号
）の開発を導きだし、それは、分子の炭素環を破壊しない経路を経てＤＢＴを代
謝しそして化石燃料の脱硫用の微生物の使用の可能性に重大な関心を招く生物で
ある。この生物は、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され（寄託番号５３９６８号）、そ
して化石燃料の脱硫への応用の可能性のあるものと考えられる最も広く研究され
た細菌である。この生物は、ＤＢＴを硫黄の唯一の源として代謝し、２−ヒドロ
キシビフェニル又は２、２´−ジヒドロキシビフェニルの何れかを生成物として
形成し（上記；Ｇａｌｌａｇｈｅｒ、Ｊ．Ｒ．ら、１９９３、ＦＥＭＳ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０７：３１−３６；及びＯｌｓｏｎ、Ｇ．Ｊ．１９
９３、Ｆｕｅｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌ．４０：１０３−１１
４）、分子の炭化水素部分をそのままに残す。ＤＢＴにおける炭素−硫黄結合は
生ずるが、硫黄は溶液中に蓄積されず、それは明らかに生合成のために細胞によ
り直ぐに使用される（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ、上記）。
【００１０】 成長条件下のＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓＩＧＴＳ８のＤＢＴ分解の代謝経路
は、硫黄のスルホキシド、スルホン、スルホン酸及び脱硫生成物２、２´−ジヒ
ドロキシビフェニルへの酸化を経て進む。休止条件下、細胞はスルホキシド、２
´−ヒドロキシビフェニル−２−スルフィナート及び２−ヒドロキシビフェニル
を生成する（上記）。生物は、石炭（Ｋｉｌｂａｎｅ及びＢｉｅｌａｇａ、上記
）及び溶解した石炭（Ｋｉｌｂａｎｅ、Ｊ．Ｊ．及びＪａｃｋｏｗｓｋｉ、Ｋ．
１９９１、ＢｉＯｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．４０：１１０７−１１１
４）を脱硫するその能力についてテストされている。しかし、生物が同化するや
り方で硫黄を使用するため、実験的な系は、少量の石炭に適用されるには多量の
細胞を要する。これは、この生物による石炭の生物脱硫への全細胞のアプローチ
の有用さの可能性を制限する。
は、硫黄のスルホキシド、スルホン、スルホン酸及び脱硫生成物２、２´−ジヒ
ドロキシビフェニルへの酸化を経て進む。休止条件下、細胞はスルホキシド、２
´−ヒドロキシビフェニル−２−スルフィナート及び２−ヒドロキシビフェニル
を生成する（上記）。生物は、石炭（Ｋｉｌｂａｎｅ及びＢｉｅｌａｇａ、上記
）及び溶解した石炭（Ｋｉｌｂａｎｅ、Ｊ．Ｊ．及びＪａｃｋｏｗｓｋｉ、Ｋ．
１９９１、ＢｉＯｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．４０：１１０７−１１１
４）を脱硫するその能力についてテストされている。しかし、生物が同化するや
り方で硫黄を使用するため、実験的な系は、少量の石炭に適用されるには多量の
細胞を要する。これは、この生物による石炭の生物脱硫への全細胞のアプローチ
の有用さの可能性を制限する。
【００１１】 その上、不十分なデータしか発見を維持するのに提出されていないため、石炭
からの有機硫黄の除去についての報告の真実性を十分に評価することは、一般に
不可能であった。実験の不足は、間接的な「有機硫黄」の測定に関する信頼度、
適切な実験のコントロールの欠落、そして石炭の回収に関するデータ及びそれに
関連する元素分析の不存在を含む（Ｏｌｓｏｎ、上記、ｐ．１０４）。石炭の「
有機硫黄」含量の測定は、いくらかの石炭における元素状硫黄、金属硫化物、ジ
ャロサイト及び黄鉄鉱の存在はすべて間接的な有機硫黄の測定における誤差を導
くために、特に誤差を生じやすい。これは、バイオマスが多くの石炭よりも遥か
に低い硫黄含量を有するので見かけの脱硫が希釈により生ずるかもしれないため
、多量のバイオマスが使用される石炭のサンプルに伴う場合に特に真実である。
からの有機硫黄の除去についての報告の真実性を十分に評価することは、一般に
不可能であった。実験の不足は、間接的な「有機硫黄」の測定に関する信頼度、
適切な実験のコントロールの欠落、そして石炭の回収に関するデータ及びそれに
関連する元素分析の不存在を含む（Ｏｌｓｏｎ、上記、ｐ．１０４）。石炭の「
有機硫黄」含量の測定は、いくらかの石炭における元素状硫黄、金属硫化物、ジ
ャロサイト及び黄鉄鉱の存在はすべて間接的な有機硫黄の測定における誤差を導
くために、特に誤差を生じやすい。これは、バイオマスが多くの石炭よりも遥か
に低い硫黄含量を有するので見かけの脱硫が希釈により生ずるかもしれないため
、多量のバイオマスが使用される石炭のサンプルに伴う場合に特に真実である。
【００１２】 それにもかかわらず、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ又はＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒ
ｏｕｓ培養物の酵素及び／又は膜抽出物（Ｋｉｌｂａｎｅの米国特許第５１３２
２１９及び５３４４７７８号）は、液体化石燃料の「強度の（ｄｅｅｐ）脱硫」
のための水素化脱硫（Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏの米国特許第５２３２８５４及び５
３８７５２３号）と組み合わされた酸素化及び再生の工程を含む連続方法（Ｍｏ
ｎｔｉｃｅｌｌｏの米国特許第５４７２８７５号）を含む、石油又は石炭におけ
る有機Ｃ−Ｓ結合の開裂のための方法（Ｋｉｌｂａｎｅの米国特許第５３５８８
６９号）において、そして化石燃料の脱硫及び脱塩の方法（Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌ
ｏの米国特許第５３５６８１３号）において示唆されてきている。
ｏｕｓ培養物の酵素及び／又は膜抽出物（Ｋｉｌｂａｎｅの米国特許第５１３２
２１９及び５３４４７７８号）は、液体化石燃料の「強度の（ｄｅｅｐ）脱硫」
のための水素化脱硫（Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏの米国特許第５２３２８５４及び５
３８７５２３号）と組み合わされた酸素化及び再生の工程を含む連続方法（Ｍｏ
ｎｔｉｃｅｌｌｏの米国特許第５４７２８７５号）を含む、石油又は石炭におけ
る有機Ｃ−Ｓ結合の開裂のための方法（Ｋｉｌｂａｎｅの米国特許第５３５８８
６９号）において、そして化石燃料の脱硫及び脱塩の方法（Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌ
ｏの米国特許第５３５６８１３号）において示唆されてきている。
【００１３】 Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓに関するＫｉｌｂａｎｅの研究の発表に続いて、
ジベンゾチオフェンの脱硫における同様な代謝経路を有すると思われる他の生物
が発表されてきている。これらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ菌
株（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５３９６９号、Ｋｉｌｂａｎｅの米国特許第５０
０２８８８号）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．菌株ＳＹ１として同
定された菌株（Ｏｍｏｒｉ、Ｔ．ら、１９９２、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：９１１−９１５）、並びにＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌ
ｉｓ Ｄ−１と仮に同定された細菌（Ｉｚｕｍｉ、Ｙ．ら、１９９４、Ａｐｐｌ
．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：２２３−２２６）を含む。これ
らは、硫黄の源としてＤＢＴを利用し、２−ヒドロキシビフェニルを生成しそし
て少量の硫酸塩を放出するといわれる。Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ Ａ．Ｔ．Ｃ
．Ｃ．５３９６９は、ＤＢＴを代謝するために栄養的なヘルパー細菌を要する。
ＤＢＴをモノヒドロキシビフェニルに転換するＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓの
他の菌株が記述されており（Ｗａｎｇ，Ｐ．及びＫｒａｗｉｅｃ、Ｓ．１９９４
、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｏｌ．１６１：２６６−２７１）；成長培地中の
硫酸塩の存在は、脱硫活性の発現を抑えるが、ＤＢＴで成長する細胞の懸濁物に
添加された硫酸塩は、脱硫活性を阻害しなかった。Ｇｏｒｄｏｎａ菌株ＣＹＫＳ
１は、ＤＢＴを２−ヒドロキシビフェニルに転換する（Ｒｈｅｅ，Ｓ．−Ｋ．ら
、１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２３２７
−２３３１）。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌株ＩＧＴＳ８と同様に、ＤＢＴ代謝は
、硫酸塩により抑えられた。生物は、ディーゼル油から硫黄を除くといわれてい
るが、イノキュレートされていないコントロールからの結果は示されていなかっ
た。 化石燃料の脱硫のための他の改良された生物触媒、特に炭素及び／又はエネル
ギー源として燃料それ自体を代謝しない剤を有することが望ましい。また、経済
的でしかも培養するのが容易な天然の源から分離される燃料の生物脱硫剤を有す
ることが望ましい。
ジベンゾチオフェンの脱硫における同様な代謝経路を有すると思われる他の生物
が発表されてきている。これらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ菌
株（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号５３９６９号、Ｋｉｌｂａｎｅの米国特許第５０
０２８８８号）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．菌株ＳＹ１として同
定された菌株（Ｏｍｏｒｉ、Ｔ．ら、１９９２、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：９１１−９１５）、並びにＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌ
ｉｓ Ｄ−１と仮に同定された細菌（Ｉｚｕｍｉ、Ｙ．ら、１９９４、Ａｐｐｌ
．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：２２３−２２６）を含む。これ
らは、硫黄の源としてＤＢＴを利用し、２−ヒドロキシビフェニルを生成しそし
て少量の硫酸塩を放出するといわれる。Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ Ａ．Ｔ．Ｃ
．Ｃ．５３９６９は、ＤＢＴを代謝するために栄養的なヘルパー細菌を要する。
ＤＢＴをモノヒドロキシビフェニルに転換するＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓの
他の菌株が記述されており（Ｗａｎｇ，Ｐ．及びＫｒａｗｉｅｃ、Ｓ．１９９４
、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｏｌ．１６１：２６６−２７１）；成長培地中の
硫酸塩の存在は、脱硫活性の発現を抑えるが、ＤＢＴで成長する細胞の懸濁物に
添加された硫酸塩は、脱硫活性を阻害しなかった。Ｇｏｒｄｏｎａ菌株ＣＹＫＳ
１は、ＤＢＴを２−ヒドロキシビフェニルに転換する（Ｒｈｅｅ，Ｓ．−Ｋ．ら
、１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２３２７
−２３３１）。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌株ＩＧＴＳ８と同様に、ＤＢＴ代謝は
、硫酸塩により抑えられた。生物は、ディーゼル油から硫黄を除くといわれてい
るが、イノキュレートされていないコントロールからの結果は示されていなかっ
た。 化石燃料の脱硫のための他の改良された生物触媒、特に炭素及び／又はエネル
ギー源として燃料それ自体を代謝しない剤を有することが望ましい。また、経済
的でしかも培養するのが容易な天然の源から分離される燃料の生物脱硫剤を有す
ることが望ましい。
【００１４】
化石燃料を脱硫する新しい微生物による方法を提供するのが本発明の目的であ
る。 改良された天然の脱硫生物触媒、並びにそれらを同定するスクリーニング方法
を提供するのが本発明の他の目的である。 炭素又はエネルギー源として燃料を明らかに利用することなく、硫黄含有化石
燃料から硫黄を選択的に除く微生物を提供するこれら及び他の目的は、本発明に
より達成される。代表的な生物脱硫方法では、微生物は、燃料から硫黄の一部好
ましくは少なくとも２０重量％を除く時間及び条件の下、化石燃料とともにイン
キュベートされる。好ましい態様では、燃料は、１段階又は多段階で３−１４日
間約２５−３０℃で基礎塩及び硫黄を欠く同化可能な炭素源を含む液体培養培地
中で微生物とのインキュベーションにより液体として脱硫される。液体として脱
硫される燃料は、石油留出物及びオイル（ｏｉｌ）、石油及び／又はオイルから
由来する合成燃料、そして溶解した、可溶化した及び／又はエマルション化した
高粘度及び固体の炭化水素燃料を含むが、これらに限定されない。炭素源は、グ
リセロール、グルコース、エタノール、酢酸ナトリウム、琥珀酸ナトリウム、安
息香酸ナトリウム、蔗糖、コーンシロップ、糖蜜、さとうきびから得られる廃物
、有機質肥料、及び／又はきのこコンポスト、又はこれらの混合物を含むが、こ
れらに限定されない。グリセロール、グルコース及び／又はエタノールは、いく
らかの態様で使用される。
る。 改良された天然の脱硫生物触媒、並びにそれらを同定するスクリーニング方法
を提供するのが本発明の他の目的である。 炭素又はエネルギー源として燃料を明らかに利用することなく、硫黄含有化石
燃料から硫黄を選択的に除く微生物を提供するこれら及び他の目的は、本発明に
より達成される。代表的な生物脱硫方法では、微生物は、燃料から硫黄の一部好
ましくは少なくとも２０重量％を除く時間及び条件の下、化石燃料とともにイン
キュベートされる。好ましい態様では、燃料は、１段階又は多段階で３−１４日
間約２５−３０℃で基礎塩及び硫黄を欠く同化可能な炭素源を含む液体培養培地
中で微生物とのインキュベーションにより液体として脱硫される。液体として脱
硫される燃料は、石油留出物及びオイル（ｏｉｌ）、石油及び／又はオイルから
由来する合成燃料、そして溶解した、可溶化した及び／又はエマルション化した
高粘度及び固体の炭化水素燃料を含むが、これらに限定されない。炭素源は、グ
リセロール、グルコース、エタノール、酢酸ナトリウム、琥珀酸ナトリウム、安
息香酸ナトリウム、蔗糖、コーンシロップ、糖蜜、さとうきびから得られる廃物
、有機質肥料、及び／又はきのこコンポスト、又はこれらの混合物を含むが、こ
れらに限定されない。グリセロール、グルコース及び／又はエタノールは、いく
らかの態様で使用される。
【００１５】 本発明の生物脱硫で有用な微生物は、土壌又は水のサンプルから得られかつ純
粋にされる。それらは、硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンに成長する微
生物として先ず同定され生物学的に純粋にされる。この予備的な段階後、それら
は、化合物のフェニル環構造を代謝することなく硫黄の唯一の源としてジベンゾ
チオフェンを利用すると思われる微生物を先ず選択し、次に化石燃料に対するそ
れらの活性についてＤＢＴから硫黄のみを利用する微生物をテストする２段階の
スクリーニングを次に特徴とする。炭素又はエネルギーの源として燃料を明らか
に利用することなく化石燃料から硫黄を除く生物は、従って同定される。
粋にされる。それらは、硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンに成長する微
生物として先ず同定され生物学的に純粋にされる。この予備的な段階後、それら
は、化合物のフェニル環構造を代謝することなく硫黄の唯一の源としてジベンゾ
チオフェンを利用すると思われる微生物を先ず選択し、次に化石燃料に対するそ
れらの活性についてＤＢＴから硫黄のみを利用する微生物をテストする２段階の
スクリーニングを次に特徴とする。炭素又はエネルギーの源として燃料を明らか
に利用することなく化石燃料から硫黄を除く生物は、従って同定される。
【００１６】 簡単には、硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンで成長すると思われる微
生物は、細菌の細胞の成長に十分な時間及び条件の下無機栄養素、硫黄を欠く同
化可能な炭素源及び硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンを含む細菌培養の
培地で土壌又は水のサンプルをインキュベーションし；少なくとも３週間１週間
の間隔で新しい培養培地により１：５００−１：２０００のファクターで成長す
る培養物を希釈して高められた（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培養物を生成し；固体培養
培地上に培養物を画線しそして分離されたコロニーの細菌細胞の成長を得る時間
及び条件の下インキュベーションし；そして分離されたコロニーを再画線して硫
黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンで成長すると思われる微生物の生物学的
に純粋にされた培養菌を得ることにより得られる。
生物は、細菌の細胞の成長に十分な時間及び条件の下無機栄養素、硫黄を欠く同
化可能な炭素源及び硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンを含む細菌培養の
培地で土壌又は水のサンプルをインキュベーションし；少なくとも３週間１週間
の間隔で新しい培養培地により１：５００−１：２０００のファクターで成長す
る培養物を希釈して高められた（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培養物を生成し；固体培養
培地上に培養物を画線しそして分離されたコロニーの細菌細胞の成長を得る時間
及び条件の下インキュベーションし；そして分離されたコロニーを再画線して硫
黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンで成長すると思われる微生物の生物学的
に純粋にされた培養菌を得ることにより得られる。
【００１７】 硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンで成長すると思われる微生物の純粋
にされた培養菌は、次に先ずジベンゾチオフェンによりスクリーニングされ、次
に化石燃料によりスクリーニングされる。第一のスクリーニングは、以下の段階
からなる。（ｉ）純粋にされた培養菌を、無機栄養素、硫黄を欠く同化可能な炭
素源及び硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンを含む培地に加えてそれによ
りサンプル培養菌を提供する工程；（ｉｉ）純粋にされた培養菌を、同じ無機栄
養素及び炭素源を含むがジベンゾチオフェンを含まない相応する第二の培地に加
え、それによりコントロール培養菌を提供する工程；（ｉｉｉ）細菌性細胞の成
長を観察するのに十分な時間及び条件の下サンプル培養菌及びコントロール培養
菌をインキュベーションする工程；（ｉｖ）ジベンゾチオフェンを含むサンプル
培養菌の成長の程度をジベンゾチオフェンを含まない培養菌の成長の程度と比較
する工程；（ｖ）ジベンゾチオフェンを含むサンプル培養で成長するがジベンゾ
チオフェンを含まないコントロール培養で成長しないすべての培養菌を同定する
工程；（ｖｉ）ジベンゾチオフェンで成長するすべての培養菌でジベンゾチオフ
ェンの代謝生成物を同定する工程；そして（ｖｉｉ）ジベンゾチオフェンで成長
しそしてビフェニル又はヒドロキシビフェニルを含むがしかし炭素を含む他の生
成物を実質的に含まない代謝生成物を生ずるすべての培養菌をポジティブな一次
のスクリーニング培養菌として同定する工程。
にされた培養菌は、次に先ずジベンゾチオフェンによりスクリーニングされ、次
に化石燃料によりスクリーニングされる。第一のスクリーニングは、以下の段階
からなる。（ｉ）純粋にされた培養菌を、無機栄養素、硫黄を欠く同化可能な炭
素源及び硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンを含む培地に加えてそれによ
りサンプル培養菌を提供する工程；（ｉｉ）純粋にされた培養菌を、同じ無機栄
養素及び炭素源を含むがジベンゾチオフェンを含まない相応する第二の培地に加
え、それによりコントロール培養菌を提供する工程；（ｉｉｉ）細菌性細胞の成
長を観察するのに十分な時間及び条件の下サンプル培養菌及びコントロール培養
菌をインキュベーションする工程；（ｉｖ）ジベンゾチオフェンを含むサンプル
培養菌の成長の程度をジベンゾチオフェンを含まない培養菌の成長の程度と比較
する工程；（ｖ）ジベンゾチオフェンを含むサンプル培養で成長するがジベンゾ
チオフェンを含まないコントロール培養で成長しないすべての培養菌を同定する
工程；（ｖｉ）ジベンゾチオフェンで成長するすべての培養菌でジベンゾチオフ
ェンの代謝生成物を同定する工程；そして（ｖｉｉ）ジベンゾチオフェンで成長
しそしてビフェニル又はヒドロキシビフェニルを含むがしかし炭素を含む他の生
成物を実質的に含まない代謝生成物を生ずるすべての培養菌をポジティブな一次
のスクリーニング培養菌として同定する工程。
【００１８】 ポジティブな培養菌を次に二次スクリーニングで再スクリーニングする。二次
スクリーニングでは、ポジティブな培養菌を、無機栄養素及び唯一の炭素及び硫
黄源として化石燃料を含む細菌性培養培地に、そしてまた同じ細菌性培養培地、
同じ化石燃料及び硫黄を欠く第二の炭素源を含む相応する第二の培養にイノキュ
レートする。両者の培養を細菌細胞の成長を観察するのに十分な時間及び条件の
下インキュベーションし、唯一の炭素源として化石燃料を含む培養の成長の程度
を、第二の炭素源として化石燃料を含む培養の成長の程度を比較する。化石燃料
から硫黄を選択的に除く微生物を、化石燃料及び第二の炭素源の存在下の培養物
中の微生物の成長、そして化石燃料は存在するが第二の炭素源は存在しない条件
でインキュベーションした対応する培養物の非成長を観察することにより同定す
る。
スクリーニングでは、ポジティブな培養菌を、無機栄養素及び唯一の炭素及び硫
黄源として化石燃料を含む細菌性培養培地に、そしてまた同じ細菌性培養培地、
同じ化石燃料及び硫黄を欠く第二の炭素源を含む相応する第二の培養にイノキュ
レートする。両者の培養を細菌細胞の成長を観察するのに十分な時間及び条件の
下インキュベーションし、唯一の炭素源として化石燃料を含む培養の成長の程度
を、第二の炭素源として化石燃料を含む培養の成長の程度を比較する。化石燃料
から硫黄を選択的に除く微生物を、化石燃料及び第二の炭素源の存在下の培養物
中の微生物の成長、そして化石燃料は存在するが第二の炭素源は存在しない条件
でインキュベーションした対応する培養物の非成長を観察することにより同定す
る。
【００１９】 本発明は、１９９８年８月１０日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託され、そしてまだ
寄託番号を付与されていないＣＤＴ−４及びＣＤＴ−４ｂと名付けられたスクリ
ーニングで同定された有効な培養菌、そして２段階のスクリーニングで同定され
た他の微生物、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種としてそしてＮｏｃａｒｄｉａ
ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓとして同定される菌株とＣＤＴ−４ｂ（ＣＤＴ−４のＮ
ｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ成分）とからなる共同培養菌（ｃｏ−ｃ
ｕｌｔｕｒｅ）である菌株ＣＤＴ−４に類似の生物学的脱硫の性質を示すものを
特に包含する。 本発明の実施にあたり、化石燃料から硫黄を選択的に除く土壌又は水の微生物
は、多段階スクリーニング法で同定かつ分離され、次に化石燃料を脱硫するのに
使用される。硫黄含有化石燃料サンプルから少なくとも２０％の硫黄を除く微生
物の培養菌が、特に好ましい。
寄託番号を付与されていないＣＤＴ−４及びＣＤＴ−４ｂと名付けられたスクリ
ーニングで同定された有効な培養菌、そして２段階のスクリーニングで同定され
た他の微生物、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種としてそしてＮｏｃａｒｄｉａ
ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓとして同定される菌株とＣＤＴ−４ｂ（ＣＤＴ−４のＮ
ｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ成分）とからなる共同培養菌（ｃｏ−ｃ
ｕｌｔｕｒｅ）である菌株ＣＤＴ−４に類似の生物学的脱硫の性質を示すものを
特に包含する。 本発明の実施にあたり、化石燃料から硫黄を選択的に除く土壌又は水の微生物
は、多段階スクリーニング法で同定かつ分離され、次に化石燃料を脱硫するのに
使用される。硫黄含有化石燃料サンプルから少なくとも２０％の硫黄を除く微生
物の培養菌が、特に好ましい。
【００２０】 本発明による生物脱硫法は、すべての硫黄含有化石燃料から硫黄を除くのに有
用である。本明細書で使用されるとき、用語「化石燃料」は、石油、石炭、けつ
岩（シェール）、原油を含むオイル、亜炭から由来するすべての炭化水素生成物
、それらから由来する合成燃料、及びこれらの混合物を含む。液体化石燃料、例
えば石油留出物及び軽油は、液体燃料が溶解化又はエマルション化なしにそのま
ま使用できるため、本発明の方法を使用する脱硫に特に適合される。一方、高粘
度のオイル、ビチューメン、石炭などは、概して、当業者に周知の任意の溶解、
可溶化又はエマルション化の方法を使用して、例えば、高粘度の炭化水素例えば
原油では、アルカンのような炭化水素溶媒に溶解するか又はＶａｌｅｎｔｉｎｅ
の米国特許第５５３９８８９号に記載された方法のようなエマルションを使用す
ることにより、又は石炭では、上記のＫｉｌｂａｎｅ及びＪａｃｋｏｗｓｋｉに
より記載されたような可溶化により、本発明の生物触媒により脱硫前に溶解、可
溶及び／又はエマルションにされる。本明細書で使用されるとき、これら高粘度
又は固体の燃料を、エマルション化、可溶化、懸濁化及び／又は溶解化によりさ
らに液体にされるとき、それらはまた液体培養培地を使用する本発明の好ましい
態様において脱硫に好適な「液体燃料」とよぶ。
用である。本明細書で使用されるとき、用語「化石燃料」は、石油、石炭、けつ
岩（シェール）、原油を含むオイル、亜炭から由来するすべての炭化水素生成物
、それらから由来する合成燃料、及びこれらの混合物を含む。液体化石燃料、例
えば石油留出物及び軽油は、液体燃料が溶解化又はエマルション化なしにそのま
ま使用できるため、本発明の方法を使用する脱硫に特に適合される。一方、高粘
度のオイル、ビチューメン、石炭などは、概して、当業者に周知の任意の溶解、
可溶化又はエマルション化の方法を使用して、例えば、高粘度の炭化水素例えば
原油では、アルカンのような炭化水素溶媒に溶解するか又はＶａｌｅｎｔｉｎｅ
の米国特許第５５３９８８９号に記載された方法のようなエマルションを使用す
ることにより、又は石炭では、上記のＫｉｌｂａｎｅ及びＪａｃｋｏｗｓｋｉに
より記載されたような可溶化により、本発明の生物触媒により脱硫前に溶解、可
溶及び／又はエマルションにされる。本明細書で使用されるとき、これら高粘度
又は固体の燃料を、エマルション化、可溶化、懸濁化及び／又は溶解化によりさ
らに液体にされるとき、それらはまた液体培養培地を使用する本発明の好ましい
態様において脱硫に好適な「液体燃料」とよぶ。
【００２１】 化石燃料から硫黄を選択的に除く土壌又は水の微生物を同定するスクリーニン
グ法は、概して、モデル化合物による予備スクリーニングで見込みのあるように
みえる培養菌が分離され生物学的に純粋にされた後、２段階の方法を含む。予備
スクリーニング段階では、土壌又は水のサンプルは、モデル硫黄化合物を使用し
てサンプルの代謝活性をテストすることにより、燃料の硫黄の除去の可能性を示
す微生物の活性についてスクリーニングされる。化石燃料で見いだされる硫黄化
合物に類似の構造を有する任意の有機硫黄化合物が、この予備的スクリーニング
段階で使用できる。燃料に通常生ずる硫黄化合物、特に上記の物理的及び化学的
な脱硫法において抵抗性があるものは、モデルとして好ましい。使用できるモデ
ル化合物は、上記のＦｏｇｈｔらにより論じられ、そしてチオフェン例えばジベ
ンゾチオフェン、ベンゾチオフェン、及びアルキルチオフェン、ジベンジルスル
フィドなどを含むが、これらに限定されない。ジベンゾチオフェンが、原油の共
通の硫黄汚染物でありしかも抵抗性があるため、本発明の好ましい態様の実施に
使用されるように選択された。しかし、本発明の方法が、ジベンゾチオフェンの
代わりに他のモデル化合物を置き換えることにより、燃料中の他の硫黄汚染物の
スクリーニングのために適合させることができることは理解すべきである。
グ法は、概して、モデル化合物による予備スクリーニングで見込みのあるように
みえる培養菌が分離され生物学的に純粋にされた後、２段階の方法を含む。予備
スクリーニング段階では、土壌又は水のサンプルは、モデル硫黄化合物を使用し
てサンプルの代謝活性をテストすることにより、燃料の硫黄の除去の可能性を示
す微生物の活性についてスクリーニングされる。化石燃料で見いだされる硫黄化
合物に類似の構造を有する任意の有機硫黄化合物が、この予備的スクリーニング
段階で使用できる。燃料に通常生ずる硫黄化合物、特に上記の物理的及び化学的
な脱硫法において抵抗性があるものは、モデルとして好ましい。使用できるモデ
ル化合物は、上記のＦｏｇｈｔらにより論じられ、そしてチオフェン例えばジベ
ンゾチオフェン、ベンゾチオフェン、及びアルキルチオフェン、ジベンジルスル
フィドなどを含むが、これらに限定されない。ジベンゾチオフェンが、原油の共
通の硫黄汚染物でありしかも抵抗性があるため、本発明の好ましい態様の実施に
使用されるように選択された。しかし、本発明の方法が、ジベンゾチオフェンの
代わりに他のモデル化合物を置き換えることにより、燃料中の他の硫黄汚染物の
スクリーニングのために適合させることができることは理解すべきである。
【００２２】 硫黄含有有機基質を代謝する能力を有する微生物は、良好な微生物の成長のた
めの有機及び無機の栄養素を供給するが、モデル化合物のような選択された微生
物により代謝されることが望ましい有機硫黄含有化合物を除いて無機及び有機の
硫黄含有化合物を概して欠く培地でテストかつ培養される。硫黄代謝菌株の成長
及び繁殖を維持すると思われる任意のタイプの液体又は固体化された培地は、本
発明の予備スクリーニング、スクリーニング及び脱硫の方法において培養物とし
て使用できる。いくつかのこれら培地は、当業者に周知である。培地の例は、以
下の実施例に記述されるミネラル栄養素（燐酸及び窒素の無機塩）（Ｋ２ＨＰＯ ４ 、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・
２Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを含む）、並びに硫黄を欠く同化可能な炭素源
を提供する基礎塩培地；Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＮａＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、Ｎａ
Ｃｌ、硫黄を欠く同化可能な炭素源、そして任意にＣａＣｌ２を含むＭ９ミニマ
ル培地などを含む。高められた培地例えばシステイン又はメチオニンなしで調製
されたＮＺＣブロスなど、並びにミニマル培地及び／又は高められた培地の混合
物も使用できる。無機栄養素を含む中性即ちｐＨ６−７．５の培地が好ましい。
液体培地も好ましいが、従来の技術を使用してアガーにより固化したような培地
も、別の態様で使用できる。
めの有機及び無機の栄養素を供給するが、モデル化合物のような選択された微生
物により代謝されることが望ましい有機硫黄含有化合物を除いて無機及び有機の
硫黄含有化合物を概して欠く培地でテストかつ培養される。硫黄代謝菌株の成長
及び繁殖を維持すると思われる任意のタイプの液体又は固体化された培地は、本
発明の予備スクリーニング、スクリーニング及び脱硫の方法において培養物とし
て使用できる。いくつかのこれら培地は、当業者に周知である。培地の例は、以
下の実施例に記述されるミネラル栄養素（燐酸及び窒素の無機塩）（Ｋ２ＨＰＯ ４ 、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・
２Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを含む）、並びに硫黄を欠く同化可能な炭素源
を提供する基礎塩培地；Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＮａＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、Ｎａ
Ｃｌ、硫黄を欠く同化可能な炭素源、そして任意にＣａＣｌ２を含むＭ９ミニマ
ル培地などを含む。高められた培地例えばシステイン又はメチオニンなしで調製
されたＮＺＣブロスなど、並びにミニマル培地及び／又は高められた培地の混合
物も使用できる。無機栄養素を含む中性即ちｐＨ６−７．５の培地が好ましい。
液体培地も好ましいが、従来の技術を使用してアガーにより固化したような培地
も、別の態様で使用できる。
【００２３】 本発明の好ましい微生物は、燃料の炭素構造を代謝することなく化石燃料を脱
硫する。従って、本発明のスクリーニング工程は、燃料中の硫黄を代謝するが燃
料以外の炭素源を要すると思われる微生物を同定するように工夫されている。そ
れゆえ、スクリーニング工程用の或る培地は、栄養素及び比較の目的のために、
微生物学的に同化可能な炭素源を使用する。硫黄を好ましくは欠く任意の同化可
能な炭素源は、望ましい微生物の成長を維持するための量で培地中で使用できる
。好適な同化可能な炭素源は、グリセロール、グルコース、及びエタノール又は
これらの混合物を含む。酢酸ナトリウム、琥珀酸ナトリウム、安息香酸ナトリウ
ム、蔗糖、コーンシロップ、糖蜜など、又は廃物例えばさとうきび、有機質肥料
、きのこコンポスト又はこれらと相互の混合物又はこれらと上記の炭素源との混
合物（これらに限定されない）も使用できる。グリセロールが、以下に示される
一つの態様で使用される。
硫する。従って、本発明のスクリーニング工程は、燃料中の硫黄を代謝するが燃
料以外の炭素源を要すると思われる微生物を同定するように工夫されている。そ
れゆえ、スクリーニング工程用の或る培地は、栄養素及び比較の目的のために、
微生物学的に同化可能な炭素源を使用する。硫黄を好ましくは欠く任意の同化可
能な炭素源は、望ましい微生物の成長を維持するための量で培地中で使用できる
。好適な同化可能な炭素源は、グリセロール、グルコース、及びエタノール又は
これらの混合物を含む。酢酸ナトリウム、琥珀酸ナトリウム、安息香酸ナトリウ
ム、蔗糖、コーンシロップ、糖蜜など、又は廃物例えばさとうきび、有機質肥料
、きのこコンポスト又はこれらと相互の混合物又はこれらと上記の炭素源との混
合物（これらに限定されない）も使用できる。グリセロールが、以下に示される
一つの態様で使用される。
【００２４】 硫黄モデル化合物の予備的スクリーニング工程では、土壌又は水のテストサン
プルが、無機栄養素、硫黄を欠く同化可能な炭素源及び硫黄の唯一の源としての
ジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）を含む細菌の培養培地に添加される。培養物は、
細菌細胞の成長を観察するのに十分な時間及び条件の下テストサンプルにインキ
ュベートされる。この予備スクリーニング工程及び以下に詳述されるスクリーニ
ング工程において、他に言及されていない限り、インキュベーションは、概して
３−１４日間約２５−３０℃で大気中で大気圧で行われる。培養物の成長は、従
来の方法により評価される。液体培養物が使用されるとき、成長の相違は、一般
に濁り度を観察かつ比較することにより測定され、この目的のために、５５０−
６５０ｎｍ例えば６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の読み取りがなされそして比
較される。顕微鏡も液体又は固体の培地の成長をモニターするために使用できる
。固体の培地では、成長はさらに肉眼による検査により評価できる。
プルが、無機栄養素、硫黄を欠く同化可能な炭素源及び硫黄の唯一の源としての
ジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）を含む細菌の培養培地に添加される。培養物は、
細菌細胞の成長を観察するのに十分な時間及び条件の下テストサンプルにインキ
ュベートされる。この予備スクリーニング工程及び以下に詳述されるスクリーニ
ング工程において、他に言及されていない限り、インキュベーションは、概して
３−１４日間約２５−３０℃で大気中で大気圧で行われる。培養物の成長は、従
来の方法により評価される。液体培養物が使用されるとき、成長の相違は、一般
に濁り度を観察かつ比較することにより測定され、この目的のために、５５０−
６５０ｎｍ例えば６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の読み取りがなされそして比
較される。顕微鏡も液体又は固体の培地の成長をモニターするために使用できる
。固体の培地では、成長はさらに肉眼による検査により評価できる。
【００２５】 この工程でのインキュベーションは、概して少なくとも３週間行われる。１週
間の間隔で、それぞれの培養物は１：５００−１：２０００好ましくは１：１０
００で新しい培養培地に希釈されて成長しつつある菌株を高める。３回目の添加
後、最初の環境上のサンプルはほとんど完全に希釈され、そして「高められた培
養物」中に存在するポジティブテスト生物は、硫黄の唯一の源としてＤＢＴで成
長できる。
間の間隔で、それぞれの培養物は１：５００−１：２０００好ましくは１：１０
００で新しい培養培地に希釈されて成長しつつある菌株を高める。３回目の添加
後、最初の環境上のサンプルはほとんど完全に希釈され、そして「高められた培
養物」中に存在するポジティブテスト生物は、硫黄の唯一の源としてＤＢＴで成
長できる。
【００２６】 高められた培養物は、標準の固体培養培地例えば栄養素又はトリプトンアガー
に画線され、そして数日間インキュベーションする。培地上に成長するいくらか
の個々のコロニーは、硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンで成長すると思
われる微生物の生物学的に純粋な培養菌を得るために、新しい栄養素アガー上に
再画線される。一般に、純粋な培養菌は、微生物の単一の純粋な培養菌からなる
。いくつかの場合には、生物の二つの菌株は、液体培養物中で共生的に成長し、
さらに固体培養培地上の両者の生物を含む単一のコロニーとして緊密に成長する
。純粋な培養菌ではないが、緊密に組合わさってしかも環境上のサンプルから純
粋にされて成長した生物のこれらの共同培養菌は、単一の菌株と同じか又はそれ
より有効にＤＢＴを代謝できる。上記の例は、ＤＢＴを代謝する栄養的なヘルパ
ー細菌を要するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ ＡＴＣＣ５３９６９
号である。
に画線され、そして数日間インキュベーションする。培地上に成長するいくらか
の個々のコロニーは、硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンで成長すると思
われる微生物の生物学的に純粋な培養菌を得るために、新しい栄養素アガー上に
再画線される。一般に、純粋な培養菌は、微生物の単一の純粋な培養菌からなる
。いくつかの場合には、生物の二つの菌株は、液体培養物中で共生的に成長し、
さらに固体培養培地上の両者の生物を含む単一のコロニーとして緊密に成長する
。純粋な培養菌ではないが、緊密に組合わさってしかも環境上のサンプルから純
粋にされて成長した生物のこれらの共同培養菌は、単一の菌株と同じか又はそれ
より有効にＤＢＴを代謝できる。上記の例は、ＤＢＴを代謝する栄養的なヘルパ
ー細菌を要するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ ＡＴＣＣ５３９６９
号である。
【００２７】 純粋にされた培養菌は、次にそれらの代謝的活性を特徴づけそして脱硫の可能
性を有するように思われる微生物を同定する一次スクリーニングでスクリーニン
グされる。一次スクリーニングでは、微生物はＤＢＴに成長し代謝するそれらの
能力についてテストされる。純粋な培養菌は、無機栄養素、硫黄を欠く同化可能
な炭素源及び硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンを含む培地にイノキュレ
ートされ、それによりサンプル培養を提供する。同時に、純粋な培養物は、同じ
無機栄養素及び炭素源を含むがジベンゾチオフェンを含まない対応する第二の培
地中にイノキュレートし、それによりコントロール培養を提供する。サンプルと
コントロールとの培養は、従来の方法例えば上記の濁り度測定又は顕微鏡により
評価される細菌の成長を測定するのに十分な時間及び条件でインキュベーション
される。成長は、硫黄の唯一の源としてＤＢＴを使用する培養菌の能力を示し確
認し、さらに培養菌が石油から硫黄を除く可能性のあるものであることを示す。
代表的なレベルは、有意な成長例えば１０９細胞／ｍＬを支持する。硫黄を含ま
ないイノキュレートされたフラスコは、比較の目的でコントロールとして使用さ
れる。
性を有するように思われる微生物を同定する一次スクリーニングでスクリーニン
グされる。一次スクリーニングでは、微生物はＤＢＴに成長し代謝するそれらの
能力についてテストされる。純粋な培養菌は、無機栄養素、硫黄を欠く同化可能
な炭素源及び硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンを含む培地にイノキュレ
ートされ、それによりサンプル培養を提供する。同時に、純粋な培養物は、同じ
無機栄養素及び炭素源を含むがジベンゾチオフェンを含まない対応する第二の培
地中にイノキュレートし、それによりコントロール培養を提供する。サンプルと
コントロールとの培養は、従来の方法例えば上記の濁り度測定又は顕微鏡により
評価される細菌の成長を測定するのに十分な時間及び条件でインキュベーション
される。成長は、硫黄の唯一の源としてＤＢＴを使用する培養菌の能力を示し確
認し、さらに培養菌が石油から硫黄を除く可能性のあるものであることを示す。
代表的なレベルは、有意な成長例えば１０９細胞／ｍＬを支持する。硫黄を含ま
ないイノキュレートされたフラスコは、比較の目的でコントロールとして使用さ
れる。
【００２８】 ＤＢＴ代謝の代謝生成物の同定は、従来の分析技術例えばクロマトグラフィー
、元素分析、質量分光測定又はこれらの組合せを使用して培養溶液で測定される
。分析の例は、以下に例示される。薄層クロマトグラフィーが、いくらかの態様
では好ましい。ジベンゾチオフェンで成長する培養菌からの培地が、例えば脱硫
された生成物例えばビフェニル又はヒドロキシビフェニルについて分析される。
培養菌は、もし代謝ＤＢＴ生成物がビフェニル又はヒドロキシビフェニルを含み
そして実質的即ち約５％より少ない好ましくは約１％より少ない炭素を含む他の
生成物を含まないならば、一次スクリーニングで定量的にポジティブと同定され
る。好ましいポジティブ培養物は、ジベンゾチオフェンの少なくとも約２０％の
脱硫化を示し、ビフェニル又はヒドロキシビフェニル代謝生成物のほとんどそれ
のみの生成を示す。一次スクリーニングでポジティブと同定される培養菌は、次
に化石燃料の脱硫を評価する二次スクリーニングで再スクリーニングされる。一
次スクリーニングからのポジティブ培養菌は、無機栄養素及び唯一の炭素及び硫
黄源として化石燃料を含む細菌培養培地中にイノキュレートされ；同じポジティ
ブ培養菌は同時に同じ細菌培養培地、同じ化石燃料及び硫黄を欠く第二の炭素源
を含む相応する第二の培養物中にイノキュレートされる。両者の培養物は、細菌
細胞の成長を観察するのに十分な時間及び条件でインキュベーションされ、唯一
の炭素源として化石燃料を含む培養物での成長の程度を、化石燃料及び第二の炭
素源を含む培養物の成長の程度と比較する。化石燃料から硫黄を選択的に除く微
生物は、化石燃料及び第二の炭素源の存在下培養物中の微生物の成長、並びに化
石燃料は存在するが第二の炭素源は存在しない条件でインキュベーションされる
対応する培養物の非成長を観察することにより、同定される。
、元素分析、質量分光測定又はこれらの組合せを使用して培養溶液で測定される
。分析の例は、以下に例示される。薄層クロマトグラフィーが、いくらかの態様
では好ましい。ジベンゾチオフェンで成長する培養菌からの培地が、例えば脱硫
された生成物例えばビフェニル又はヒドロキシビフェニルについて分析される。
培養菌は、もし代謝ＤＢＴ生成物がビフェニル又はヒドロキシビフェニルを含み
そして実質的即ち約５％より少ない好ましくは約１％より少ない炭素を含む他の
生成物を含まないならば、一次スクリーニングで定量的にポジティブと同定され
る。好ましいポジティブ培養物は、ジベンゾチオフェンの少なくとも約２０％の
脱硫化を示し、ビフェニル又はヒドロキシビフェニル代謝生成物のほとんどそれ
のみの生成を示す。一次スクリーニングでポジティブと同定される培養菌は、次
に化石燃料の脱硫を評価する二次スクリーニングで再スクリーニングされる。一
次スクリーニングからのポジティブ培養菌は、無機栄養素及び唯一の炭素及び硫
黄源として化石燃料を含む細菌培養培地中にイノキュレートされ；同じポジティ
ブ培養菌は同時に同じ細菌培養培地、同じ化石燃料及び硫黄を欠く第二の炭素源
を含む相応する第二の培養物中にイノキュレートされる。両者の培養物は、細菌
細胞の成長を観察するのに十分な時間及び条件でインキュベーションされ、唯一
の炭素源として化石燃料を含む培養物での成長の程度を、化石燃料及び第二の炭
素源を含む培養物の成長の程度と比較する。化石燃料から硫黄を選択的に除く微
生物は、化石燃料及び第二の炭素源の存在下培養物中の微生物の成長、並びに化
石燃料は存在するが第二の炭素源は存在しない条件でインキュベーションされる
対応する培養物の非成長を観察することにより、同定される。
【００２９】 本発明のスクリーニング法の明確な利点は、その簡単さである。プロトコール
は簡単である。多くのサンプルは、同時に処理できる。スクリーニングは、化石
燃料の脱硫に好適な脱硫能力を示す多数の微生物を生ずる。一つの特に有利な微
生物の培養菌は、実施例でＣＤＴ−４と表示され、そして１９９８年８月１０日
にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託された、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓと
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種との共同培養菌として同定された。ＣＤＴ−４ｂと
呼ばれるＣＤＴ−４のＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ成分も、１９９
８年８月１０日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託された。他の好ましい微生物は、上記
の予備スクリーニング及びスクリーニングの工程に従うことにより分離され、そ
してＣＤＴ−４及びＣＤＴ−４ｂに類似の生物学的脱硫の性質を示す。好ましい
菌株は、ＤＢＴ代謝の少なくとも５０％早い速度を示す。 本発明の分離されそして純粋な脱硫生物触媒は、多数の望ましい性質を示す。
菌株は、容易に培養され、そして通常の炭素源を補給された標準の培地で良好な
成長速度を示し、さらに燃料中の炭素を代謝することなく化石燃料を脱硫できる
。
は簡単である。多くのサンプルは、同時に処理できる。スクリーニングは、化石
燃料の脱硫に好適な脱硫能力を示す多数の微生物を生ずる。一つの特に有利な微
生物の培養菌は、実施例でＣＤＴ−４と表示され、そして１９９８年８月１０日
にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託された、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓと
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種との共同培養菌として同定された。ＣＤＴ−４ｂと
呼ばれるＣＤＴ−４のＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ成分も、１９９
８年８月１０日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託された。他の好ましい微生物は、上記
の予備スクリーニング及びスクリーニングの工程に従うことにより分離され、そ
してＣＤＴ−４及びＣＤＴ−４ｂに類似の生物学的脱硫の性質を示す。好ましい
菌株は、ＤＢＴ代謝の少なくとも５０％早い速度を示す。 本発明の分離されそして純粋な脱硫生物触媒は、多数の望ましい性質を示す。
菌株は、容易に培養され、そして通常の炭素源を補給された標準の培地で良好な
成長速度を示し、さらに燃料中の炭素を代謝することなく化石燃料を脱硫できる
。
【００３０】 この点に関し、本発明の生物触媒は、既に記述したいくらかのものより優れた
性質を示す。例えば、以下の実施例に詳述される、本発明の一つの新しい脱硫培
養物ＣＤＴ−４を、下述のように、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ
．５３９６８）に比較した（また実施例に記述される）。結果は、以下のように
要約できる。 ＣＤＴ−４ ＡＴＣＣ５３９６８
硫黄源としてＤＢＴを代謝 ＋ ＋ 炭素及びエネルギー源としてＤＢＴを代謝 − − ＤＢＴ代謝の相対速度 １．９ １．０ 硫黄源として留出燃料油を代謝 ＋ ＋ 留出燃料油を脱硫 ＋ ＋ 炭素及びエネルギー源として留出燃料油を代謝 − ＋ Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓは、炭素の源として留出物を代謝したが、本発明
の生物触媒はそうではなかった。従って、留出物の脱硫では、ＣＤＴ−４は優れ
ている。
性質を示す。例えば、以下の実施例に詳述される、本発明の一つの新しい脱硫培
養物ＣＤＴ−４を、下述のように、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ
．５３９６８）に比較した（また実施例に記述される）。結果は、以下のように
要約できる。 ＣＤＴ−４ ＡＴＣＣ５３９６８
硫黄源としてＤＢＴを代謝 ＋ ＋ 炭素及びエネルギー源としてＤＢＴを代謝 − − ＤＢＴ代謝の相対速度 １．９ １．０ 硫黄源として留出燃料油を代謝 ＋ ＋ 留出燃料油を脱硫 ＋ ＋ 炭素及びエネルギー源として留出燃料油を代謝 − ＋ Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓは、炭素の源として留出物を代謝したが、本発明
の生物触媒はそうではなかった。従って、留出物の脱硫では、ＣＤＴ−４は優れ
ている。
【００３１】 硫黄は、燃料から硫黄の少なくとも一部を除く時間及び条件で、本発明のＣＤ
Ｔ−４、ＣＤＴ−４ｂ又は他の微生物とそれらを接触させることにより硫黄を含
む化石燃料から除去される。概して、これは、硫黄の少なくとも一部が除去され
る時間及び条件下でミネラル栄養素と硫黄を欠く同化可能な炭素源とを含む培地
中で本発明のＣＤＴ−４、ＣＤＴ−４ｂ又は他の微生物の培養物と化石燃料特に
液体化石燃料をインキュベーションすることを含む。培地及びインキュベーショ
ンの条件の例は、上記のスクリーニングについて記述されたものである。好まし
い態様では、硫黄の少なくとも約２０％が除かれる。
Ｔ−４、ＣＤＴ−４ｂ又は他の微生物とそれらを接触させることにより硫黄を含
む化石燃料から除去される。概して、これは、硫黄の少なくとも一部が除去され
る時間及び条件下でミネラル栄養素と硫黄を欠く同化可能な炭素源とを含む培地
中で本発明のＣＤＴ−４、ＣＤＴ−４ｂ又は他の微生物の培養物と化石燃料特に
液体化石燃料をインキュベーションすることを含む。培地及びインキュベーショ
ンの条件の例は、上記のスクリーニングについて記述されたものである。好まし
い態様では、硫黄の少なくとも約２０％が除かれる。
【００３２】 本発明の脱硫生物触媒は、化石燃料を処理するのに単独で、又は他の例えば従
来周知の生物触媒との組合せ及び／又は他の方法との組合せで使用できる。本発
明の方法とともに使用できる他の方法の例は、米国特許第５４６８６２６号でＪ
ｏｈｎｓｏｎらにより記述されたもののような硫黄化合物の分離、そして上記の
米国特許第５２３２８５４号においてＭｏｎｔｉｃｅｌｌｏにより記述された水
素化脱硫及び生物改善（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）を含むが、それらに制
限されない。方法が他の脱硫法を使用して除くことができない抵抗性のある硫黄
を除くのに有用であることが本発明の利点である。 以下の実施例は、本発明をさらに説明するのに提供され、決して本発明を制限
するものとしてはならない。
来周知の生物触媒との組合せ及び／又は他の方法との組合せで使用できる。本発
明の方法とともに使用できる他の方法の例は、米国特許第５４６８６２６号でＪ
ｏｈｎｓｏｎらにより記述されたもののような硫黄化合物の分離、そして上記の
米国特許第５２３２８５４号においてＭｏｎｔｉｃｅｌｌｏにより記述された水
素化脱硫及び生物改善（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）を含むが、それらに制
限されない。方法が他の脱硫法を使用して除くことができない抵抗性のある硫黄
を除くのに有用であることが本発明の利点である。 以下の実施例は、本発明をさらに説明するのに提供され、決して本発明を制限
するものとしてはならない。
【００３３】
【実施例】 実施例 １ 硫黄の唯一の源としてＤＢＴで成長した高められた微生物培養菌を、本実施例
で精油所ランドの貯油設備の土壌から分離した。下記のように、Ｇｉｂｂｓ試薬
による定性テストは、すべての培養溶液中のフェノールの存在を示した。 生物及び培養条件。Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ菌株ＩＧＴＳ８は、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ５３９
６８）から得られ、栄養素アガーに維持した。他の菌株は、Ｂｉｌｌｉｎｇｓ、
Ｍｏｎｔａｎａの付近の石油ランドの貯油設備から得られた土壌のサンプルから
得た。土壌を、硫黄の唯一の添加された源としてＤＢＴを含む基礎塩培地（Ｏｌ
ｓｏｎら、１９９３）中にイノキュレートした。基礎塩培地（ＢＳＭ）は、硫黄
及び炭素及びエネルギーの源を欠き、Ｋ２ＨＰＯ４、４．０；ＮａＨ２ＰＯ４・
Ｈ２Ｏ、４．６；ＮＨ４Ｃｌ、２．０；ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ、０．２；ＣａＣｌ ２ ・２Ｈ２Ｏ、０．００１及びＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．００１（蒸留水１Ｌ
当たりｇ）からなった。培地は、１５分間１２１℃でオートクレーブにかけるこ
とにより滅菌した。燐酸塩を別にオートクレーブにかけ、冷えてから残りの培地
と合わせた。培地のｐＨは６．５であった。ＤＢＴを、エタノール中１００ｍＭ
ストック溶液から０．２ｍＭの最終濃度で加えた。グリセロールを炭素及びエネ
ルギーの源として使用した。それは、滅菌２０％溶液から０．２％の最終濃度で
添加された。
で精油所ランドの貯油設備の土壌から分離した。下記のように、Ｇｉｂｂｓ試薬
による定性テストは、すべての培養溶液中のフェノールの存在を示した。 生物及び培養条件。Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ菌株ＩＧＴＳ８は、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ５３９
６８）から得られ、栄養素アガーに維持した。他の菌株は、Ｂｉｌｌｉｎｇｓ、
Ｍｏｎｔａｎａの付近の石油ランドの貯油設備から得られた土壌のサンプルから
得た。土壌を、硫黄の唯一の添加された源としてＤＢＴを含む基礎塩培地（Ｏｌ
ｓｏｎら、１９９３）中にイノキュレートした。基礎塩培地（ＢＳＭ）は、硫黄
及び炭素及びエネルギーの源を欠き、Ｋ２ＨＰＯ４、４．０；ＮａＨ２ＰＯ４・
Ｈ２Ｏ、４．６；ＮＨ４Ｃｌ、２．０；ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ、０．２；ＣａＣｌ ２ ・２Ｈ２Ｏ、０．００１及びＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．００１（蒸留水１Ｌ
当たりｇ）からなった。培地は、１５分間１２１℃でオートクレーブにかけるこ
とにより滅菌した。燐酸塩を別にオートクレーブにかけ、冷えてから残りの培地
と合わせた。培地のｐＨは６．５であった。ＤＢＴを、エタノール中１００ｍＭ
ストック溶液から０．２ｍＭの最終濃度で加えた。グリセロールを炭素及びエネ
ルギーの源として使用した。それは、滅菌２０％溶液から０．２％の最終濃度で
添加された。
【００３４】 土壌サンプル（０．５ｇ）を、グリセロール（０．２％）とＤＢＴ（０．２ｍ
Ｍ）を補給された基礎塩培地５０ｍＬを含む１２５ｍＬ容エルレンマイヤーフラ
スコ中にイノキュレートした。２５℃の１２日間のインキュベーション後、０．
１ｍＬを５０ｍＬの新しい培地中に移した。この工程を１０日の間隔でさらに２
回繰り返した。４回の連続したサブ培養後、最初の土壌の硫黄は殆ど排除され、
そして培養物に成長する細胞は、ＤＢＴからそれらの成長の必要条件として硫黄
をもっぱら得つつあるようになった。高められた培養物は、栄養素アガー上に画
線し、２−３日後、異なる外観のいくつかのコロニーを、新しい栄養素アガープ
レート上に２回再画線した。分離したものを栄養素アガースラントに移し、そし
て追加のテストをこれらの９つの分離物で行った。
Ｍ）を補給された基礎塩培地５０ｍＬを含む１２５ｍＬ容エルレンマイヤーフラ
スコ中にイノキュレートした。２５℃の１２日間のインキュベーション後、０．
１ｍＬを５０ｍＬの新しい培地中に移した。この工程を１０日の間隔でさらに２
回繰り返した。４回の連続したサブ培養後、最初の土壌の硫黄は殆ど排除され、
そして培養物に成長する細胞は、ＤＢＴからそれらの成長の必要条件として硫黄
をもっぱら得つつあるようになった。高められた培養物は、栄養素アガー上に画
線し、２−３日後、異なる外観のいくつかのコロニーを、新しい栄養素アガープ
レート上に２回再画線した。分離したものを栄養素アガースラントに移し、そし
て追加のテストをこれらの９つの分離物で行った。
【００３５】 化学的分析。Ｇｉｂｂｓ試薬（２、６−ジクロロキノン−４−クロロイミド、
Ｓｉｇｍａ）を使用して、培養溶液中のフェノール性化合物の生成を測定した（
Ｋｉｂａｎｅ及びＢｉｅｌａｇａ、１９９１）。試薬を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で
エタノール中で調製した。アッセイは、０．１６ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）炭酸ナ
トリウムを５．０ｍＬの遠心分離した（４０００×ｇ、１０分間）培養培地に添
加し、次に０．０５ｍＬのＧｉｂｂｓ試薬を加えた。青色がフェノールの存在で
生じた。６１０ｎｍでの溶液の吸収を３０分後に測定した。較正曲線を真正２−
フェニルフェノール（２−ヒドロキシビフェニル、Ａｌｄｒｉｃｈ）から作成し
た。
Ｓｉｇｍａ）を使用して、培養溶液中のフェノール性化合物の生成を測定した（
Ｋｉｂａｎｅ及びＢｉｅｌａｇａ、１９９１）。試薬を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で
エタノール中で調製した。アッセイは、０．１６ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）炭酸ナ
トリウムを５．０ｍＬの遠心分離した（４０００×ｇ、１０分間）培養培地に添
加し、次に０．０５ｍＬのＧｉｂｂｓ試薬を加えた。青色がフェノールの存在で
生じた。６１０ｎｍでの溶液の吸収を３０分後に測定した。較正曲線を真正２−
フェニルフェノール（２−ヒドロキシビフェニル、Ａｌｄｒｉｃｈ）から作成し
た。
【００３６】 層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用して、培養溶液中のＤＢＴ代謝の生成
物をさらに同定した。遠心分離した培養溶液（２０ｍＬ）を６Ｍ ＨＣｌ（０．
５ｍＬ）により酸性にし、２ｍＬずつのクロロホルムにより２回抽出した。抽出
物を合わせ、蒸発させて約０．２ｍＬにした。１０−１５μＬの部分を、２０分
間１２０℃で予め加熱したシリカゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０）ＴＬＣプレ
ートにスポットした。真正のＤＢＴ、２−ヒドロキシビフェニル（２ｍｇ／ｍＬ
）及び２、２−ビフェノール（ジヒドロキシビフェニル、Ａｌｄｒｉｃｈ、４ｍ
ｇ／ｍＬ）をクロロホルム中で調製し、参考として適用した（１０μＬ）。ＴＬ
Ｃプレートを、移動相としてクロロホルムを含むタンク中に置いた。風乾後、Ｔ
ＬＣプレートを短波ＵＶ光の下調べた。 硫酸塩は、濁り度により測定され、次に塩化バリウムにより処理した（ＡＳＴ
Ｍ、１９８９）。この技術の検出限界は、１−２ｍｇ／Ｌの硫酸塩（０．０１−
０．０２ｍＭ）である。
物をさらに同定した。遠心分離した培養溶液（２０ｍＬ）を６Ｍ ＨＣｌ（０．
５ｍＬ）により酸性にし、２ｍＬずつのクロロホルムにより２回抽出した。抽出
物を合わせ、蒸発させて約０．２ｍＬにした。１０−１５μＬの部分を、２０分
間１２０℃で予め加熱したシリカゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０）ＴＬＣプレ
ートにスポットした。真正のＤＢＴ、２−ヒドロキシビフェニル（２ｍｇ／ｍＬ
）及び２、２−ビフェノール（ジヒドロキシビフェニル、Ａｌｄｒｉｃｈ、４ｍ
ｇ／ｍＬ）をクロロホルム中で調製し、参考として適用した（１０μＬ）。ＴＬ
Ｃプレートを、移動相としてクロロホルムを含むタンク中に置いた。風乾後、Ｔ
ＬＣプレートを短波ＵＶ光の下調べた。 硫酸塩は、濁り度により測定され、次に塩化バリウムにより処理した（ＡＳＴ
Ｍ、１９８９）。この技術の検出限界は、１−２ｍｇ／Ｌの硫酸塩（０．０１−
０．０２ｍＭ）である。
【００３７】 実施例 ２ 硫黄の唯一の源としてＤＢＴを利用すると実施例１で同定された細菌の培養物
を、この実施例で留出燃料油の脱硫についてさらにスクリーニングした。 留出燃料油によるテスト。０．３３％の硫黄を含むと証明されたＮｏ．２留出
燃料油を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ
ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た（ＮＩＳＴ標準参照物質１６２４ｂ）
。油の１．０−２．０ｍＬの部分を、１Ｌ容栓つきガラス瓶で０．２％グリセロ
ールを含むＢＳＭ５０ｍＬ（以下のテスト１）又は１Ｌ（以下の残りのテスト）
に加えた。瓶に、グリセロールとＤＢＴをプラスしたＢＳＭから活発に成長して
いる細胞をイノキュレートした。インキュベーションは、旋回振盪器上で１００
ｒｐｍで緩やかな撹拌で２５℃であった。コントロールテストは、イノキュレー
トしないままであった。
を、この実施例で留出燃料油の脱硫についてさらにスクリーニングした。 留出燃料油によるテスト。０．３３％の硫黄を含むと証明されたＮｏ．２留出
燃料油を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ
ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た（ＮＩＳＴ標準参照物質１６２４ｂ）
。油の１．０−２．０ｍＬの部分を、１Ｌ容栓つきガラス瓶で０．２％グリセロ
ールを含むＢＳＭ５０ｍＬ（以下のテスト１）又は１Ｌ（以下の残りのテスト）
に加えた。瓶に、グリセロールとＤＢＴをプラスしたＢＳＭから活発に成長して
いる細胞をイノキュレートした。インキュベーションは、旋回振盪器上で１００
ｒｐｍで緩やかな撹拌で２５℃であった。コントロールテストは、イノキュレー
トしないままであった。
【００３８】 石油生物脱硫のいくつかのテストを行った。一次テストは、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃ
ｈｒｏｕｓ ＩＧＴＳ８による留出物の一つだけのステージの５日間の処理を含
んだ。３種類のイノキュレートされたそしてイノキュレートされていないフラス
コをテストした。生物処理後、燃料油をピペットにより回収した。油のいくらか
は、培養培地とエマルションを形成し、そして油を十分に回収するために、１０
分間１０００×ｇでの遠心分離によりエマルションを破壊することが必要になる
だろう。残りのテストを、培養物ＣＤＴ−４により行い、２工程で行われた。テ
ストは、ＢＳＭ、グリセロール及びＤＢＴで成長した細胞０．０５ｍＬをイノキ
ュレートして１０５細胞／ｍＬの最初の濃度にした。１０−１４日間の最初の工
程での反応後、８００−９００ｍＬの培養溶液を取り出し（油は残ったまま）、
新しい培養培地を留出物を含む残りの培養物に添加して留出物の２工程の処理を
行った。
ｈｒｏｕｓ ＩＧＴＳ８による留出物の一つだけのステージの５日間の処理を含
んだ。３種類のイノキュレートされたそしてイノキュレートされていないフラス
コをテストした。生物処理後、燃料油をピペットにより回収した。油のいくらか
は、培養培地とエマルションを形成し、そして油を十分に回収するために、１０
分間１０００×ｇでの遠心分離によりエマルションを破壊することが必要になる
だろう。残りのテストを、培養物ＣＤＴ−４により行い、２工程で行われた。テ
ストは、ＢＳＭ、グリセロール及びＤＢＴで成長した細胞０．０５ｍＬをイノキ
ュレートして１０５細胞／ｍＬの最初の濃度にした。１０−１４日間の最初の工
程での反応後、８００−９００ｍＬの培養溶液を取り出し（油は残ったまま）、
新しい培養培地を留出物を含む残りの培養物に添加して留出物の２工程の処理を
行った。
【００３９】 回収した留出物を元素分析のためにＨｕｆｆｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、ＣＯに付託した。さらに、サンプルの一部を、Ｐｉｔｔｓｂ
ｕｒｇｈ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒで低電圧高分解
能質量分光測定（ＨＲＭＳ）により分析した。ＨＲＭＳは、化石燃料に存在する
官能基及び全硫黄のデータをもたらす。 細菌の培養。上記の実施例１に記載された高められた培養物から得られた８種
の細菌培養菌を、それらがまた唯一の硫黄の源として留出燃料油中の硫黄を代謝
するかどうかを知るためにテストした（以下の表１）。Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏ
ｕｓ ＡＴＣＣ５３９６８（ＩＧＴＳ８）を、比較の目的のために含んだ。生物
のどれも、基礎培地のみ又は基礎培地プラスグリセロールで成長しなかった。も
しＤＢＴ及びグリセロールが基礎培地に添加されたならば、すべての培養菌の成
長が生じた。もしグリセロールと留出燃料油を基礎培地に添加したならば、すべ
ての培養菌が成長した。これらの結果は、すべての培養菌が、留出燃料油からそ
してＤＢＴから成長のために硫黄を得ることができることを示した。
ｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、ＣＯに付託した。さらに、サンプルの一部を、Ｐｉｔｔｓｂ
ｕｒｇｈ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒで低電圧高分解
能質量分光測定（ＨＲＭＳ）により分析した。ＨＲＭＳは、化石燃料に存在する
官能基及び全硫黄のデータをもたらす。 細菌の培養。上記の実施例１に記載された高められた培養物から得られた８種
の細菌培養菌を、それらがまた唯一の硫黄の源として留出燃料油中の硫黄を代謝
するかどうかを知るためにテストした（以下の表１）。Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏ
ｕｓ ＡＴＣＣ５３９６８（ＩＧＴＳ８）を、比較の目的のために含んだ。生物
のどれも、基礎培地のみ又は基礎培地プラスグリセロールで成長しなかった。も
しＤＢＴ及びグリセロールが基礎培地に添加されたならば、すべての培養菌の成
長が生じた。もしグリセロールと留出燃料油を基礎培地に添加したならば、すべ
ての培養菌が成長した。これらの結果は、すべての培養菌が、留出燃料油からそ
してＤＢＴから成長のために硫黄を得ることができることを示した。
【００４０】
【表１】
【００４１】 （＋）は２週間のインキュベーション後の成長を示し、（−）は成長しなかった
ことを示す。 追加のテストは、留出燃料油のみが基礎培地に添加されたとき、９種の培養菌
中４種（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓを含む）が成長したことを示した。これは
、これらが硫黄、炭素及びエネルギーの唯一の源として留出燃料油を代謝するこ
とを示す。従って、留出燃料の炭化水素の一部が代謝された。５種の培養菌は、
基礎塩培地プラス留出燃料油で成長することができなかった。これは、これらの
生物が留出燃料油を代謝できなかったことを示す。これらの５種の培養菌は、さ
らなるテストのための候補であった。
ことを示す。 追加のテストは、留出燃料油のみが基礎培地に添加されたとき、９種の培養菌
中４種（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓを含む）が成長したことを示した。これは
、これらが硫黄、炭素及びエネルギーの唯一の源として留出燃料油を代謝するこ
とを示す。従って、留出燃料の炭化水素の一部が代謝された。５種の培養菌は、
基礎塩培地プラス留出燃料油で成長することができなかった。これは、これらの
生物が留出燃料油を代謝できなかったことを示す。これらの５種の培養菌は、さ
らなるテストのための候補であった。
【００４２】 ＤＢＴ代謝の生成物。ＤＢＴから２−ヒドロキシビフェニルを形成するＲ．ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓの能力を確認した。ＢＳＭプラスグリセロール（０．２％
）及びＤＢＴ（０．２ｍＭ）での振盪フラスコ中の生物の成長の３日後、Ｇｉｂ
ｂｓアッセイにより測定される２−ヒドロキシビフェニルの濃度は、０．０４ｍ
Ｍであり、ＤＢＴの２０％転換に相当した。培養抽出物の薄層クロマトグラフィ
ーは、ＤＢＴ及びモノヒドロキシビフェニルとまったく同一のＲｆを有するスポ
ットを示した（表２）。イノキュレートされていないコントロールは、ＤＢＴに
相当する単一のスポットを示した。真正の２−ヒドロキシビフェニル及びジヒド
ロキシビフェニルは、培養物の抽出物中に加えられそしてクロマトグラフィーに
かけられたとき、２−ヒドロキシビフェニルに相当するスポットは明らかになり
、そしてジフェニルビフェニルに相当する新しいスポットが生じた。
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓの能力を確認した。ＢＳＭプラスグリセロール（０．２％
）及びＤＢＴ（０．２ｍＭ）での振盪フラスコ中の生物の成長の３日後、Ｇｉｂ
ｂｓアッセイにより測定される２−ヒドロキシビフェニルの濃度は、０．０４ｍ
Ｍであり、ＤＢＴの２０％転換に相当した。培養抽出物の薄層クロマトグラフィ
ーは、ＤＢＴ及びモノヒドロキシビフェニルとまったく同一のＲｆを有するスポ
ットを示した（表２）。イノキュレートされていないコントロールは、ＤＢＴに
相当する単一のスポットを示した。真正の２−ヒドロキシビフェニル及びジヒド
ロキシビフェニルは、培養物の抽出物中に加えられそしてクロマトグラフィーに
かけられたとき、２−ヒドロキシビフェニルに相当するスポットは明らかになり
、そしてジフェニルビフェニルに相当する新しいスポットが生じた。
【００４３】
【表２】
【００４４】１ クロロホルム中の真正のＤＢＴ、ＭＨＢ、ＤＨＢのそれぞれ１０μＬを添加さ
れた抽出物 Ｇｉｂｂｓの試薬により示されるようにグリセロールとＤＢＴとを加えた基礎
塩で成長したとき、８種の土壌培養菌もフェノール性化合物を生成した。ＴＬＣ
による追加のテストは、培養菌が唯一の検出可能な生成物として２−ヒドロキシ
ビフェニルを生成したことを示した（表２）。この生成物は、ＤＢＴを含むイノ
キュレートされていない溶液では検出されなかった。硫酸塩は、培養溶液に検出
されず、又は硫化水素の匂いも検出されなかった。これらの結果は、８種の培養
菌がおそらくＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓに類似の経路によりＤＢＴを代謝する
ことを示す。 成長の動力学及びＤＢＴの転換は、８種の培養菌及びＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏ
ｕｓについてテストされた。６４時間成長後、菌株ＣＤＴ−４は、最高の濁り度
に成長し、そしてＧｉｂｂｓのアッセイにより測定されるように、多量のフェノ
ール性物質を生成した（表３）。
れた抽出物 Ｇｉｂｂｓの試薬により示されるようにグリセロールとＤＢＴとを加えた基礎
塩で成長したとき、８種の土壌培養菌もフェノール性化合物を生成した。ＴＬＣ
による追加のテストは、培養菌が唯一の検出可能な生成物として２−ヒドロキシ
ビフェニルを生成したことを示した（表２）。この生成物は、ＤＢＴを含むイノ
キュレートされていない溶液では検出されなかった。硫酸塩は、培養溶液に検出
されず、又は硫化水素の匂いも検出されなかった。これらの結果は、８種の培養
菌がおそらくＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓに類似の経路によりＤＢＴを代謝する
ことを示す。 成長の動力学及びＤＢＴの転換は、８種の培養菌及びＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏ
ｕｓについてテストされた。６４時間成長後、菌株ＣＤＴ−４は、最高の濁り度
に成長し、そしてＧｉｂｂｓのアッセイにより測定されるように、多量のフェノ
ール性物質を生成した（表３）。
【００４５】
【表３】
【００４６】１ ３０℃、１８０ｒｐｍで６４時間０．２ｍＭ ＤＢＴと０．２％グリセロール
とを含む２５０ｍＬ容エルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬのＢＳＭ中で成長
した細胞。フェノール性生成物へのＤＢＴ転換は、Ｇｉｂｂｓの試薬を使用して
比色定量で定量した。 ＣＤＴ−４を、留出燃料油について追加のテストで選択した。この培養菌は、
２種の細菌の菌株の混合物である。一つは、グリセロールと硫酸塩とを含むＢＳ
Ｍで成長するとき、単一又は組で生ずるグラム陰性の運動性の桿菌であり、そし
て膜脂肪酸分析によりＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種として同定される。他の培養
物は、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓとして同様に同定された。それ
は、非運動性の不規則なグラム陽性の桿菌であり、ときにはＶ字形又は枝分かれ
する形態で生ずる。
とを含む２５０ｍＬ容エルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬのＢＳＭ中で成長
した細胞。フェノール性生成物へのＤＢＴ転換は、Ｇｉｂｂｓの試薬を使用して
比色定量で定量した。 ＣＤＴ−４を、留出燃料油について追加のテストで選択した。この培養菌は、
２種の細菌の菌株の混合物である。一つは、グリセロールと硫酸塩とを含むＢＳ
Ｍで成長するとき、単一又は組で生ずるグラム陰性の運動性の桿菌であり、そし
て膜脂肪酸分析によりＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種として同定される。他の培養
物は、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓとして同様に同定された。それ
は、非運動性の不規則なグラム陽性の桿菌であり、ときにはＶ字形又は枝分かれ
する形態で生ずる。
【００４７】 ＣＤＴ−４培養菌のＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ成分（ＣＤＴ−
４ｂ）のみがＤＢＴを代謝した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種は、硫黄の唯一の
源としてＤＢＴに成長せず、そしてＧｉｂｂｓのアッセイにより測定されるよう
にＤＢＴからフェノール性化合物を形成しなかった。Ｎｏｃａｒｄｉａの種は、
ＤＢＴを代謝するのにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の存在を要しなかった。Ｇｉｂ
ｂｓのアッセイによるテストは、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓが２
７℃では２１℃でおいてよりも約２倍早くＤＢＴを代謝したことを示した。ＤＢ
Ｔは、３５℃で生物により代謝されなかった。以下に示されるように、Ｎｏｃａ
ｒｄｉａの種は、またＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種の不存在下ディーゼル燃料か
ら硫黄を除いた。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種は、Ｎｏｃａｒｄｉａの生物をＤＢ
Ｔの代謝又はディーゼル燃料の脱硫について必要としないが、共同培養菌中の生
物は、培養溶液から硫酸塩をスカベンジできる。培養培地中の硫酸塩は、Ｎｏｃ
ａｒｄｉａ種によるＤＢＴの代謝を抑える。その結果、より早く成長するＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ菌株による硫酸塩のスカベンジングは、ラグ時間を短縮できる
か、又は培養溶液中の硫酸塩の蓄積を防ぎ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉ
ｄｅｓによるＤＢＴのさらに能率的な分解を導く。
４ｂ）のみがＤＢＴを代謝した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種は、硫黄の唯一の
源としてＤＢＴに成長せず、そしてＧｉｂｂｓのアッセイにより測定されるよう
にＤＢＴからフェノール性化合物を形成しなかった。Ｎｏｃａｒｄｉａの種は、
ＤＢＴを代謝するのにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の存在を要しなかった。Ｇｉｂ
ｂｓのアッセイによるテストは、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓが２
７℃では２１℃でおいてよりも約２倍早くＤＢＴを代謝したことを示した。ＤＢ
Ｔは、３５℃で生物により代謝されなかった。以下に示されるように、Ｎｏｃａ
ｒｄｉａの種は、またＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種の不存在下ディーゼル燃料か
ら硫黄を除いた。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種は、Ｎｏｃａｒｄｉａの生物をＤＢ
Ｔの代謝又はディーゼル燃料の脱硫について必要としないが、共同培養菌中の生
物は、培養溶液から硫酸塩をスカベンジできる。培養培地中の硫酸塩は、Ｎｏｃ
ａｒｄｉａ種によるＤＢＴの代謝を抑える。その結果、より早く成長するＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ菌株による硫酸塩のスカベンジングは、ラグ時間を短縮できる
か、又は培養溶液中の硫酸塩の蓄積を防ぎ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉ
ｄｅｓによるＤＢＴのさらに能率的な分解を導く。
【００４８】 留出燃料油によるテスト。 最初の生物脱硫のテストは、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＩＧＴＳ８を含む
培養溶液５０ｍＬで行われた。元素分析は、生物による留出燃料油の脱硫を示唆
した（表４、テスト１；表５）。しかし、この生物によるより高いレベルの生物
脱硫を達成する次の試みは、不成功であった。これらのテストは、より長い時間
より多い（１Ｌ）体積の培養培地で留出物の２工程処理を使用した。これらのテ
ストで形成したエマルションから油を回収することはできなかった。この生物は
、炭素とエネルギーとの唯一の源として留出物で成長できるため、燃料油の生物
脱硫を進めることができる。この方法は、少量（５０ｍＬ）の体積での最初の短
期のテストでは明白ではなかったことであろう。
培養溶液５０ｍＬで行われた。元素分析は、生物による留出燃料油の脱硫を示唆
した（表４、テスト１；表５）。しかし、この生物によるより高いレベルの生物
脱硫を達成する次の試みは、不成功であった。これらのテストは、より長い時間
より多い（１Ｌ）体積の培養培地で留出物の２工程処理を使用した。これらのテ
ストで形成したエマルションから油を回収することはできなかった。この生物は
、炭素とエネルギーとの唯一の源として留出物で成長できるため、燃料油の生物
脱硫を進めることができる。この方法は、少量（５０ｍＬ）の体積での最初の短
期のテストでは明白ではなかったことであろう。
【００４９】 留出燃料油の脱硫のテストは、ＤＢＴで最も良く成長した２種の培養菌、ＣＤ
Ｔ−１及びＣＤＴ−４により行われた（表４、テスト２）。元素分析は、ＣＤＴ
−４が留出燃料油から硫黄を除いたがＣＤＴ−１はそうではなかった証拠をもた
らした。これらのテストでは、ＣＤＴ−４はＣＤＴ−１より遥かに良く成長し、
それぞれ一次及び二次の工程の処理後１．６及び１．１×１０８／ｍＬの細胞密
度に達した。ＣＤＴ−１は、処理の両方の工程の終わりで４．０×１０７細胞／
ｍＬの細胞密度に達した。
Ｔ−１及びＣＤＴ−４により行われた（表４、テスト２）。元素分析は、ＣＤＴ
−４が留出燃料油から硫黄を除いたがＣＤＴ−１はそうではなかった証拠をもた
らした。これらのテストでは、ＣＤＴ−４はＣＤＴ−１より遥かに良く成長し、
それぞれ一次及び二次の工程の処理後１．６及び１．１×１０８／ｍＬの細胞密
度に達した。ＣＤＴ−１は、処理の両方の工程の終わりで４．０×１０７細胞／
ｍＬの細胞密度に達した。
【００５０】 菌株ＣＤＴ−４による他のテスト（表４、テスト３）は、油の生物脱硫の証拠
をさらに提供した。しかし、コントロールフラスコの一つから回収された油の硫
黄含量は、どういうわけか低かった。このテストでは、ＣＤＴ−４は、６日間の
倍増した時間によりＢＳＭ、グリセロール及び油で成長し、一次工程の処理後９
×１０７細胞の細胞密度に達し、そして二次工程の処理後７×１０７細胞／ｍＬ
に達した。対応する細胞バイオマスの収量は、２８及び２６ｍｇの乾燥細胞であ
った。ＣＤＴ−４バイオマスの硫黄含量は知られていない。しかし、もしそれが
、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉバイオマス（Ｂａｉｌｅｙ、Ｊ．Ｅ．及び
Ｏｌｌｉｓ、Ｄ．Ｆ．１９７７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
により報告）におけるように１％であるならば、ＣＤＴ−４細胞のこの収量は、
油中の硫黄の質量の１５％を除いたことになるだろう。
をさらに提供した。しかし、コントロールフラスコの一つから回収された油の硫
黄含量は、どういうわけか低かった。このテストでは、ＣＤＴ−４は、６日間の
倍増した時間によりＢＳＭ、グリセロール及び油で成長し、一次工程の処理後９
×１０７細胞の細胞密度に達し、そして二次工程の処理後７×１０７細胞／ｍＬ
に達した。対応する細胞バイオマスの収量は、２８及び２６ｍｇの乾燥細胞であ
った。ＣＤＴ−４バイオマスの硫黄含量は知られていない。しかし、もしそれが
、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉバイオマス（Ｂａｉｌｅｙ、Ｊ．Ｅ．及び
Ｏｌｌｉｓ、Ｄ．Ｆ．１９７７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
により報告）におけるように１％であるならば、ＣＤＴ−４細胞のこの収量は、
油中の硫黄の質量の１５％を除いたことになるだろう。
【００５１】
【表４】
【００５２】 ４番目のテストも、回収された油の元素分析により測定されるＣＤＴ−４（表
４）による留出燃料油の脱硫の証拠を提出した。低電圧高分解能質量分光分析に
よる回収された油のさらなる測定は、生物処理された油中の硫黄の損失を確認し
、さらに芳香族硫黄は生物触媒により留出物から除かれつつある（表５）。
４）による留出燃料油の脱硫の証拠を提出した。低電圧高分解能質量分光分析に
よる回収された油のさらなる測定は、生物処理された油中の硫黄の損失を確認し
、さらに芳香族硫黄は生物触媒により留出物から除かれつつある（表５）。
【００５３】
【表５】
【００５４】 ％ＢＴ：アルキルベンゾチオフェンと組合わさった全イオン強度の％；％ＤＢＴ
：アルキルジベンゾチオフェンと組合わさった全イオン強度％；％Ｓ：重量％Ｓ
。ＢＴとＤＢＴとのフラクションは、留出物中の硫黄の大多数を占める。標準と
して２−ヒドロキシビフェニル。 元素分析は、すべての回収された油中の１００％に近かった（表６）。生物処
理後の燃料油の回収は、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓによる短期のテストでは８
５％であったが、ＣＤＴ−４による長期の２状態テストでは約７０％に過ぎない
（表５）。油の回収は、コントロール及びイノキュレートされたフラスコで同様
であり、不完全な油の回収がおそらく細胞の代謝の存在によるものではないこと
を示した。水中の非常に細かい分散した油は、回収を避けることになったであろ
う。
：アルキルジベンゾチオフェンと組合わさった全イオン強度％；％Ｓ：重量％Ｓ
。ＢＴとＤＢＴとのフラクションは、留出物中の硫黄の大多数を占める。標準と
して２−ヒドロキシビフェニル。 元素分析は、すべての回収された油中の１００％に近かった（表６）。生物処
理後の燃料油の回収は、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓによる短期のテストでは８
５％であったが、ＣＤＴ−４による長期の２状態テストでは約７０％に過ぎない
（表５）。油の回収は、コントロール及びイノキュレートされたフラスコで同様
であり、不完全な油の回収がおそらく細胞の代謝の存在によるものではないこと
を示した。水中の非常に細かい分散した油は、回収を避けることになったであろ
う。
【００５５】
【表６】
【００５６】１ かっこ（）の３種類のフラスコの標準偏差。２ 示された２種類のフラスコの結果。 テストは、ＣＤＴ−４のＮｏｃａｒｄｉａ成分のみがディーゼル燃料から硫黄
を除けるかどうかを決めるためにもなされた。これらのテストでは、ＮＩＳＴ
ＳＲＭ２７２４ａ即ち０．０４３％のＳを含むと証明されているディーゼル燃料
を、テスト基質として使用した。表７と８とに示された結果は、Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ（ＣＤＴ−４ｂ）のみによるディーゼル燃料の処理が
ディーゼル燃料から有意の量の硫黄を除く証拠をもたらす。
を除けるかどうかを決めるためにもなされた。これらのテストでは、ＮＩＳＴ
ＳＲＭ２７２４ａ即ち０．０４３％のＳを含むと証明されているディーゼル燃料
を、テスト基質として使用した。表７と８とに示された結果は、Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ（ＣＤＴ−４ｂ）のみによるディーゼル燃料の処理が
ディーゼル燃料から有意の量の硫黄を除く証拠をもたらす。
【００５７】 Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓを含む培養培地５００ｍＬを含む２
種類のフラスコに添加されたディーゼル燃料１．５ｇによる単一の工程のテスト
は、２７℃で２０日間行われた。ディーゼル燃料を含むがイノキュレートされな
いままの２種類のコントロールフラスコもテストされた。回収されたディーゼル
燃料の分析（表７）は、有意の硫黄がＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ
の存在下で除かれるが、どんな硫黄もコントロールのディーゼル燃料からは失わ
れなかったことを示した。イノキュレートされたフラスコからの溶液は、Ｇｉｂ
ｂｓアッセイにより、コントロールフラスコからの溶液よりも５倍多いフェノー
ル含量を含んだ。
種類のフラスコに添加されたディーゼル燃料１．５ｇによる単一の工程のテスト
は、２７℃で２０日間行われた。ディーゼル燃料を含むがイノキュレートされな
いままの２種類のコントロールフラスコもテストされた。回収されたディーゼル
燃料の分析（表７）は、有意の硫黄がＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ
の存在下で除かれるが、どんな硫黄もコントロールのディーゼル燃料からは失わ
れなかったことを示した。イノキュレートされたフラスコからの溶液は、Ｇｉｂ
ｂｓアッセイにより、コントロールフラスコからの溶液よりも５倍多いフェノー
ル含量を含んだ。
【００５８】
【表７】
【００５９】１ 原料中の０．０４３％のＳの証明された値に基づく。 ディーゼル燃料の生物脱硫の２工程テストは、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒ
ｏｉｄｅｓにより３種類で行われた。このテストでは、１．５ｇのディーゼル燃
料を５００ｍＬの培養培地に添加し、フラスコをイノキュレートした。コントロ
ールはイノキュレートされないままであった。イノキュレートしたフラスコから
回収されたディーゼル燃料の硫黄含量は、２４日間後コントロールより有意に低
かった（表８）。
ｏｉｄｅｓにより３種類で行われた。このテストでは、１．５ｇのディーゼル燃
料を５００ｍＬの培養培地に添加し、フラスコをイノキュレートした。コントロ
ールはイノキュレートされないままであった。イノキュレートしたフラスコから
回収されたディーゼル燃料の硫黄含量は、２４日間後コントロールより有意に低
かった（表８）。
【００６０】
【表８】
【００６１】１ 原料中の０．０４３％のＳの証明された値に基づく。 ＣＤＴ−４即ちＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓとＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ種とからなる共同培養菌、並びにＣＤＴ−４ｂ即ちＣＤＴ−４のＮｏｃａ
ｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ成分は、１９９８年８月１０日にＡｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）
，１０８０１，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ
，ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託され、それぞれ寄託番号２０２１６０及び
２０２１６１を有する。
ｎａｓ種とからなる共同培養菌、並びにＣＤＴ−４ｂ即ちＣＤＴ−４のＮｏｃａ
ｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ成分は、１９９８年８月１０日にＡｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）
，１０８０１，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ
，ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託され、それぞれ寄託番号２０２１６０及び
２０２１６１を有する。
【００６２】 上記のすべての特許及び文献は、それらの全体を参考として本明細書に引用さ
れる。 上記の記述は、本発明をいかに実施するかを当業者に教示する目的のためであ
り、記述を読んで当業者に明らかになるだろう明白な変化及び変更のすべてを詳
述することを目的としていない。しかし、すべてのこれらの明白な変化及び変更
が、請求の範囲により規定される本発明の範囲内に含まれることを目的としてい
る。請求の範囲は、内容が特に逆なことを指示していない限り、そこで目指して
いる目的に合致するのに有効である任意の順序で請求の範囲の成分及び工程をカ
バーすることを目的としている。
れる。 上記の記述は、本発明をいかに実施するかを当業者に教示する目的のためであ
り、記述を読んで当業者に明らかになるだろう明白な変化及び変更のすべてを詳
述することを目的としていない。しかし、すべてのこれらの明白な変化及び変更
が、請求の範囲により規定される本発明の範囲内に含まれることを目的としてい
る。請求の範囲は、内容が特に逆なことを指示していない限り、そこで目指して
いる目的に合致するのに有効である任意の順序で請求の範囲の成分及び工程をカ
バーすることを目的としている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:365） Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B063 QA18 QQ06 QQ18 QQ19 QR41 QR44 QR46 QR50 QR69 QS24 QX01 4B065 AA38X AA41X BB02 BB06 BB13 BB15 BB40 BC03 CA46 CA56
Claims (20)
- 【請求項１】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種とＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅ
ｒｏｉｄｅｓの種ＣＤＴ−４ｂとの生物学的に純粋にされた微生物の共同培養菌
ＣＤＴ−４。 - 【請求項２】 化石燃料中の硫黄の少なくとも一部を除く条件及び時間の下
でミネラル栄養素と硫黄を欠く同化可能な炭素源とを含む培地中で燃料を請求項
１の培養菌とインキュベーションすることからなる硫黄を含む化石燃料から硫黄
を除く方法。 - 【請求項３】 硫黄の少なくとも２０％が、約１４−２４日間約２５−３０
℃ でのインキュベーションで除かれる請求項２の方法。 - 【請求項４】 培地が基礎塩培地であり、そして同化可能な炭素源がグリセ
ロール、グルコース、エタノール及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請
求項２の方法。 - 【請求項５】 化石燃料が液体であり、そして培養培地が液体である請求項
２の方法。 - 【請求項６】 化石燃料が石油留出物である請求項５の方法。
- 【請求項７】 燃料中の硫黄の一部を除くのに有効な時間及び条件の下、基
礎塩栄養素と硫黄を欠く同化可能な炭素源とを含む液体培地中で微生物培養菌Ｃ
ＤＴ−４又はＣＤＴ−４ｂと燃料をインキュベーションすることからなる硫黄を
含む液体化石燃料から硫黄を除く方法。 - 【請求項８】 硫黄の少なくとも約２０％が除かれる請求項７の方法。
- 【請求項９】 （ａ）（ｉ）細菌細胞の成長を観察するのに十分な時間及び
条件の下、無機栄養素、硫黄を欠く同化可能な炭素源及び硫黄の唯一の源として
ジベンゾチオフェンを含む細菌培養培地中で土壌又は水のサンプルをインキュベ
ーションし； （ｉｉ）高められた培養菌を得るために１週間の間隔で少なくとも３週間新しい
培養培地により１：５００−１：２０００のファクターで成長する培養菌を希釈
し； （ｉｉｉ）培養菌を固体培養培地上に画線し、そして分離されたコロニーの細菌
細胞の成長を得るための時間及び条件の下インキュベーションし；そして （ｉｖ）分離されたコロニーを再び画線して硫黄の単一の源としてジベンゾチオ
フェンで成長すると思われる生物の生物学的に純粋にされた培養菌を得ること により硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンで成長すると思われる微生物を
先ず分離して生物学的に純粋にし、 （ｂ）（ｉ）工程（ａ）からの純粋にされた培養菌を、無機栄養素、硫黄を欠く
同化可能な炭素源及び硫黄の唯一の源としてジベンゾチオフェンを含む培地に加
えてそれによりサンプル培養菌を提供する工程； （ｉｉ）純粋にされた培養菌を、同じ無機栄養素及び炭素源を含むがジベンゾチ
オフェンを含まない相応する第二の培地に加え、それによりコントロール培養菌
を提供する工程； （ｉｉｉ）細菌細胞の成長を観察するのに十分な時間及び条件の下サンプル培養
菌及びコントロール培養菌をインキュベーションする工程； （ｉｖ）ジベンゾチオフェンを含むサンプル培養菌の成長の程度をジベンゾチオ
フェンを含まない培養菌の成長の程度と比較する工程； （ｖ）ジベンゾチオフェンを含むサンプル培養菌で成長するがジベンゾチオフェ
ンを含まないコントロール培養菌で成長しないすべての培養菌を同定する工程；
（ｖｉ）ジベンゾチオフェンで成長するすべての培養菌でジベンゾチオフェンの
代謝生成物を同定する工程；そして （ｖｉｉ）ジベンゾチオフェンで成長しそしてビフェニル又はヒドロキシビフェ
ニルを含むがしかし炭素を含む他の生成物を実質的に含まない代謝生成物を生ず
るすべての培養菌をポジティブな一次のスクリーニング培養菌として同定する工
程 からなる一次のスクリーニングで生物学的に純粋にされた培養菌を次にスクリー
ニングし、そして次に （ｃ）（ｉ）スクリーニング（ｂ）で同定されたポジティブな培養菌を、無機栄
養素及び唯一の炭素及び硫黄源として化石燃料を含む細菌性培養培地にイノキュ
レートする工程； （ｉｉ）同じポジティブな培養菌を、同じ細菌性培養培地、同じ化石燃料及び硫
黄を欠く第二の炭素源を含む相応する第二の培養物にイノキュレートする工程；
（ｉｉｉ）細菌性細胞の成長を観察するのに十分な時間及び条件の下培養物をイ
ンキュベーションする工程； （ｉｖ）唯一の炭素源として化石燃料を含む培養物の成長の程度を、第二の炭素
源として化石燃料を含む培養物の成長の程度を比較する工程； （ｖ）化石燃料及び第二の炭素源の存在下の培養物中の微生物の成長、そして化
石燃料は存在するが第二の炭素源は存在しない条件でインキュベーションした相
応する培養物の非成長を観察することにより化石燃料から硫黄を選択的に除く微
生物を同定する工程 からなる二次スクリーニングで（ｂ）で同定されたポジティブ培養菌を再スクリ
ーニングする ことからなる化石燃料から硫黄を選択的に除く土壌又は水の微生物を同定し純粋
にするスクリーニング法。 - 【請求項１０】 一次スクリーニング培養物中のジベンゾチオフェンの少な
くとも約２０％で脱硫する一次スクリーニングのポジティブテストサンプルのみ
が二次スクリーニングでテストされる請求項９の方法。 - 【請求項１１】 両者のスクリーニングのインキュベーションが３−１４日
間約２５−３０℃で行われる請求項９の方法。 - 【請求項１２】 炭素源が、グリセロール、グルコース、エタノール及びそ
れらの混合物からなる群から選ばれ、そして両者のスクリーニング用の培地が基
礎塩培地である請求項９の方法。 - 【請求項１３】 炭素源がグリセロールである請求項１２の方法。
- 【請求項１４】 請求項９の方法により同定されそして分離された微生物の
培養菌。 - 【請求項１５】 微生物の培養菌ＣＤＴ−４又はＣＤＴ−４ｂに類似した生
物学的脱硫性を示す請求項１４の培養菌。 - 【請求項１６】 硫黄を含む化石燃料サンプルから硫黄を除く方法であって
、該燃料サンプルの少なくとも一部を除く時間及び条件の下、ミネラル栄養素と
硫黄を欠く同化可能な炭素源とを含む培地で請求項１４の培養菌とともに該サン
プルをインキュベーションすることからなる方法。 - 【請求項１７】 培養菌による化石燃料のインキュベーションが、約１４−
２０日間約２５−３０℃での２段階インキュベーションからなる請求項１６の方
法。 - 【請求項１８】 化石燃料が液体であり、そして培地が液体である請求項１
５の方法。 - 【請求項１９】 化石燃料が石油留出物である請求項１８の方法。
- 【請求項２０】 Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓＣＤＴ−４ｂの
生物学的に純粋にされた微生物の培養菌。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/131,685 | 1998-08-10 | ||
| US09/131,685 US6124130A (en) | 1998-08-10 | 1998-08-10 | Microbial catalyst for desulfurization of fossil fuels |
| PCT/US1999/018102 WO2000009761A1 (en) | 1998-08-10 | 1999-08-10 | Improved microbial catalyst for desulfurization of fossil fuels |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002522098A true JP2002522098A (ja) | 2002-07-23 |
Family
ID=22450564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000565195A Pending JP2002522098A (ja) | 1998-08-10 | 1999-08-10 | 化石燃料の脱硫化用の改良された微生物触媒 |
Country Status (6)
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