CN110747141B - 一种油基钻屑降解菌株及其应用 - Google Patents

一种油基钻屑降解菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种油基钻屑降解菌株及其应用，菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp.）WJ2019，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2019年7月19日，保藏编号为CCTCC NO：M2019574。该菌株可以在常规条件下以油基钻屑作为唯一碳源进行生长，无需人为添加能源和碳源。因此该菌可以用于油基钻屑中的石油组分降解，在45天内对反排油含量为1200mg/kg的油基钻屑降解率可达到48.8%以上，具有除油效率高、处理周期短的显著优势。可用于页岩气开采过程中产生的油基钻屑或含油土壤、含油污泥的生物修复，亦可用于与其它菌株共同制备复合菌剂，以高效彻底去除环境中的油基钻屑，具有良好的应用前景。

Description

一种油基钻屑降解菌株及其应用
技术领域
本发明属于含油固体废弃物微生物处理技术领域，特别的涉及一种油基钻屑降解菌株及其应用。
背景技术
随着我国天然气工业的蓬勃发展，2020年我国页岩气年产量将达到300亿m3。油基泥浆具有抗高温、润滑性好、对油气层损害小等优点，被大规模地应用于页岩气钻采过程，但在该过程中会产生大量的油基泥浆钻井岩屑，其中包括反排油即柴油、白油、生物油、矿物油、合成油和各种油田化学剂等，具有体系异常稳定，污染物种类复杂、含油量高等特点，处理难度非常大，现已被列入国家危险废弃物(HW08)。油基钻屑直接排放将对环境的影响主要体现在以下几个方面：1、有机污染物污染地表水和地下水资源；2、石油类对植物的生长有毒害作用，长期滞留土壤抑制植物生长和土壤微生物繁殖；3、高浓度可溶性盐会造成周围土壤硬化，减少土壤肥力；4、油基钻屑中含有大量的铜、铅、铬等重金属离子，进入土壤后被作物吸收最终通过食物链作用进入人体，危害人体健康。因此，研究处理油基泥浆钻井岩屑具有重要的实际意义。
目前处理油基泥浆钻井岩屑的方法主要分为物理处理法、化学处理法和生物降解法。其中物化处理技术是国内外如今普遍采用较成熟的方法，但上述方法对环境有较大污染隐患，设备能耗大、成本高、二次污染严重及普适性差等问题；生物降解法因具有处理成本低、对环境无二次污染等优点，被认为最经济和最具永续利用的环保型技术，现已得到较多应用。
微生物降解技术是指在适宜环境下通过微生物各种代谢途径将污染物降解的技术。大量研究表明，在石油烃类污染的自然降解中，微生物降解起着重要的作用。向石油污染的水体或土壤中投加环境适应性强、降解效能高的菌种或菌群是提高石油降解效率的重要技术手段。微生物好氧代谢过程中能够降解大部分饱和脂肪烃和芳香烃，脂肪烃在单氧化酶和脱氢酶的作用下生成脂肪酸，而芳香烃则在氧化酶和水解酶的作用下转化成二氢二醇。但已有的石油烃降解微生物的筛选主要关注汽油、柴油及原油等石油烃物质，对于成分更复杂、降解更困难的由柴油、白油、生物油、矿物油、合成油和各种油田化学剂混合的反排油（油基钻屑）关注较少。发明专利CN201410419910.3公开了一种油基钻屑降解菌及其制备和应用方法，该油基钻屑降解菌含有拉丁文学名为Pseudomonas Aeruginosa的铜绿假单胞菌、拉丁文学名为Kocuriakristinae的克氏微球菌和拉丁文学名为Acinetobacter Calcoaceticus的乙酸钙不动杆菌；发明专利CN201410270862.6公开了一种处理油基钻屑的微生物复合菌剂、其制备方法及其应用，该复合菌剂包含保藏号为CGMCCNO：8983的铜绿假单胞菌和保藏号为CGMCCNO：8984的鲍曼不动杆菌。可见对于降解油基钻屑的微生物还较为匮乏，因此筛选新型高效的油基钻屑降解微生物与应用研究，对保障油气田勘探开发的正常进行、保护油气田安全、绿色、和谐的可持续生产具有非常重要意义。
发明内容。
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种油基钻屑降解菌株，解决现有能降解油基钻屑的微生物较为匮乏，为生物修复油基钻屑提供了新选择和新思路，且降解效率低的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种油基钻屑降解菌株，所述菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp.）WJ2019，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2019574，其16S rRNA序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。
一种油基钻屑降解剂，有效成分为上述的芽孢杆菌WJ2019。
进一步，所述芽孢杆菌WJ2019为该菌株的培养菌悬液或发酵液，所述发酵液是将所述芽孢杆菌WJ2019在LB固体培养基上活化，然后将活化后的菌接种于LB液体培养基中培养，震荡培养至对数期即得到发酵液。
本发明还提供了上述油基钻屑降解菌株在生物修复油基钻屑方面的应用。
具体的，向无机盐培养基中加入待处理油基钻屑，然后加入无机铵盐和无机磷盐得到反应液，再将油基钻屑降解菌株接种到所述反应液中，30~35℃，160~200rpm避光培养120~240h。
进一步，所述反应液中的含油量为500~2000mg/L。
进一步，所述反应液中的N:P的摩尔比为2~4:1，pH值为6~9，氯化钠浓度为0.1~1%。
进一步，所述无机铵盐为所述无机铵盐为(NH4)2SO4；所述无机磷盐为KH2PO4、K2HPO4。
进一步，所述无机盐培养基包括以下组分：(NH4)2SO4 1.26g，KH2PO4 0.5g ，NaCl5.0g，K2HPO4 1.0g，MgSO4 0.5g，CaCl 0.1g，KCl 0.1 g，微量元素溶液1ml，加超纯水至1L，pH7.0；所述微量元素溶液包括以下分组：FeSO4.7H2O 2.0g，MnSO4.H2O 2.0g，ZnSO4.7H2O0.5g，Na2MoSO4.2H2O 0.5g，CuSO4.5H2O 0.4g，NiCl2.6H2O 0.2g，H3BO4 0.2g，加超纯水至1L。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明在重庆某页岩气开采井分离筛选得到芽孢杆菌WJ2019，该菌株可以在常规条件下以油基钻屑作为唯一碳源进行生长，无需人为添加能源、碳源等。因此该菌可以用于油基钻屑中的石油组分降解，在45天内对反排油含量为1200mg/kg的油基钻屑降解率可达到48.8%以上，具有除油效率高、处理周期短的显著优势。可用于页岩气开采过程中产生的油基钻屑或含油土壤、含油污泥的生物修复，亦可用于与其他菌株共同制备复合菌剂，以高效彻底去除环境中的油基钻屑，具有良好的应用前景。
2、本发明提供的油基钻屑降解剂，具有制备简单，成本低，易于工业化生产，对油基钻屑的降解效果良好，且不会造成环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。也为进一步利用生物技术修复油基钻屑提供科学依据与研究思路。
附图说明
图1为菌株Bacillus sp. WJ2019的菌落形态图；
图2为菌株Bacillus sp. WJ2019的菌株系统发育树；
图3为菌株Bacillus sp. WJ2019在不同pH条件下对油基钻屑降解率示意图；
图4为菌株Bacillus sp. WJ2019在不同温度条件下对油基钻屑降解率示意图；
图5为菌株Bacillus sp. WJ2019在不同N:P条件下对油基钻屑降解率示意图；
图6为菌株Bacillus sp. WJ2019在不同NaCl质量浓度条件下对油基钻屑降解率示意图；
图7为菌株Bacillus sp. WJ2019在最佳降解条件下的其固相中和液相中含油量曲线变化图；
图8为菌株Bacillus sp. WJ2019的降解曲线示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。
以下实施例所用的所采用的培养基成分：
无机盐培养基：(NH4)2SO4 0.617g，KH2PO4 0.5g ，NaCl 5.0g，K2HPO4 1.0g，MgSO40.5g， CaCl 0.1， KCl 0.1 g，微量元素溶液1ml，加超纯水至1L，pH7.0；所述微量元素溶液包括以下分组：FeSO4.7H2O 2.0g，MnSO4.H2O 2.0g，ZnSO4.7H2O 0.5g，Na2MoSO4.2H2O 0.5g，CuSO4.5H2O 0.4g，NiCl2.6H2O 0.2g，H3BO4 0.2g，加超纯水至1L。
液体分离培养基：在无机盐培养基的基础上添加油基钻屑使油含量为2g.L-1。
固体分离培养基：在无机盐培养基的基础上添加琼脂20g.L-1，添加油基钻屑使油含量为2g.L-1。
LB液体培养基：酵母粉5 g.L-1，胰蛋白胨10 g.L-1，NaCl 5 g.L-1。
LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上加琼脂20g.L-1。
实施例1 菌株芽孢杆菌WJ2019的分离筛选及形态鉴定
分离和筛选方法：
（1）在重庆某页岩气开采井取5g油基钻屑样品放入50 ml离心管中，加入25ml超纯水，涡旋震荡器上震5~10min，使土壤充分打散，静置沉淀，然后取10ml上清液加入100ml液体分离培养基中，在30℃、200r/min-1摇床培养7天，得到菌液。
（2）将菌液按1%（v/v）接种，重新转接入无菌的液体分离培养基中，与上述培养条件相同，连续转接传代培养3次，得到培养液。
（3）采用稀释涂布平板法进行分离，将培养液稀释至10-3后，取100μL菌液稀释涂布于固体分离培养基中培养48h，待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，分别回接于固体分离培养基和液体分离培养基中，在两种含油分离培养基中均能生长的即为筛选目标菌WJ2019。
（4）将筛选出来的目标菌株WJ2019划线培养并重新接种回液体分离培养基，纯化三次，涂布于LB固体培养基中，收集菌体，加入40%甘油，按照甘油和菌液的比例为1：1混合，于-80℃保存。
形态学鉴定：
经用光学显微镜观察该菌株WJ2019的菌落呈圆形、白色、表面光滑、中部凸起及边缘整齐革兰氏阴性（图1）。
生理生化鉴定：
参照《常见细菌系统鉴定手册》中的生理生化鉴定指标，对本发明实施例提供的菌株WJ2019进行生理生化鉴定。该菌为好氧细菌，糖酵解实验阴性，淀粉水解实验阳性，V-P实验阴性，甲基红实验阳性，硝酸盐还原实验阳性，氧化酶实验阳性，H2S实验阴性，明胶液化实验阴性。
结果表明WJ2019菌株在分类学上属于芽孢杆菌（Bacillus sp.），命名为芽孢杆菌WJ2019。
实施例2 16S rDNA序列分析
根据通用引物来扩增菌株WJ2019中16S rDNA基因。
PCR扩增体系：Taq DNA聚合酶 0.5 μL，10×Buffer 2.5μL，正向引物(27F, 10μM)2μL，反向引物(1492R 10μM) 2μL，模板（DNA）1μL，dNTP (2.5mM) 1μL，无菌ddH2O补足至50μL。
正向引物27F和反向引物1492R为：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3'
PCR反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 1 min；56℃ 40 sec；72℃ 1 min，循环10次，每个循环退火温度降低1℃；再以前面PCR产物为模板，体系不变94℃5 min；94℃5 min，53℃40 sec；72℃1 min；72℃延伸7 min，循环30次。
获得PCR产物委托上海美吉生物工程有限公司进行测序，所得基因序列通过GenBank进行同源性比较，确定其分类地位。
菌株16SrRNA基因测序结果如SEQ ID NO:1所示，结果表明其基因序列长度约为1050bp，对其进行系统发育树分析（图2），表明其与芽胞杆属Bacillus sp.HNS74具有相隔最近亲缘关系，相似性达99%，因此该菌株属于芽胞杆属Bacillus sp.。
实施例3 菌株WJ2019降解油基岩屑的条件优化
1）不同pH对菌株降解油基岩屑的影响
S1：将芽孢杆菌WJ2019接种到LB固体培养基上30℃培养过夜，然后将活化后的菌落接种于LB液体培养基中以200rpm/min，30℃震荡培养至对数期即得到发酵液，即油基钻屑降解剂。
S2：准备15个100ml锥形瓶，分别称取5g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入25ml的无机盐培养基，使其含油量保持在1200mg/L左右得到反应液，设置成5组，每组实验设置3个平行样，每组反应液的初始pH分别为5、6、7、8和9，再将菌株WJ2019发酵液按接种量10%分别接入上述锥形瓶中，以等量磷酸盐缓冲液（pH=7.0）代替菌悬液作为空白对照，考察不同pH对菌株WJ2019降解油基岩屑的影响。将锥形瓶置于恒温摇床中以200rpm/min，30℃培养10d后，测定样品中的反排油含量，计算降解率。结果如图3所示，该菌株WJ2019在pH为7的条件下降解效率最高，在15天内能对油基泥浆中反排油的降解率达到23%左右。
2）不同温度对菌株降解油基岩屑的影响
S1：将芽孢杆菌WJ2019接种到LB固体培养基上30℃培养过夜，然后将活化后的菌落接种于LB液体培养基中以200rpm/min，30℃震荡培养至对数期即得到发酵液，即油基钻屑降解剂。
S2：准备15个100ml锥形瓶，分别称取5g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入25ml的无机盐培养基（pH 7.0~7.2），使其含油量保持在1200mg/L左右得到反应液，设置成5组，每组实验设置3个平行样，再将菌株WJ2019发酵液按接种量10%分别接入上述锥形瓶中，以等量磷酸盐缓冲液（pH=7.0）代替菌悬液作为空白对照。将锥形瓶按组分别置于20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的恒温摇床中以200rpm/min培养10d后，考察不同温度对菌株WJ2019降解油基岩屑的影响，测定样品中的反排油含量，计算降解率。结果如图4所示，该菌株WJ2019在温度为35℃的条件下降解效率最高，在15天内能对油基泥浆中反排油的降解率达到28%左右。
3）不同N:P对菌株降解油基岩屑的影响
S1：将芽孢杆菌WJ2019接种到LB固体培养基上30℃培养过夜，然后将活化后的菌落接种于LB液体培养基中以200rpm/min，30℃震荡培养至对数期即得到发酵液，即油基钻屑降解剂。
S2：准备15个100ml锥形瓶，分别称取5g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入25ml的无机盐培养基（pH 7.0~7.2），使其含油量保持在1200mg/L左右得到反应液，设置成5组，每组实验设置3个平行样，加入KH2PO4，使每组反应液的PO4 3--P含量保持在150 mg/L，再加入(NH4)2SO4，使每组反应液的N含量分别为150 mg/L、300 mg/L、700 mg/L、1400 mg/L和2800mg/L。再将菌株WJ2019发酵液按接种量10%分别接入上述每个锥形瓶中，以等量磷酸盐缓冲液（pH=7.0）代替菌悬液作为空白对照。将锥形瓶按组置于恒温摇床中以200rpm/min、30℃培养10d后，考察不同N:P对菌株WJ2019降解油基岩屑的影响，测定样品中的反排油含量，计算降解率。结果如图5所示，该菌株WJ2019在N:P为4：1的条件下降解效率最高，在15天内能对油基泥浆中反排油的降解率达到24.8%左右。
4）不同盐浓度对菌株降解油基岩屑的影响
S1：将芽孢杆菌WJ2019接种到LB固体培养基上30℃培养过夜，然后将活化后的菌落接种于LB液体培养基中以200rpm/min，30℃震荡培养至对数期即得到发酵液，即油基钻屑降解剂。
S2：准备15个100ml锥形瓶，分别称取5g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入25ml的无机盐培养基（pH 7.0~7.2），使其含油量保持在1200mg/L左右得到反应液，设置成5组，每组实验设置3个平行样，向每组加入不同量的氯化钠，使每组反应液中氯化钠的质量分数分别为：0.1%、0.5%、1%、2%和3%。再将菌株WJ2019发酵液按接种量10%分别接入上述每个锥形瓶中，以等量磷酸盐缓冲液（pH=7.0）代替菌悬液作为空白对照。将锥形瓶按组置于恒温摇床中以200rpm/min、30℃培养10d后，考察不同氯化钠含量对菌株WJ2019降解油基岩屑的影响，测定样品中的反排油含量，计算降解率。结果如图6所示，该菌株WJ2019在氯化钠浓度为0.5%的条件下降解效率最高，在15天内能对油基泥浆中反排油的降解率达到21%左右。
实施例4
S1：将芽孢杆菌WJ2019接种到LB固体培养基上30℃培养过夜，然后将活化后的菌落接种于LB液体培养基中以200rpm/min，30℃震荡培养至对数期即得到发酵液，即油基钻屑降解剂。
S2：称取5g油基泥浆钻井岩屑放入锥形瓶，向锥形瓶中加入无机盐培养基（pH 7.0~7.2），使其含油量保持在1200mg/L左右，然后加入0.5%wt氯化钠以及KH2PO4和(NH4)2SO4，使其N:P为3：1，然后将上述溶液分为3组反应液：将WJ2019的发酵液按接种量10%接入反应液中作为实验组；将大肠杆菌发酵液替代WJ2019发酵液接种到反应液中作为阴性对照1；将失活的WJ2019发酵液替代WJ2019发酵液接种到反应液中作为阴性对照2，将无菌LB液体培养基代替WJ2019发酵液接种到反应液中作为空白对照。空白处理以等量磷酸盐缓冲液（pH=7.0）代替菌悬液，考察不同处理对油基钻屑中反排油的降解能力。将样品置于恒温摇床中以200rpm/min，30℃培养45d，测定样品的固相和液相中的石油烃含量，计算降解率。每组实验设置3个平行样。结果如图7和图8所示，虽然空白对照组和阴性对照样品的固相中的油含量有所下降，但液相中油的含量明显升高，即石油烃由固相转移到液相，整体的油含量并未下降，而实验组中固相中的油含量明显下降，并且液相中并未检测到油。本发明菌株WJ2019在45天内能对反排油的降解率达到48%左右，其中钻屑油含量为624 mg/kg，达到了《海洋石油勘探开发污染物排放浓度限值》(GB4914-2008)三级排放标准(含油率≤8%)。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆市生态环境科学研究院；
<120> 一种油基钻屑降解菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1050
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌（Bacillus sp.）
<400> 1
tccatgcggc gtgctataat gcagtcgagc ggacagaagg gagcttgctc ccggatgtta 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
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gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420
acaagtgcaa gagtaactgc ttgcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540
aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600
gtcattggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 720
gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780
gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 840
taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960
tgacatcctc tgacacccta gagatagggc tttcccttcg gggacagagt gacaggtggt 1020
gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1050

Claims (5)

1.一种油基钻屑降解菌株在生物修复油基钻屑方面的应用，其特征在于，向无机盐培养基中加入待处理油基钻屑，然后加入无机铵盐和无机磷盐得到反应液，再将油基钻屑降解菌株接种到所述反应液中，30~35℃，160~200rpm避光培养120~240h；所述菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp.）WJ2019，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019574。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述反应液中的含油量为500~2000mg/L。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述反应液中的N:P的摩尔比为2~4:1，pH值为6~9，氯化钠浓度为0.1~1%。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述无机铵盐为(NH4)2SO4；所述无机磷盐为KH2PO4或K2HPO4。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述无机盐培养基包括以下组分：(NH4)2SO41.26g，KH2PO4 0.5g ，NaCl 5.0g，K2HPO4 1.0g，MgSO4 0.5g，CaCl2 0.1g，KCl 0.1 g，微量元素溶液1ml，加超纯水至1L，pH7.0；所述微量元素溶液包括以下分组：FeSO4.7H2O 2.0g，MnSO4.H2O 2.0g，ZnSO4.7H2O 0.5g，Na2MoSO4.2H2O 0.5g，CuSO4.5H2O 0.4g，NiCl2.6H2O0.2g，H3BO4 0.2g，加超纯水至1L。
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高效石油解菌的筛选、降解特性分析及应用研究;徐冯楠;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20101115(第11期);全文 *

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