CN105524859A - 一种水基钻屑石油烃降解菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水基钻屑石油烃降解菌，保藏编号为：CGMCC？No.11389，保藏日期：2015年09月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，所述石油烃降解菌降解正十九烷、姥鲛烷、菲、芘和苯并(α)芘。本发明提供的菌株经过石油烃降解菌20天的降解，菌株CH1对柴油的降解率均达到90％以上，空白对照组挥发量约占60％；通过GC-MS全扫描正十九烷的降解产物，得出其降解率及降解产物峰图，正十九烷20天的挥发量约有97％-99％。

Description

一种水基钻屑石油烃降解菌

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种水基钻屑石油烃降解菌。

背景技术

石油已成为港口海域主要污染源之一，港口海域受到天然源的石油和人为排放石油(海洋石油运输、海洋钻井平台石油生产、城市污水排放、疏浚物释放、陆地石油生产大气沉降、城市地表径流携带、工业污水排放、河流输送)的污染。大型港口的水深一般为几米至几十米，周围没有潮滩，持续输入的石油污染经过扩散、蒸发、溶解、乳化、光化学氧化、微生物氧化、沉降、形成沥青球等一系列复杂变化后，大量石油污染沉降进入沉积层，受温度、溶氧、pH等环境条件限制，沉积物中石油烃的自然降解非常缓慢，石油烃会在此驻留几年甚至几十年，在海流、海浪、疏浚等作用下，沉入海底的石油或石油氧化物还可能再次浮上海面，造成二次污染。而长期受石油污染的区域会有石油烃降解菌的富集，可以采用土著石油烃降解菌对污染港口海域进行原位修复。

2011年对渤海湾沉积物的石油烃含量进行调查，调查结果显示，港口海域(天津港)沉积物石油烃含量为484mg/kg，污染高于其他海域。由此可见，港口海域已成为我国石油污染的重灾区。为了解决港口海域石油污染问题，进行石油烃的微生物修复技术的研究，治理港口石油污染，不造成二次污染的降解是十分必要的。本课题针对港口海域的石油污染状况，利用天津港筛选出的土著微生物，构建适合港口海域对石油烃具有较强降解效果的菌群；而对于石油烃降解菌株的专一性降解实验，可以有效分析菌株对烃类物质的降解能力，并以此理论进行港口石油污染的生物修复，对于港口海域的治理，具有重要的理论和应用性的意义。以期为微生物修复港口海域石油污染技术提供理论支持。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种降解效率高的水基钻屑石油烃降解菌。

本发明实现目的的技术方案是：

一种水基钻屑石油烃降解菌，保藏编号为：CGMCCNo.11389，分类命名为：芽孢杆菌Bacillussp.，保藏日期：2015年09月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

而且，所述石油烃降解菌降解正十九烷、姥鲛烷、菲、芘和苯并(α)芘。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明提供的菌株采用平板法甄别菌株的降解专一性结果为菌株CH1可降解正十九烷、姥鲛烷、菲、芘和苯并(α)芘。

2、本发明提供的菌株混合菌在姥鲛烷、菲、荧蒽、苯并(α)芘、这四种物质混合烃以及空白对照的培养液中生长30天后，平板涂布法观察菌落结构发生变化：空白组中菌株CH1数量占绝对优势。

3、本发明提供的菌株经过石油烃降解菌20天的降解，菌株CH1对柴油的降解率均达到90％以上，空白对照组挥发量约占60％；通过GC-MS全扫描正十九烷的降解产物，得出其降解率及降解产物峰图，正十九烷20天的挥发量(20μg/L的浓度除外)约有97％-99％。

附图说明

图1为本发明CH1的菌落形态图；

图2为本发明CH1的扫描电镜图片。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

申请人对天津港口海域海水中烷烃、芳烃含量进行检测，其中烷烃的浓度为24.44μg/L，甲基取代的芳香烃浓度为1.60μg/L，含量远远大于渤海海域等其他海域含量；对潮间带沉积物优控多环芳烃含量进行检测，其中低潮位的16种优控多环芳烃的浓度为154.07ng/g，中潮位为42.21ng/g，高潮位为33.11ng/g，含量高于其它非港口海域。分析沉积物中PAHs含量，通过对多环芳烃混标进行选择离子扫描，低潮位、中潮位和高潮位的沉积物中PAHs的GC-MS色谱图。其成分为：萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽。

一种水基钻屑石油烃降解菌，具体发现及鉴定过程如下：

本发明是采集背景调查的港口海域海水，利用逐级驯化培养的方法筛选分离出其中的土著石油烃降解菌，对其进行电镜扫描形态观察，并通过16SrDNA测序分析，进行菌种鉴定。，本申请筛选的菌株，保藏编号为：CGMCCNo.11389，分类命名为：芽孢杆菌Bacillussp.，保藏日期：2015年09月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，为了叙述方便，以下采用CH1代替保藏编号为：CGMCCNo.11389来进行说明。

一、试剂：蛋白胨、酵母浸出粉、(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O、FePO₄·4H₂O、NaOH和浓盐酸。

材料：0#柴油、海水晶。

培养基配方见表1。

表1实验所用培养基配方

二、石油烃降解菌的驯化、分离与纯化

1、石油烃降解菌的驯化步骤为：

(1)无菌实验条件下，加入5mL采集的海水于100mL富集培养液Ⅰ中，在30℃、150rpm条件下，进行摇瓶实验，对海水中的细菌驯化培养；

(2)培养一周后，摇匀培养液并转移约一半体积至50mL新鲜富集培养液Ⅰ中继续培养；

(3)在同上的条件下，再转移至富集培养液Ⅱ中，依次进行2次富集培养。

2、石油烃降解菌的分离与纯化：

(1)采用平板涂布分离法，用无菌水对驯化四周后的培养液进行梯度稀释，稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍，分别取0.1mL10^-5、10^-6、10^-7倍的稀释液于柴油平板培养基上进行涂布，在30℃的培养箱中培养2d；

(2)挑选形态不同的单独菌落，进行划线分离，在30℃的培养箱中培养2d；

(3)重复步骤(2)对菌株进行划线纯化，直至平板上所有菌落的形态一致，即为单一菌株，分离出的菌株用柴油斜面培养基划线保种，4℃冰箱保存。

三、菌株扫描电镜观察

进行扫描电镜观察前用去离子水配制PBS缓冲液(PhosphateBufferedSaline)，灭菌后置于4℃冰箱保存待用；LB(Luria-Bertani)培养液、1mL移液枪枪头和10mL离心管提前灭菌。

其中PBS缓冲液：KH₂PO₄0.27g/L、Na₂HPO₄1.42g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L，1％盐酸调节pH至7.4。

使用扫描电镜观察细菌菌体形态需要对细菌进行前处理：

(1)无菌条件下挑取纯化后的单一菌落，接入有50mLLB培养液的锥形瓶中，37℃、150rpm条件下摇瓶振荡培养12h，使用1000μL的移液枪吸取800μL菌液10mL离心管内；

(2)将离心管置于高速离心机，3000rpm离心5min，倒去上清液，加入500μL蒸馏水，离心去上清液，重复离心清洗3次洗净培养液，以免对电镜观察造成干扰；

(3)离心管中加入1mL2.5％戊二醛，用力混合均匀，放冰箱4℃冷藏静置4～5h；3000rpm离心去上清液后使用PBS缓冲液对细菌清洗离心3次；

(4)利用四个梯度浓度(20％、50％、80％、100％)的乙醇溶液依次对细菌进行脱水处理，每个梯度脱水10min后3000rpm离心，去上清液；

(5)用800μL蒸馏水置换乙醇，吸取菌悬液轻轻滴在洁净的载玻片中心，自然风干以待进行扫描电镜的观察。

四、石油烃降解菌的16SrDNA的分子学鉴定

1、DNA的提取

使用AXYGEN的AxyPrep细菌基因组DNA小量试剂盒对筛选出的石油烃降解菌进行总DNA提取，分离纯化后的菌株接种于LB培养液中，在恒温振荡培养箱中37℃、150rpm振荡培养12h，按照提取试剂盒的离心法步骤进行菌株的DNA提取，然后将提取出的DNA置于-20℃温度下保存且尽快进行PCR扩增。

2、PCR扩增

模板是提取的菌株总DNA，石油烃降解菌的总DNA提取物利用细菌16SrRNA为通用引物进行PCR扩增，扩增引物为：

27F：5′AGAGTTTGATCATGGCTCAG3′；

1492R：5′CTACGGTTACCTTGTTACGAC3′；

PCR反应体系为Mix25μL，模板2.0μL，两种引物各1.0μL，ddH₂O21μL共50μL。

PCR扩增反应程序见表2：

表2PCR扩增反应程序

3、PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测

操作步骤：

(1)配制琼脂糖凝胶：取0.2g琼脂糖置于锥形瓶中，量取20mL1×TAE缓冲液入锥形瓶中，电炉加热溶液至溶液沸腾，琼脂糖完全融化，摇匀，配成20mL的1％浓度的琼脂糖凝胶。加入2μLGoldViewⅠ核酸染料至琼脂糖凝胶溶液，(琼脂糖凝胶溶液冷却至60℃左右，即感觉不烫手)，轻轻摇晃溶液，至GoldViewⅠ核酸染料与溶液混合均匀；

(2)倒胶：电泳槽、制胶模子和梳子等用去离子水冲洗干净晾干，将制胶模子的组装好后插入适当大小的梳子，然后将配制好的琼脂糖凝胶轻轻倒入制胶模子，注意倒胶时要缓慢匀速不要产生气泡，全部倒入后，于室温条件下静置，待其凝固完全，垂直方向轻轻拔下梳子并将凝固好的琼脂糖凝胶轻轻取下，放入电泳槽，加1×TAE缓冲液于电泳槽中至液面高于胶面1mm；

(3)点样：使用5μL的移液枪，移取5μLPCR样品于凝胶加样空中，将枪头深入，迅速点样，枪头提前灭菌处理，点样完毕后盖上电泳槽开始电泳实验。电泳电压150V，时间30min，电泳结束后取出凝胶，放入凝胶成像系统中观察结果。

其中TAE贮存液为50×TAE，配置方法为：Tris碱、EDTA各242g、37.2g，量取800mL去离子水加入，搅拌至完全溶解后加入57.10mL冰乙酸，搅拌至混合均匀，然后用去离子水定容至1L，高温高压灭菌，室温保存。

注意：整个电泳过程应戴手套完成。

4、PCR产物测序

委托北京六合华大基因科技股份有限公司对菌株PCR产物进行测序工作，然后通过NCBI网站提供给的BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)功能与Genbank中的DNA基因序列进行比对，分析1株菌的16SrRNA基因序列测序结果。

下载相似度≥98％的基因序列，利用BioEdit与MEGA两种软件确定菌株的属。

五、石油烃降解菌群的驯化与分离

石油烃降解菌的分离纯化结果：港口海域海水中的石油烃降解菌经过4周时间的摇瓶驯化以及菌液的涂布划线分离，纯化筛选出得到1株较为优势生长的石油烃降解菌为CH1。

通过肉眼观察平板培养基上各菌株的菌落特征分别为：CH1的菌落较大，菌落直径约为0.5～1.0mm，菌落透明、边缘光滑，见(图1)。

本发明根据“逐级驯化”降解菌的方法，依次用1％低浓度和2％中等浓度柴油对石油烃降解菌群进行逐级驯化培养，既驯化了土著菌株的降解能力，而且进行了优势菌的二次筛选，筛选效率提高。

六、扫描电镜观察结果

对筛选出的1株菌株，利用扫描电镜进行形态观察，形状如图2所示，由图中可以看出菌株CH1体积大小为0.8～1.0μm×2.0～3.0μm，形状为短杆状。

七、分子学鉴定

提取CH1株菌株的总DNA，采用细菌16SrDNA通用引物对降解菌的总DNA提取物进行PCR扩增，并对1株菌株的PCR产物进行电泳试验，扩增产物均在约1500bp处产生明亮条带，并且没有拖尾现象，证明PCR成功扩展目标片段，可以进行基因序列测序。委托北京六合华大基因科技股份有限公司对PCR产物进行测序工作，通过对测序结果进行基因比对，最终测得1株菌株CH1的16SrRNA序列长度分别为：1402bp。

将菌的16SrDNA基因序列测序结果通过NCBI网站提供给的BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)功能与Genbank中的DNA基因序列进行比对，BLAST比对结果见表3。

表3菌株CH1的Blast比对结果以及GenBank登录号

通过对港口海水中可降解石油烃的菌株逐级进行驯化筛选，经鉴定CH1属于芽孢杆菌属(Bacillussp.)，与菌株Bacillussp.F67相似性最高，相似度为99％。

八、石油烃降解菌的降解专一性

对本发明筛选到的降解菌CH1，用平板法甄别菌株对正十九烷、姥鲛烷、菲、芘、荧蒽和苯并芘等烃类化合物的降解专一性，进行了单菌株及混合菌株在含有不同烃类化合物无机盐培养液中的生长情况以及对烃类物质的降解率，还进行了菌株对正十九烷的降解产物的分析。

结论：本发明利用逐级驯化分离石油烃降解菌的方法，从天津港港口海域筛选出1株高效石油烃降解菌CH1，菌株CH1体积大小为0.8～1.0μm×2.0～3.0μm，菌株的形状为短杆状。经16SrDNA基因序列鉴定，CH1为芽孢杆菌属(Bacillussp.)，与菌株Bacillussp.F67同源性最高，相似度为99％。

(1)平板法甄别菌株的降解专一性结果为菌株CH1可降解正十九烷、姥鲛烷、菲、芘和苯并(α)芘。

(2)混合菌在姥鲛烷、菲、荧蒽、苯并(α)芘、这四种物质混合烃以及空白对照的培养液中生长30天后，平板涂布法观察菌落结构发生变化：空白组中菌株CH1数量占绝对优势。

(3)经过石油烃降解菌20天的降解，菌株CH1对柴油的降解率均达到90％以上，空白对照组挥发量约占60％；通过GC-MS全扫描正十九烷的降解产物，得出其降解率及降解产物峰图，正十九烷20天的挥发量(20μg/L的浓度除外)约有97％-99％。

CH1的基因序列为：

CGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTCTAGTCACATTCGTTACGACTCGCAGGAGTAG。

Claims (2)

1.一种水基钻屑石油烃降解菌，其特征在于：保藏编号为：CGMCCNo.11389，分类命名为：芽孢杆菌Bacillussp.，保藏日期：2015年09月17日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述的水基钻屑石油烃降解菌，其特征在于：所述石油烃降解菌降解正十九烷、姥鲛烷、菲、芘和苯并(α)芘。