CN1219855C

CN1219855C - 利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌r－8进行油品脱硫的方法

Info

Publication number: CN1219855C
Application number: CN 02117766
Authority: CN
Inventors: 罗明芳; 刘会洲; 邢建民; 缑仲轩; 李珊; 陈家镛
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2002-05-16
Filing date: 2002-05-16
Publication date: 2005-09-21
Anticipated expiration: 2022-05-16
Also published as: CN1458229A

Abstract

本发明涉及的利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法，其步骤如下：1.保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8对数生长期或静止期细胞的制备；2.用海藻酸钙包埋所获得的德氏假单胞菌R-8菌体；3.增殖培养所得固定化细胞；4.油品的脱硫；5.按步骤4中的油品脱硫方法重复步骤4的过程；该方法的固定化细胞活性高、稳定性好、易于回收生物催化剂重复使用，并可避免游离细胞脱硫反应所产生色素对油品的污染；海藻酸钠价格便宜，生物相容性好。故本法工艺简单，生产成本低，并易于在工业上应用。

Description

利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法

发明领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法。

背景技术

石油及其产品中含有的硫化物燃烧时产生二氧化硫，造成环境污染，并且是导致酸雨形成的主要原因之一，对人类的可持续发展造成了威胁。同时，硫化物的存在还会影响燃料及其产品的外观，腐蚀输送设备。为此必须脱除石油及其产品中的硫化物。目前，世界发达国家都制定出严格的规定来控制石油产品中的硫含量，我国SO2的排放量远远超过世界平均水平。面对日益严峻的环保形势，我国政府实施了可持续发展战略，大力推行清洁生产，并颁布了一系列环保法规。初步提出将目前柴油硫含量从5000ppm降低到2000ppm以下，部分大城市车用柴油中硫含量低于500ppm的要求。因此，开发高效、低成本的燃料脱硫技术，将对我国实施的环境保护和可持续发展战略产生积极而深远的影响。常用的脱硫方法有物理、化学和生物法。物理和化学法能有效脱除燃料中的无机硫和部分有机硫。目前普遍采用脱有机硫的方法为加氢脱硫(以下简称HDS)。HDS是一个需要催化剂和氢气的高温高压过程，对于杂环类含硫化合物，如二苯并噻酚(以下简称DBT)、带有烷基取代的DBT类化合物特别是4，6-二甲基二苯并噻吩(以下简称DMDBT)(见图1)，HDS催化剂受烷基空间位阻的影响，脱硫速度大大降低。仅靠HDS很难满足日益增加的超低硫燃料的生产要求。

生物脱硫(以下简称BDS)是利用微生物对硫源的特殊需要或代谢方式来实现硫脱除的方法。它具有反应专一、效率高、常温常压操作及受烷基空间位阻影响小的特点。另外，其设备投资仅为加氢脱硫的30％，反应过程没有有害产物生成，可以实现深度脱硫，是一种具有广阔发展前途的清洁燃料生产技术。目前，已分离了多种能脱除DBT中硫的微生物，其中有好氧菌和厌氧菌。厌氧脱硫菌如Desulfovibrio desulfurcans M6能厌氧降解DBT，并主要产生联苯。但转化率低，速度慢。好氧性脱硫菌主要有两种脱硫途径，一种是以攻击C-C键为代表的“Kodama途径”(如图2)，这种类型的代谢，由于含碳结构脱除，从而导致燃料燃烧值的降低。因此在石油及其产品的脱硫应用方面受到限制；另一种是以攻击“C-S”键为代表的硫特异性途径，又称为“4S途径”(如图3)，这一途径的优点是对底物的破坏作用很小，从而对其燃烧值的影响较小。现在国内外已发现了几十株能专一性脱硫的微生物。

要实现BDS的工业化，必需从BDS的工艺过程进行考虑，其中限制BDS工业化的主要因素为生物催化剂的生产成本，油水相比，即与反应器的体积反应速率密切相关。BDS可以采用游离形式的整细胞或酶，或固定化的整细胞或酶对油品进行脱硫。由于游离细胞或酶在油水相脱硫过程中油水相乳化严重，导致后期分离及生物催化剂的回收再利用非常困难。为了克服这些问题，固定化生物催化剂是最好的解决方法。另外，BDS是一个多酶反应过程，并且需要辅因子NADH的参与，因此采用固定化酶的方法势必导致生物催化剂的生产成本大幅度上升。由此可见，固定化整细胞是促进BDS工业化不可缺的先决条件。从现有的文献可以看出，有关固定化细胞脱硫的研究屈指可数。其中，韩国的Chang等人(Chang et al.FEMS Microbiol.Lett.，2000，182：309-312.)采用硅藻土吸附的方法对Gordona sp.CYKS1和Nocardia sp.CYKS2进行了固定化，并用此固定化细胞进行了模拟油(DBT溶于十六烷)体系和轻汽油的脱硫。该方法是采用的吸附固定化方法。由于吸附的细胞很容易从载体脱落，仍然会对后期分离带来困难。Naito等人(Naito et al.Appl Microbiol.Biotechnol.2001，55：374-378.)尝试了凝胶包埋的方法对R.erythropolis KA2-5-1进行了固定化研究，得到比较好的脱硫结果。其所选ENT-4000载体固定化的细胞在模拟油(DBT溶于十四烷)水相体系中的活性最好，该催化剂可重复使用达900h。

我国在油品微生物脱硫研究方面还处于起步阶段。中国科学院过程工程研究所分离科学与工程青年实验室分离的革兰氏阴性脱硫菌—德氏假单胞菌(Pseudomonas delafieldii)R-8能选择性脱除DBT中的硫生成2-羟基联苯，以硫酸盐的形式将硫释放到水相。该菌具有较好的脱除柴油中有机硫化物的能力(姜成英，刘会洲，邢建民等.德氏假单胞菌菌株及其在脱除含硫有机化合物中硫的应用[P].中国专利，ZL01115921.9，2001-05-28)。但在实际应用中发现，游离的R-8菌株在油水相脱硫反应后，油水相乳化严重，给油相的分离及生物催化剂的回收再利用造成很大的困难，从而会导致生物催化剂生产成本的上升。另外，反应过程中有油溶性色素产生，造成油品的污染。

由于海藻酸钙生物相容性好，价格便宜，因此常用作生物催化剂固定化载体。并且海藻酸钙固定化生物催化剂也常用于有机相酶催化反应。Naito等人(Naito etal.Appl Microbiol.Biotechnol.2001，55：374-378.)虽然也采用了海藻酸钙作为固定化载体，但由于其对模拟油体系的脱硫反应过程中未加水相，而海藻酸钙为亲水性载体，从而导致脱硫效率不高。另外，在Naito等人的研究中，两次脱硫过程中需要一个固定化细胞的活化过程，从而增加了工艺的复杂性。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法，即采用海藻酸钙包埋法对德氏假单胞菌R-8(保藏号CGMCC 0570)进行固定化，并用此固定化细胞脱除油相中的有机硫化合物；具有固定化细胞活性高，稳定性好，能有效降低油水比提高体积反应速率，易于实现生物催化剂的回收、再生和重复使用的优点，并可避免游离细胞脱硫反应所产生色素对油品的污染；海藻酸钠价格便宜，生物相容性好；其工艺简单，生产成本低，易于在工业上应用。

本发明的实施方案如下：

本发明提供的利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法，其工艺步骤如下：

1)保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8对数生长期或静止期细胞的制备：

挑取1～2环斜面保存或0.5～1毫升甘油保存的德氏假单胞菌R-8菌株，加入到体积为20～50毫升的培养基中，在30℃，170r/min的条件下培养1～2天后，再将培养后的德氏假单胞菌R-8菌株接种至含150ml上述培养基的500ml三角瓶中，摇床或发酵罐培养，5000rpm离心6min获得德氏假单胞菌R-8对数生长期或静止期细胞；将收集到的细胞用生理盐水洗涤2～3次，所得菌体悬浮于生理盐水中，得保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8菌体的生理盐水菌悬液；在4℃冰箱中放置待用；

所用培养基组成如下：去离子水1000ml，KH₂PO₄ 2.44g；Na₂HPO₄·12H₂O12.03g；NH₄Cl 2.0g；MgCl₂·6H₂O 0.4g；CaCl₂·2H₂O 0.001g；FeCl₃·6H₂O 0.001g；MnCl₂·4H₂O 0.004g；甘油10g和硫源，所述硫源为二苯并噻吩，硫酸钠或二甲基亚砜；

2)用海藻酸钙包埋所获得的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8菌体：

称取海藻酸钠溶于去离子水、生理盐水或增殖培养基中，制成质量百分比浓度为2～6％海藻酸钠水溶液，然后与等体积含德氏假单胞菌R-8菌体的生理盐水菌悬液均匀混合；将此混合液用针筒、滴定管或其它装置挤入0.1～2M CaCl₂水溶液中，形成直径为1～5mm用海藻酸钙固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8细胞的小球；室温下固化0.5～2小时，冰箱放置过夜；

所用增殖培养基组成如下：去离子水1000ml，KH₂PO₄ 0.24g；Na₂HPO₄·12H₂O1.20g；NH⁴Cl 2.0g；MgCl₂·6H²O 0.4g；CaCl₂·2H²O 0.001g；FeCl₃·6H²O 0.001g；MnCl²·4H²O 0.004g；甘油10g；

3)增殖培养上述固定化细胞：

将第2步中所制得的海藻酸钙固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8的固定化细胞从冰箱取出，用去离子水或生理盐水洗涤3～4次，然后使其悬浮于固定化细胞增殖培养基中，所述硫源为二苯并噻吩，于30℃，170r/min条件下摇床培养1～2天；

所用增殖培养基组成如下：去离子水1000ml，KH₂PO₄ 0.24g；Na₂HPO₄·12H₂O1.20g；NH⁴Cl 2.0g；MgCl₂·6H²O 0.4g；CaCl₂·2H²O 0.001g；FeCl₃·6H²O 0.001g；MnCl₂·4H²O 0.004g；甘油10g；

4)油品的脱硫：

取增殖培养活化后的海藻酸钙固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8的固定化细胞，倾去培养液，加入含硫油相和水相，进行脱硫反应，水相的体积占油水相总体积的0～50％。当硫含量降到0～30ppm以后，将油相、水相同固定化细胞分离；油水相采用常用的液液分离手段分离。所述水相为生理盐水或增值培养基；

5)上述固定化细胞的重复使用：

在经4)步反应后的固定化细胞中加入含硫油相和水相，进行脱硫反应，水相的体积占油水相总体积的0～50％。当硫含量降到0～30ppm以后，将油水相同固定化细胞分离；油水相采用常用的液液分离手段分离。所述水相为生理盐水或增值培养基；重复此过程，实现海藻酸钙固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8的固定化细胞对油品脱硫的多次使用。

本发明提供的利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法，适用于溶有DBT的十二烷、十四烷或十六烷的油相或柴油、加氢脱硫柴油、汽油等油相的油品脱硫；具有固定化细胞活性高，稳定性好，能有效降低油水相体积比提高体积反应速率，易于实现生物催化剂的回收、再生和重复使用的优点，并可避免游离细胞脱硫反应所产生色素对油品的污染；海藻酸钠价格便宜，生物相容性好；其工艺简单，生产成本低，易于在工业上应用。

附图说明

附图1为模型化合物DBT的分子结构图；

附图2为模型化合物DMDBT的分子结构图；

附图3为生物脱硫的“4S途径”示意图；

A为二苯并噻吩 B为二苯并噻吩亚砜 C二苯并噻砜

D为羟基联苯磺酸 E为羟基联苯

附图⁴为海藻酸钙固定化细胞脱除模拟油(十二烷)中的⁴，6-二甲基二苯并噻酚(DMDBT)中硫的脱硫曲线图；

—■—为DMDBT的脱硫曲线 —●—为脱硫产物曲线；

附图6为重复使用海藻酸钙固定化细胞脱除模拟油(十二烷)中的二苯并噻吩(DBT)中的硫的脱硫曲线图；

1为第1次脱硫曲线 2为第2次脱硫曲线 3为第3次脱硫曲线，

4为第4次脱硫曲线 5为第1次脱硫曲线。

具体实施方式

实施例1：

1.培养保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8的对数生长期细胞：

挑取营养斜面培养的德氏假单胞菌R-8菌株，加入体积为25毫升的培养基中，在30℃，170r/min的条件下培养2天，再将培养后的德氏假单胞菌R-8菌株接种至含150ml上述培养基的500ml三角瓶中，摇床培养至对数生长期，5000rpm离心6min获得德氏假单胞菌R-8菌体；将其用生理盐水洗涤2～3次，所得德氏假单胞菌R-8菌体悬浮于生理盐水中，在4℃冰箱中放置；

培养基的组成如下：去离子水1000ml，KH₂PO₄ 2.44g；Na₂HPO₄·12H₂O 12.03g；NH₄Cl 2.0g；MgCl₂·6H₂O 0.4g；CaCl₂·2H₂O 0.001g；FeCl₃·6H₂O 0.001g；MnCl₂·4H₂O 0.004g；甘油10g，二苯并噻吩0.1mmol/L；

2.用海藻酸钙包埋所获得的德氏假单胞菌R-8对数生长期细胞：

称取海藻酸钠溶于去离子水中，制成质量百分比浓度为4％的海藻酸钠水溶液，然后与等体积含德氏假单胞菌R-8菌体的生理盐水菌悬液均匀混合；将此混合液用针筒挤入0.1M CaCl₂水溶液中，形成直径为3mm左右用海藻酸钙固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8细胞的小球；室温下固化2小时，冰箱放置过夜；

3.增殖培养：

将第2步中所制得的海藻酸钙固定化细胞从冰箱取出，用生理盐水洗涤3次，然后悬浮于固定化细胞增殖培养基中，硫源为0.1mmol/L二苯并噻吩；于30℃，170r/min条件下摇床培养2天，得到增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞；

所用增殖培养基组成如下：去离子水1000ml，KH₂PO₄ 0.24g；Na₂HPO₄·12H₂O1.20g；NH₄Cl 2.0g；MgCl₂·6H₂O 0.4g；CaCl₂·2H₂O 0.001g；FeCl₃·6H₂O 0.001g；MnCl₂·4H₂O 0.004g；甘油10g；

4.油品的脱硫处理：

用步骤3得到的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞脱除十二烷模拟油(十二烷)相中的DBT的硫，其具体步骤如下：

取步骤3得到的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞(细胞含量相当于0.2g干细胞)于100ml三角瓶中，加5ml增殖培养基和5ml十二烷(溶解了1mmol/LDBT)，水相体积占油水相总体积的50％；在30℃，170r/min条件下，摇床反应；十二烷中的DBT及脱硫产物2-羟基联苯(2-HBP)含量采用高效液相色谱(HPLC)分析测定；反应24h，DBT残留量仅为0.02mmol/L，生成0.68mmol/L2-HBP。

实施例2：

1.培养保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8的静止期细胞：

取0.5毫升甘油保存德氏假单胞菌R-8加入体积为50毫升的培养基中，在30℃，170r/min的条件下培养2天，再将培养后的德氏假单胞菌R-8菌株接种至含150ml上述培养基的500ml三角瓶中，摇床培养2天，转入发酵罐培养至静止期，5000rpm离心6min获得德氏假单胞菌R-8菌体；将其用生理盐水洗涤2～3次，所得德氏假单胞菌R-8菌体悬浮于生理盐水中，在4℃冰箱中放置；

培养基的组成如下：去离子水1000ml，KH₂PO₄ 2.44g；Na₂HPO₄·12H₂O 12.03g；NH₄Cl 2.0g；MgCl₂·6H₂O 0.4g；CaCl₂·2H₂O 0.001g；FeCl₃·6H₂O 0.001g；MnCl₂·4H₂O 0.004g；甘油10g，二甲基亚砜2mmol/L；

2.用海藻酸钙包埋所获得的德氏假单胞菌R-8静止期细胞：

称取海藻酸钠溶于增殖培养基中，制成质量百分比浓度为2％的海藻酸钠水溶液，然后与等体积含德氏假单胞菌R-8菌体的生理盐水菌悬液均匀混合；将此混合液用针筒挤入2M CaCl₂水溶液中，形成直径为1mm左右用海藻酸钙固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8细胞的小球；室温下固化0.5小时，冰箱放置过夜；

3.增殖培养：

将步骤2所制得的海藻酸钙固定化细胞从冰箱取出，用生理盐水洗涤4次，然后悬浮于固定化细胞增殖培养基中，硫源为0.1mmol/L二苯并噻吩；于30℃，170r/min条件下摇床培养1天，得到增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞；

4.油品的脱硫处理：

用步骤3得到的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞脱除十二烷模拟油(十二烷)相中的4，6-DMDBT的硫，其具体步骤如下：

取步骤3得到的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞(细胞含量相当于0.2g干细胞)于100ml三角瓶中，加10ml十二烷(溶解了1mmol/L 4，6-DMDBT)，水相体积占油水相总体积的0％；在30℃，170r/min条件下，摇床反应；十二烷中的4，6-DBT及脱硫产物2-羟基-3，3’-二甲基联苯(HDMBP)含量采用高效液相色谱(HPLC)分析测定；反应28小时，4，6-DMDBT全部降解，生成0.8mmol/LHDMBP，其结果见附图4。

实施例3：

重复使用实施例1制得的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞脱除模拟油(十二烷)中的二苯并噻吩(DBT)中的硫：

取实施1制备的得到的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞数克(含0.2g干细胞)于100ml三角瓶中，加5ml增殖培养基和5ml十二烷(溶解了1mmol/LDBT)，水相体积占油水相总体积的50％，30℃，170r/min摇床反应，反应24小时后，倾去油水相，固定化细胞采用生理盐水洗涤3次，然后加入新鲜的增殖培养基5ml和5ml十二烷(溶解了1mmol/L DBT)；在30℃，170r/min条件，进行摇床反应；用HPLC分析油相中DBT的含量；24小时后，重复上述过程，此重复脱硫结果见附图5。

实施例4：

1.培养保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8的静止期细胞：

取1毫升甘油保存德氏假单胞菌R-8加入体积为50毫升的培养基中，在30℃，170r/min的条件下培养2天，再将培养后的德氏假单胞菌R-8菌株接种至含150ml上述培养基的500ml三角瓶中，摇床培养2天，转入发酵罐培养至静止期，5000rpm离心6min获得德氏假单胞菌R-8菌体；将其用生理盐水洗涤2～3次，所得德氏假单胞菌R-8菌体悬浮于生理盐水中，在4℃冰箱中放置；

培养基的组成如下：去离子水1000ml，KH₂PO₄ 2.44g；Na₂HPO₄·12H₂O 12.03g；NH₄Cl 2.0g；MgCl₂·6H₂O 0.4g；CaCl₂·2H₂O 0.001g；FeCl₃·6H₂O 0.001g；MnCl₂·4H₂O 0.004g；甘油10g，二苯并噻吩0.5mmol/L；

2.用海藻酸钙包埋所获得的德氏假单胞菌R-8静止期细胞：

称取海藻酸钠溶于生理盐水中，制成质量百分比浓度为6％的海藻酸钠水溶液，然后与等体积含德氏假单胞菌R-8菌体的生理盐水菌悬液均匀混合；将此混合液用针筒挤入0.2M CaCl₂水溶液中，形成直径为5mm左右用海藻酸钙固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8细胞的小球；室温下固化1小时，冰箱放置过夜；

3.增殖培养：

将步骤2所制得的海藻酸钙固定化细胞从冰箱取出，用生理盐水洗涤4次，然后悬浮于固定化细胞增殖培养基中，硫源为0.1mmol/L二苯并噻吩；于30℃，170r/min条件下摇床培养2天，得到增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞；

4.油品的脱硫处理：

用步骤3得到的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞脱除汽油中的硫，其具体步骤如下：

取步骤3得到的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞(细胞含量相当于0.5g干细胞)于100ml三角瓶中，加10ml汽油和2ml增值培养基，水相体积占油水相总体积的17％；在30℃，170r/min条件下，摇床反应24小时；固定化细胞脱硫前后汽油中的硫含量分别为50ppm和0ppm。

实施例5：

按实施例1中步骤1～3制得的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞用于加氢脱硫后柴油的脱硫，其具体实施步骤如下：

取实施1制备的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞数克(含0.5g干细胞)于100ml三角瓶中，加5ml生理盐水和10ml加氢脱硫柴油，进行反应，水相体积占油水相总体积的33％，30℃，170r/min摇床反应24小时，固定化细胞脱硫前后柴油中的硫含量分别为270ppm和5ppm。

实施例6：

按实施例1中步骤1～3制得的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞用于柴油的脱硫，其具体实施步骤如下：

取实施1制备的增殖培养活化后的海藻酸钙固定化细胞数克(含0.8g干细胞)于100ml三角瓶中，加5ml增殖培养基和10ml柴油；30℃，170r/min摇床反应48小时；固定化细胞脱硫前后柴油中的硫含量分别为1000ppm和20ppm。

Claims

1.一种利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法，其工艺步骤如下：

挑取1～2环斜面保存或0.5～1毫升甘油保存的德氏假单胞菌R-8菌株，加入到体积为20～50毫升的培养基中，在30℃，170rpm的条件下培养1～2天后，再将培养后的德氏假单胞菌R-8菌株接种至含150ml上述培养基的500ml三角瓶中，摇床或发酵罐培养，5000rpm离心6min获得德氏假单胞菌R-8对数生长期或静止期细胞；将收集到的细胞用生理盐水洗涤2～3次，所得菌体悬浮于生理盐水中，得保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8菌体的生理盐水菌悬液；在4℃冰箱中放置待用；

所用培养基组成如下：去离子水1000ml，KH₂PO₄ 2.44g；Na₂HPO₄·12H₂O12.03g；NH₄Cl 2.0g；MgCl₂·6H₂O 0.4g；CaCl₂·2H₂O 0.001g；FeCl₃·6H₂O 0.001g；MnCl₂·4H₂O 0.004g；甘油10g和0.1-2mmol/L的硫源，所述硫源为二苯并噻吩，硫酸钠或二甲基亚砜；

称取海藻酸钠溶于去离子水、生理盐水或增殖培养基中，制成质量百分比浓度为2～6％海藻酸钠水溶液，然后与等体积含德氏假单胞菌R-8菌体的生理盐水菌悬液均匀混合；将此混合液用针筒、滴定管或其它装置挤入0.1～2M CaCl₂水溶液中，形成直径为1～5mm用海藻酸钙固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8细胞的小球；室温下固化0.5～2h，冰箱放置过夜；

3)增殖培养上述固定化细胞：

将第2步中所制得的海藻酸钙固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8的固定化细胞从冰箱取出，用去离子水或生理盐水洗涤3～4次，然后使其悬浮于固定化细胞增殖培养基中，硫源为0.1mmol/L二苯并噻吩；于30℃，170rpm条件下摇床培养1～2天；

所用增殖培养基组成如下：去离子水1000ml，KH₂PO₄ 0.24g；Na₂HPO₄ ·12H₂O1.20g；NH₄Cl 2.0g；MgCl₂·6H₂O 0.4g；CaCl₂·2H₂O 0.001g；FeCl₃·6H₂O 0.001g；MnCl₂·4H₂O 0.004g；甘油10g；

4)油品的脱硫：

取增殖培养活化后的海藻酸钙的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8固定化细胞，倾去培养液，加入含硫油相和水相，进行脱硫反应，水相的体积占油水相总体积的0～50％；当硫含量降到0～30ppm以后，将油水相同固定化细胞分离；所述水相为生理盐水或增值培养基。

2.按权利要求1所述的利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法，其特征在于，所述的油品为汽油，柴油和加氢脱硫柴油。

3.按权利要求2所述的利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法，其特征在于，所述油品为有机硫含量50～1000ppm的汽油，柴油和加氢脱硫柴油。

4.按权利要求1所述的利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法，其特征在于，步骤4)分离得到的固定化细胞再用于含硫油品的脱硫处理：在步骤4)分离得到的固定化细胞中加入含硫油相和水相，进行脱硫反应，水相的体积占油水相总体积的0～50％，所述水相为生理盐水或增值培养基。