CN105176888B - 一株假单胞菌及其在降解石油类污染物中的应用 - Google Patents
一株假单胞菌及其在降解石油类污染物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105176888B CN105176888B CN201510690558.1A CN201510690558A CN105176888B CN 105176888 B CN105176888 B CN 105176888B CN 201510690558 A CN201510690558 A CN 201510690558A CN 105176888 B CN105176888 B CN 105176888B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pseudomonas
- lky
- oil
- dibenzothiophenes
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Production Of Liquid Hydrocarbon Mixture For Refining Petroleum (AREA)
Abstract
本发明涉及微生物在环境污染物降解中的应用领域，特别涉及一株假单胞菌及其在降解石油类污染物中的应用，本发明从中国胜利油田石油污染土壤中筛选出一株假单胞菌（Pseudomonas sp.LKY‑5），它的保藏号是CCTCC NO：M 2015448。本发明筛选得到的Pseudomonas sp.LKY‑5能有效降解含硫杂环芳烃如二苯并噻吩、苯并噻吩、烷基二苯并噻吩、4,6‑二甲基二苯并噻吩、2,4,6‑三甲基二苯并噻吩等；同时，还可以降解原油中其他的污染物如正十六烷、菲、芘、咔唑等多种污染物。
Description
技术领域
本发明涉及微生物在环境污染物降解中的应用领域，特别涉及一株假单胞菌及其在降解石油类污染物中的应用。
背景技术
石油类污染物是油田开发和石油加工过程中产生的最重要的污染物。石油类污染物的危害主要表现在对人类、动物、土壤和天然水体的危害和影响。石油类污染物已列入我国危险废物名录，在列入的48种危险废物中，石油类排第8位。
井喷、油罐泄漏、油轮泄漏、油田设备检修、石化生产、运输事故等，都会溢出和排放石油烃类。其中，含硫杂环芳烃是高硫原油的重要组成，70％以上的含硫化合物是二苯并噻吩(DBT)和其衍生物，它属于污染面广、毒性更大的一类难降解有机物，具有强致癌、致畸和致突变效应。石油、石化产品以及炼焦生产在生产、运输以及使用过程中会造成土壤和地下水的污染，并产生大量的废水，含硫杂环芳烃作为主要的污染物之一的降解对于土壤生物修复以及石化污水、炼焦废水的处理具有重要意义，此外这些污染中还含有烷烃和多环芳烃等污染物。
生物治理是指微生物利用污染物作为碳源或其他营养源如氮源、硫源等，将其分解利用转化为二氧化碳、水以及无机矿物质等。生物治理/处理因为成本低、操作简单、条件温和以及无二次污染等优势，在土壤生物修复以及石化污水、炼焦废水的处理过程中具有绝对的优势，筛选、获得对含硫杂环芳烃具有快速降解能力，以及对烷烃、多环芳烃等污染物具有降解作用的高效微生物菌株，可以将其投加于待修复的土壤以及污水处理中，来大幅提高生物降解的效果，这对保护生态具有重要意义。
一般来说生物降解菌要求具有对生长环境要求低、生长速度快、降解速度快、可耐受或可降解多种污染物的优势。
二苯并噻吩作为含硫杂环芳烃的模式物，微生物对二苯并噻吩的代谢途径主要分为“4S”途径(产物为2-羟基联苯)和“Kodama”途径(产物为3-羟基-2-甲酰基苯并噻吩)，不能完全矿化生成二氧化碳和水，生物修复价值较低。此外，实际污染情况下往往有多种底物同时存在，因而能够利用和降解多种底物的降解菌将在生物修复过程中占有重要地位。
发明内容
本发明提供一株假单胞菌及其在降解石油类污染物中的应用。
本发明的技术方案是：
本发明从中国胜利油田石油污染土壤中筛选出一株假单胞菌(Pseudomonassp.LKY-5)，于2015年7月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号是CCTCC NO：M 2015448。它能够将二苯并噻吩降解生成邻苯二酚，进入三羧酸循环，生成CO2和H2O，该代谢途径相较已有的“4S”途径和“Kodama”途径有进一步的延伸，可以7天完全降解100mg/L的二苯并噻吩。
本发明的另一个目的在于公开该假单胞菌在降解石油类污染物中的应用。
石油类污染物主要包括烷烃(正十六烷)、多环芳烃(菲、芘)、含硫杂环芳烃(二苯并噻吩)、含氮杂环芳烃(咔唑)等，其中，含硫杂环芳烃是污染物中最为顽固，且极难降解的一类物质。
1)菌株的筛选及分离纯化
取1g新鲜土样加入到筛选培养基中，在温度为30℃、转速为160rpm的摇床中振荡培养一周后，接种5％的培养液转接至新鲜的培养基中继续培养，相同条件下连续转接5～7次。然后取培养液进行梯度稀释，涂布于二苯并噻吩-无机盐固体培养基上，培养3天后，挑取产生降解圈的菌落，在LB平板上划线分离纯化，直至得到纯的单菌落。将菌株经培养后，再单独接种到DBT-无机盐液体培养基中摇瓶培养，选择降解效果最好的菌株作为研究对象。
其中：
无机盐培养基：Na2HPO40.6g，KH2PO40.2g，NaNO34.0g，CaCl20.01g，FeSO40.01g，MgSO40.3g，酵母粉0.5g，蒸馏水1000mL，调节pH至7.2～7.5。(CaCl2和MgSO4单独高温灭菌，FeSO4过滤除菌)
筛选培养基：在无机盐培养基的基础上加40mg/L的二苯并噻吩的丙酮溶液。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.5。
DBT-无机盐固体培养基：在无机盐培养基中加入20g/L的琼脂，将DBT的丙酮溶液涂布于固体培养基上。
2)菌株的分子生物学鉴定：
将分离的菌株提取总DNA后进行PCR扩增，
正向引物27F：5'-agagtttgatcctggctcag-3'，SEQ ID NO.1
反向引物1492R：5'-ggttaccttgttacgactt-3'，SEQ ID NO.2
PCR条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增之后的产物送至上海生工生物公司进行测序。该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
将LKY-5的测序结果提交到GenBank进行比对，发现LKY-5和Pseudomonassp.BC041(HQ105010)同源性为99％，命名为Pseudomonas sp.LKY-5。
Pseudomonas sp.LKY-5的扫描电镜分析见图1。从图1中可以看出，LKY-5菌株以杆菌形态存在，长度约为1.5μm，宽度约为0.42μm。
二苯并噻吩作为含硫杂环芳烃的模式物，经过分析可知，本发明筛选的LKY-5对二苯并噻吩(DBT)的降解主要有以下两条代谢途径。
一条代谢途径为：DBT首先在加氧酶的作用下生成DBT砜，然后打开噻吩环上的C-S键生成2’-羟基联苯基-2-亚磺酸盐，然后脱掉磺酸基生成2-羟基联苯，然后再脱掉羟基生成联苯，联苯发生开环反应，生成2-羟基-6-酮基-6-苯基-2,4己二烯，随后水解生成苯甲醛，然后氧化生成苯甲酸，苯甲酸在双加氧酶的作用下生成邻苯二酚(儿茶酚)，或者苯甲醛在单加氧酶作用下生成2-羟基苯甲醛，随后氧化生成2-羟基苯甲酸(水杨酸)，然后再生成邻苯二酚，最后生成2-羟基己二烯半醛酸进入三羧酸循环，生成CO2和H2O。
另一条代谢途径为：DBT断裂一个苯环生成3-羟基-2-甲酰基苯并噻吩，然后脱掉羧基生成3-羟基苯并噻吩，或脱掉羟基生成苯并噻吩-2-羧酸，然后生成2,3-苯并噻吩二酮，断裂噻吩环生成硫代水杨酸，随后生成苯甲酸，最后生成邻苯二酚进入三羧酸循环，生成CO2和H2O。或者两个2,3-苯并噻吩二酮生成硫靛，然后生成2-巯苯基乙醛酸，再生成苯乙酸。
本发明的有益效果是：
1)本发明筛选得到的Pseudomonas sp.LKY-5能够将二苯并噻吩降解生成邻苯二酚，进入三羧酸循环，生成CO2和H2O，该代谢途径相较已有的“4S”途径和“Kodama”途径有进一步的延伸，具有较高的生物修复价值。
2)本发明筛选得到的Pseudomonas sp.LKY-5能有效降解含硫杂环芳烃如二苯并噻吩、 苯并噻吩、烷基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩、2,4,6-三甲基二苯并噻吩等；同时，还可以降解原油中其他的污染物如正十六烷、菲、芘、咔唑等多种污染物。
附图说明
附图1为本发明的假单胞菌菌株Pseudomonas sp.LKY-5的扫描电镜图；
附图2为本发明具体实施例3中Pseudomonas sp.LKY-5对石油类污染物的降解情况。
具体实施方式
本发明的具体实施方式如下：
实施例1：二苯并噻吩降解
将Pseudomonas sp.LKY-5菌株接种至100mL含有100mg/L二苯并噻吩的无机盐培养基中。30℃，pH 7.5，接种量10wt％，160rpm摇床培养7天，用6M的HCl酸化至pH≤2后，加入等体积的乙酸乙酯萃取，于4℃，5000rpm离心10min，取上清液用Bruker 450气相色谱仪(FID，HP5毛细管柱)测定，二苯并噻吩降解率达100％。
实施例2：
将Pseudomonas sp.LKY-5菌株分别接种至含有100mg/L的菲、芘、咔唑、正十六烷的无机盐培养基中，30℃，pH 7.5，接种量10wt％，160rpm摇床培养7天，正十六烷采用Bruker450气相色谱仪测定。菲、芘和咔唑采用高效液相色谱Waters 2695测定，使用紫外检测器，Waters sunfire C18反相色谱柱(柱长150mm，内径4.6mm，填料5μm)，柱子恒温25℃，于254nm检测物质的吸收峰，流动相A为含0.5％三氟乙酸的水，流动相B为含0.5％三氟乙酸的乙腈。采用梯度洗脱，见表1。
表1 梯度洗脱程序
结果如图2所示，Pseudomonas sp.LKY-5对正十六烷、菲、芘和咔唑均有降解效果，降解能力顺序为正十六烷＞菲＞咔唑＞芘。
实施例3：
分别添加2mL市售0号柴油(密度为0.841g/mL)、2mL青岛炼化催化裂化柴油(密度为0.9468g/mL)于无机盐培养基中(培养基终体积为30mL)，Pseudomonas sp.LKY-5菌株的接种量为10wt％，不接种的作为空白对照。30℃，160rpm，培养时间7天后，将空白对照和降解后的含油培养基用石油醚(30～60℃)进行振荡萃取，合并萃取液，于5000rpm、4℃下离心10min，经无水硫酸钠脱水后，在30℃下减压旋转蒸发至石油醚完全挥发后，移至色谱瓶中，采用美国Varian 3800气相色谱仪进行分析。检测器为脉冲式火焰光度检测器(PFPD)，HP-5NS石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)，进样量1μL，分流比30:1，进样口温度300℃，柱温80℃保持2min，然后6℃/min升至280℃，载气He，流速1mL/min。柴油中总含硫量测定采用Multi EA 3100S/N微量分析仪。结果如表2所示。
表2 柴油中不同类型硫化物的降解
Claims (6)
1.一株假单胞菌（Pseudomonas sp. LKY-5），它的保藏号是CCTCC NO：M 2015448。
2.如权利要求1所述的假单胞菌，其特征在于，它的16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种如权利要求1所述的假单胞菌在降解石油类污染物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的石油类污染物为含硫杂环芳烃。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述含硫杂环芳烃为二苯并噻吩。
6.如权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于，将所述的假单胞菌Pseudomonassp. LKY-5菌株接种到石油类污染物中进行降解。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510690558.1A CN105176888B (zh) | 2015-10-22 | 2015-10-22 | 一株假单胞菌及其在降解石油类污染物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510690558.1A CN105176888B (zh) | 2015-10-22 | 2015-10-22 | 一株假单胞菌及其在降解石油类污染物中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105176888A CN105176888A (zh) | 2015-12-23 |
| CN105176888B true CN105176888B (zh) | 2019-04-02 |
Family
ID=54899322
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510690558.1A Expired - Fee Related CN105176888B (zh) | 2015-10-22 | 2015-10-22 | 一株假单胞菌及其在降解石油类污染物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105176888B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105907676B (zh) * | 2016-05-04 | 2019-09-06 | 大连海事大学 | 一株具有低温降解石油功能的交替假单胞菌及其应用 |
| CN105907677B (zh) * | 2016-05-04 | 2019-09-06 | 大连海事大学 | 具有低温降解多环芳烃功能的交替假单胞菌及其应用 |
| CN108034625B (zh) * | 2018-02-06 | 2020-08-04 | 北京大学 | 一种含油污泥中石油烃类的降解菌株jn7及其应用 |
| CN108048374B (zh) * | 2018-02-06 | 2020-08-04 | 北京大学 | 一种含油污泥中石油烃类的降解菌株jn4及其应用 |
| CN108102978B (zh) * | 2018-02-06 | 2020-08-04 | 北京大学 | 一种含油污泥中石油烃类的降解菌株jn8及其应用 |
| CN108504591B (zh) * | 2018-03-23 | 2021-06-25 | 辽宁大学 | 一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的复合菌剂及其应用 |
| CN109929781B (zh) * | 2019-03-26 | 2021-02-02 | 中国矿业大学 | 一株降解菲的菌株及其在土壤修复中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101955896A (zh) * | 2010-06-18 | 2011-01-26 | 上海交通大学 | 一株有机溶剂耐受型假单胞菌及其在降解多环芳烃中的应用 |
| CN102367423A (zh) * | 2011-09-19 | 2012-03-07 | 北京大学 | 一株咔唑降解细菌及其培养方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1219855C (zh) * | 2002-05-16 | 2005-09-21 | 中国科学院过程工程研究所 | 利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌r－8进行油品脱硫的方法 |
-
2015
- 2015-10-22 CN CN201510690558.1A patent/CN105176888B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101955896A (zh) * | 2010-06-18 | 2011-01-26 | 上海交通大学 | 一株有机溶剂耐受型假单胞菌及其在降解多环芳烃中的应用 |
| CN102367423A (zh) * | 2011-09-19 | 2012-03-07 | 北京大学 | 一株咔唑降解细菌及其培养方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Optimization for microbial Degradation of Dibenzothiophene by Pseudomonas sp.LKY-5 Using Response Surface Methodology;Li Lin，et al;《China Petroleum Processing and Petrochemical Technology》;20141231;第16卷(第1期);abstract，experimental * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105176888A (zh) | 2015-12-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105176888B (zh) | 一株假单胞菌及其在降解石油类污染物中的应用 | |
| Rathour et al. | Biodegradation of pyrene in soil microcosm by Shewanella sp. ISTPL2, a psychrophilic, alkalophilic and halophilic bacterium | |
| Tavassoli et al. | Asphaltene biodegradation using microorganisms isolated from oil samples | |
| Al-Baldawi et al. | Phytodegradation of total petroleum hydrocarbon (TPH) in diesel-contaminated water using Scirpus grossus | |
| Pineda-Flores et al. | A microbial consortium isolated from a crude oil sample that uses asphaltenes as a carbon and energy source | |
| Ingle et al. | Nanoremediation: a new and emerging technology for the removal of toxic contaminant from environment | |
| KR101241546B1 (ko) | 신규한 스핑고모나스 속 미생물 및 이를 이용한 메탄 또는 악취유발 화합물의 분해방법 | |
| Al-Sbani et al. | Sub-surface flow system for PAHs removal in water using Lepironia articulate under greenhouse conditions | |
| Papizadeh et al. | Growth-phase dependent biodesulfurization of dibenzothiophene by Enterobacter sp. strain NISOC-03 | |
| CN109161499A (zh) | 一种产表面活性剂细菌及其在煤/石油化工废水中原位削减多环芳烃的应用 | |
| CN110669700A (zh) | 一株高效石油烃降解菌pa16_9及其筛选方法与应用 | |
| Yadav et al. | Leveraging the biosorption potential of Leptolyngbya boryana for Cr (VI) removal from aqueous solution | |
| Akash et al. | Biotransformation as a tool for remediation of polycyclic aromatic hydrocarbons from polluted environment-review on toxicity and treatment technologies | |
| Chebbi et al. | A moderately thermophilic and mercaptan-degrading Bacillus licheniformis strain CAN55 isolated from gas-washing wastewaters of the phosphate industry, Tunisia | |
| KR101332347B1 (ko) | 유류 분해능을 가지는 슈도모나스 속 ｎｒ1 균주 및 이를 이용한 유류 분해 방법 | |
| Zang et al. | Biodegradation of 2-naphthol and its metabolites by coupling Aspergillus niger with Bacillus subtilis | |
| Kumar et al. | Biotreatment of oil-bearing coke-oven wastewater in fixed-film reactor: a viable alternative to activated sludge process | |
| Handayani et al. | Biodegradation of BTEX by indigenous microorganisms isolated from UCG project area, South Sumatra | |
| Khedkar et al. | Degradation of dibenzothiophene and its metabolite 3-hydroxy-2-formylbenzothiophene by an environmental isolate | |
| Singh et al. | Evaluation of carbazole degradation by Enterobacter sp. isolated from hydrocarbon contaminated soil | |
| Kim et al. | Isolation and characterization of ethylbenzene degrading Pseudomonas putida E41 | |
| Russel et al. | Exploring the novel indigenous strains for degrading the crude oil contaminants in soil sample | |
| Varjani et al. | Soil microcosm study for bioremediation by a crude oil degrading Pseudomonas aeruginosa NCIM 5514 | |
| CN104120096B (zh) | 一种小单孢菌菌株及其应用 | |
| Wang et al. | Performance and mechanism of the in situ restoration effect on VHCs in the polluted river water based on the orthogonal experiment: photosynthetic fluorescence characteristics and microbial community analysis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190402 Termination date: 20201022 |