CN102367423A - 一株咔唑降解细菌及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株咔唑降解细菌及其培养方法。本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039，其保藏号为CGMCC No.4222，还提供了假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在降解咔唑中的应用。本发明的实验证明，本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039，可作为难降解有机废水生物治理工艺中的生物强化剂，并借此开发出相应的环保生物制剂，具有较高的研究、应用及市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株咔唑降解细菌及其培养方法。
背景技术
受启于地球自净过程的生物作用具有成本低、二次污染轻、环境相容性好等优势，以微生物处理废水的生物处理技术日益受到人们的关注。在生物处理技术中，具有高活性降解功能的微生物群体充当着重要角色。传统废水生物处理法利用的是大量自然的、或经过一定驯化的微生物种群，在处理系统的工作条件下有效地去除易降解的有机污染物；然而，随着现代工业的迅速发展，当前越来越多的废水中含有多种有毒有害物质，致使传统生物处理系统中大多数普通微生物种群失活和失效。因此，对特种微生物进行分离、筛选，对功能基因进行分离、提取，以及借此获得或构建各种环境工程菌已成为环境科学、生命科学的研究热点。
目前工业生产产生和排放大量的芳香族化合物，这其中包含大量的杂环化合物，且绝大多数属高毒性、难降解污染物。有研究表明，烷基化多环芳烃物质与杂环芳烃共存时所具有的生物毒性比其自身毒性高40-70倍，因此杂环类化合物一直受到许多研究者的关注。咔唑为三元非碱性氮杂环芳烃化合物，为无色单斜片状结晶，微溶于水，溶于乙醇、乙醚等多种有机溶剂，对人体健康和生态环境存在着危害。咔唑在化工行业(如焦化、石油、染料、制药等)中广泛存在，是一种常见的有毒污染物。
关于咔唑的生物降解的研究，在20世纪90年代才有第一例报道，随着科学研究的深入，咔唑的微生物降解机理(包括降解途径以及降解基因等)已被完整报道，降解时咔唑杂环中的氮被转化为氨氮释放到水体，易产生氨氮二次污染。在全球氮循环转化中，微生物起着关键的作用，传统的生物脱氮理论包括好氧硝化、异养反硝化，后由Robertson和Kuenen发现了细菌的好氧反硝化现象，补充完善了氮转化的理论。
对于特异性的咔唑降解菌株的降解特性及机理的研究是解决实际污染问题的根本，也是实现生物基因技术突破的基础。因此，有必要研究菌株的咔唑降解性能和降解途径，另外考察其对副产物氨氮的转化能力，以期获得具有同步去除咔唑和氨氮污染的复合功能的菌株材料，有望应用于我国有机工业废水的生物治理中。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039。
本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039，其保藏号为CGMCC No.4222。
所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在降解咔唑中的应用也是本发明保护的范围；
或所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在制备降解咔唑产品中的应用也是本发明保护的范围。
所述降解的温度为30℃-35℃，所述降解的温度具体为30℃，所述降解初始pH值为7.0，所述降解的时间为0h-48h，所述降解的时间具体为36h。
所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在转化氨氮中的应用也是本发明保护的范围；
或所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在制备转化氨氮产品中的应用也是本发明保护的范围。
所述转化氨氮采用硝化和反硝化的方式；
所述硝化的温度为30℃-35℃，所述硝化的温度具体为30℃，所述硝化的时间为0h-36h，所述硝化的时间具体为36h；
所述反硝化的温度为30℃-35℃，所述反硝化的温度具体为30℃，所述反硝化的时间为0h-120h，所述反硝化的时间具体为24h。
所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在防治废水中咔唑和/或氨氮污染的应用也是本发明保护的范围；
或所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在制备降解咔唑和/或转化氨氮产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种制备降解咔唑和/或转化氨氮产品的方法。
本发明提供的方法，为发酵所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222，收集发酵产物，即得到降解咔唑产品。
所述发酵的温度为30℃-35℃，所述发酵的温度具体为30℃；
所述发酵时间为20h-36h，所述发酵时间具体为20h、24h或36h；
所述发酵的振荡频率为150rpm-180rpm，所述发酵的振荡频率具体为180rpm，所述发酵的振幅为26mm。
所述发酵的培养基为LB培养基或无机盐培养基(MSM)；
LB培养基：每1000mL水中含：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，调节pH 7.0。
无机盐培养基(MSM)：每1000mL水中含：Na2HPO4 4.26g，KH2PO4 2.65g，MgSO4·7H2O 0.20g，CaCl2 0.006g，H3BO3 0.000006g，ZnCl2 0.00007g，MnSO4·H2O0.0012g，CuCl2·2H2O 0.000002g，CoCl2·6H2O 0.00019g，Na2MoO4·2H2O 0.000024g，FeCl3·6H2O 0.00015g，NiCl·6H2O 0.000024g，调节pH 7.0。固体MSM添加琼脂1.5％-2.0％(m/v)。
假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039于2010年10月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路一号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.4222，该菌株的分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.。
本发明的实验证明，本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039，一方面对咔唑具有很强的降解活性，另一方面可对氨氮及其它含氮物质转化，且其具有培养方法简单，生长速度快的优点，非常适用于含有咔唑类污染物的高氨氮废水(如焦化废水)的生物治理，可作为难降解有机废水生物治理工艺中的生物强化剂，并借此开发出相应的环保生物制剂，具有较高的研究、应用及市场价值。
附图说明
图1为假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039的电镜照片
图2为假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039对咔唑的降解
图3为假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039咔唑降解基因carAa电泳谱图
图4为假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039的硝化特征曲线
图5为假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039的反硝化特征曲线
图6为假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039反硝化基因nirS和nosZ电泳谱图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所有培养基中的溶剂均为去离子水。
无机盐培养基(MSM)：每1000mL水中含：Na2HPO4 4.26g，KH2PO4 2.65g，MgSO4·7H2O 0.20g，CaCl2 0.006g，H3BO3 0.000006g，ZnCl2 0.00007g，MnSO4·H2O0.0012g，CuCl2·2H2O 0.000002g，CoCl2·6H2O 0.00019g，Na2MoO4·2H2O 0.000024g，FeCl3·6H2O 0.00015g，NiCl·6H2O 0.000024g，调节pH 7.0。固体MSM添加琼脂1.5％-2.0％(m/v)。
实施例1、假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039的分离纯化、鉴定及耐药性
1、分离纯化
假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039是从焦化活性污泥中分离、纯化而得到的一株G-细菌，在以一定浓度的咔唑(DMSO溶解态)为选择压力的条件下，即以咔唑作为唯一可利用的碳源与氮源，从长期驯养的活性污泥中，经过富集、分离、筛选、纯化等步骤得到菌株BC039。
具体分离过程如下：将采集的焦化活性污泥样品，接种到含咔唑的液体MSM选择培养基(该培养基中填加咔唑为微生物可利用的唯一碳源与氮源，DMSO溶解态咔唑+MSM)的摇瓶中，30℃、180rpm下振荡培养五个周期，每个周期约3d，五个周期的咔唑浓度依次为100、200、300、500、500mg/L。将富集菌液稀释至10-7倍，涂布到固体MSM咔唑选择培养基上，30℃恒温培养，直至长出明显可见的菌落。挑取单菌落，采用平板划线纯化法对菌种进行纯化，观察记录菌落形态，检测纯度，直至获得以咔唑为唯一碳源与氮源生长的纯菌株，命名为BC039。
2、鉴定
1)形态观察
将该菌株BC039分别接种在加咔唑的普通细菌LB固体培养基及无机盐加咔唑(500mg/L)选择性固体培养基(咔唑+MSM/LB)上生长，观察菌落，该菌均可在上述培养基上生长，且菌落淡黄色、不透明、呈圆形，边缘光滑，菌株为G-球形或短杆菌，长约1.3-1.8μm，直径约0.5-0.6μm(见图1)，易聚堆，不运动。
2)分子生物学鉴定
从MSM固体培养基中挑取单克隆BC039，接种于50mL的LB液体培养基中，在30℃、180rpm条件下振荡，过夜培养至OD602为1左右，4000rpm离心10min收集菌体；取1-2mL菌液，采用TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化，北京)提取细菌的总DNA。
以菌株BC039的总DNA作为模板，以27F(5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3’)与1492R(5’TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3’)为引物，对该菌株的16S rDNA片段PCR进行扩增，得到16S rDNA，测序为序列1，将该序列进行blast比对，与Pseudomonas stutzeri strain 53(HQ680964)的同源性为99％，因此鉴定为菌株BC039是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。
3)生理生化鉴定
好氧呼吸代谢：取1mL生长至对数期的BC039菌液，与冷却至40℃左右的半固体培养基在培养皿中混合均匀，于30℃的培养箱中培养2d，若只在培养基表面长出菌落，则为好氧菌；若在培养基的表层和内部都有菌落出现，则为兼性菌；如果只在培养基内部生长则为厌氧菌。BC039菌株仅生长于培养基表面，说明其营好氧呼吸。
综合菌株形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列，鉴定BC039为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039。
假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039于2010年10月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路一号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.4222，该菌株的分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.。
3、假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039的抗性谱
假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039对头孢、卡那霉素、利福平、氨苄青霉素、氯霉素、四环素、壮观霉素七种抗生素的抗性。
采用稀释涂布法将该菌株分别接种于含有不同浓度的上述抗生素的LB固体培养基，30℃静置培养3d，观察菌体在培养基表面上形成菌落的情况。抗性试验结果列于表1。
表1假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039在不同抗生素条件下的生长状况
注：表中“+”表示菌体在相应的抗性平板上生长，“+”越多表示菌株长得越好；“-”表示菌体在相应的抗性平板上不生长。
可以看出，假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039除对头孢、氨苄青霉素、壮观霉素、氯霉素4种抗生素有抗性外，对其余抗生素敏感。
实施例2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039的功能研究
一、假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039对咔唑的生物降解
1、假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039对咔唑的生物降解
从MSM固体培养基上挑取单克隆假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039，接种于100mL的LB液体培养基中，在30℃、180rpm(振幅26mm)条件下振荡培养36h，4000rpm离心10min收集菌体；再用无菌液体MSM洗涤该菌液，以去除残余的LB培养基及菌的代谢杂质；然后再以4000rpm离心10min收集菌体；最后将所得菌体用MSM水溶液重悬，制备成菌悬液。
配制含咔唑浓度为520.6mg/L的MSM选择培养基100mL，初始pH值为7.0，接种上述制备的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039菌悬液(菌量约为0.04g/L)，同时设置空白对照组(体系中不投加BC039菌悬液)及死细胞对照组(经121℃、20min高温灭菌而得等浓度BC039死细胞的菌悬液)，降解试验在30℃、180rpm(振幅26mm)恒温摇床中进行，降解时间为48h。
咔唑的检测方法采用高效液相色谱(HPLC)法：
样品预处理：在好氧降解过程中，每隔一定时间采集水样，水样经等体积乙酸乙酯萃取，VOTEX充分振荡3min，然后用Eppendorf离心机以10000rpm离心10min，回收率可达97％，上层有机相用0.22μm有机系滤膜过滤后用于咔唑的HPLC定量分析。
高效液相色谱仪为岛津SHIMADZU，LC-VP系列，色谱柱为Diamosil(TM)钻石C18柱，250mm×4.6mm，粒度为5μm；流动相为甲醇/水＝9/1(v/v)，流动相流速为1.0mL/min。测定波长254nm。
咔唑降解结果如图2所示，经驯化后的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039对MSM中的咔唑有较好的降解效果，在投入反应体系后，迅速进入快速降解阶段，不存在抑制现象。36h内对所试浓度的咔唑几乎完全降解，36h时，咔唑去除率达98.7％(残留咔唑为6.67mg/L)。与空白对照组及死细胞对照组比较，确定咔唑的去除作用主要是由生物降解产生的，而非生物吸附或自然挥发导致。在咔唑快速降解期，即0-21h内，假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039对咔唑的平均去除速率
为19.86mg/(L·h)。
2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039咔唑降解基因的考察
咔唑1，9-双加氧酶(CARDO)参与咔唑的角双加氧反应生成2`-氨基联苯-2，3-二醇，CARDO由末端氧化酶(CarAa)、铁氧化还原蛋白(CarAc)以及铁氧化还原蛋白还原酶(CarAd)组成，其中carAa从基因序列及进化距离上均与其它双加氧酶有较大差异，可视为咔唑1，9-双加氧酶的标识基因。此基因的检测过程如下：
1)、DNA提取
同实施例1中的2鉴定中2)分子生物学鉴定中总DNA的提取方法。
2)、PCR扩增
上游引物：5′-GCGAGCCGAAGACACTAA-3′；
下游引物：5′-GCGTAGAAATCCACCATAGC-3′。
反应体系：TAKARA(Takara Bio.，日本)Taq HS PreMix型DNA聚合酶25μL，上游引物、下游引物和DNA模板各1μL，以ddH2O补足50μL。反应在200μL PCR管(AXYGEN，美国)中进行。
PCR温度程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃终延伸10min，4℃保存。反应在PCR热循环仪(Takara Bio.，日本)中进行。
3)、检测
PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳分离鉴定，电压为100V，电泳谱图见图3所示，其中M：Marker，分子量从上至下为4500，3000，2000，1200，800，500，200bp；1：阴性对照；2：carAa基因，PCR产物约900bp。
将PCR产物采用ABI 3730xl DNA分析仪(Applied Biosystems，美国)进行双向DNA序列分析，结果在GenBank中经BLAST软件进行了序列同源性比较，得出其与已知咔唑降解基因Pesudomonas resinovorans CA10的carAa(AB088420)相似度为97％。因此，可以确定假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039具有咔唑降解基因carAa。
二、假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039氮转化能力(转化氨氮)的考察
1、硝化特性
反应体系为100mL的MSM，以葡萄糖提供碳源，以NH4Cl提供氮源，NH4+-N初始浓度为83.7mg/L，初始C/N为25∶1，接种由上述步骤一的1得到的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039菌悬液，菌量约为0.04g/L，在30℃、180rpm(振幅26mm)的恒温摇床上振荡培养36h。
结果见图4，可以看出，假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039在36h内可将浓度为83.7mg/L的NH4 +-N完全利用和转化，一部分经同化作用生成微生物细胞的组成成分，其中微生物细胞浓度以OD602计，由初始的0.12最高增长至3.13；另一部分经微生物硝化作用氧化生成硝酸盐，整个硝化反应过程中NO3 --N的浓度最高达16.0mg/L。
2、反硝化特性
反应体系为100mL的MSM，以葡萄糖提供碳源，以KNO3提供氮源，NO3 --N初始浓度为95.8mg/L，初始C/N为25∶1，接种由上述步骤一的1得到的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039菌悬液，菌量约为0.04g/L，在30℃、180rpm(振幅26mm)的恒温摇床上振荡培养120h。
结果如图5，可以看出，假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039可在24h内将NO3 --N去除，除了细胞合成利用硝氮，BC039还可利用葡萄糖为碳源，对硝氮进行反硝化反应。NO3 --N快速转化过程中，有少量NO2 --N的积累，这说明BC039优先利用NO3 --N为氮源进行反硝化作用。在NO3 --N快速转化的前24h内，NO3 --N的去除速率为3.83mg/(L·h)。
3、假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC03反硝化基因的考察
亚硝酸盐还原酶基因(nirS)和氧化二氮还原酶基因(nosZ)两个基因可视为是反硝化过程中的基因标记。nirS可转化NO2 -生成NO，nosZ还原NO生成N2。功能基因的测定可从基因学的角度判断反硝化路径及氮最终转化的形态。
1)、DNA提取
同实施例1中的2鉴定中2)分子生物学鉴定中总DNA的提取方法。
2)、PCR扩增
nirS-F：5′-CACGG
GT
CTGCGCAAGGGCGC-3′
nirS-R：5′-CGCCACGCGCGG
TCGGGTGGTA-3′
nosZ-F：5′-CG
TGTTC
TCGACAGCCAG-3′
nosZ-R：5′-CATGTGCAG
GC
TGGCAGAA-3′
黑体部分表示：B，G+T+C；M，A+C；N，A+C+G+T；R，A+G；S，G+C；Y，C+T
反应体系：DNA聚合酶选用TAKARA(Takara Bio.日本)Taq HS PreMix25μL。上游引物、下游引物和DNA模板各1μL，以ddH2O补足50μL。反应在200μL PCR管(AXYGEN，美国)中进行。
温度反应程序：94℃预变性3min；94℃变性20s，65℃退火30s，72℃延伸30s，1个循环；94℃变性20s，62℃退火30s，72℃延伸35s，2个循环；94℃变性20s，59℃退火30s，72℃延伸40s，3个循环；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸45s，4个循环；94℃变性20s，53℃退火30s，72℃延伸50s，5个循环；94℃变性20s，50℃退火45s，72℃延伸1min，25个循环；最后，72℃终延伸10min，保存在4℃。反应在PCR热循环仪(Takara Bio.，日本)中进行。
3)、检测
PCR扩增后产物在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳分离鉴定，电压为100V。电泳谱图见图6所示，可以看出PCR产物约700bp，与GenBank中Shinella zoogloeoides BC026的nosZ(EU346731)同源基因序列相似。可推断出得出假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039可将硝氮最终还原生成氮气。
Claims (8)
1.假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039，其保藏号为CGMCC No.4222。
2.权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在降解咔唑中的应用；
或权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在制备降解咔唑产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述降解的温度为30℃-35℃，所述降解的温度具体为30℃，所述降解初始pH值为7.0，所述降解的时间为0h-48h，所述降解的时间具体为36h。
4.权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在转化氨氮中的应用；
或权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在制备转化氨氮产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述转化氨氮采用硝化和反硝化的方式；
所述硝化的温度为30℃-35℃，所述硝化的温度具体为30℃，所述硝化的时间为0h-36h，所述硝化的时间具体为36h；
所述反硝化的温度为30℃-35℃，所述反硝化的温度具体为30℃，所述反硝化的时间为0h-120h，所述反硝化的时间具体为24h。
6.权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在防治废水中咔唑和/或氨氮污染中的应用；
或权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222在制备降解咔唑和/或转化氨氮产品中的应用。
7.一种制备降解咔唑和/或转化氨氮产品的方法，为发酵权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC039CGMCC No.4222，收集发酵产物，即得到降解咔唑产品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述发酵的温度为30℃-35℃，所述发酵的温度具体为30℃；
所述发酵时间为20h-36h，所述发酵时间具体为20h、24h或36h；
所述发酵的振荡频率为150rpm-180rpm，所述发酵的振荡频率具体为180rpm，所述发酵的振幅为26mm。
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| US20040110258A1 (en) * | 2002-09-10 | 2004-06-10 | Kayser Kevin J. | Method for metabolizing carbazole in petroleum |
-
2011
- 2011-09-19 CN CN 201110277688 patent/CN102367423B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040110258A1 (en) * | 2002-09-10 | 2004-06-10 | Kayser Kevin J. | Method for metabolizing carbazole in petroleum |
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