KR20080046301A

KR20080046301A - 유류 오염 토양의 정화용 미생물 액상 조성물, 이의제조방법 및 이를 이용한 유류 오염 토양의 정화방법

Info

Publication number: KR20080046301A
Application number: KR1020060115553A
Authority: KR
Inventors: 박철희; 우승한; 김주회
Original assignee: 에스케이에너지 주식회사
Priority date: 2006-11-22
Filing date: 2006-11-22
Publication date: 2008-05-27
Also published as: KR101300348B1

Abstract

본 발명은 유류 오염 토양의 정화용 미생물 액상 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 유류 오염 토양의 정화방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로, 유류 오염 토양으로부터 분리한 유류 분해능을 갖는 미생물을 성장 속도에 따라 분리 배양한 혼합 균주를 사용함으로써, 성장 속도의 차이에 따라 발생할 수 있는 유류 분해 활성이 우수하나 성장 속도가 느린 미생물의 활성 저하없이 오염 물질의 분해속도를 증진시키고 효과적으로 분해하여 유류 오염 토양의 정화시간을 단축시킬 수 있는 유류 오염 토양의 정화용 미생물 액상 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 유류 오염 토양의 정화방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 오염물질의 분해속도를 증진시키고, 다양한 오염물질을 효과적으로 분해함으로써 오염된 토양의 정화시간을 획기적으로 단축시킬 수 있고 결과적으로 오염된 토양의 정화비용을 대폭적으로 절감할 수 있는 장점이 있다.

중유, 벙커 C유, 유류, 미생물, 생분해, 생물복원, 배양, 정화, 토양

Description

유류 오염 토양의 정화용 미생물 액상 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 유류 오염 토양의 정화방법{Liquid composition of microorganisms for bioremediation of hydrocarbon-contaminated soil, method of preparing the same, and Bioremediation using the same}

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 활성배양액에서 고성장 균주군과 저성장 균주군의 성장속도를 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명의 실시예에 따른 중유 분해용 미생물 균주 각각의 2주 처리 후 벙커 C 분해도와 혼합균주의 분해도를 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명의 실시예에 따른 미생물제제를 투여하지 않은 액상시료(a)와 분해균주 중 가장 분해도가 높은 D7 균주로 처리한 시료(b), 미생물제제를 성장속도에 따라 분리배양 후 혼합하여 처리한 시료(c)에서 벙커 C유의 가스크로마토그래피를 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 실시예에 따른 실제 중유로 오염된 토양의 초기시료(a)와 미생물제제를 투입하여 31일간 처리한 시료(b)의 벙커 C유의 가스크로마토그래피를 나타내는 그래프이다.

급격한 산업화로 인하여 화석연료의 사용량 증가, 오염물질 배출량의 급증, 대도시로의 인구집중, 무리한 개발계획에 따른 자연파괴로 인한 심각한 환경오염에 직면해 있다. 이러한 환경오염은 대기나 물 등을 매개체로 하여 인간의 생활에 신속하고도 직접적인 영향을 미칠 뿐만 아니라 토양과 지하수를 통하여 오랜 기간동안 느린 속도로 노출되기도 한다. 특히 과거 유해물질의 부적절한 폐기, 노후시설의 파손, 갑작스런 환경사고 등에 따른 토양의 오염은 광범위한 오염범위, 막대한 처리비용 등으로 인해 오랫동안 방치되어 왔다.

토양오염을 야기하는 오염물질은 경유, 디젤유, 중유, 윤활유 등의 유류와 클로로페놀, 폴리클로리네이티드비페닐, 다환방향족탄화수소, 중금속 등이 될 수 있으며, 이중에서 탄화수소를 근간으로 하는 유기화합물은 특정 분해미생물의 탄소원 및 에너지원으로 사용됨으로써 별도의 환경오염이 없이 생분해 (Biodegradation)가 가능한 특성을 가지고 있다.

생분해란 자연 생태계의 특정 미생물 등이 적절한 조건하에서 유해오염물질을 분해하여 무해화 또는 영양원으로 사용하는 현상이며, 미생물의 이러한 기능을 이용하여 토양, 지하수, 해양, 하천등 오염된 지역을 정화하는 종합적인 엔지니어링 기술을 생물학적 복원기술(Bioremediation)이라 한다. 생물학적복원기술이 효율적일 경우 최종산물은 물이나 이산화탄소와 같이 무해한 물질로 변화되어 환경이나 생물에 아무런 해를 주지 않아야 한다. 이러한 생물학적 복원기술은 경제적이면서도, 자연의 정화능력을 이용함으로 해서 2차적인 오염원이 없는 장점이 있어 최근 각광받고 있는 기술이다.

생물학적 복원기술(Bioremediation)은 오염지역에 자연적인 분해를 가속화하기 위해서 외부기술을 적용하느냐의 여부에 따라 크게 능동적 복원과 수동적 복원으로 분류할 수 있다. 능동적 복원기술은 기술의 적용형태에 따라 편의상 현장에서 그대로 처리하는 부지내 기술과 오염 매개물을 현장외부로 이동하여 기술을 적용하는 부지외 기술로 분류할 수 있다.

예를 들어, 토양경작기술(landfarming)은 지표부근의 오염된 토양에 대해 현장에서 그대로 적용될 수 있는 기술이다. 미생물의 성장을 촉진하기 위해 질소와 인을 포함한 영양분과 물을 첨가하여 수분조절을 하고 pH를 조절하기 위해 석회를 사용한다. 그리고 산소공급을 원활히 하기 위해서는 주기적으로 뒤집기를 실시하는 방식을 이용하고 있다.

또한 토양경작기술에 오염토양 내에 이미 존재하는 미생물을 그대로 이용하면서 이러한 미생물의 활성을 촉진하는 미생물 촉진법(Biostimulation)이 적용되기도 하고, 특정 오염물질에 대한 분해능이 우수한 외래미생물을 첨가하는 미생물 투입법(Bioaugmentation)이 적용되기도 한다. 토양경작 기술은 다른 방식에 의해 처리된 토양의 후처리로 사용될 수 있으며 처리비용이 가장 저렴하다는 큰 장점을 가지고 있다. 그러나, 처리시간이 길고 분해속도가 느리다는 단점이 있다.

이러한 생물학적 복원기술이 성공하기 위해서는 즉, 미생물이 토양내의 오염물질을 효과적으로 분해하기 위해서는, 미생물의 성장에 필요한 영양분의 존재, 산소와 같은 전자 수용체의 존재, 탄소원과 에너지원이 되는 오염물질의 전달, 오염물질을 분해할 수 있는 효소의 활성화 등의 여러 조건이 만족되어야만 한다. 이를 해결하기 위하여, 토양 내에 부족할 수 있는 질소와 인을 포함하는 비료를 투입하기도 하며, 토양 뒤집기같은 물리적 산소공급 또는 과산화수소와 같은 산소유발물질을 투입하기도 하며, 오염물질의 전달을 촉진하기 위하여 계면활성제를 투입하기도 한다. 오염물질의 생화학적 분해는 여러 단계를 거치게 되어 최종적으로 이산화탄소와 물, 그리고 미생물 생체로 변화하게 되며, 각 단계마다 필요한 효소가 적절하게 활성화되어야만 한다. 특히, 고농도 유류로 오염된 경우 미생물 생존환경이 매우 열악하므로 외부에서 미생물을 투입하고 적절한 생존환경을 만들어주는 것이 필수적이라 할 수 있다.

한편, 한국등록특허 제421654호, 제421655호, 제469480호 및 제469481호에는 유류분해능을 갖는 미생물 균주에 대해 기술되어 있으며, 한국등록득허 464107호, 제535936호 및 한국공개특허 제2005-43506호에는 유류 분해능을 갖는 균주들을 혼합한 미생물 제제에 대해 기술되어 있다.

그러나, 기존의 생물학적 복원기술에서 분해 미생물을 투입하는 경우 유류 분해 균주를 단순 배양 후 투입하는 경우가 대부분이며, 혼합균주들을 어떻게 적절하게 배양하여 접종균주를 준비할 것인가에 대한 고려가 전무하였다. 특히 혼합균주를 사용할 경우 대량 배양하는 과정에서 성장속도가 느린 일부 균주는 영양분 경쟁관계에 의해 최종 접종 균주내에 거의 존재하지 않게 된다. 중유의 경우 미생물의 이용성이 매우 낮기 때문에 성장속도가 느린 미생물들이 오히려 직접접촉에 의해 더 활발히 분해하는 경우가 흔히 있다.

따라서, 혼합균주 중 성장속도가 느리나 분해효율이 높은 균주가 존재하는 경우 기존의 배양방법은 매우 비효율적이 된다. 그 결과, 투입된 외래 미생물이 현장토양 환경에 적응하지 못하고 소멸되어 무용화된 경우가 많으며, 미생물 성장이 원활하더라도 정작 오염된 물질의 분해는 매우 느린 경우가 많아서 신속하게 토양오염을 해소하지 못하는 등의 문제점이 있었다.

이에 본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위한 연구를 수행한 결과, 유류 오염 토양으로부터 유류 분해능을 갖는 미생물을 선별 분리한 후, 이들을 성장 속도에 따라 각각 분리하여 배양한 후, 혼합하여 유류 오염 토양에 처리하게 되면, 오 염물질의 분해 속도가 촉진되고 다양한 오염 물질을 효과적으로 분해할 수 있어 오염된 토양의 정화시간을 단축시킬 수 있음을 발견하였고, 본 발명은 이를 기초로 완성되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유류의 분해 활성이 증진된 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유류 오염 토양을 신속하게 정화할 수 있는 유류 오염 토양의 생물학적 정화방법을 제공하는 데 있다.

상기 본 발명의 목적을 이루기 위한 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물은 유류 오염된 토양으로부터 분리된 유류 분해능을 갖는 10시간 이내에 정지기에 도달하는 고성장 균주의 배양액; 및 상기 고성장 균주보다 성장 속도가 느린 저성장 균주의 배양액이 혼합된 것으로 구성된다.

상기 본 발명의 다른 목적을 이루기 위한 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물의 제조방법은 유류 오염 토양으로부터 유류 분해능을 갖는 균주를 선별 및 분리하는 단계; 상기 균주를 성장속도에 따라 10시간 이내에 정지기에 도달하는 균주를 고성장 균주로, 10시간 이후에 정지기에 도달하는 균주를 저성장 균주로 분리하는 단계; 상기 고성장 균주 및 저성장 균주를 각각 배양배지에서 배양시키는 단계; 및 상기 고성장 균주의 배양액 및 저성장 균주 배양액을 혼합하는 단계를 포함한다.

상기 본 발명의 또 다른 목적을 이루기 위한 유류 오염 토양의 생물학적 정화방법은 상기 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물을 유류 오염 토양에 대하여 1∼200g/㎏의 범위 내에서 최종 미생물 개체수가 토양 1g당 106개체 이상이 되도록 처리하는 것으로 구성된다.

이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 유류 오염 토양으로부터 유류 분해능을 갖는 미생물 균주를 선별하여, 이들을 성장속도에 따라 각각 분리하여 배양시킨 후 혼합시켜 유류 오염 토양에 적용함으로써, 종래 유류 분해능을 갖는 미생물을 단순 혼합하여 배양할 경우 발생할 수 있는, 유류 분해 효율이 높으나 성장속도가 느린 균주의 소멸에 따른 유류 분해능 저하없이 미생물 액상 조성물을 제조함으로써 효율적이며 신속하게 유류 오염 토양을 정화시킬 수 있다.

본 발명에 따르면, 우선, 유류 오염 토양으로부터 유류 분해능을 갖는 균주를 선별 및 분리하고, 상기 균주를 성장속도에 따라 고성장 균주 및 저성장 균주로 분리하게 된다. 이후, 상기 고성장 균주 및 저성장 균주를 각각 효소 발현 촉지제가 함유된 배양배지에서 배양시켜서, 상기 고성장 균주의 배양액 및 저성장 균주 배양액을 바람직하게는 1 : 1 내지 1 : 9의 부피비, 좀 더 바람직하게는 1 : 1의 부피비로 혼합하여 미생물 액상 조성물을 제공하게 된다. 상기 혼합비율을 벗어나면 분해효율이 떨어지는 경향이 있다.

본 발명에 따르면, 고성장 균주와 저성장 균주의 판단 기준은 배양 후 약 10 시간을 기준으로 그 이전에 정지기(stationary phase)에 들어가면 고성장 균주, 그 이후에 들어가면 저성장 균주로 판단할 수 있을 것이다. 고성장 균주와 저성장 균주는 모두 배양완료 후 10⁹∼10¹⁰/㎖의 수준의 개체수를 확보할 수 있으며, 이들의 혼합 후에도 비슷한 수준으로 유지할 수 있다.

유류 분해능을 갖는 균주는 예를 들어, 유류 오염 토양을 채취하여 유류가 함유된 최소영양 배지에서 성장하는 균주로부터 선별할 수 있으며, 16S rDNA 서열분석(sequencing) 또는 지방산(fatty acid) 분석법 등을 통해 동정할 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 공단 지역의 유류로 오염된 토양을 채취하여 중유를 함유하는 최소 배양 배지 상에서 성장한 10여 종의 미생물 군락을 선별하여 이들을 16S rDNA 서열분석(sequencing) 또는 지방산(fatty acid) 분석법을 통해 동정하였다. 그 결과 이들은 각각 아시네토박터(Acinetobacter) sp., 아시네토박터 해모리티커스(Acinetobacter haemolyticus), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 라디오레시스텐스(Acinetobacter radioresistens), 스테노프로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 및 바실러스 스패리커스(Bacillus sphaericus), 노카르디아 노바(Nocardia nova), 셀루로모나스 터바타(Cellulomonas turbata), 및 플라보박테리움 존소니아(Flavobacterium johnsoniae)으로 판명되었다.

여기서, 아시네토박터(Acinetobacter) sp., 아시네토박터 해모리티커스(Acinetobacter haemolyticus), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 라디오레시스텐스(Acinetobacter radioresistens), 스테노프로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 및 바실러스 스패리커스(Bacillus sphaericus)는 고성장 균주이고, 노카르디아 노바(Nocardia nova), 셀루로모나스 터바타(Cellulomonas turbata), 및 플라보박테리움 존소니아(Flavobacterium johnsoniae)은 저성장 균주이다.

이렇게 유류 오염 토양으로부터 분리한 유류 분해능을 갖는 균주들은 성장 속도에 따라 고성장 균주와 저성장 균주로 분리하게 된다. 상대적으로 성장 속도가 느린 저성장 균주들의 경우 고성장 균주에 비해 유류 분해 활성이 높은 균주가 존재할 경우, 이들을 고성장 균주와 함께 혼합하여 배양하게 되면 최종 배양물에 거의 존재하지 않을 수 있으며, 중유의 경우 미생물의 이용성이 낮기 때문에 성장속도가 느린 미생물들이 직접 접촉에 의해 활발하게 분해할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 유류 분해능을 갖는 미생물을 고성장 균주 및 저성장 균주로 분리하여 이들을 각각 따로 배양한 후 혼합하여 사용하게 된다.

본 발명에서 상기 고성장 균주 및 저성장 균주 배양시 유류 분해 활성을 갖는 효소의 발현을 촉진시키기 위해서 효소 발현 촉진제를 포함하는 배양 배지를 사용하게 된다. 상기 효소 발현 촉진제는 예를 들어, 벤조산(benzoic acid) 및/또는 n-옥탄(octane) 등이다. 이들의 사용량은 배지에 대하여 0.001∼1g/ℓ이며, 바람직하게는 약 0.2g/ℓ이다. 이들의 사용량이 1g/ℓ을 초과하면 미생물 성장이 저해 받을 수 있고, 0.001g/ℓ 미만이면 첨가효과가 거의 없다.

한편, 이렇게 각각 분리하여 배양한 고성장 균주액 및 저성장 균주액은 1 : 1 내지 1 : 9의 부피비로 혼합하여 유류 토양에 적용할 수 있다.

본 발명의 미생물 제제를 토양에 처리할 경우, 처리 토양에 대하여 1∼200g/㎏의 범위 내에서 최종 미생물 개체수가 토양 1g당 10⁶개체 이상이 되도록 처리하는 것이 처리효율 및 경제성 측면에서 바람직하다. 미생물 균주액의 사용 부피는 개체 수 조건을 맞춘 후 토양 함수율이 포화되지 않는 범위내의 물의 부피에 준비하여 첨가하여야 한다.

이와 같이 본 발명에 따라 미생물을 성장 속도에 따라 별로로 분리 배양하여 혼합하게 되면 오염된 유류에 대한 분해능이 우수하나 성장 속도가 느린 균주의 활성이 유지되어 오염 물질의 분해속도를 증진시키고, 다양한 오염물질을 효과적으로 분해할 수 있어 오염 토양의 정화시간을 단축시킬 수 있으므로, 정화비용을 절감할 수 있는 장점이 있다.

이하, 실시 예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하나, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실험 예 1

유류분해 미생물의 분리 및 동정

본 발명에 사용된 토양시료는 공단지역 유류로 오염된 토양을 채취하여 사용하였다. 토양시료를 토양의 상단 15㎝로부터 채취하여 2㎜ 직경의 체로 거른 후, 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다. 토양시료 10g을 1㎖의 벙커C유를 함유하는 100㎖ 최소영양배지에 넣고 25℃에서 150rpm으로 2주간 배양하였다. 상기 배양된 시료 의 상층부 1㎖를 취하여 0.1㎖의 벙커C를 함유하는 최소영양배지 10㎖에 접종하고 1주간 배양하였다. 상기 배양시료를 희석하여 영양한천배지(Nutrient Broth Agar, Difco)에서 평판 배양한 결과, 서로 다른 형태를 나타내는 콜로니들이 형성되었다.

상기 최소영양배지의 조성은 하기 표 1과 같다.

성 분	함 량
NH₄Cl	5.35g
NaH₂PO₄	0.6g
Na₂HPO₄	1.6g
EDTA	0.38g
KCl	0.75g
Na₂SO₄	0.28g
MgSO₄·7H₂O	0.31g
미네랄 용액(Mineral solution)	5㎖
2차 증류수	1ℓ

실험결과 10종의 중유 분해균주를 분리하였고, 이들을 각각 SK49, SK60, O4, D4, D7, D9, C1, C2, C4, 및 C6으로 명명하였다. 각각의 균주를 16S rDNA 서열분석(sequencing) 또는 지방산(fatty acid) 분석법을 통해 분석한 결과 SK49, SK60은 아시네토박터(Acinetobacter) 속, O4는 아시네토박터 해모리티커스(Acinetobacter haemolyticus), D4는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), D7은 노카르디아 노바(Nocardia nova), D9는 셀루로모나스 터바타(Cellulomonas turbata), C1은 아시네토박터 라디오레시스텐스(Acinetobacter radioresistens), C2는 스테노트로포모나스 말토필러스(Stenotrophomonas maltophilia), C4는 바실러스 스패리커스(Bacillus sphaericus), 및 C6은 플라보박테리움 존소니아(Flavobacterium johnsoniae)인 것으로 확인되었다.

실험 예 2

유류 분해 미생물의 성장 속도에 따른 분리

상기 실험예 1에 따른 10종의 유류분해 미생물을 성장 속도를 영양배지(Nutrient Broth)에서 조사하였다. 15㎖ 시험관에 멸균된 영양배지 8㎖를 넣고 각각의 균주를 접종한 후 25℃에서 분당 150회의 왕복 진탕배양기(reciprocal shaker)에서 배양하면서 시간별로 600㎚에서 광학밀도(OD)를 측정하였다. 하기 표 2에는 9시간 이후와 24시간 이후의 OD값을 나타내었다.

그 결과 SK49, SK60, O4, D4, C1, C2 및 4C는 빠르게 성장하여 9시간 이내에 정지기(stationary phase)에 도달하였다.

C4는 최대 성장했을 경우의 OD가 낮으나 성장속도는 빨라 초기 9시간에 정지기에 도달하였다. D7, D9, C6은 느린 속도로 성장하여 9시간 이후 24시간까지 지속적으로 성장하였다. 본 실험결과를 바탕으로 성장속도에 따라 SK49, SK60, O4, D4, C1, C2, 및 C4는 고성장 균주(CF) 군으로 D7, D9, C6은 저성장 균주(CS) 군으로 분류하였다.

구 분	균주명	OD(9h)	OD (24h)	분류
1	Acinetobacter sp. SK49	0.69	0.68	CF
2	Acinetobacter sp. SK60	0.54	0.58	CF
3	Acinetobacter haemolyticus O4	0.72	0.74	CF
4	Pseudomonas aeruginosa D4	0.76	0.80	CF
5	Nocardia nova D7	0.09	0.18	CS
6	Cellulomonas turbata D9	0.11	0.17	CS
7	Acinetobacter radioresistens C1	0.40	0.39	CF
8	Stenotrophomonas maltophilia C2	0.59	0.58	CF
9	Bacillus sphaericus C4	0.25	0.28	CF
10	Flavobacterium johnsoniae C6	0.27	0.43	CS

실험 예 3

장기 보관 균주의 제조

실험 예 1에서 순수 분리한 균주들을 각각 영양배지 25㎖이 들어있는 50㎖ 원심분리튜브에 접종하여 25℃, 150rpm에서 24시간 배양하였다. 각 튜브에 멸균한 50% 글리세롤 10㎖씩 첨가하여 혼합한 후 마이크로튜브에 1㎖씩 분주하여 70℃ 냉동실에 넣어서 보관하였다.

실험 예 4

벙커 C유의 추출 및 분석

배지로부터 벙커 C유의 추출을 위해 적당한 핵산을 넣고 흔들어 섞은 후에 소니케이터(sonicator)에서 10분간 처리하여 원심분리한 후 핵산층 분리추출과정 2회 반복하여 모은 핵산층에 Na₂SO₄를 소량 넣고 잘 흔들어 혼합한 후 0.45㎛ 필터로 여과 후 검액으로 사용하였다. 벙커 C유의 분석은 모세관 컬럼(capillary column; HP 5, 전장 30m, 직경 0.25㎜; Hewlette Packard Co., U.S.A.) 및 FID(flame ionization detector) 검출기를 탑재한 기체크로마토그래피(Agilent technologies 6890G, Agilent Co., U.S.A.)를 사용하여 분석하였다. 검출기 및 주입구(injector)의 운전온도는 각각 320℃ 및 300℃이었다. 컬럼(오븐)온도는 처음 2분 동안은 50℃로 고정시킨 후 8℃/min의 속도로 320℃까지 증가시켰다. 운반기체(carrier gas)는 헬륨을 사용하였으며, 상기 기체의 유속은 40㎖/min이었다.

실험 예 5

순수균주의 벙커 C유 분해도

실험 예 1로부터 분리한 분해균주 10종에 대한 각각의 벙커 C유 분해도 실험을 수행하였다.

배양 시험관 12㎖에 최소 영양배지 5㎖과 벙커 C유 농도 5,000ppm이 되도록 넣고 각 균주에 대해 4%(v/v)로 접종시키고, 25℃, 150rpm에서 2주일간 배양하였다. 균주는 각각 영양배지에서 24시간 배양한 후 15000rpm에서 5분간 원심분리후 상등액을 제거하고 최소영양배지 1㎖를 넣어 준비하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 10종 모두에 대해 벙커 C유의 분해현상을 확인하였으며, 특히 O4, D4, D7은 65% 이상의 분해율을 보였고 D7은 70% 분해율로 가장 높은 분해율을 보였다. 저성장균주인 D7이 70%, D9가 48%, O6이 22% 분해로 상당히 높은 분해율을 보였다.

실시 예 1

혼합 균주의 분리 배양

1. 순수 배양

상기 실험 예 3에서 제조된 10종의 장기 보관용 냉동균주를 꺼내 각 균주별로 5㎖ 영양배지를 넣은 15㎖ 튜브에 접종하고 25℃ 150rpm에서 24시간 배양하였다.

2. 고성장 균주 및 저성장 균주의 배양

상기 10종의 순수 배양된 균주 중에서 고성장균주인 SK49, SK60, O4, D4, C1, C2, C4를 동일한 양으로 전체 배양액에 대해 5%가 되도록 활성배양액 20㎖를 넣은 원심분리 튜브에 혼합 접종하여 25℃, 150rpm에서 12시간 배양하였다. 또한, 저성장균주인 D7, D9, C6을 동일한 양으로 전체 배양액에 대해 5%가 되도록 활성배양액 20㎖를 넣은 원심분리튜브에 혼합 접종하여 25℃, 150rpm에서 24시간동안 배양하였다. 한편, 상기 고성장 및 저성장 균주의 활성 배양액 조성은 하기 표 3과 같다.

활성배양액 조성

성 분	함 량
최소영양배지	1ℓ
영양 배지(nutrient broth)	8.0g
글루코스(glucose)	10g
벤조산(benzoic acid)	0.2g
n-옥탄(n-octane)	0.2g

실시 예 2

혼합 균주의 벙커 C유 분해도

실시 예 1에 따라 배양한 고성장 균주군(7종, 이하, CFG라 함) 및 저성장 균주군(3종, 이하, CSG라 함)으로 분류하여, 각 각을 활성배양액에서 배양 후 혼합하여 벙커 C유를 포함하는 액상배지에서 분해도를 조사하였다.

배양 시험관 12㎖에 최소 영양배지 5㎖과 벙커 C유 농도 5,000ppm이 되도록 넣고, 상기 CFG 및 CSG는 각각의 순수 미생물 균주가 전체 배양액에 대하여 총 2%(v/v)가 되도록 동일하게 접종하여 25℃, 150rpm에서 1주일간 배양하였다.

이때, CFG 및 CSG의 배양액을 전체 배양액의 총 5%(v/v)가 되도록 활성 배양액에 접종하여 25℃에서 24시간 배양하였다. 상기 배양물을 각각 15000rpm에서 5분간 원심분리하고 상등액을 제거한후, 최소영양배지 1㎖를 넣고 현탁하여 CSG 및 CFG 배양물을 1:1로 혼합하여 벙커 C유를 포함하는 액상 배지에 접종하였다. 그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 81.3%의 분해도를 나타내었으며, 순수 균주에 비해 높은 분해도를 나타냄을 알 수 있다. 한편, 도 3에는 본 발명에 따른 미생물 조성물을 투여하지 않은 경우(a)와 분해균주 중 가장 분해도가 높은 D7 균주로 처리한 경우(b), 미생물을 성장속도에 따라 분리배양 후 혼합하여 처리한 경우(c)에서 벙커 C유의 가스크로마토그래피를 나타내는 그래프를 나타내었다. 그 결과, 본 발명에 따라 미생물을 성장 속도에 따라 분리 배양 후 혼합한 경우 벙커 C유의 분해정도가 높음을 알 수 있다.

실시 예 3

실시 예 1에 따라 배양한 CFG(O4, D4, SK49, SK60, C1, C2, C4) 및 CSG(C6, D7, D9)에 대하여 실제 오염 토양에 대한 분해 능력을 조사하였다.

120㎖ 혈청 보틀(serum bottle)에 중유로 오염된 토양 100g, 트윈(tween) 80 (2g/ℓ), 최소영양배지 10㎖, CFG 100㎕ 및 CSG 100㎕를 접종하였다. 이때 투여 미생물 수는 2×10⁹/㎖ 수준으로 토양 1g 당 4×10⁶ 수준이 될 수 있도록 양을 조절하여 접종하였다. 오염토양의 초기 미생물 수는 3.2×10⁵/g으로 대조구의 경우 이 정도의 수준으로 유지되었으나 미생물제제를 투여한 경우 7일 후 2.4×10⁷/g으로 약 10배 정도 증가하였다. 초기오염토양의 유류 농도는 8,050ppm 이었으며 미생물제제를 투여하여 31일 지난 후 처리효율은 44%이었다. 도 4는 실제 중유로 오염된 토양의 초기시료(a)와 미생물제제를 투입하여 31일간 처리한 경우(b)의 벙커 C유의 가스크로마토그래피를 나타내는 것으로, (b)의 경우 (a)에 비해 벙커 C가 분해되었음을 알 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따라 유류 분해능을 갖는 균주들을 성장 속도에 따라 분리하여 배양한 후 혼합하여 사용하면, 오염 물질의 분해속도를 증진시키고, 다양한 오염물질을 효과적으로 분해할 수 있어 오염 토양의 정화시간을 단축시킬 수 있으므로, 정화비용을 절감할 수 있는 장점이 있다.

Claims

유류 오염된 토양으로부터 분리된 유류 분해능을 갖는 10시간 이내에 정지기에 도달하는 고성장 균주의 배양액; 및 상기 고성장 균주보다 성장 속도가 느린 저성장 균주의 배양액이 혼합된 것을 특징으로 하는 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물.
제1항에 있어서, 상기 고성장 균주 배양액 및 저성장 균주 배양액은 1 : 1 내지 1 : 9의 부피비로 혼합된 것을 특징으로 하는 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물.
제1항에 있어서, 상기 고성장 균주는 아시네토박터(Acinetobacter) sp., 아시네토박터 해모리티커스(Acinetobacter haemolyticus), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 라디오레시스텐스(Acinetobacter radioresistens), 스테노프로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 및 바실러스 스패리커스(Bacillus sphaericus)이고, 상기 저성장 균주는 노카르디아 노바(Nocardia nova), 셀루로모나스 터바타(Cellulomonas turbata) 및 플라보박테리움 존소니아(Flavobacterium johnsoniae)인 것을 특징으로 하는 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물.
유류 오염 토양으로부터 유류 분해능을 갖는 균주를 선별 및 분리하는 단계;

상기 균주를 성장속도에 따라 10시간 이내에 정지기에 도달하는 균주를 고성장 균주로, 10시간 이후에 정지기에 도달하는 균주를 저성장 균주로 분리하는 단계;

상기 고성장 균주 및 저성장 균주를 각각 배양배지에서 배양시키는 단계; 및

상기 고성장 균주의 배양액 및 저성장 균주 배양액을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 배양배지는 배지 1ℓ에 대하여 효소 발현 촉진제 0.001∼1g을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 효소 발현 촉진제는 벤조산(benzoic acid), n-옥탄(octane) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 고성장 균주는 아시네토박터(Acinetobacter) sp., 아시네토박터 해모리티커스(Acinetobacter haemolyticus), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 라디오레시스텐스(Acinetobacter radioresistens), 스테노프로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 및 바실러스 스패리커스(Bacillus sphaericus)이고, 상기 저성장 균주는 노카르디아 노바(Nocardia nova), 셀루로모나스 터바타(Cellulomonas turbata) 및 플라보박테리움 존소니아(Flavobacterium johnsoniae)인 것을 특징으로 하는 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 고성장 균주 배양액 및 저성장 균주 배양액은 1 : 1 내지 1 : 9의 부피비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 유류 오염 토양 정화용 미생물 액상 조성물을 유류 오염 토양에 대하여 1∼200g/㎏의 범위 내에서 최종 미생물 개체수가 토양 1g당 10⁶개체 이상이 되도록 처리하는 것을 특징으로 하는 유류 오염 토양의 정화방법.