KR100421655B1

KR100421655B1 - 신규한 원유분해 균주 및 그 생산방법

Info

Publication number: KR100421655B1
Application number: KR10-2001-0001207A
Authority: KR
Inventors: 문혜준; 정욱진; 오영숙; 주춘성; 김윤관
Original assignee: 주식회사 에코솔루션; 정욱진; 오영숙
Priority date: 2001-01-09
Filing date: 2001-01-09
Publication date: 2004-03-10
Also published as: KR20020060009A

Abstract

본 발명은 신규한 원유분해 균주 및 그 생산방법에 관한 것으로, 원유에 의해 오염된 토양으로부터 원유, 가솔린, 경유 및 등유와 같은 유류의 분해능이 우수한 슈도모나스 속 CU1 균주(Pseudomonassp. CU1)를 선별하여 제공함으로써 원유에 의해 오염된 토양을 생물학적 방법으로 복원할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

신규한 원유분해 균주 및 그 생산방법 {Novel microorganism for the degradation of crude oil and process for production thereof}

본 발명은 신규한 원유분해 균주 및 그 생산방법에 관한 것으로 보다 상세하게는, 원유에 의해 오염된 토양으로부터 분리한 원유분해능이 우수한 슈도모나스 속 균주 및 그 생산방법에 관한 것이다.

현대 산업사회에서 원유의 이용범위와 사용량은 계속적으로 증가하고 있다. 그러나 원유는 수송하는 과정에서 사고로 인한 유출, 고의적인 유출 및 산업폐수 등으로 인하여 전세계적으로 매년 천만톤 이상이 해양으로 유출되어 생태계에 커다란 피해를 유발시키고 있다. 유출된 원유는 대부분이 휘발되거나 미생물에 의해 제거되는데 1946년 Zobell에 의해 매우 다양한 미생물이 원유분해에 관여하며 이러한 미생물이 자연계에 널리 분포하고 있다는 사실이 밝혀졌다. 이후로 원유오염문제를 미생물학적 측면에서 해결하려는 노력들이 계속되어 왔다. 최근에 우리나라에서도 여러번 원유오염사건이 발생하여 큰 피해를 입은 바 있으나 적당한 처리방법이 아직까지 마련되지 않고 있으며, 현재 사용되고 있는 물리-화학적인 방법은 경제적 부담 및 2차적인 오염문제가 대두되고 있다. 또한, 자연환경에 유출된 원유를 생물학적 방법에 의해 분해함으로써 환경을 복원시키려는 생물학적복원(bioreme- diation)기술에 대한 연구가 현재 활발하게 진행되고 있으며 실제적으로 오염현장에 적용되고 있다. 즉, 오염 유류의 분해속도와 분해정도를 증가시키기 위하여 영양제(nutrients), 화학비료(fertilizer)의 첨가 및 미생물의 투여와 같은 다양한 방법을 이용하여 유출된 유류를 빠르게 분해시키고자 하는 연구들이 진행되어 왔다. 그러나 지금까지의 연구결과로 볼 때 실험실에서 배양한 미생물의 투여가 효과적이라고 할 수 없으며, 현재까지 가장 성공적인 결과는 제어된 환경에서의 오염물질을 제거하는 것이 효과적이었다. 상기와 같은 생물학적인 방법은 물리화학적 방법에 비하여 시간이 오래 소요되는 반면 비용이 저렴하고 2차적인 오염문제가 유발되지 않기 때문에 오염처리에 있어서 적합한 방법이 될 수 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 착안하여 자연계로 방출된 원유의 미생물학적 처리를 위하여 원유를 분해하는 미생물을 원유오염토양에서 분리한 다음 원유분해능이 우수한 균주를 선별함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 원유분해능이 우수한 미생물을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 원유분해 균주의 생산방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 원유분해 균주를 오염된 토양으로부터 순수분리하고유류분해능 및 성장정도가 우수한 균주를 선발한 후 동정한 다음 본 발명 원유분해 균주의 석유화합물 분해능과 원유분해능을 조사하고 원유분해를 위한 최적 온도와 pH 조건을 조사하였다. 본 발명에 따라 토양에서 분리한 원유분해능이 있는 슈도모나스 속 CU1(수탁번호:KCTC 18065P)균주는 20℃, pH 6인 조건에서 원유분해력이 61.39%로 높게 나타나 유류로 오염된 해양 또는 토양현장에 적용할 수 있는 우수한 균주임을 확인하였다.

이하, 본 발명의 구성을 설명한다.

도 1은 4%(v/v) 원유(Arabian Light)가 포함된 고체배지에 접종하여 25℃에서 7일간 배양한 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주(Psedomonassp. CU1)의 사진도이다.

도 2는 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주를 원유1%(v/w), 함수율 50%인 토양에서 25℃, 7일간 배양한 경우와 상기 토양에 원예용 완효성 비료 SRF를 77mg/10g soil를 첨가한 후 본 발명 균주를 배양한 경우의 원유분해능을 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주를 원유 1%(v/w)가 함유된 토양에 접종하여 25℃, 7일간 배양한 후 가스크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 원유 1%(v/v)가 포함된 최소배지에 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주 2%(v/v)를 접종하여 25℃에서 6일간 배양한 후 원유의 유화 및 응집된 모습을 나타낸 사진도이다.

도 5는 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주를 원유 1%(v/v)가 포함된 최소배지에 접종하고 온도를 달리하여 pH 7에서 6일간 배양한 후의 원유분해정도를 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주를 원유 1%(v/v)가 포함된 최소배지에 접종하고 pH를 달리하여 20℃에서 6일간 배양한 후의 원유분해정도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 원유분해능이 높은 미생물을 분리하기 위하여 원유에 의해 오염된 토양을 채취하고 탄소원으로 원유 4%(v/v) 첨가한 최소배지에 접종하여 25℃에서 3개월간 농화배양한 다음 영양한천배지에 도말하여 원유분해균주를 분리하고 원유분해능과 성장정도를 조사하여 원유분해 균주를 분리하는 단계; 상기 단계의 분리균주를 동정하고 이를 명명한 다음 석유화합물에 대한 분해능을 조사하는 단계; 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주(Pseudomonassp. CU1)를 원유에 의해 오염된 토양에 접종하여 배양한 후 원유분해력을 조사하는 단계; 상기 단계의 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주(수탁번호: KCTC 18065P)의 최적 원유분해 온도 및 pH를 조사하는 단계로 구성되어 있다.

상기 단계에서 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주의 원유분해를 위한 최적조건은 온도 15∼25℃, pH 5∼9이며 바람직하게는 온도 20∼25℃, pH 5∼6의 조건에서원유분해능이 우수하다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만,본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 원유분해 균주의 분리

원유분해효율이 높은 미생물을 분리하기 위하여 폐수 슬러지(waste water sludge)와 원유 폐수 슬러지(crude oil waste water sludge)를 채취하였다. 상기 오염된 토양을 탄소원 및 에너지원으로 4%(v/v) 원유(crude oil)가 포함된 NaNO₃4g/L, KH₂PO₄0/15g/L, Na₂HPO₄0.5g/L, MgSO₄·7H₂O 0.2g/L, FeCl₃·6H₂O 0.005g/L, CaCl₂·2H₂O 0.01g/L로 조성된 최소배지에 접종하여 25℃에서 3개월간 농화배양하였다. 농화배양 후 박토 소고기 추출물(bacto beef extract) 3g/L, 박토펩톤(bacto peptone) 5g/L 및 한천(agar) 15g/L로 조성된 영양한천배지에 도말하여 원유분해균주를 분리하였다.

원유분해균주의 원유분해능은 2,6-DCPIP(Dichlorophenol-Indophenol)의 환원반응에 의해 나타나는 색변화와 원유가 포함된 고체배지에서의 생장유무로 확인하였다. DCPIP 실험은 10%(v/v) 원유가 포함된 최소배지에 분리균 10%(v/v)를 접종하고 DCPIP(3g/L) 2.5%를 반응시약으로 첨가하여 25℃에서 배양하였다. 배양 후 푸른색에서 무색으로 변화된 시료를 원유분해 균주로 1차 분리하였다. 원유가 포함된 고체배지 조성은 4%(v/v) 원유가 포함된 최소배지에 한천을 첨가하여 제조하였으며잔탄 검(xantan gum) 0.5%(w/v)를 배지 제조시 원유의 유화를 위해 첨가하였다.

실험 결과, 우수한 원유 분해력을 지닌 균주를 분리하였다.

실시예 2: 본 발명 분리균의 동정 및 석유화합물 분해능 조사

상기 실시예 1에서 분리한 균주를 TSBA(Trypticase soy broth agar)에서 24시간 배양한 후 MIDI(Microbial Identification System, Microbial ID Inc., Newark, Del.)법에 의해 지방산을 추출하여 균주를 동정하였다. 또한, 상기 실시예 1의 분리균 CU1을 가솔린, 경유, 등유 및 윤활유를 각각 1%(v/v)농도로 첨가한 배지에 접종하여 상기 실시예1의 DCPIP법으로 석유화합물 분해능을 조사하였다.

실험 결과, 본 발명 분리균주는 슈도모나스 속(Pseudomonassp.)으로 동정되었으며 본 발명 균주의 콜로니 특성은 표 1에 나타낸 바와 같다. 또한, 도 1에 나타낸 바와 같이 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주는 원유가 포함된 고체배지에서 생장함을 확인하였다. 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주의 석유화합물의 분해능은 표 2에 나타낸 바와 같으며, 원유 이외에도 등유, 경유, 가솔린에 분해능을 가진 우수한 유류 분해균주임을 확인하였다. 그러나, 윤활유는 분해하지 못하였는데 이는 윤활유의 경우 탄소수 C₁₈∼C₅₀의 중질유계 난분해성 화합물로서 중금속 등이 다량 함유되어 있어 분해에 어려움이 있기 때문이라 생각된다.

본 발명에 따라 오염된 토양에서 순수분리한 상기 슈도모나스 속 CU1 균주를 생명 공학 연구소내 미생물 기탁센터에 2000년 12월 29일 수탁번호 KCTC 18065P로기탁하였다.

본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주의 콜로니 특성

균 주	콜로니 직경(mm)	색	가장자리^*	형태
슈도모나스 CU1	4	크림색	E	이중고리
〔주〕가장자리(margin): E-고르다 ,I-불규칙적이다

본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주의 DCPIP 실험 결과

균 주	DCPIP 실험
균 주	원유	가솔린	경유	등유	윤활유
슈도모나스 CU1	+++	++	+++	+++	-
〔주〕+++: 분해능이 아주 높음, ++: 분해능이 높음, +:분해능이 있음, -: 분해능 없음

실시예 3: 본 발명 원유분해 균주의 원유분해력 조사

본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주의 토양내 원유분해력을 측정하기 위하여 토양 10g을 원유 1%(v/w)로 인위적으로 오염시켰다. 상기 원유로 오염된 토양을 함수율 50% (water holding capacity)로 수분을 조절한 후 배양균주 1.00 OD_660nm1mL(약 1×10⁸CFU/g)를 접종하여 25℃에서 7일간 배양한 다음 GC-FID(HP 6890, Hewlette packard, U.S.A)로 분석하였다. GC-FID 분석에 사용된 컬럼은 HP-5MS (Hewlett Packard, 0.25nm×30m, 직경 0.25μm, capillary)를 사용하였고 운반기체(carrier gas)로는 헬륨(helium)을 사용하였다. 운반기체의 속도는 1.5mL/ min이였고 오븐온도는 45℃-15분, 300℃-12분, 승온 15℃/min으로 조절하였고 주입기(injector)의 온도는 320℃, 검출기(detector)의 온도는 340℃였다. GC 분석시 스쿠알렌 (Squalane)을 표준시료(internal standard)로 사용하였으며 황산나트륨(sodium sulfate)으로 시료내 수분을 제거하였다.

토양내 원유농도의 측정은 미국의 EPA 법 3550M에 의해 소닉(sonic) 추출한 후 EPA 8015B에 의하여 TPH(Total Petroleum Hydrocarbon) 함량으로 정량분석하였다.

한편, 토양내에 영양염류를 첨가하였을 때의 분해력을 측정하기 위하여 SRF(조선비료, urea 54mg/g, PO₄ ^3-33mg/g) 77mg을 토양 10g에 첨가하여 실험을 수행하였다. 이때 탄소:질소:인의 비율을 100:10:3으로 조절하였다.

실험 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주의 토양내 원유분해능은 57.17%였으며 SRF 첨가시 73.97%로 분해율이 매우 높았다. 또한, 도 3에 나타낸 바와 같이 GC 피크(peak) 분석 결과 대부분 탄소수 C₁₀∼C₂₂알칸계열인 경유의 피크(peak)들이 빠르게 분해되어 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 C₂₃이상의 분자량이 큰 피크(peak)들의 분해율은 상대적으로 느린 것으로 나타났다. 상기와 같은 결과로 볼 때 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주는 원유 구성 성분 중 특정기질을 선호하며 분해한다는 것을 알 수 있었다. 그러나 경유, 등유, 가솔린 및 원유에 대해 고른 분해력을 나타내는 것으로 보아 유류 오염 토양의 정화에 유용하게 사용할 수 있는 균주로 사료된다.

실시예 5: 본 발명 균주에 의한 원유분해 최적조건 조사

본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주 (Pseudomonassp. CU1)에 대하여 최적 원유분해 온도 및 pH를 조사하였다. 원유 1%(v/v)를 첨가한 최소배지 20mL에 접종원 2%(v/v)를 접종하여 각각 20℃, 25℃ 및 30℃ 온도에서 pH 조건(pH 5, 6, 7, 8, 9)을 달리하여 6일간 배양하였다. 배양후 EPA 3510의 액액 추출법으로 추출한 후 GC-FID로 정량 분석하였으며 GC 분석조건은 상기 실시예 4와 동일하게 실시하였다.

실험 결과, 도 4 내지 도 6에 나타낸 바와 같이 20℃, pH 6의 조건에서 배양한 경우 원유분해력이 61.39% 높게 나타났으며 배양시 미생물에 의한 원유의 유화, 응집이 일어나면서 분해가 진행되는 것을 확인할 수 있었다.

국내에서도 노카르디아 속(Nocardiasp.)과 같은 원유 분해 균주의 분리 및 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으나 대부분 해양오염처리를 위한 목적으로 개발되고 있는 실정이다. 반면, 본 발명 슈도모나스 속 CU1 균주는 해양유류오염 처리 이외에도 토양에서 우수한 분해능을 보이므로 유류오염토양 처리에 유용한 균으로 사용되어질 수 있으며 원유이외에 가솔린, 경유, 등유 등의 다양한 유류 오염물질의 분해가 가능하므로 다양한 유류 오염물질 처리시 매우 유용할 것으로 생각된다. 또한, 대한민국의 평균토양 온도 및 pH 조건인 20℃, pH 6에서 매우 높은 유류분해능을 나타내므로 본 발명 슈도모나스 속 CU1(수탁번호 KCTC 18065P)균주는 토양환경에 매우 적합한 균주임을 알 수 있었다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 원유를 비롯하여 가솔린, 경유 및 등유를 분해할 수 있는 균주를 제공함으로써 유류로 오염된 해양 뿐 아니라 토양을 생물학적 방법에 의해 복원시킬 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 환경산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

유류를 분해할 수 있는 토양으로부터 분리한 원유분해 균주 슈도모나스 속 CU1(수탁번호:KCTC 18065P).
온도 15∼25℃, pH 5∼9의 조건에서 토양내 유류분해능이 50% 이상임을 특징으로 하는 원유분해 균주 슈도모나스 속 CU1(수탁번호: KCTC 18065P).
제 1항 내지 제 2항에 있어서, 상기 유류는 원유, 가솔린, 경유 및 등유임을 특징으로 하는 원유 분해균주 슈도모나스 속 CU1(수탁번호: KCTC 18065P).
탄소원으로 유류를 첨가한 최소배지에 유류오염된 토양을 접종하여 20∼30℃에서 농후배양한 다음 영양한천배지에 도말하여 원유분해균주를 분리하고 상기 분리 균주의 성장정도와 유류분해능을 조사하여 균주를 선별함을 특징으로 하는 원유분해 균주 슈도모나스 속 CU1(수탁번호: KCTC 18065P)의 생산방법.