KR100998035B1

KR100998035B1 - 유류 분해능을 갖는 슈도모나스 속 미생물 및 상기미생물을 이용한 유류 오염 물질의 처리 방법

Info

Publication number: KR100998035B1
Application number: KR1020030030509A
Authority: KR
Inventors: 김무훈; 박형수; 이종광; 조미영
Original assignee: 삼성엔지니어링 주식회사
Priority date: 2003-05-14
Filing date: 2003-05-14
Publication date: 2010-12-03
Also published as: KR20040098213A

Abstract

본 발명은 유류 오염 물질의 생물학적 처리를 위하여 유류 분해능을 갖는 슈도모나스 속 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 발명으로서, 본 발명의 미생물은 디젤유 등과 같은 유류 오염 물질에 대한 처리 능력이 우수한 특성이 있으므로, 이를 이용하여 유류 오염 물질을 처리하면 유류 오염 물질로 오염된 토양을 경제적이면서도 효율적으로 정화시킬 수 있다는 장점이 있다.

유류, 슈도모나스 속 미생물, 유화 활성도

Description

유류 분해능을 갖는 슈도모나스 속 미생물 및 상기 미생물을 이용한 유류 오염 물질의 처리 방법{Pseudomonas sp. capable of dissolving oil and method of treating oil material which involves pollution using the same}

도 1 은 본 발명의 신규한 미생물 슈도모나스(Pseudomonas sp.) 제네코-1(수탁 번호 : KCCM 10435)의 전자 현미경 사진이다.

도 2 는 본 발명의 신규한 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)을 이용하여 디젤유를 처리하는 경우, 배양 시간대별 상기 미생물의 유화 활성도를 상이한 디젤유 농도에 따라 나타낸 그래프이다.

도 3 은 본 발명의 신규한 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)을 이용하여 디젤유를 처리한 후, 상기 미생물 배양액 중 잔류 디젤유를 가스 크로마토그래피로 분석하여, 그 결과를 대조구인 디젤유를 분석한 결과와 함께 나타낸 그래프이다. (A) 는 미생물 배양에서 사용한 디젤유와 동일한 디젤유를 미생물없이 4 일간 교반한 후 수거하여 GC(가스 크로마토그래피) 분석한 결과이고, (B) 와 (C) 는 본 발명의 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)을 디젤유에 접종한 후, 각각 2, 4 일간 교반시켜 배양한 후 배양액 중의 잔류 디젤유를 수거하여 분석한 결과이다.

도 4 는 본 발명의 신규한 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)을 이용 하여 TPH가 5,000, 10,000, 15,000 mg/kg 이 되도록 디젤유로 인공 오염시킨 실제 오염된 토양을 처리한 후, 잔류 디젤유를 측정하여 시간별 디젤유 제거율을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 유류(油類) 분해능을 갖는 슈도모나스 속 미생물 및 상기 미생물을 이용한 유류 오염 물질의 처리 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 디젤유 등과 같은 유류 오염 물질에 대하여 분해능이 우수한 미생물 슈도모나스 제네코-1(GENECO-1) 및 이러한 미생물을 이용하여, 고농도의 유류 오염 물질을 처리하는 방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 유류는 중요한 에너지 자원으로서 널리 사용되고 있으며, 그 사용량 및 사용 범위는 계속적으로 증가하고 있는 추세이다. 그러나, 이러한 증가 추세와 더불어 유류 유출 빈도 및 유류 유출로 인한 오염도 또한 급증하고 있는 실정이다. 예를 들면, 석유 화학 물질의 이송 파이프 또는 주유소의 지하 저장 탱크의 관리 미흡 및 각종 사고로 인한 유류 유출, 고의적인 유류 유출 등은 전지구적으로 엄청난 규모의 환경 오염을 야기시키고 있다.

그 중 토양 오염은 대기 오염이나 수질 오염에 비하여 오염 물질의 확산 속도가 낮은 반면, 피해 정도가 광범위하고 피해 양상이 지속적으로 나타난다는 특징이 있어, 일단 오염된 토양을 복원하기 위하여 시간 및 비용이 많이 필요하며 정화 기술 면에서도 대기 및 수질 오염과는 상이한 방식으로 접근하여야 한다.

일반적인 유류 오염 토양 복원 기술은 물리적 처리 기술, 화학적 처리 기술 및 생물학적 처리 기술을 포함한다.

이 중, 고화 처리 등과 같은 물리적 처리 기술은, 오염 물질의 이동을 통제하여 주위 환경에의 노출을 방지하여 그 위해성을 제거하는 방법으로서 오염 물질을 근본적으로 제거하는 방법이 아니라는 한계점을 갖고 있다. 한편, 토양 세척 등과 같은 화학적 처리 기술은, 화학적 촉매를 사용하여 토양 중에 흡착되어 있는 오염 물질을 토양으로부터 분리시키는 방법으로서, 오염 물질 처리에 사용된 각종 화학 물질로 인한 2차 오염이 수반된다는 한계점을 갖고 있다.

이러한 한계점을 갖고 있는 물리적 처리 기술 및 화학적 처리 기술의 대체 기술로서, 미생물을 이용한 생물학적 복원 기술(bioremediation)이 현재 활발히 연구되고 있다. 유류 분해 효소를 갖고 있는 미생물은 각종 유류 등을 탄소원으로 분해하여 이를 물질 생합성의 기질로 이용하기 때문에 이를 이용하는 생물학적 복원 기술은 2차 오염을 유발시키지 않는 친환경적인 방법으로서 현재 각광받고 있으며, 이와 관련된 출원도 증가 추세에 있다.

그러나, 이러한 생물학적 복원 기술은 물리 화학적 복원 방법에 비하여 유류 분해 속도가 느리다는 단점이 있어, 유류 분해능이 매우 우수하고 고농도의 유류 오염 물질에도 적용이 가능한 균주의 분리 및 선별은 관련 기술 분야의 핵심이다. 또한 유류 분해능이 우수한 균주를 바탕으로 한 미생물 처리제로 오염된 토양을 정화시키는 경우, 경제적이고 효율적으로 유류 오염 물질을 정화할 수 있으므로, 이 러한 처리제가 상품화되어 판매되고 있으며 보다 나은 제품을 위한 개발과 연구도 계속적으로 수행되고 있다.

유류 분해 미생물 등은, 한국 특허 공개 번호 제2002-0060009호 "신규한 원유분해 균주 및 그 생산방법" 및 공개 번호 제1996-014329호 "유류 분해능을 갖는 아시네토박터 속 미생물" 등에 기재되어 있다. 이 중, 한국 특허 공개 번호 제2002-0060009호에는, 상기 특허 공보에 기재되어 있는 미생물 슈도모나스 속 CU1을 이용하여 원유 1%(v/w)로 오염된 토양을 7 일간 처리한 결과 토양 내 57.17 % 의 원유를 분해하였다고 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 현재 유류 오염 물질로 인한 오염 빈도 및 오염 정도의 증가 추세에 비추어 볼 때, 유류 오염 물질을 효율적이고도 경제적으로 제거하기 위하여, 유류 오염 물질 처리 속도 및 분해능 등을 개선할 필요성은 여전히 남아 있다.

따라서, 본 발명자들은 이와 같은 유류 오염 물질 제거를 위한 생물학적 복원 기술 분야의 문제점을 충분히 인식하고, 유류 오염 물질의 분해 속도 및 분해능을 혁신적으로 높일 수 있는 본 발명의 미생물을 밝혀내었다.

본 발명의 주된 목적은 유류 분해능을 갖는 미생물 슈도모나스 제네코-1 (KCCM 10435)을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 이용한 유류 오염 물질의 처리 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 유류 분해능이 우수한 미생물 슈도모나스 제네코-1(GENECO-1)을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 유류 분해능이 우수한 미생물 슈도모나스 제네코-1을 이용한 유류 오염 물질 처리 방법을 제공한다.

본 발명의 유류 오염 물질 처리 방법에 있어서, 유류 오염 물질로 오염된 토양의 TPH(총석유계탄화수소)는 바람직하기로는 2,000 - 10,000 ppm 이고, 더욱 바람직하기로는 5,000 - 10,000 ppm 이다.

본 발명의 유류 오염 물질 처리 방법에 있어서, 상기 유류에는 가솔린, 디젤유, 등유, 가황유 등이 포함되며, 바람직하기로는 디젤유이다.

본 발명에 있어서, "TPH" 라는 용어는, 총석유계탄화수소(Total Petroleum Hydrocarbon)로서, 물 또는 토양 등에 포함되어 있는 원유 농도를 의미한다. 이와 같은 TPH 의 측정은 예를 들면, 미국의 EPA 법 3550M 에 의하여 소닉(sonic) 추출한 후 EPA 8015B 에 의하여 정량분석될 수 있다.

본 발명에 있어서, "유류(油類)"란 용어는, 광의로는 동ㆍ식물성 기름 및 광물성 기름을 모두 포함한다. 주성분은 탄화수소로서, 원유를 증류시킨 결과 얻을 수 있는 나프타(가솔린), 등유, 디젤유 및 이들을 다양한 사용 목적에 맞추어 가공 처리한 각종 기름도 포함한다.

본 발명에 있어서 "유류 오염 물질"이라는 용어는, 상기 정의된 바와 같은 유류 중 예를 들면 유류 이송 파이프, 유류 저장 탱크 등에 의하여 통제되지 않은 채, 물(담수 및 해수를 포함함) 또는 토양 등에 유출되어 환경 오염을 야기하는 유 류를 의미한다.

본 발명에 있어서 "디젤유"란 용어는, 디젤 엔진의 연료로서 알맞은 유류로서 원유를 증류시켜 얻을 수 있으며, 경유 또는 중유 등이 이에 포함된다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위하여 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)의 분리 방법을 설명한다.

본 발명은 유류 분해능이 탁월한 신규한 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)를 제공한다. 본 발명의 균주는 2002년 10월 12일자로 한국 미생물 보존센터에 기탁번호 KCCM 10435로 기탁되었다.

본 발명의 미생물은 다음과 같은 과정에 의하여 분리될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

오랜 기간 유류 오염에 노출되었던 토양으로부터 디젤을 탄소원으로 한 고체 배지를 이용하여 생육 가능한 균주를 1차 분리한 다음, 1차 분리된 균주를 디젤을 유일한 탄소원으로 첨가한 액체 배지에서 4 일간 배양한 후, 유화 활성도를 측정하여 유화 활성능이 우수한 균주를 2차 분리한다. 2차 분리된 각각의 균주를 단일 탄소원으로서 디젤을 첨가한 액체 배지에 접종하여 4 일간 배양한 후, 배양액 중의 잔류 디젤유의 양을 분석하여 이 중 디젤 분해능이 가장 우수한 균주를 최종 선별하여 동정한다.

더욱 구체적으로, 다음과 같은 과정에 의하여 분리될 수 있다.

유류 분해능이 있는 미생물을 분리하기 위하여, 오랜 기간 동안 유류 오염에 노출되었던 토양의 시료(예를 들면, 주유소 근처의 토양)를 채취하여 멸균 식염수 에 현탁한 다음, 1.0 % 디젤유를 첨가한 기본 배지(Bushnell Hass Medium : Difco)로 제조한 고체 배지를 사용하여 37℃에서 4일간 배양하여 생육 가능한 균주를 1차 분리한다. 상기 1차 분리된 균주를 회수하여 0.2 - 1 % 의 디젤이 유일한 탄소 공급원으로서 함유되어 있는 디젤분해최소배지(Yeast extract 0.1 g/l, NH₄NO₃ 1 g/l, K₂HPO₄ 1.5 g/l, NaH₂PO₄ 0.2 g/l, MgSO₄ㆍ7H ₂O 0.25 g/l, MnSO₄ㆍ4H₂O 0.05 g/l, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.05g/l)에서 30℃, 180rpm으로 24시간 배양한다. 이 후, 일정량의 배양액을 무균적으로 채취하여 Bioscreen C(Labsystem co, Finlan)로 유화 활성화도를 측정한다. 유화 활성화도가 높은 우수한 균주를 2차 분리하여 이를 다시 디젤분해최소배지에 접종하여 30℃, 180rpm으로 4일간 배양한 후, 가스 크로마토그래피를 이용하여 배양액 중의 잔류 디젤유를 분석하여 균주별 디젤유 분해능을 비교한다. 이와 같이 유류로 오염된 토양으로부터 분리한 각 균주의 유화 활성도 및 디젤유 분해능을 각각 비교하여, 유화 활성도 및 디젤유 분해능이 우수한 균주를 분리할 수 있다. 본 발명에 따른 미생물 슈도모나스 제네코-1의 세부적인 형태와 크기를 광학현미경(Olympus BS51TR-3200, Japan) 및 주사전자현미경(FE-SEM, HITACHI-S4500II)으로 관찰하여, 그 결과를 표 1 에 기재하였다.

형태 특성

항목	특성
그람염색(Gram stain)	-
형상(Shape)	간균
폭(Width)	0.5 - 0.6 (㎛)
길이(Length)	1.8 - 2.6 (㎛)

본 발명에 따른 미생물 슈도모나스 제네코-1의 배양 특성을 표 2 에 기재하였다.

배양 특성

항목	특성
최적 배양 온도	30 ℃
최적 pH	7.0
호기적 성장	양성

본 발명의 슈도모나스 제네코-1의 생리생화학적 검사를 API 20NE test strip(bioMerieux Co, France)로 실시하여 그 결과를 각각 표 3 및 표 4 에 기재하였다.

생리 생화학적 특성

항목	특성
카탈라제(카탈라제 생산)	+
옥시다제(시토크롬 옥시다제 생산)	+
질산칼륨(질산염의 환원)	+
트립토판 이용(인돌 생성)	-
글루코스 이용(산화)	-
아르기닌 이용(아르기닌 디하이드롤레이즈 생산)	+
우레아 이용(우레이즈 생산)	-
에스큘린 이용(에스큘린 가수분해)	-
젤라틴 이용(젤라틴 가수분해)	-
피엔피지(피-니트로페닐-베타-디-갈락토피라노시드) 이용(베타-갈락토시다제 생산)	-

유기물 이용 능력

항목	특성
글루코스(호기성)	+
아라비노스	-
만노스	-
만니톨	-
엔-아세틸-글루코사민	-
말토스	-
글루코네이트	+
카프레이트	+
에디페이트	+
말레이트	+
시트레이트	+
페닐-아세테이트	+

이어서 본 발명의 미생물 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)를 이용하여 유류 오염 물질을 처리하는 방법을 설명한다.

본 발명의 미생물을 사용하여 유류 오염 물질을 처리하는 하나의 방법은 본 발명의 미생물을 이용하여 유류로 오염된 토양을 직접 처리(인 시튜(in situ) 생물학적 토양 정화)하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 처리 방법은 오염 토양 주변에 건물이나 지하 관망 등이 있어서 오염 토양을 굴착하기 어려운 상황에서 사용하는데, 바이오벤팅(bioventing) 및 공기 주입법 등을 포함할 수 있으며, 통상적으로 유류 분해능이 있는 미생물을 토양 중에서 활성화시키기 위하여 산소 및 미생물 영양원 등을 공급하여 오염 지역을 복원하는 기술이다.

본 발명의 미생물을 사용하는 유류 오염 물질을 처리하는 또 다른 방법은, 본 발명의 미생물, 담체, 영양 염류 등을 포함하는 오염 토양 정화용 조성물을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 토양 안정용 또는 개량용 물질 또는 수질 개선제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 미생물 또는 유류로 오염된 물 또는 토양의 토착 미생물의 활동성 또는 오염 물질 분해 효소의 발현을 촉진시키는 가속 영양제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 미생물을 사용하여 유류 오염 물질을 처리하는 또 다른 방법은 본 발명의 미생물을 유류로 오염된 물 또는 토양과 동시에 또는 순차적으로 반응기 내에서 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 반응기는 오염 토양 정화 시스템의 일부를 구성할 수 있다. 이러한 반응기는 통상적으로 오염토양저장조, 오염토양처리조, 배출수저장조와 유수분리기를 포함하며, 외부 기후 변화에 따른 온도 저하로 미생물에 의한 처리효율 저하를 방지하기 위하여 토양 온도를 높이는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물을 반응기 내에서 생장에 적합한 온도, pH 및 영양 염류 조건(본 발명 미생물의 배양 특성은 상기 표 2 에 기재되어 있음)으로 배양하면서, 유류로 오염된 물 또는 토양을 반응기 내로 연속적으로 또는 불연속적으로 공급하므로써 본 발명의 미생물과 오염된 유류를 접촉시킬 수 있다.

본 발명의 미생물을 사용하여 유류 오염 물질을 처리하는 방법은 단독으로 또는 본 발명의 미생물의 생장 및 유류 분해능을 저해하지 않는 범위 내에서 물리 화학적 방법과 함께 유류로 오염된 물 또는 토양에 사용하는 것을 포함할 수 있다. 통상적인 물리적 오염 토양 처리 방법은 고화 처리, 지중 가열, 지중 유리화 및 지반 동결, 차폐 및 차수막에 의한 방법 등을 포함할 수 있으며, 통상적인 화학적 오염 토양 처리 방법은 토양 세척 및 추출 기술, 토양증기 세척법, 공기 주입법(Air Sparging), 용매추출법 등과 같은 방법을 포함할 수 있다.

다음의 실시예로서 본 발명을 예시할 수 있다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 좀더 자세하게 설명하고자 하는 것이며, 본 발명의 보호 범위가 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 유류로 오염된 토양으로부터 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)의 분리

(1) 1차 균주 분리 : 유류로 오염된 토양으로부터 생육 가능한 균주의 분리

유류 분해능이 있는 미생물을 분리하기 위하여, 오랜 기간동안 유류 오염에 노출되었던 토양의 시료(주유소 근처의 토양)를 채취하여 멸균 식염수에 현탁한 다음, 1.0 % 디젤유를 첨가한 기본 배지(Bushnell Hass Medium : Difco)로 제조한 고체 배지를 사용하여 생육 가능한 균주를 1차 분리하였다. 이와 같이 1차 분리된 균주를 다음의 유화 활성화도 평가에서 사용하였다.

(2) 2차 균주 분리 : 유화 활성화도 평가에 의한 유류 분해능이 우수한 균주의 분리

상기 1차 분리된 균주를 수거하여 1 % 의 디젤이 유일한 탄소 공급원으로서 함유되어 있는 디젤분해최소배지(Yeast extract 0.1 g/l, NH₄NO₃ 1 g/l, K₂HPO₄ 1.5 g/l, NaH₂PO₄ 0.2 g/l, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.25 g/l, MnSO₄ㆍ4H₂O 0.05 g/l, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.05g/l)에서 30℃, 180rpm으로 24 일간 배양하였다. 이 후, 일정량의 배양액을 무균적으로 채취하여 Bioscreen C(Labsystem co, Finlan)로 유화 활성화도를 측정하였다. 유화 활성화도가 높은 우수한 균주를 분리하여 다음의 디젤유 분해능 평가에서 사용하였다.

(3) 최종 선별 : 잔류 디젤유 분석에 의한 최우수 균주의 분리

상기 2차 분리된 균주를 다시 디젤분해최소배지에 접종하여 30℃, 180rpm으 로 4일간 배양한 후, 가스 크로마토그래피를 이용하여 잔류 디젤유를 측정하여 균주별 디젤유 분해능을 비교하였다. 이렇게 얻은 액체 배양액을 분액 깔때기에 넣은 후, 배양액 내의 유분을 회수하기 위하여 상기 배양액의 2 배에 해당하는 n-헥산을 넣고 잘 혼합되도록 하여 잔류 디젤유가 n-헥산 층으로 옮겨지도록 하였다. 이 후, 혼합물의 n-헥산층이 완전히 분리될 때까지 정치해 둔 다음, n-헥산층을 회수하였다. 이와 같은 과정을 3 회 반복하여 배양액 내의 유분을 완전히 분리하였다. 회수된 n-헥산층을 수거하여 무수 황산 나트륨 20 g 을 채운 화학분석용 여지(Whatma No. 1)에 통과시켜 탈수시켰다. 여액의 용매를 진공 건조기를 이용하여 완전히 제거하여 가스 크로마토그래피의 분석 시료로 사용하였다. 사용된 가스 크로마토그래피는 불꽃 이온화 검출기가 장착된 HP-5890 Plus II(Hewlett Packard)였다. 가스 크로마토그래피의 운반 기체로서 질소를 사용하였으며, 운반 기체의 유속을 13.1 ml/min 로 하였다. 가스 크로마토그래피의 컬럼은 DB-5 GC 컬럼(30 m ×0.53 mm, 1.5 ㎛)을 사용하였다. 컬럼 온도를 2 단계로 나누어 승온시켰는데, 1 단계 승온 온도는 50 - 210 ℃ 로 분당 8 ℃ 씩 증가시켰으며, 2 단계 승온 온도는 210 - 270 ℃ 로 분당 60 ℃ 씩 증가시켰으며, 승온 단계 이후 최종적으로 5 분간 270 ℃ 의 온도를 유지시켰다. 주입구 및 검출기의 온도를 250 ℃ 로 조정한 후 1 ㎕ 의 시료를 주입하여 분석하였다.

이와 같이 유화 활성도 및 디젤유 분해능을 각각 비교한 결과, 유류로 오염된 토양에서 분리된 미생물 중 유화 활성도 및 디젤유 분해능이 가장 우수한 미생물을 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)로 명명하고 2002년 10월 12일자로 한국 미 생물 보존 센터에 기탁 번호 KCCM 10435 로 기탁하였다.

실시예 2 : 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)의 유화 활성화도 및 디젤 분해능 측정

실시예 1 에서와 같이 유류로 오염된 토양으로부터 분리, 선별한 미생물 슈도모나스 제네코-1의 유류 오염 물질 정화 능력을 측정하고자, 다음과 같이 유화 활성화도 및 디젤 분해능을 평가하였다.

(1) 전배양 과정

유화 활성도 및 디젤 분해능 조사를 위하여, 1.0 % 의 디젤이 첨가된 기본 배지(Nutrient Broth : Difco) 5 ml 에 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)를 한 백금이 접종한 후 30 ℃ 에서 24 시간 동안 180 rpm 으로 진탕 배양하였다.

(2) 유화 활성도 측정

3 개의 Bioscreen C 의 용기에 디젤 농도가 각각 2,000 ppm, 5,000 ppm, 10,000 ppm 인 멸균된 디젤분해최소배지 380 ㎕ 를 첨가한 다음, 상기 (1) 전배양 과정에서 얻은 전배양액을 5 % 의 농도로 접종하여, 30 ℃ 에서 교반없이 7 일간 배양하면서 540 nm 에서의 흡광도를 자동 측정하였다. 흡광도 0.1 을 유화 활성도 1 unit 로 나타내었다. 실험 결과 2,000 - 10,000 ppm 의 다양한 유류 오염 물질 농도 범위에서 본 발명 미생물의 적용이 가능한 것으로 나타났으며, 특히, 10,000 ppm 의 고농도에서도 적용이 가능한 것으로 밝혀졌다.

(3) 잔류 디젤의 분석

3 개의 배양 용기에 동일한 양의 디젤(1%)을 포함하는 멸균된 디젤분해최소 배지 50 ml 를 첨가한 다음, 그 중 2 개의 용기에 상기 (1) 의 전배양 과정에서 얻은 전배양액을 2.0 % 농도로 접종한 다음, 30℃에서 4일간 180rpm으로 진탕 배양하였다(단, 전배양액을 접종한 2 개의 용기 중 하나는 2 일간만 배양하였음). 이후, 실시예 1 의 잔류 디젤 분해능 분석 실험 절차와 동일한 절차로 상기 3 가지 배양 용기 내의 배양액에 대하여 가스 크로마토그래피 분석을 실시하였다. 가스 크로마토그래피 분석으로 얻은 크로마토그램의 각 피크의 면적을 적분법으로 계산한 결과, 본 발명의 미생물은 저분자 탄화수소는 물론 C₁₆ 이상의 비교적 고분자의 알칸 계열 탄화수소를 분해 96시간 이내에 95% 이상 분해할 수 있는 것으로 나타났다. 크로마토그램의 각 피크 적분값 및 디젤유 분해율은 하기 표 5에 기재된 바와 같다.

	2일째		4일째
	피크 적분면적값	분해율(%)	피크 적분면적값	분해율(%)
D. W.			3.1726 ×10⁶	0(기준)
제네코-1	1.92356 ×10⁶	39.37	8.97553 ×10⁴	97.19

도 3 및 표 5 에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 미생물은 저분자 탄화수소는 물론 C₁₆ 이상의 비교적 고분자의 알칸 계열 탄화수소를 분해 96 시간 이내에 95 % 이상 분해할 수 있는 것으로 나타났다.

실시예 3 : 비교 실시예

슈도모나스 제네코-1의 유화활성의 우수성을 확인하기 위하여 n-alkanes의 분해능이 있는 슈도모나스 애루지노사 KCTC1636(ATCC 15522, 미국 특허)와 유화활성을 비교하였다. 1.0%의 디젤이 첨가된 기본 배지(Nutrient Broth : Difco) 5 ml에 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)과 슈도모나스 애루지노사 KCTC1636을 한 백금이 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 180rpm으로 진탕배양하였다. 디젤 1%가 첨가된 디젤분해최소배지 5ml 전배양액을 2.0%로 접종한 다음, 30℃에서 4일간 180rpm으로 진탕배양하였다. 배양 후 540nm에서의 흡광도를 측정하여, 흡광도 0.1을 유화 성도 1unit로 하여 유화 활성도를 각각 측정하였는 바, 그 결과를 하기 표 6 에 나타내었다.

균주명 및 제품명	흡광도 (O.D 540nm)	유화활성도 (O.D 0.1=1unit)
Pseudomonas sp. 제네코-1	1.034	10.34
Pseudomonas aeruginosa KCTC1636 (ATCC 15522)	0.788	7.88

실험 결과 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)이 슈도모나스 애루지노사 KCTC1636에 비하여 우수한 유화활성도를 나타내었다.

실시예 4 : 실제 유류 오염 물질의 정화

TPH가 각각 5,000, 10,000, 15,000 mg/kg 이 되도록 디젤유로 인공 오염시킨 실제 토양을 슈도모나스 제네코-1으로 처리하여 본 발명의 미생물의 생물학적 분해능을 평가하였다. Batch 실험 결과는, TPH가 5,000 mg/kg인 토양의 디젤유 제거율이 가장 높게 나타났으나, 28일 후에는 TPH가 10,000 mg/kg 인 토양이 67% 로 가장 높은 디젤유 분해율을 나타냈다. 이는 초기 TPH의 농도가 5,000 mg/kg보다 높은 경우, 미생물이 최적 반응 조건을 형성하는데 소요되는 적응 기간이 필요하기 때문인 것으로 사료된다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 다양한 농도의 유류 오염 물질을 슈도모나스 제네코-1(KCCM 10435)를 이용하여 처리하는 경우, 이러한 오염 물질들을 효과적으로 분해, 제거할 수 있다.

Claims

유류 분해능을 갖는 미생물 슈도모나스 (Psedomonas sp.) 제네코-1 (수탁 번호 : KCCM 10435).
제 1 항의 미생물을 제공하는 단계; 및

상기 미생물을 유류 오염 물질과 접촉시키는 단계

를 포함하는, 제 1 항의 미생물을 이용한 유류 오염 물질의 처리 방법.
제 2 항에 있어서, 유류 오염 물질의 TPH(총석유계탄화수소)가 2,000 - 10,000 ppm 인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 유류가 디젤유인 방법.