KR0126419B1 - 유류 분해능을 갖는 아시네토박터(Acinetobacter)속 미생물 - Google Patents

유류 분해능을 갖는 아시네토박터(Acinetobacter)속 미생물

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Abstract

본 발명은 신규한 미생물을 제공하며, 이 미생물은 아시네토박터(Acinetobacter)속에 속하며 우수한 유류 분해능을 갖는다. 본 발명의 균주 USI(KCTC 8618P)은 따라서 유류의 분해 또는 유류에 의해 오염된 지역을 처리하기 위한 목적으로 이용될 수 있다.

Description

유류 분해능을 갖는 아시네토박터(Acinetobacter)속 미생물
본 발명은 유류(油類) 분해능을 갖는 신규한 아시네토박터(Acinetobacter)속 미생물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 해양 또는 토양이 유류에 의해 오염된 경우에 오염된 유류를 분해하여 제거하기 위해 사용할 수 있는 아시네토박터속 미생물에 관한 것이다.
원유탐사, 수송중 사고에 의해 또는 청소나 공장폐기물의 고의적인 유출 등에 의해 해양 및 육상에 유출된 유류는 피막을 형성하여 산소나 태양광선의 투과를 차단하여, 수중유(oil-in-water)상태로 휘발성분이 제거되면 고밀도의 타르볼(tar ball)로 응집한다. 유출유류는 자연계에서 완전히 제거되는데 수백년 소요된다.
유류유출 오염사고는 그 시기를 예측할 수 없고, 시간이 지남에 따라 오염범위가 확대되므로 신속한 대처가 요구된다.
종래 유류 유출오염 사고지역을 처리하는 방법으로는 오일펜스, 오일붐(oil boom)등의 확산방지방법과 유류회수장치 등의 기계적 수단, 볏짚, 폴리우레탄폼, 쵸크 등의 물리적 흡착, 그물 등으로 유출유류를 회수하는 방법과 분산제로 처리하는 방법 등을 들 수 있다. 그러나 전자의 방법은 2차적인 처리가 요구되며, 후자의 분산처리방법은 2차 오염이 발생되는 문제점을 갖는다. 현장에서 소각하는 방법은 가장 손쉬운 처리방법이지만 이 방법을 적용할 수 있는 경우가 제한되며, 소각장치까지 이송해야 하는 문제점이 있다. 한편 미생물을 이용하는 자연정화방법은 영양물질이나 산소공급이 요구되지만, 상술한 문제점을 갖지 않기 때문에 가장 추천되고 있는 방법이다.
종래 유류 분해능을 갖는 미생물을 이용하여 유출오염 유류를 처리하는 방법으로는 슈도모나스(Pseudomonas)속 미생물을 이용한 예가 보고 되고 있다. 즉, 리투아니아공화국의 빌니우스에 소재하는 바이오센트라스(Biocentras)사가 발행하는 기술자료에 따르면, 상기 회사는 개발한 유류 분해능 미생물 제제인 Degradoilas와 Putidoil을 개발한 것으로 보고하고 있는데, 이들 제제는 각각 슈도모나스속의 균주를 비롯한 여러 속의 혼합균주 및 슈도모노나스 푸티다 균주를 함유하고 있다. 사용방법은 질소, 인 및 카리를 포함한 비료 용액에 상기 미생물 균주를 넣어 유류 오염지역에 스프레이하는 것이다.
한편 미국에서도 일부 회사가 유류 분해능 미생물 제제를 개발한 것으로 보고하고 있지만, 상세한 균주 목록은 비밀로 유지하고 있고 다만 슈도모나스속에 속하는 균주라는 것만 밝혀져 있다(BioEnviro Tech, Inc. 사 발행 카타로그; 및 Oppenheimer Environmental Co. 발행 카타로그).
그러나 상술한 종래의 방법으로도 효율적으로 오염 유류를 분해제거할 수 없었기 때문에, 본 발명자들은 보다 분해능이 뛰어나고 유용하게 이용할 수 있는 새로운 균주를 제공하고자 광범위하게 연구한 결과, 아시네토박터속 미생물에 의해 상기 목적을 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 목적은 유류(油類) 분해능을 갖는 아시네토박터(Acinetobacter)속 균주(KCTC 8618P)를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기한 균주를 유류에 의해 오염된 지역에 사용함을 특징으로 유류에 의해 오염된 지역의 처리방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명하며, 본 발명의 다른 목적 및 적용은 하기 발명의 상세한 설명란으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명자들은 우수한 유류 분해능을 갖는 미생물을 찾기 위하여 울산 퇴적토에 각종 미생물을 분리하고 그들의 원유 분해능을 측정하고, 그중 분해능이 우수한 균주를 분리 및 동정하였다. 유류 분해능이 가장 우수한 균주는 아시네토박터속의 새로운 균주로 동정되었으며, 본 발명자들은 이 균주를 USI으로 명명하였다. 본 발명에 따른 아시네토박터 USI은 1994년 9월 30일자로 한국과학기술원 유전자은행에 KCTC 8618P의 기탁번호로 기탁되었다.
이하 실시예를 통하여 본 발명의 균주를 분리 및 동정하고 그의 원유 분해능을 측정하는 방법을 기술한다.
[실시예 1]
울산의 퇴적토를 채취하여 멸균된 시료채취병에 옮기고, 냉장보관하였다. 유황 성분을 2.52%의 양으로 함유하는 쿠웨이트 원유 0.5%를 함유하는 원유액체배지(황산암모니움 1g, 제2인산칼륨 0.01g, 숙성 해수 750ml, 증류수 250ml, pH 7.5)10ml내에서 25℃, 1주일간 진탕배양하였다.
배양액 1ml을 취하여 조벨 2216e 한천배지(이후 조벨배지로 약함; 펩톤 5g, 효모엑기스 1g, 인산철 0.01g, 숙성해수 1리터, pH 7.5)에 도말하고, 25℃에서 5일간 배양하며 미생물 집략을 분리하였다.
각각의 집략을 조벨배지에서 배양하여 흡광도를 1.0으로 조절한 후, 다시 원유액체배지 10ml에 접종하여 25℃, 120rpm에서 3일간 배양하였다. 배양액을 10초간 볼택싱한 뒤, 10분간 정치하고, 유화층을 3ml 취하여 표면장력측정기(미국 피셔사 제품)으로 표면장력을 측정하였고, 또한 헥사데칸에 대한 계면장력을 측정하여 유화능을 검토하였다.
그 결과 미생물을 접종하지 않은 대조군에서의 표면장력은 64.7dyne/cm로 나타났으며, 각 미생물을 접종한 군에서의 직쇄상 성분에 대한 표면장력은 47 내지 65dyne/cm의 범위내에 있었다. 이중에서 표면장력이 47dyne/cm로서 유화능이 가장 우수한 균주를 선정하고 US1으로 명명하였다. 본 발명의 균주 아시네토박터 US1은 헥사데칸에 대한 계면장력도 대조군의 58.0dyne/cm보다 낮은 49.0dyne/cm의 값을 나타내어 유화능이 우수함을 알 수 있었다.
[실시예 2]
유류 분해능을 다음과 같은 방법으로 측정하였다 : 원유액체배지 10ml에서 각각의 분리된 미생물을 배양한 후 진한 염산을 1ml 첨가하고, 클로로포름 5ml로 추출하였다. 클로로포름 3ml로 2회 더 추출한 뒤, 추출액을 분액깔대기에 옮기고, 무수 황산나트륨에 통과시켜 수분을 제거하였다. 클로로포름 10ml로 2회 세척하였다.(이를 클로로포름 추출액이라 한다.) 내경 18mm의 유리관에 알루미나를 1.5cm, 실리카를 3.5cm 되도록 충진한 컬럼에 클로로포름 추출액을 첨가한 후 헥산 20ml, 클로로포름 20ml를 각각 통과시켜 직쇄상 성분과 방향족(aromtic) 성분을 얻을 수 있으며, 진공증발기로 유기용매를 날려보냈다.
직쇄상 성분과 방향족 성분을 각각 헥산 3ml로 용해시키고, 8ml 용량의 갈색 유리용기에 옮긴 후 질소개스로 유기용매를 날려보냈다. 다시 헥산 1ml 녹이고, 1μ1을 취하여 메틸 실리콘이 충전된 컬럼 30m×0.53mm으로 개스크로마토그래피로 FID분석하였다. 주입온도는 306℃, 분석온도는 280℃, 컬럼시작온도는 100℃, 컬럼최종온도는 300℃로, 100℃에서 180℃까지 본당 8℃로, 180℃에서 210℃까지 분당 3℃로 증가시켰고, 최종 1.5분간 홀딩시켰다. 개스는 고순도 질소를 사용하였다. 개스크로마토그래피의 운영조건은 블루머 등의 방법(Blumer et., Deep-Sea Res, 20, 239, 1973)을 이용하였다.
원유의 직쇄상 성분의 미생물학적인 분해를 측정하기 위하여 클로로포름 추출액에 스콰렌을 첨가하여 정량하는 기준물질로 사용하였다. 개스크로마토그래피에서 얻은 피크로부터 원유 직쇄상 성분의 C17/프리스탄 및 C18/피탄의 비교치를 구하였다.
그 결과, 본 발명의 아시네토박터 US1은 그의 C17/프리스탄 및 C18/피탄의 비교값이 각각 1.34 및 1.25로서 그의 우수한 직쇄상 유류의 분해능을 나타내었다.
[실시예 3]
실시예 1에서 얻는 US1 미생물을 동정하기 위하여 각종 실험을 행하고 그 결과를 아래에 나타내었다.
본 발명의 아시네토박터속 US1은 그램염색시 음성의 간균으로서, 4-35℃에서 생장하며 최적 생장온도는 25℃이었다. 특히 소금이 0-4% 함유되어 있는 경우 모두 생장하였다. 집략형태는 베이지색 원형으로, 표면은 매끄럽고, 컨벡스(convex)형이며, 둘레는 미끈하였다.(entire)
생화학적 시험 결과는 다음과 같다.
옥시다제 : 음성
카탈라제 : 양성
O/F test : 음성
운동성 : 음성
TSI : 음성
전분 가수분해 : 음성
젤라팀 가수분해 : 음성
카세인 가수분해 : 음성
유화수소 생성 : 음성
유레아제 : 양성
구연산 : 양성
인돌 생성 : 양성
질산 생성 : 음성
트윈 80 분해 : 음성
메틸레드 : 음성
보게스/프로스카우어 반응 : 음성
0/129 감수성 : 양성
에스클린 가수분해 : 양성
포도당 발효 : 음성
말토스 발효 : 음성
만니톨 발효 : 음성
이상에서 얻어진 결과를 토대로 하여 Bergy's Manual을 참고로 본 발명의 균주 US1은 아시네토박터속의 새로운 균주로 동정되었다. 본 발명자들은 상기 아시네토박터속 US1을 1994년 9월 30일에 한국과학기술원 유전자은행에 기탁하고 KCTC 8618P의 기탁번호를 수여받았다.
[실시예 4]
쿠웨이트 원유를 0.2%로 첨가한 원유액체배지 10ml(유류 6.09mg 함유)에 아시네토박터속 US1(KCTC 8618P)을 접종하고, 25℃에서 3일간 또는 5일간 배양하였다. 이후 시료를 실시예 2와 동일하게 처리하여 유류 잔류량을 측정하고 균주에 의한 유류 분해도를 계산하였다.
3일 또는 5일 배양에 의해 유류는 각각 2.67mg 및 1.41mg의 양으로 잔존하였고, 미생물을 접종하지 않은 대조군에서는 초기 6.09mg, 3일후 3.74mg, 5일후 3.21mg의 유류를 포함하고 있었다. 따라서, 미생물에 의해 56.2% 및 76.8%의 원유가 분해되었음을 알 수 있다.
[실시예 5]
실시예 4에서와 동일하게 미생물을 배양한 후 얻어진 시료를 실시예 2에서와 동일하게 추출공정을 거쳐 최종적으로 헥산에 용해되는 방향족 성분을 얻었다. 이 방향족 성분을 질소개스로 처리하여 유기용매를 날린 후 아세토니트릴 원액(LC 등급)으로 다시 녹여 회석한 후 여과하였다.
여액에 포함된 방향족 화합물의 잔류량을 HPLC를 이용하여 측정하였다. 이때 사용된 컬럼은 Inertsil ODS 150-T이고, 이동상으로는 아세토니트릴 80%를 사용하였다. 용매용출속도는 1ml/min, 주입된 시료의 양은 10μ, 그리고 검출파장은 254nm이었다. 시료의 정량기준물질로는 페난스렌을 사용하였다.
5일 배양한 경우, 미생물을 접종하지 않은 대조군에 비해 아시네토박터속 US1(KCTC 8618P)을 접종한 처리군에서는 방향족 성분이 76.4% 분해되는 것으로 측정되었다. 따라서, 본 발명의 균주인 아시네토박터속 US1(KCTC 8618P)은 유화활성 특성뿐만 아니라 직쇄상 탄화수소와 방향족 탄화수소를 분해하는 능력을 고루 갖추고 있는 새로운 균주임이 확인되었다.
[실시예 6]
실시예 4에서 배양에 의해 얻은 유류 시료에 대하여 실시예 2에서와 동일한 방법으로 C17/프리스탄 및 C18/피탄의 비교치를 구하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1 C17/프리스탄, C18/피탄의 비교치]
상기 결과로부터 유류가 미생물학적으로 분해되었음을 확인할 수 있다.
이상에서 설명한 바와 같이 우수한 유류 분해능을 나타내며 방향족 유류 성분도 분해할 수 있는 본 발명의 아시네토박터속 US1(KCTC 8618P)은 유류 유출사고 등에 의해 유류에 의해 오염된 토양 또는 해양에 적용하여 이들 오염지역을 정화하는데 사용될 수 있다. 유류에 의해 오염된 지역에 상기 균주를 적용하는 방법은 특별히 한정적이지 않으며, 통상의 처리방법에 따라 행할 수 있다.

Claims (2)

  1. 유류 분해능을 갖는 아시네토박터(Acinetobacter)속 US1(KCTC 8618P).
  2. 유류 분해능을 갖는 아시네토박터(Acinetobacter)속 US1(KCTC 8618P)을 유류에 의해 오염된 지역에 적용시킴을 특징으로 하는 유류에 의해 오염된 지역의 처리방법.
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