KR100406879B1

KR100406879B1 - 벤젠분해균주 및 그 이용방법

Info

Publication number: KR100406879B1
Application number: KR10-2000-0044629A
Authority: KR
Inventors: 박진희
Original assignee: 삼성에버랜드 주식회사
Priority date: 2000-08-01
Filing date: 2000-08-01
Publication date: 2003-11-21
Also published as: KR20020011252A

Abstract

본 발명은 유류 및 유독성분 중 벤젠을 단시간에 다량 분해시킬 수 있고, 혐기적 조건 및 호기적 조건 하에서 모두 생장 가능하며, 넓은 범위의 생육 pH를 갖는 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) HPLB-1 및 그 이용방법에 관한 것이다. 본 발명의 균주는 1500 ppm 이상의 높은 농도에서도 효과적인 매우 빠른 속도의 벤젠 분해능을 가지므로 벤젠으로 오염된 지역을 정화하는 데 효과적이며 환경친화적인 정화방법을 제공한다.

Description

벤젠분해균주 및 그 이용방법{BENZENE-DEGRADING BACTERIA AND ITS UTILIZTION METHOD}

본 발명은 벤젠분해균주 및 그 이용방법에 관한 것이다.

전세계적으로 석유탄화수소는 산업현장에 널리 쓰이고 있으며 많은 양의 원유 또는 정제된 제품들이 생산, 운반, 저장, 이용 등의 과정으로 환경에 유출되고 있다. 이것들은 계속되는 사회발전과 더불어 그 사용량이 증가하고 있으므로, 이에 따라 환경오염이 더욱 심화되고 있어, 이러한 유류에 의한 환경오염의 정화는 필수적이며, 해외에서는 수년 전부터 여러 가지 처리방법들이 연구되어 왔고 국내에서도 활발히 개발되고 있는 실정이다.

현재 주유소, 공장이나 각종 사업체 등에서 기름에 의한 환경오염 문제의 심각성은 국내외적으로 크게 대두되고 있다. 그런데 전체 기름 중 특히 가솔린에 많이 포함되어 있는 벤젠은 발암물질로 잘 알려져 있으며, 비교적 높은 용해도와 휘발성으로 인해 대기와 수질에 매우 큰 오염을 일으키고 있다. 따라서 이를 분해할 수 있는 미생물의 개발이 절실히 필요한 실정이다.

종래 벤젠분해균주의 선발 및 동정은 대부분 낮은 벤젠 농도에서 행해진 것으로서 이는 실험실 수준에서 행해질 수 있는 것이나 (Mallakin and ward 1996 J of Industrial Microbiology 16, 309-318; Heldeman 1994 Applied and environmental microbiology 60:2697-2703; Haack et al 1994 Applied and environmental microbiology 60:2480-2493; Robert et al. 1998 Applied and environmental microbiology 64:3961-3165; Norman et al. Plant diesease 1997 81:847-850; Jaunisses et al 97 Jaunisses 등 Phytoma la defence des vesetanx 49:17-22), 실제 오염지에서는 벤젠 농도가 높아 벤젠분해균주를 직접 오염지에 접종하여 벤젠을 분해시키는데는 이용할 수 없다는 단점이 있다.

따라서 벤젠을 분해할 수 있는 미생물의 개발이 절실히 필요하며, 유류오염지 등 실제 필드에 적용하기 위해서는 고농도의 벤젠을 함유한 경우에도 생육 및 분해가 충분히 높은 정도로 이루어지는 균주 및 이를 이용한 경제적, 효과적 및 환경친화적인 벤젠 분해 방법이 필요하다.

본 발명은 유류 및 유독성분 중 벤젠을 빠른 시간 내에 다량 분해시킬 수 있고, 혐기성 조건 및 호기성 조건에서 모두 생장가능하며, 넓은 범위의 생육 pH를 가지며, 1500 ppm 이상의 높은 벤젠 농도에서도 효과적인 벤젠분해능을 갖는 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) HPLB-1 및 그 이용방법에 관한 것이다.

도 1a 및 도 1b는 본 균주의 16s rRNA 분석법을 이용한 동정결과를 나타내는 데이터이다.

본 발명은 벤젠분해균주 및 그 이용방법에 관한 것이다.

일반적으로 미생물에 의한 벤젠오염 분해제품은 벤젠농도가 1000 ppm 이하인 농도에서 분해연구를 수행하고 있다. 그러나 본 미생물은 1500 ppm의 고농도 벤젠이 함유된 배지에서 실험을 수행하여 균주를 분리 및 실험하였다. 따라서 기타 분리미생물에 비하여 훨씬 높은 벤젠분해율을 보일 것으로 생각된다.

오염농도의 수준은 자연환경에서 다양하게 나타날 수 있으므로 저농도 및 고농도에서의 분해활성이 높아야 효율적인 유독 폐가스 제거미생물이라고 할 수 있으며, 또한 호기 조건뿐만 아니라 혐기 조건에서도 효율적인 생장이 이루어져야만 분해할 세균의 밀도가 증가하게 된다. 그리고 토양내 또는 배양기상에서 독성가스형태의 휘발물질인 벤젠을 효율적으로 분해하려면 미생물의 분해속도가 중요하며 미생물이 생장하는 장소의 pH도 매우 주요한 요소이다.

현재까지의 세균 분리는 실험실 조건, 즉 낮은 벤젠농도와 미생물 생장에 매우 적합한 조건에서 실시되었지만 본 발명에서는 오염지의 환경과 유사할 정도로 벤젠농도가 높은 상태에서 그 오염을 줄이기 위한 균주를 필요로 한다. 따라서 실제오염상황과 비슷한 조건에서 감소율을 측정하기 위하여 벤젠분해균주를 선발하여 균주 동정하고, 가시적 세균활력검정으로 벤젠을 오염원으로 하는 지역에 사용함으로써 그 목적을 달성하고자 한다. 또한 넓은 범위의 pH와 혐기성 조건에서도 벤젠을 분해할 수 있는 우수한 균주를 선발하는데 본 발명의 또 다른 목적이 있다.

본 발명에 따른 벤젠분해균주의 분리방법은 유류로 오염된 토양을 채취한 다음 벤젠을 포함하는 배지에서 배양하여 벤젠분해능이 높은 균주를 선발, 동정한다. 벤젠분해균주의 선발에 있어서 자연상황의 조건을 인위적으로 쉽게 부여해 줄 수 있는 기본영양배지 (MSM : minimum salt medium; Na₂HPO₄·12H₂O 9g/ℓ, KH₂PO₄1.5g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.2g/ℓ, NH₄Cl 1.0g/ℓ, FeSO₄·7H₂O 0.1g/ℓ, CaCl₂·2H₂O 0.1 g/ℓ, 미량원소 용액(ZnSO₄·7H₂O 10mg/ℓ, MnCl·4H₂O 3mg/ℓ, H₃BO₃30mg/ℓ, CoCl₂·6H₂O 20mg/ℓ, CuCl·6H₂O 0.56mg/ℓ, NiCl·6H₂O 2mg/ℓ, NaMoO₄·2H₂O 10mg/ℓ) 3㎖/ℓ)에 탄소원 및 에너지원으로 벤젠을 첨가하여 분해 미생물을 분리하였다. 배양 후 많은 밀도를 가지는 우점균을 선별하여, 벤젠을 단일 탄소원으로 사용하는 기본배지에서 1 ∼ 3 일간 호기조건으로 배양한 후 벤젠 분해도가 우수한 균주를 선택하였다. 선별된 균주가 다양한 pH와 무산소 상태에서도 잘 생장할 수 있는지의 여부를 검정하고, 균주동정은 16s rRNA Gene에 기초하여 MicroSeq 16s rRNA sequencing kit를 이용하여 이루어졌으며, ATCC 표준균주의 16s rRNA 분석결과 라이브러리와 비교하여 동정하였다. 그 결과는 도 1에 나타낸 바과 같이, 본 발명의 균주는 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)인 것으로 확인되었으며, 이 균주를 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) HPLB-1로 명명하였으며, 5월 18일자로 서울특별시 서대문구 홍제 1동에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM-10187를 받았다.

실시예

실시예 1: 벤젠분해균주의 분리

시료채취를 위하여, 경기도 일대에서 장기간 폐기물이 존재했던 지역을 조사하여 토양을 선택하고, 지하 0 ~ 50 cm에서 기름지 토양을 채취하여 비닐봉투에 투입한 후 4 ℃에서 냉장보관하였다.

번호	채취일자	채취장소	시료수	오염원
1	1999.4.15	경기남부 공업폐기물 처리장	14	유류
2	1999.4.17	수원동부 폐기물처리장	11	유류
3	1999.4.12	수원지역 폐기물처리장	8	유류

상기에서 채취한 시료 1 g을 MSB(minimal salt broth) 50 ㎖가 포함된 250 ㎖ 삼각플라스크에 접종하고, 각각 1000 ppm의 벤젠을 첨가한 후 테플론으로 처리한 고무마개로 막아 2 ∼ 3 일간 30 ℃, 170 rpm으로 집적배양하였다. 균주가 자라 배지가 탁하게 되면 2 ∼ 3 회 계대배양한 후 루리아스 아가배지(Luria's agar media)에 평판 도말하였다. 이틀 후 집락이 많이 형성된 균주를 다시 루리아스 아가배지에 선형 도말하여 배양한 후, 각각 500, 1000, 및 1500 ppm 벤젠이 포함된 MSB에 접종시켰다. 24 시간 진탕배양 (30 ℃, 170 rpm)한 후, 각각의 벤젠분해도를 측정하였다.

상기 최소영양성분에 벤젠을 포함한 배지에서 10⁶∼ 10⁷cfu/㎖ 범위의 콜로니를 선택하여 각각 순수분리하고, 이 순수분리한 균주를 500, 1000, 1500 ppm의 벤젠을 포함한 각 배지에서 24 ∼ 48 시간 배양한 후에 잔존 벤젠양을 측정하였다. 벤젠분해도가 높은 배양기상의 세균을 평판 도말법으로 분리하여 균주동정은 16s rRNA Gene에 기초하여 MicroSeq 16s rRNA sequencing kit를 이용하여 이루어졌으며, ATCC 표준균주의 16s rRNA 분석결과 라이브러리와 비교하여 동정하였다. 동정된 균주는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) HPLB-1로 명명하였으며, 5월 18일자로 서울특별시 서대문구 홍제 1동에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM-10187를 받았다. 유전자 검색에 따른 동정결과를 도 1에 나타냈으며, 벤젠분해능에 관한 가스크로마토그래프는 도 2에 나타내었다.

실시예 2: 벤젠분해능 측정

멸균된 7 ㎖ 최소영양배지와 단일 탄소원으로 첨가된 벤젠을 포함하는 혈청병(serum bottle)에 파장 660 nm에서 흡광도 0.12로 조절된 배양균주 3 ㎖를 접종하고, 24 ∼ 48 시간 동안 30 ℃에서 170 rpm으로 진탕배양하였다. 그런 후에 혈청병 상부공간의 벤젠을 500 ㎕ 가스 실린지를 사용하여 100 ㎕를 취하여 가스크로마토그래피로 잔류 벤젠양을 분석하고, 미생물의 유류소비율을 평가하기 위해서 미생물을 넣지 않고 유류와 미네랄성분만을 포함한 대조구와 투여한 대조구와 비교하였다. 본 발명에 의한 균주의 시간에 따른 벤젠농도별 벤젠분해율을 표 2에 나타냈다.

벤젠주입량 ppm	0시간	4시간	6시간	7시간	7.5시간
50	0.0	100	-	-	-
100	0.0	14.6	100	-	-
500	0.0	18.2	51.8	80.6	100

미네랄영양분과 물을 넣고 거기에 각각의 농도(ppm)로 벤젠을 첨가시킨 후 그 안에 세균을 접종시켰을 경우, 세균이 벤젠을 이용함으로써 첨가된 벤젠이 감소되는 정도인 감소율을 보면, 500 ppm의 경우 1 시간 이후부터 급격한 감소율을 보이며 4 시간 이후 100 % 감소율을 보였다. 100 ppm의 경우에 6 시간에 100 % 감소율을 보였고 500 ppm에서는 7.5 시간 이후에 100 % 감소율을 보였다. 또한, 첨가된 벤젠의 농도가 500, 1000, 1500 ppm인 경우에 균주를 접종한 후 24 시간 배양하면 모든 농도에서 100 % 벤젠이 분해되었다.

실시예 3: 고농도 벤젠의 분해율

주입된 벤젠의 농도가 1000 내지 5000 ppm 범위인 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 조건에서 본 발명의 균주를 상기 농도의 벤젠을 포함하는 배지에서 48 시간 동안 배양한 후에 벤젠분해율을 표 3에 나타냈다. 1500 ppm까지의 벤젠농도에서는 48 시간 동안 배양한 후에 100 % 분해하였다. 벤젠분해율은 3000 ppm에서 가장 높았으며, 효율은 낮으나 분해가능한 최고농도는 4000 ppm이며, 5000 ppm이상의 농도에서는 벤젠이 분해능이 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명의 균주는 4000 ppm 정도의 높은 벤젠농도에서도 생육가능하며 우수한 벤젠분해력을 나타냈다.

벤젠농도(ppm)	분해도(%)	제거량(ppm)
1000	100	1000
1500	100	1500
2000	87.0	1739.9
3000	59.9	1798.2
4000	7.0	281.4
5000	0	0

실시예 4: 생육 PH 측정

본 발명의 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) HPLB-1의 생육 및 벤젠 분해 적정 pH 범위를 측정하기 위해서, 1.0 M HCl과 NaOH를 이용하여 LB 배지의 pH를 4, 5, 6, 7로 각각 조절한 4 가지 배지에 하룻밤 동안 배양한 본 발명의 균주를 접종시켰다. 48 시간 후에 자외선 스펙트로포토미터(Hewlett Packard 8453)를 사용하여 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하면 다음 표 4와 같다. pH 4에서의 흡광도는 0.1611로 상대적으로 낮은 값을 나타내지만 매우 낮은 pH라는 것을 감안한다면, 본균주는 pH 4 - 7의 범위, 즉 자연계에서 일어날 수 있는 모든 pH 조건 하에서 생장할 수 있음을 알 수 있다.

균주	pH 4	pH 5	pH 6	pH 7
HPLB-1	0.1611	1.6329	1.7848	1.5051

실시예 5: 호기 조건 및 혐기 조건에서의 생육실험

혐기조건과 호기조건에서의 균주 생육 실험을 수행하기 위하여, 브로모티몰블루(bromothymol blue)가 첨가된 루리아스 아가 배양액 5 ㎖에, 하룻밤 배양한 균주 50 ㎕를 접종시켰다. 그런 후에 살균된 2 ㎖의 액체파라핀을 투여한 후 30 ℃에서 4 일간 정치배양한 후에, 배지의 색깔 변화로 호기 또는 혐기적 조건을 평가하였다. 그 결과 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) HPLB-1를 배양한 배지는 혐기적 조건과 호기적 조건 모두에서 노란색으로 변화하여 호기 및 혐기 조건에서도 벤젠을 탄소원으로 하여 생장가능함을 확인하였다.

본 발명은 유류 및 유독성분 중 벤젠을 빠른 시간 내에 다량 분해시킬 수 있고, 혐기 조건 및 호기 조건에서 모두 생장가능하며, 넓은 범위의 생육 pH를 갖는 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) HPLB-1 및 그 이용방법에 관한 것이다. 본 발명의 균주는 1500 ppm 이상의 높은 농도에서도 효과적인 벤젠분해능을 가지므로 벤젠으로 오염된 지역의 정화하는 데 효과적이며, 환경친화적인 정화방법을 제공한다.

Claims

1500 ppm 이상의 고농도 벤젠을 함유한 배지에서 생장 및 벤젠분해가능한 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) HPLB-1 (KCCM-10187).

제 1항의 균주를 벤젠 함유 토양에 직접 접종하여 벤젠을 분해하는 방법.

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