KR100481404B1 - 방향족 화합물 분해능을 갖는 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 피와이제이-1(케이에프씨씨-11302) 및 이를 이용한 오, 폐수 및 대기의 처리 방법 - Google Patents

방향족 화합물 분해능을 갖는 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 피와이제이-1(케이에프씨씨-11302) 및 이를 이용한 오, 폐수 및 대기의 처리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 난분해성 방향족 화합물의 분해에 우수한 능력을 보이는 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1(Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1) (KFCC-11302) 및 이를 이용한 오.폐수 및 대기의 생물학적인 처리방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 신규한 미생물에 의해 오.폐수 및 대기의 방향족 유기화합물 중 벤젠, 톨루엔, 자이렌, 스틸렌 화합물의 생물학적 처리에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 미생물은 단일 방향족 화합물 분해 뿐만 아니라, 혼합 방향족 화합물의 분해가 가능하므로, 오.폐수 및 대기의 처리에 큰 효과를 나타내어 환경오염을 방지할 수 있다.

Description

방향족 화합물 분해능을 갖는 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 피와이제이-1(케이에프씨씨-11302) 및 이를 이용한 오, 폐수 및 대기의 처리 방법{NOVEL MICROBE, RHODOCOCCUS PYRIDINOVORANS PYJ-1 (KFCC-11302) ENABLING DEGRADATION OF AROMATIC COMPOUNDS AND METHODS FOR DISPOSAL OF WASTE WATER, SEWAGE AND AIR USING THE SAME}
본 발명은 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1 (Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1) (KFCC-11302)및 이를 이용한 오. 폐수 및 대기의 생물학적인 처리방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 난분해성 방향족 화합물을 분해하는 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1를 제공하고, 이를 이용하여 난분해성 방향족 화합물인 벤젠, 톨루엔, 자이렌, 스티렌 화합물을 포함하는 오. 폐수, 토양 및 대기를 생물학적으로 처리하는 방법에 관한 것이다.
문명이 점차 발달하면서 점점 생태 환경에 관심이 높아지고 있다. 특히, 유기합성 기술에 의하여 생산되는 수많은 유독성 방향족 화합물들에 의한 수계의 각종 생물체에 미치는 보건학적 문제는 심각한 사회문제로 대두되어 관심이 높다. (Ember, 1990).
일반적으로 벤젠(benzene), 톨루엔(toluene), 스틸렌(styrene), 자일렌(xylene)등의 휘발성 유기 화합물은 산업이 발달함에 따라 많은 양이 생산되고, 수많은 산업공정에 광범위하게 사용되고 있다. 이로 인해, 최근 휘발성 유기화합물은 빈번하게 작업자에 노출되는 경우가 발생한다. 이러한 휘발성 유기화합물에 노출될 경우 비뇨기 및 장액 (serum bile acids)분비에 이상이 초래될 수 있다고 보고 되었다(Martin 등, 1998). 특히, 휘발성 유기화합물 중 벤젠은 매우 낮은 농도에 노출되어도 발암성과 중추신경계 마비, 간과 신장 등의 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
이러한 물질들이 환경과 인간의 건강에 미치는 악영향과 환경오염에 대한 관심이 증대되면서 휘발성 유기화합물을 정화하는 방법이 개발되어 오고 있다.
일반적으로 수 생태계에 존재하는 대표적인 방향족 화합물 분해 세균으로는 슈도모나스(Pseudomonas), 아크로모박터(Achromobacter), 알트로박터(Arthrobacter), 악시네토박테리아(Acinetobacteria) 등이 알려져 있다 (Bartha and Atlas, 1977). 그러나, 이들 미생물에 관한 연구는 대부분 혼합 방향족 화합물보다는 단일 방향족 화합물의 분해에 관한 것이었으며, 온도와 pH와 같은 환경요인 들을 고려한 포괄적인 연구가 되지 않아 미생물에 의한 그 분해능의 유지가 의문시되고 있는 실정이다.
또한 상기 방향족 화합물은 화학적으로 매우 안정한 구조를 이루고 있어 미생물에 의한 분해가 어려운 난분해성 물질(recalcitrants)로 분류되고, 이들을 분해하기 위한 물리화학적인 처리법은 일반적으로 2차 환경오염의 가능성이 클 뿐만 아니라 처리비용이 고가라는 단점을 가지고 있다. 따라서 활성이 큰 미생물을 이용한 효과적인 처리기술 개발이 더욱 절실히 요청되고 있는 실정이다.
일반적으로 벤젠은 직접적인 링(ring) 공격을 받아 분해되며, 톨루엔과 자일렌과 같은 메틸벤젠류들은 링(ring) 공격이나 메틸기의 하이드록실레이션(hydroxylation)에 의하여 분해가 개시되는 것으로 알려져 있다 (Bayly and Barbour, 1984). 그러므로 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌의 완전한 분해를 위해서는 다양한 종의 미생물이 확보되어야 한다.
보고 (Lee 1995)에 의하면 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌의 완전한 분해를 위해서 유전자 재조합된 균주를 만들었으나, 이러한 균주를 실제 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌 처리에 사용할 때의 안정성 문제가 여전히 남게 된다. 따라서 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌의 완전한 분해를 위해서는 우수한 분해능을 가진 미생물을 확보하는 것이 시급한 문제이다.
또한, 실제 공정을 적용해야 하는 상황에서는 단일 오염물질보다는 여러 가지의 오염물질을 동시에 처리하는 것이 필요하지만 모든 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌, 스틸렌 구성화합물을 동시에 분해하는 균주가 없는 실정이므로 벤젠, 톨루엔, 자일렌의 완전한 분해를 위하여 복합 균주의 사용이 필수적이다 (Lee at al., 1995).
이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 자연계에 존재하는 여러 가지 단핵 구조의 방향족 탄화수소 화합물에 대하여 분해능이 우수한 균주를 분리하고 방향족 화합물의 분해특성을 확인하여 이러한 배경으로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 및 스틸렌의 방향족 화합물 각각을 분해할 뿐 만 아니라, 그 혼합된 방향족 화합물도 효과적으로 분해할 수 있는 단일 균주를 분리 동정하는데 성공하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 벤젠, 톨루엔, 스티렌 및 자일렌 등이 포함된 방향족 화합물을 분해할 수 있는 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1(KFCC-11302)을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1(KFCC-11302)을 이용하여 단일 방향족 화합물 또는 혼합 방향족 유기화합물을 분해하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 신규한 미생물은 화학관련 폐수처리장의 폐수가 유출되는 하천 주위의 물과 토양 슬러지 등에서 채취한 시료 중에서 규제대상 휘발성 유기화합물 중 4종 (벤젠, 톨루엔, 자일렌, 스틸렌)화합물을 유일한 탄소원 및 에너지원으로 이용하는 5개의 균주를 분리하여 벤젠, 톨루엔, 자일렌 또는 스틸렌에 대하여 가장 높고 안정적인 분해능을 보인 종을 고체 한천 배지 상에서 분리하고 종 단위까지 동정하였다.
상기 방법으로 분리된 균주를 방향족 화합물의 분해에 이용할 시료로 제조하기 위하여, 최소배지 (Na2HPO4 4g, KH2PO4 1.5g, MgSO4 ㆍ7H2O 0.2g, CaCl2 0.01g, FeNH4-citrate 0.005g, 한천 15g을 1L에 녹여 만든 액체 배지)에 방향족 화합물, 예컨대, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 스틸렌을 첨가하고, 20-45℃, 가장 바람직하게는 32℃, pH 6-8, 가장 바람직하게는 pH 7의 호기적인 조건 하에서, 분리된 신규한 균주를 접종하여 배양하고 원심 분리하여 균주를 수득하였다.
본 발명의 신규한 균주는 공지의 처리제에 포함될 수 있다.
상기 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1(Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1) (기탁번호 KFCC-11302)는 방향족 화합물 특히, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 스티렌 각각을 포함하는 방향족 유기화합물의 분해 뿐 만 아니라, 이들이 혼합된 혼합 방향족 유기화합물 분해능을 갖는 미생물로서 오.폐수 및 대기 등의 처리에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예1
방향족 화합물 분해능을 가진 균주의 분리
방향족 탄화수소를 분해하는 균주의 분리를 위해서 방향족 탄화수소 혼합체를 각각의 물질이 적절한 농도로 함유되어 있는 최소배지 (Na2HPO4 4g, KH2PO 4 1.5g, MgSO4ㆍ7H2O 0.2g, CaCl2 0.01g, FeNH4-citrate 0.005g, 한천 15g을 1L에 녹여 만든 액체 배지)에 첨가하여 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌 또는 스틸렌을 유일한 탄소원으로 사용하는 5개의 균주를 이에 접종한 후 진탕 배양기를 이용하여 32℃에 배양하였다. 이후, 측정된 혼탁도(turbidity) (A600)가 1.0 이상일 때 새로운 최소배지에 2차 계대배양하여 미생물의 성장을 확인하였다. 계속하여 동일한 배지에 2-3회 다시 계대배양하여 안정된 균주를 얻었다.
상기 균주는 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌, 스틸렌을 유일 탄소 원으로 하여 32℃ 및 pH 6-8 에서 배양한 후 그 배양액을 5분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 이후 회수된 균주를 최소배지에 현탁한 후, 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌 및 스틸렌을 30ppm을 투입하였다. 32℃ pH 6-8에서 진탕배양하는 동안 일정 시간 간격을 두고 가스 시료를 채취하여 시료 내에 존재하는 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌, 스틸렌 양을 가스크로마토그래피로 측정하였다.
발명에 사용된 초기 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌, 스틸렌 접종량이 동일할 때, 단위 시간당 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌, 스틸렌 분해속도가 가장 빠른 균주를 분해능이 가장 높은 균주로 선별 분리하여 이를 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1(Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1)로 명명하였다.
실시예2
방향족 화합물 분해능을 가진 균주의 동정
상기 실시예1 에서 분리된 균주는 운동성이 있는 그람 양성간균으로 배지 상에서 둥글고 볼록한 콜로니를 형성하며 이의 특성은 표 1에 나타나 있다.
로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1의 형태적 배양적 특성
항목 특성
그람 염색 +
모양 간균
운동성 +
콜로니 색깔 빨간색
( +: 양성, - : 음성)
균주의 동정을 위하여 지방산을 분리하여 가스 크로마토그래피로 분석한 결과는 표 2에 나타낸 바와 같이 16:0이 31.94%로 가장 높은 조성을 보였다. 이 세포 지방산 조성과 16S rDNA 서열을 데이터베이스로 분석한 결과 로도코코스 피리디노보란스와 99%의 상동성을 보이는 바, 신규한 미생물은 로도코코스 피리디노보란스종의 신규한 종임이 확인되었다.
이상의 형태적, 배양학적 특성 및 생화학적 특성에 근거하여 본 신규한 미생물을 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1(Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1)로 명명하고, 2002년 3월 7일 한국 미생물 보존센타에 기탁번호 KFCC-11302로 기탁하였다.
로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1의 주요 지방산 성분
지방산 구성 (%)
12:0 0.1
14:0 1.71
15:0 1.53
16:1 w7c/15 iso 2OH 7.98
15:0 2OH/16:1 iso I 9.94
16:0 31.94
17:1 w8c 2.87
17:0 3.46
18:1 w9c/w7c 29.54
18:0 3.17
실시예 3
단일 방향족 화합물을 유일한 탄소원으로 한 최소배지에서 균주의 성장 확인
상기 실시예 1에서 분리된 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1(Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1) (기탁번호 KFCC-11302)의 단일 방향족 화합물의 분해능을 조사하기 위하여, 실시예 1의 최소배지, pH 6-8, 32℃에서 방향족 화합물인 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌, 스틸렌, 트리크로로에틸렌, 크로로포름을 유일 탄소원으로 이용하고, 각각 10 ppm씩 각각의 배지에 첨가한 후 배양하여, 배양액을 원심분리 하였다. 이후 채취한 상등액을 분광광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여, 균주의 생장정도를 판단하였다. 상기의 결과는 표 3과 같다. 본 발명의 신규한 균주는 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌, 스틸렌을 탄소와 에너지원으로 이용하여 증식하는 속도가 빨랐다. 그러나 트리크로로에틸렌과 크로로포름에 대하여는 낮은 증식상태를 나타냈다.
로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1의 방향족 물질과 유기염소계 물질에서의 성장 특성
기질 성장 특성
Benzene +++
Toluene +++
m-Xylene +++
o-Xylene +++
Styrene +++
TCE +
Chloroform +
( +: 낮은 성장, ++: 중간성장, +++: 빠른 성장)
실시예 4
단일 방향족 화합물을 유일한 탄소원으로 한 최소배지에서 균주의 방향족 단일 화합물의 분해능의 확인
실시예 3과 같은 방법으로 실험 후 상등액에 잔류하는 방향족 화합물의 양을 분석한 결과 단일 화합물의 제거경향은 도 1과 같이 나타났다. 도 1의 미착색 부분은 대조군으로서 균주 미첨가시의 결과이다. 10시간 배양 후 벤젠, 톨루엔, 스틸렌의 경우 잔류량이 검출되지 않았다. 메타-자일렌의 경우 20시간 후 100% 분해되어 다른 종류의 화합물보다 다소 느리게 분해되고 있음을 알 수 있었다. 방향족 화합물의 종류에 따른 분해 정도의 경향성은 벤젠, 톨루엔, 스틸렌 > 메타-자일렌의 순으로 나타났다. 본 발명의 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1 미생물이 벤젠, 톨루엔, 스틸렌, 메타-자일렌 화합물의 우수한 분해능을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 5
혼합 방향족 화합물을 유일한 탄소원으로 한 최소배지에서 균주의 성장 확인
상기 실시예1 에서 분리된 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1(Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1) (기탁번호 KFCC-11302)의 혼합 방향족 화합물의 분해능을 조사하기 위하여, 실시예 1의 최소배지, pH 6-8, 32℃에서 방향족 화합물 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌 및 스틸렌을 유일 탄소원으로 각각 6 ppm씩 첨가하여 총 농도 24ppm로 배지에 첨가한 후 배양하여, 배양액을 원심 분리한 후 채취한 상등액을 분리하여 분광광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 증식상태를 판단하고 그 결과는 도2와 같이 나타난다. 본 균주는 19시간 내에 정지기로 들어가는 양상을 보였으며 대수증식기를 지나 흡광도는 일정한 값을 유지하였다. 비교 균주 1과 2는 (Pseudomonas sp.) 19시간 내에 정지기로 들어가는 결과를 보였지만, 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌, 스틸렌을 유일한 탄소원으로 이용하는 능력이 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1보다 떨어짐을 알 수 있었다. 따라서 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1로 동정된 본 발명의 신규한 미생물이 비교 미생물에 비하여 생육이 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 6
혼합 방향족 화합물을 유일한 탄소원으로 한 최소배지에서 균주의 방향족 혼합 화합물의 분해능의 확인
상기 실시예 5와 동일한 방법으로 실험 후 상등액에 잔류하는 혼합 방향족화합물의 양을 측정한 결과는 도 3과 같이 나타났다. 이때 대조군은 방향족 유기화합물 분해능을 갖는 것으로 공지된 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.)을 이용하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 혼합체의 분해능도 단일 화합물의 경우와 마찬가지로 적응기가 나타나지 않았다. 본 발명의 신규한 균주 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1 균주의 경우 9시간 경과 후 90% 정도 제거되었으며, 이후 14시간에는 거의 100%의 제거효율을 보였다. 또한, 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌, 스틸렌을 각각 25 ppm을 함께 첨가 (총농도 100 ppm)한 후 제거능은 14시간 경과 후 64% 정도가 제거되었으며 26시간 후 93%의 제거효율을 보였다.
방향족 탄화수소와 같은 혼합물의 미생물에 의한 분해는 다양한 요인들에 의해 결정되고, 특히 혼합물의 분해시 미생물은 특정 물질에 대한 선호도를 나타내는 경우가 있는데, 이 경우 선호도의 정도에 따라 따른 물질의 상대적인 분해 저해 현상이 나타나게 된다. 그러나 도 3의 경우 방향족 탄화수소 분해시 최소의 상대적인 저해도가 나타나 방향족 탄화수소 분해의 극대화를 이룰 수 있었다.
이러한 결과에서 알 수 있듯이, 현재까지 혼합 방향족 화합물 특히, 벤젠과 톨루엔, 메타-자일렌, 스틸렌 혼합체의 동시 제거는 보고 되고 있지 않았으나, 본 발명의 신규한 균주는 이러한 혼합 방향족 화합물의 분해능이 매우 우수한 것으로 판명되었다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1 (KFCC-11302)는 산업활동 과정에서 자연 환경에 유출되어 인체 및 생물체에 유해한 영향을 미치고 나아가 환경오염을 일으키는 주범인 방향족 화합물 특히 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌, 스틸렌 등의 제거능이 우수한 것을 알 수 있다. 또한, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 스틸렌 네 물질을 동시에 모두 분해하는 단일 균주는 존재하지 않는 것으로 보고되었으나, 본 발명의 신규한 균주는 이들이 혼합된 경우에도 동시에 분해할 수 있는 능력이 있음을 확인 할수 있다.
따라서, 본 발명의 신규한 미생물을 이용하여 방향족 화합물에 오염된 폐수, 하수, 또는 토양, 대기 등에 적용시 상기 미생물을 이용한 생분해 과정에 의하여 2차 오염 없이 환경을 효율적으로 정화할 수 있으므로, 휘발성 유기용제를 사용하는 세탁소 등 소규모 사업장에서부터 화학, 제약공장, 폐기물처리장, 농축산물 가공업체에 이르기까지 폭 넓게 활용될 수 있을 것이고, 특히 본 연구의 결과로 주유소와 같은 시설 주변의 오염된 토양과 대기 및 지하수의 방향족 탄화수소 제거에 응용될 수 있으며 악취성 휘발성 물질의 제거에 중요한 자료로 이용될 것이다.
도 1은 본 발명의 신규 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1 (KFCC-11302)을 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌 및 스틸렌의 단일 화합물을 함유한 최소배지에서 배양 후 화합물의 농도감소를 도시한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 신규 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1 (KFCC-11302)을 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌 및 스틸렌의 혼합 방향족 화합물을 함유한 최소 배지에서 배양 후 이들의 성장을 도시한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 신규 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1 (KFCC-11302)을 벤젠, 톨루엔, 메타-자일렌 및 스틸렌의 혼합 방향족 화합물을 함유한 최소 배지에서 배양 후 이 혼합 방향족 화합물의 제거효율을 도시한 그래프이다.

Claims (7)

  1. 단일 방향족 화합물 및 혼합 방향족 화합물 분해능을 갖는 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1(Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1) (KFCC-11302).
  2. 제 1항에 있어서, 방향족 화합물은 벤젠, 톨루엔, 자일렌 또는 스틸렌 각각 또는 이들이 혼합된 혼합 방향족 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 신규한 미생물 로도코코스 피리디노보란스 PYJ-1(Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1) (KFCC-11302).
  3. 제 1항의 신규한 미생물을 이용한 단일 방향족 화합물 또는 혼합 방향족 화합물을 포함하는 오.폐수 및 대기의 처리방법.
  4. 제 3항에 있어서, 방향족 화합물은 벤젠, 톨루엔, 자일렌 및 스틸렌 각각의 단일 화합물 또는 이들이 혼합된 혼합 방향족 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 오.폐수 및 대기의 처리방법.
  5. 제 4항에 있어서, 자일렌은 메타 자일렌인 것을 특징으로 하는 오.폐수 및 대기의 처리방법.
  6. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 신규한 미생물을 20-45℃, pH 6-8에서 배양하는 것을 특징으로 하는 오.폐수 및 대기의 처리방법.
  7. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 혼합된 벤젠, 톨루엔, 자일렌 또는 스틸렌 화합물이 100ppm 이하인 것을 특징으로 하는 오.폐수 및 대기의 처리방법.
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