KR100333439B1

KR100333439B1 - 원유분해 균주 슈도모나스 ＨＰＬＣ１(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＨＰＬＣ１)

Info

Publication number: KR100333439B1
Application number: KR1019990067864A
Authority: KR
Inventors: 박진희; 이승우; 박재현
Original assignee: 허 태 학; 삼성에버랜드 주식회사
Priority date: 1999-12-31
Filing date: 1999-12-31
Publication date: 2002-04-25
Also published as: KR20010103140A

Abstract

본 발명은 원유분해용 균주 슈도모나스 HPLC-1(Pseudomonas sp. HPLC-1)(기탁번호: KCTC 0713BP)에 관한 것으로, 해수 및 토양의 유류에 의한 기오염 장소로부터 균주들을 분리하여, 높은 농도의 원유포함 조건에서 원유의 높은 분해율을 가지며, 고농도의 생물유화제를 분비하는 슈도모나스 HPLC-1의 분리·동정과 최적 생장 배양법의 설정을 그 특징으로 하며, 본 발명에 의한 상기 원유분해 균주는 원유를 오염원으로 하는 지역의 오염분해에 대처하기 위한 안정적이며 환경 친화적인 정화방법을 제공하는데 현저한 효과가 있다.

Description

원유분해 균주 슈도모나스 ＨＰＬＣ１ (Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＨＰＬＣ１) {Strain for disintegrating crude oil Pseudomonas sp. HPLC-1}

본 발명은 원유분해 균주 슈도모나스 스투쩌리(Pseudomonas stutzeri) HPLC-1에 관한 것으로, 보다 상세하게는 원유로 오염된 해수 및 토양에서 공히 우수한유류분해력을 갖는 슈도모나스의 분리·동정 및 그의 생장 향상법에 관한 것이다.

원유로부터 유래한 탄화수소는 근대 산업화 이래 거의 모든 분야의 생산과 소비활동에 사용되어온 필수적 산업요소이다. 하지만, 개발과 생산지상주의에 입각한 무분별한 사용으로 심각한 환경문제를 일으켜 온 것은 주지의 사실로써, 이러한 문제들은 계속되는 사회발전과 더불어 지속적으로 증가할 것은 이미 예견된 바, 선진국을 비롯한 각국에서는 청정기술을 이용한 오염원의 매출억제에 노력을 경주해 왔으며 차세대 기술로써 기오염된 환경의 복원기술의 개발이 요구되고 있다.

이에 따라 미국을 비롯한 선진국에서는 수년 전부터 여러 환경복원기술이 활발하게 연구되고 있으며, 국내에서도 최근 오염처리기술 개발을 시도하고 있다. 이러한 환경복원기술의 보편적인 예는 지하수나 토양오염의 경우, 파이프를 설치하고 공기를 주입함으로써, 탈기시켜 대기로 방출하거나 활성탄 등에 흡착시키는 방법이 있으며, 해양 유출의 경우 오염의 확산을 방지하기 위한 수증막을 설치하고 화학계면활성제나 침전제를 살포하여 희석 또는 침전을 유도하는 방법이 있다. 그러나, 이 처리방법은 막대한 비용과 에너지가 소요되며, 때에 따라서는 전혀 해법을 제시하지 못할 수도 있다. 또한, 이 방법은 오염물질의 실질적인 제거가 아니라 단지 오염매체를 또 다른 매체로 옮긴 것에 불과한 것으로 토양이나 해수의 품질 개선에는 도움이 될지 모르나 궁극적인 해결책은 아닌 것이다.

따라서, 오염물질을 무기물화함으로써 2차 오염의 문제를 최소화할 수 있으며, 상대적으로 처리비용이 적게 소요되는 미생물학적 복원방법에 많은 연구가 실행중이다. 그러나, 현재의 연구는 대부분 기름농도가 20,000ppm의 낮은 농도에서의 미생물 정화에 관한 것이나, 실제로 유류오염지는 매우 낮은 농도부터 높은 농도에 이르기까지 그 농도가 다양하다. 또한, 원유는 가솔린유, 디젤유, 케로신유과 비교하여 성분별로 매우 다양한 종류의 물질로 구성되어 있어서, 원유가 토양이나 해수에 오염되었을 경우 빠른 시간내에 기름을 빨리 분해시킬 필요가 있다.

원유는 휘발유, 경유, 등유 등 특정용도에 사용하기 위하여 정제된 유류와 달리, 이들 유류성분 모두를 포함하는 것은 물론 나프타, 피치, 황, 염분, 기타 잔류물 등 갖가지 복잡 다양한 성분들로 구성되어 있어 분해나 제거가 용이하지 않다. 또한, 오염의 배출경로를 살펴보면, 제품화된 석유탄화수소는 원료유 생산을 위한 정제 및 화학제품 생산을 위한 이용과정 등에서 지속적으로 발생하나, 원유의 유출경로는 주로 운반선박의 좌초 등 돌발적인 사고에 의한 것으로 오염의 여파가 단기가, 그리고 집중적으로 나타나는 경향이 있으므로 기타 유류제품(휘발유, 경유 등의 연료유를 비롯한 벤젠, 톨루엔 등 중간 원료)등의 오염과는 다른 경로 및 형태를 갖는 것으로 보아야 할 것이다. 따라서, 오염에 대한 올바른 대처를 하기 위해서는 정화기술도 다르게 적용되어야 할 것으로 사료된다.

이에 따라 본 발명자들은 자연친화적인 미생물의 생리·생태학적 조건에 입각하여 짧은 시간내에 효과적으로 미생물을 분리하였으며, 종래의 연구결과에 비해 높은 농도에서도 생육이 가능하고 활성이 높은 미생물을 개발할 필요가 있다고 판단하여 300,000ppm에서 원유분해를 원활이 하는 미생물을 선별하고, 또한 이들 미생물의 생장에 매우 좋은 조건을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 저농도 뿐만 아니라 실제 환경오염지와 유사한 고농도의 원유에 대해서도 우수한 분해력을 갖는 슈도모나스 HPLC-1을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 균주가 가장 높은 활력을 가질 수 있는 최적의 생장환경 및 영양분을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

도 1은 본 발명에 의한 슈도모나스 스투쩌리 HPLC-1의 질소량에 따른 생장정도를 나타낸 그래프이고,

도 2는 본 발명에 의한 슈도모나스 스투쩌리 HPLC-1의 미네랄 영양원 감소에따른 생장정도를 나타낸 그래프이고,

도 3은 여러 pH 조건에서 본 발명에 의한 슈도모나스 스투쩌리 HPLC-1의 생장을 나타낸 그래프이고,

도 4는 여러 완충조건의 pH 조건에서 본 발명에 의한 슈도모나스 스투쩌리 HPLC-1의 생장을 나타낸 그래프이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은 다음과 같다.

본 발명에 의한 균주의 분리 추출 및 재구성 방법은 오염토양 채취단계, 균주 선발단계, 원유분해력 평가단계, 균주동정단계로 연구를 실시하였으며, 영양분에 따른 생장검토를 통해 원유 분해 균주의 최적의 생장조건을 선정하였다.

이하에서 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 하기한 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 본 발명의 일실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

먼저, 본 발명에 의한 슈도모나스 HPLC-1의 분리 및 동정에 대해서 설명한 다음, 상기 HPLC-1의 최적의 생장조건에 대해서 설명하고자 한다.

원유분류에 대한 고찰

원유의 화학작용에 대하여 '현대정유 대상공장 품질보증실 및 공정실험과'에서 제공한 자료를 살펴보면, 아래의 표 1과 같다.

원유	수율(%)	Sulfer(PTB)	Salt(PTP)	Nitrogen
원유	∼15℃	Sulfer(PTB)	Salt(PTP)	Nitrogen	16∼81℃
Arabian Heavy	4.11	5.42	2.8	1.2	849
Arabian Light	3.31	6.81	1.78	1.7	363
Iranian Heavy	3.77	5.13	1.86	5	1359

상기 표 1에 의하면, 원유에는 염분이 1.2∼5PTB이며 질소질이 849∼1359ppm포함되어 있음을 알 수 있다. 또한, 온도에 따른 휘발율은 15℃까지가 3.31∼4.11%, 16∼80℃에서 5.13∼6.81%로 기화하며 상온에서는 5.13∼6.81%정도로 나타나므로 기화율이 매우 낮고 이에 따라 원유는 휘발성이 매우 낮은 것으로 판단된다.

오염토양 및 해수 채취

경기도 일대의 폐기물이 오랜 기간 존재하는 지역을 조사하여 지하 0∼50cm에서 오염토양을 채취한 후 즉시 비닐빽에 투입한 다음 -5∼0℃에서 냉장보관하였다, 그리고, 강원도 지역의 유류에 의한 오염이 확인된 항구로부터 해수를 5000㎖씩 8개의 샘플을 얻었다.

	일시	장소	샘플수	기타
1	1999. 8. 5	경기	132	유류오염지
2	1999. 9. 10	동해, 삼척	8	유류오염지

균주분리 단계

상기 채취된 오염시료에 원유와 미네랄을 첨가하여 3일간 배양한 후 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 상기 시료내의 균주들 중 미네랄원을 넣어 생장이 용이하도록 하였으며, 원유분해력이 큰 균주의 농화배양을 위하여 원유 30%를 첨가하였다.

그 후, 원유분해가 가능한 세균을 LA(Luria-bertani broth + Agar, Difco, USA)에 도말하여 순수분리하였고, 다음으로 유일한 탄소원으로 원유를 30% 포함하는 미네랄 배지(표 3 참조)에 분리한 세균을 30℃, 10일간 각각 생장시킨 후 원유의 분해도를 검정하였다. 이들 가운데 생장이 가장 우수하며 원유의 분해도가 가장 높은 균주를 최종적으로 선발하여 보관하였다.

종류	첨가물	기타
다량첨가물질	Na₂HPO₄·12H₂O 9.0gKH₂PO₄1.5gMgSO₄·7H₂O 0.2gNH₄Cl 1.0gFeSO₄·7H₂O 0.1gCaCl₂·2H₂O 0.1g소량첨가물질 3mL2차 증류수 1000mL	pH 6.0∼6.2로 맞추어 121℃에서 15분간 살균시키고 50℃로 식힌 후, 멸균된 NaHCO₃의 마지막 농도를 0.5g/L로 맞춘다.
소량첨가물질	ZnSO₄·7H₂O 10㎎MnCl·4H₂O 3㎎H₃BO₃30㎎CoCl₂·6H₂O 20㎎CuCl·6H₂O 0.79㎎NiCl·6H₂O 2㎎NaMoO₄·2H₂O 0.01gFeCl₂0.1g

원유분해력 평가

유류분석은 가스크로마토그라피(Gas chromatography, Hewlett Packard, HD6890 series GC system)에 의하여 배양 후 잔존 기름함량으로 전량분석 하였다.

30%(v/v) 원유가 함유된 26㎖의 변형된 미네랄 배지(Modified minerals broth)와 30%(v/v)원유가 함유된 26㎖의 변형된 미네랄 배지에 글루코스를 2%함유시킨 메디아에 하릇밤 생장된 상기 균주를 1%(v/v)농도로 접종하여 30℃±1, 150 rpm으로 15일간 생장시켰다. 그 후, 헥산을 사용하여 남아 있는 원유를 추출한 다음 가스크로마토그라피(Gas Chromatography, FID, HP-6890)로 분석하였다.

원유의 분해력은 실험구 내의 미생물 대사활동에 의해 소모된 원유의 소모량을 측정하고, 대조구의 자연소모량을 구해 보정하여 평가하였다. 본 발명에 의해설계된 실험구와 대조구의 내용은 다음과 같다.

첫째, 유일한 탄소원으로 30%(v/v) 원유가 함유된 20㎖의 변형된 미네랄 배지(Modified minerals broth)와 둘째, 상기와 동일 조건에 부가적인 탄소원으로 글루코스를 0.3% 첨가시킨 배지 두 가지를 준비한 후, LB에서 하룻밤 생장된 상기 균주를 각각 1%(v/v)농도로 접종하여 실험구 1과 2로 설정하였고 상기한 두 가지 배지 조건에 미생물을 접종하지 않은 것으로 대조구 1과 2를 설정하였다. 그런 다음 30℃±1, 150 rpm으로 진탕 배양하였으며, 15일 후 실험구와 대조구의 원유 잔량을 측정하였다.

원유분석을 위하여 FID(Flame Ionized Detector)를 장착한 가스크로마토그라피(Gas chromato- graphy, HP6890, Hewlett Packard, USA)를 사용하였으며, 분석조건으로 미 환경부 지정 분석법(EPA Method 8015B)에 준하여 실시하였다.

상기 생장된 원유 분해균주의 원유 분해능은 아래의 표 4과 같다. 여기서, 표 4의 결과는 대조구에 대한 비교값을 나타낸 것이다.

종류	탄소원	분해율(%)
실험구 1	원유	15.9
실험구 2	원유+글루코스	20.6

상기 표4에 의하면, 슈도모나스 HPLC-1은 15일간의 생장후, 탄소원으로 30%원유와 글루코스를 첨가한 실험구 2는 대조구2에 비하여 20.6%로 원유를 분해하였으며, 글루코스를 첨가하지 않은 실험구 1은 15.9% 분해하였다. 따라서, 부가적인 탄소원으로 글루코스를 첨가한 실험구에서의 분해율이 4.68% 더 높은 것으로 나타났다. 이 결과에 의하면 슈도모나스 HPLC-1은 두 개 이상의 탄소원이 기질로 작용할 경우, 기질간의 저해작용 효과보다는 상승작용효과가 있는 것으로 판단된다. 이는 지역적으로 차이는 있으나 자연상태의 토양 및 해양에 탄소원으로서 글루코스를 비롯한 기본적인 당류가 존재하므로, 원유 유출에 의한 오염사고에 적용하는데 유리하게 작용할 것으로 판단된다.

따라서, 본 발명에 의한 균주 HPLC-1을 기름 오염지에 처리할 시 미네랄 영양원만 투여하여도 30%의 높은 원유오염지에서 기름을 다량분해하며, 그외에 0.3%의 탄소원인 당을 투여할 경우 원유를 분해시키는데 훨씬 더 효율을 증가시키는 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명에 의한 균주 슈도모나스 HPLC-1은 고농도의 기질분해력이 뛰어나므로 다량으로 유출된 현장에서의 적용성이 용이함은 물론, 지역적인 조건에 따른 적응능력도 뛰어난 것으로 사료된다.

균주 동정

상기 균주를 다음과 같이 동정하였다. 균주동정결과는 선정된 그람테스트(gram test)와 혐기·호기성 실험과 운동성 실험에서 그람(gram)음성, 호기성으로 나타났고, 현미경검정으로는 막대모양, 운동성은 양성으로 나타났다. 또한, Biolog.실험에 의한 균주의 생리적, 생화학적 특성을 조사한 결과, 슈도모나스 스투쩌리(Pseudomonas stutzeri)로 나타났다.

따라서, 본 균주은 슈도모나스 스투쩌리와 가장 유사한 것으로 나타났으며, HPLC-1(기탁번호 : KCTC 0713BP)로 명명하여, 한국과학기술원 유전자 은행에 1999. 12. 15.자로 기탁하였다.

상기와 같은 슈도모나스 스투쩌리 HPLC-1의 생장에 있어서 질소원, 미네랄 영양원, pH 등이 미치는 영향을 검토하기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다.

질소질의 양에 따른 생장

기름분해가 계속되는 경우 필요한 영양분을 검정하기 위하여 질소원 투여량에 따라 생장량을 비교하여 보았다. 상기 표 2의 영양분 중 NH₄Cl 1g(N: 0.261g) 대신에 (NH₄)₂SO₄1g(N: 0.21g), (NH₄)₂SO₄2g (N: 0.42g), (NH₄)₂SO₄4g (N: 0.84g), (NH₄)₂SO₄8g, (NH₄)₂SO₄16g (N: 1.68g)을 첨부한 후의 균의 생장량을 측정하여 질소원이 충분한 상태에서 균주의 생육력을 검정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 a1∼a6는 각각 a1 : NH₄Cl 1g, a2 : (NH₄)₂SO₄1g, a3 : (NH₄)₂SO₄2g, a4 : (NH₄)₂SO₄4g, a5 : (NH₄)₂SO₄8g, a6 : (NH₄)₂SO₄16g을 첨가한 경우를 나타낸 것이다.

상기 도 1에 의하면 1g의 질소(NH₄Cl)가 함유된 처리구가 약간 높았고, (NH₄)₂SO₄16g/L 처리한 경우가 약간 낮았으나, 질소량 증가에 따른 생육은 거의 유사함을 알 수 있다. 따라서, 높은 농도의 질소처리량도 균주의 생장에는 거의 무관할 것으로 판단된다.

미네랄 영양원 감소에 따른 생장 비교

각종 영양분의 과부족에 대해서도 검정을 실시하였다. 표 2의 영양분에서 다량 첨가물질의 양을 각각 1/10씩 감소시켜 첨가하였을 때의 생장을 검토하였다. 도 2에서,

b1 : 원래의 양대로 첨가한 경우 b2 : Na₂HPO₄·12H₂O를 0.9g 첨가한 경우

b3 : KH₂PO₄를 0.15g 첨가한 경우 b4 : MgSO₄·7H₂O를 0.02g 첨가한 경우

b5 : NH₄Cl를 0.1g 첨가한 경우 b6 : FeSO₄·7H₂O를 0.01g 첨가한 경우

b7 ; CaCl₂·2H₂O를 0.01g 첨가한 경우를 나타낸다.

도 2에 의하면 원래의 영양분에서 Na₂HPO₄의 감소가 가장 큰 영향을 주었고 다음이 MgSO₄, NH₄Cl, CaCl₂, FeSO₄가 생장에 다소 영향을 주었음을 알 수 있다.

원유분해균의 다양한 pH 조건에서의 생장

여러 pH 조건에서 본 발명에 의한 HPLC-1의 생장을 실험한 결과 도 3과 같다. 도 3은 배지의 초기 pH를 2N NaOH(수산화나트륨), 2N HCl(염산)을 이용하여 pH를 4, 5, 6, 7에 맞춘 후 슈도모나스 HPLC-1을 접종하여 생장실험을 수행한 결과이다. 도 3에 의하면, pH 7에서의 생장이 가장 우수했으며, pH 6, 5, 4의 순으로 생장이 우수함을 알 수 있다. 따라서, 도 3에 의한 결과로 유추할 시, 본 발명에 의한 HPLC-1을 투여할 시에는 pH 조건을 5∼7로 조절하는 것이 효율적이고, 특히, pH 7로 처리하는 것이 가장 바람직한 것으로 판단된다.

완충 pH 조건에서의 생장 검토

도 4는 배지의 완충용액 이용하여 pH4, 5, 6, 7에 맞춘 후 슈도모나스 HPLC-1을 접종하여 생장실험을 수행한 결과이다. 슈도모나스 HPLC-1의 성장에 기인한 배지성분의 변화로 수반되는 pH의 변화를 억제한 도 4에 결과에 의하면, pH 7에서의 생장이 가장 우수했으며, pH 6의 경우에서도 효율적이나, pH 5 이하에서는 생장율이 현저히 둔화되는 것을 알 수 있다.

따라서, 현장 적용시 슈도모나스 HPLC-1의 최적 생장조건을 유지하기 위해서, 토양오염의 경우 토양 pH를 조절해주기 위하여 여러토양 pH 조절물질인 석회 등과 동시에 처리함이 효율적이라 판단되며 또한 해수의 경우, 해수는 pH가 거의 중성의 pH를 유지함으로써 본 미생물을 처리하기위한 조건으로 매우 효율적인 것으로 판단된다.

해수에서의 생장

NaCl 27.5g, MgCl₂5g, MgSO₄·7H₂O 2g, CaCl₂0.5g, KCl 1g, FeSO₄1mg, 원유 3%를 첨가시킨 pH 6.8의 해수영양원 배지에서 30℃에서 2일간 생육시킨 후 밀도를 측정한 결과, 660nm에서 3.98로 관찰되어 밀도는 비교적 높게 관찰되어 해수에서도 생육이 가능한 균주로 결과를 얻었다. 따라서, 본 발명에 의한 균주는 해수에 오염되어 있는 원유에 대해서 원활하게 적용될 수 있다고 판단된다.

생물유화제 분비효과

본 발명에 의한 균주를 상기 표 2의 미네랄 영양분에 올리브 오일 1.5%, 노르말헥사데칸 1.5% 첨가한 메디아에 30℃에서 3일간 생장시킨 후 생물유화효과를 표면장력측정기(Tensiometer, Fisher, USA)로 측정한 결과 아래의 표 5에서와 같이 본 발명에 의한 슈도모나스 HPLC-1의 경우 34.7 dyne/cm±2로 나타나 특허 출원 중(특허출원 제99-49954호)에 있는 슈도모나스 푸티다 HPLJS보다 6.3 높게 나타났다.

슈도모나스 스투쩌리 HPLC-1	슈도모나스 푸티다 HPLJS
34.7dyne/㎝±2	41dyne/㎝

본 발명에 의한 슈도모나스 스투쩌리 HPLC-1은 저농도 뿐만 아니라 고농도의 원유에 대해서도 분해능력이 뛰어나므로 오염도가 높은 지역에서도 효과적으로 이용될 수 있으며, 해수 및 토양에 처리할 경우 생물유화제 능력이 있다.

또한, 본 발명은 상기 원유 분해균주 HPLC-1의 최적의 생장조건을 제공하여 빠른 시간내에 그리고 지속적으로 유해물질을 제거할 수 있는 방법을 제공함으로써 시간과 비용면에서 보다 경제적인 잇점이 있다.

Claims

원유 분해균주 슈도모나스 스투쩌리 HPLC-1(Psedomonas stutzeriHPLG-1)

(KCTC 0713BP).
pH 5∼7에서 Na₂HPO₄·12H₂O 9g, KH₂PO₄1.5g,MgSO₄·7H₂O 0.2g, NH₄Cl 1g, FeSO₄·7H₂O 0.1g, CaCl₂·2H₂O 0.1g, ZnSO₄·7H₂O 10㎎, MnCl·4H₂O 3㎎, H₃BO₃30㎎, CoCl₂·6H₂O 20㎎, NiCl·6H₂O 2㎎, NaMoO₄·2H₂O 0.01g, FeCl₂0.1g의 영양원으로 제1항의 슈도모나스 스투쩌리 HPLC-1를 배양하는 방법.