KR100301525B1 - 등유분해용 복합균주 ｈｐｌｋ(기탁번호 : ｋｃｔｃ ０６２６ｂｐ) 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 등유 분해용 복합균주 HPLK(기탁번호 : KCTC 0626BP) 및 그 제조방법에 관한 것으로 본 발명에 의한 복합균주는 유류에 의해 오염된 토양에서 분리한 균주들을 변형배지를 통하여 등유 분해 균주를 순수선발한 다음, 상기 등유 분해 균주 중에서 고농도의 등유를 유일한 탄소원으로 하는 조건에서 빠른 성장을 보이는 균주를 선택하고, 다시 이들 각각의 선발된 균주를 혼합하는 것에 의해서 제조되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 복합균주는 고농도의 등유 및 원유 유래 탄화수소를 오염원으로 하는 오염물질의 분해에 사용되어 안정적이며 환경친화적인 수질 및 토양정화방법을 제공하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 등유분해용 복합균주 HPLK에 관한 것으로, 보다 상세하게는 공장이나 산업체 등지에서 기름오염원으로 다량 배출되고 있는 등유를 효과적으로 분해하여 자연친화적인 방법으로 환경오염을 줄이는 복합균주에 관한 것이다.
환경오염은 오염된 매체에 따라 대기오염, 수질오염, 토양오염으로 나눌 수있으며, 국가간의 무역과 생산활동에도 영향을 미치는 대기오염이나, 확산속도가 빠르며 파급효과가 상대적으로 크게 나타나는 수질오염에 비하여 토양오염은 그 성질상 국지적이고 오염의 속도가 상대적으로 느리며, 오염 정도가 쉽게 관찰되지 않아 인간에 의해 감지될 단계에 이르게 되면 커다란 사회적 문제를 야기할 수 있으며, 또한, 오염범위가 넓고 지하심층으로도 확산된다는 점에서 오염정화를 위한 처리가 상당히 어렵고, 많은 비용과 장비를 필요로 한다.
토양오염은 대기오염이나 수질오염과 마찬가지로 매우 다양한 화학물질에 의해 야기되고 있으며, 그 중 대표적인 오염물질은 원유로부터 유래한 탄화수소이다. 전세계적으로 석유탄화수소는 가정과 산업현장에서 널리 사용되고 있으며, 많은 양의 원유 또는 정제된 석유제품들이 생산, 운반, 저장 등의 과정에서 우발적 또는 고의적으로 자연환경에 유출되고 있다.
등유는 토양에 유입되었을 때 휘발유와 달리 소량만이 대기 중에 증발하고 나머지는 토양에 잔류하게 된다. 이렇게 토양에 유입된 등유는 대기오염이나 수질오염에 비하여 확산속도는 낮은 반면, 오염지역과 인근지역에 미치는 영향이 매우 지속적이어서 그 위험도가 높으며, 더욱이 토양오염은 지하수의 오염과 밀접한 관련을 가지므로 예상보다 광범위한 지역에 형향을 미칠 수 있다. 또한, 일단 토양오염을 거쳐 지하수로 추가적인 오염이 전개되면 오염의 확산속도가 빠르며 처리의 난이도가 높고 그에 따르는 처리비용의 증가를 가져오므로 토양오염의 단계에서 처리가 되어야 한다.
이처럼 유해한 영향을 끼치는 등유를 비롯한 탄화수소화합물로 오염된 토양을 정화할 때에는 일반적으로 물리적, 화학적, 생물학적인 방법을 고려할 수 있으며, 전자의 두 가지 방법이 전통적으로 사용되어 왔던 반면, 미생물을 이용한 생물학적인 처리방법은 최근에 각광받기 시작하였다. 여기서, 물리, 화학적 방법은 토양내의 오염물질을 근본적으로 파괴한 것이 아니라 토양이외의 다른 매체로 옮긴 경우에 불과한 것으로 정화의 목표가 되는 토양이나 지하수의 품질 개선에는 도움이 될 지 모르나 궁극적인 해결책은 아니며, 비용이 과다하고 분해가 잘 안될 뿐만 아니라 열처리시 유해가스의 방출로 대기오염의 원인이 되는 문제가 있다. 반면에, 생물학적 처리방법은 오염물질을 분해하여 광물화하고, 처리비용이 저렴하여 환경오염처리의 새로운 대안으로 각광받고 있다.
이에 최근에는 오염토양 분해용 미생물 제재가 개발되고 있으나, 종래 사용되고 있는 미생물 제재는 3%이하의 저농도 유류에 대해서는 유류 분해 효과가 어느 정도 뛰어나나, 30%정도로 높은 고농도 유류에 대해서는 그러한 효과가 나타나지 않아 실제로 유류에 의한 토양오염의 정도가 심한 지역에 대해서는 원하는 정도의 유류 분해효과를 얻을 수 없다는 문제점이 있을 수 있다.
이에 본 발명자는 저농도 유류 뿐만 아니라 실제 산업 현장의 고농도 유류도 효과적으로 분해할 수 있는 복합균주를 발견하여 본 발명을 완성하였다.
또한, 종래 미생물 제재에 의한 유류 분해 균주제조방법은 유류에서 선발실험을 통해 유류 분해능이 있는 균주를 분리하고 탄소원을 별도로 첨가하여 배양한 후 유류에 주입하여 분해효과가 있는지 여부를 확인하는 과정으로 이루어져 있었으나, 이러한 방법은 유류에서 균주를 별도로 분리하여 배양시킨 후 유류에 의해 오염된 토양에 투입하는 것으로 실제로 적용할 경우 많은 양의 균주를 유류에서 분리하여 배양시킨 다음에 오염된 토양지역에 투입하여야 하는 것이다.
따라서, 종래의 방법은 일반적으로 유류에 의한 토양오염지역이 매우 광범위하고 그 오염정도도 매우 높은 점을 고려할 때 시간과 경비가 많이 드는 문제점이 있다.
이에 본 발명자는 유류에 의해 오염된 토양지역에 직접 영양분을 공급하여 별도로 탄소원을 공급하지 않고 균주를 배양함으로 보다 간단하고 신속하며 경제적인 방법으로 유류 분해 균주를 제조하는 방법을 완성하게 되었다.
본 발명은 저농도 등유 뿐만 아니라 고농도의 등유도 효과적으로 분해하여 토양오염을 방지하는 복합균주 HPLK를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 보다 간단하고 경제적인 유류 분해 균주 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 슈도모나스 HPLK1-Y3의 지방산 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 슈도모나스 HPLK2-Y3의 지방산 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 슈도모나스 HPLK3-Y3의 지방산 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 슈도모나스 HPLK4-Y3의 지방산 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 의한 복합균주와 개별균주의 등유소비율을 비교하여 나타낸 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은 다음과 같다.
본 발명에 의한 복합균주를 제조하는 방법은 유류에 의해서 오염된 토양을 채취하는 단계, 상기 채취된 토양내에 존재하는 미생물의 활성을 증진시키는 단계, 상기 토양에서 유류 분해능이 있는 균주를 분리하는 단계, 상기 유류 분해능이 있는 균주에서 우수 유류 분해균주를 선별하는 단계, 상기 선별된 균주를 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하에서 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 하기한 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 본 발명의 일실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
유류 오염 토양 채취단계
하기의 표 1에서와 같이 폐기물 유출로 인하여 10년이상 오랜기간 동안 다양한 종류의 유류에 의해 오염, 축적되어 있는 경기남부의 공장지역에 존재하는 토양을 채취하였다. 채취한 토양은 비닐백에 투입한 후 0∼-5℃에서 냉장보관하였다.
| No. | 채취일자 | 장소 | 시료수 | 오염원 |
| 1 | 1999. 4. 15 | 수원지역 | 8 | 공업폐기물처리장 |
| 2 | 1999. 4. 17 | 용인외곽지역 | 12 | 공업폐기물처리장 |
| 3 | 1999. 4. 12 | 수원외곽지역 | 2 | 공업폐기물처리장 |
미생물 활성 증진단계
상기 채취된 오염시료에 무기영양분을 투여하여 3일간 배양한다. 상기 시료내의 미생물은 오랜 기간의 유류 유출에 의하여 충분히 순응되어 있으나, 무기영양분의 부족으로 충분한 활성을 띠고 있지 않은 상태이므로 상기 시료내에 과량으로 존재하는 탄소원을 유지한 상태에서 무기영양분만을 추가적으로 공급하는 것이다.
이때 미생물에 공급되는 무기영양분의 성분 및 그 제조방법은 하기의 표 2와같다.
| 종류 | 첨가물 | 기타 |
| 다량첨가물질 | Na2HPO4·12H2O 9.0gKH2PO41.5gMgSO4·7H2O 0.2gNH4Cl 1.0gFeSO4·7H2O 0.1gCaCl2·2H2O 0.1g소량첨가물질 3mL2차 증류수 1000mL | pH 6.0∼6.2로 맞추어 121℃에서 15분간 살균시키고 50℃로 식힌 후, 멸균된 NaHCO3의 마지막 농도를 0.5g/L로 맞춘다. |
| 소량첨가물질 | ZnSO4·7H2O 10㎎MnCl·4H2O 3㎎H3BO330㎎CoCl2·6H2O 20㎎CuCl·6H2O 0.79㎎NiCl·6H2O 2㎎NaMoO4·2H2O 0.01gFeCl20.1g |
유류 분해 균주 분리단계
상기 활성이 증가된 시료와 인산완충용액(PBS : Phosphate buffer solution)을 1 : 5로 섞은 후 균질화하고 초음파탈착한다. 상기 균질화된 시료를 5㎖ 취하여 65㎖의 최소영양배지(MSM : minimal salt medium)에 접종하고, 그 기질로 등유를 30㎖ 첨가하여 150rpm, 25∼27℃에서 20일간 진탕배양한 후, 영양한천배지(LA : Luria-bertani Agar, Difco)에 도말하여 많은 밀도를 가지는 세균을 분리한다.
우수 유류 분해 균주 선별 및 동정단계
상기 농화배양조건에서 빠른 성장을 보이는 균주를 선별하여 우수 유류 분해 균주로 선별한다. 상기 선별된 균주들을 10∼13일간 호기조건에서 각각 순수배양 및 조합배양하여 기름분해도를 육안으로 관찰비교한다. 상기 과정을 통해서 선별된 우수 유류 분해 균주를 트립티케이스 콩 육즙한천배지(TSBA : trypticase soy broth agar)에서 하루 동안 배양한 후 MIDI법을 사용하여 지방산을 분리한 후 동정하였다. 여기서, MIDI(Microbial Identification System) 분석법에 의한 분류동정은 세포막 및 세포벽의 구성물질인 지질, 인지질 등을 에스테르화시킨 후 가스크로마토그래피를 이용하여 지방산의 조성을 분석함으로써 각 미생물을 분류동정하는 방법으로, 미생물에 존재하는 특징적인 세포질 지방산(CFA : Cellular Fatty Acid)의 종류 및 정량의 차이를 이용하여 미생물을 동정하는 것을 기본원리로 한다. 이러한 방법으로 동정한 4종의 균주를 각각 하기의 표 3과 같이 명명하였으며, 4종으로 이루어진 복합균주를 HPLK(기탁번호 : KCTC 0626BP)로 명명하여 한국과학기술원 유전자은행에 1999. 6. 4.자로 기탁하였다.
| 번호 | 동정 | 명명 |
| 1 | Pseudomonas fluorescens biotype C | HPLK1-Y3 |
| 2 | Pseudomonas putida biotype B | HPLK2-Y3 |
| 3 | Pseudomonas putida biotype A | HPLK3-Y3 |
| 4 | Pseudomonas chlororaphis | HPLK4-Y3 |
상기 4종의 개별균주의 지방산 분석결과는 하기의 표 4와 같으며, 각 균주의 지방산 분석결과 그래프는 도 1 내지 4에 나타내었다.
본 발명에서 사용된 MIDI분석법에서는 지방산의 화학적인 명명법을 다음과 같이 간편화된 형태로 명명하였다. 예를 들어, 표 4의 '10:0 3OH'에서 10은 탄소수를 0은 이중결합수, 3은 OH기의 개수를 의미하며, '16:1 w7c + 15 iso 2OH'에서 16과 1은 각각 탄소수와 이중결합수를 의미하며, w는 카보닐기 반대쪽을 의미하며, 7은 이중결합의 위치, c는 cis-를 의미한다.
| 균주명 CPA | 슈도모나스 HPLK1 | 슈도모나스 HPLK2 | 슈도모나스 HPLK3 | 슈도모나스 HPLK4 |
| 10:0 3OH | 4.62 | 3.59 | 3.86 | 4.18 |
| 12:0 | 3.58 | 3.92 | 2.98 | 3.93 |
| 12:0 2OH | 4.18 | 3.98 | 4.82 | 5.94 |
| 12:0 3OH | 3.85 | 3.71 | 4.25 | 5.42 |
| 14:0 | 0.93 | 0.71 | - | 0.66 |
| 16:1 w7c+15 iso 2OH | 35.10 | 25.69 | 31.07 | 26.51 |
| 16:0 | 31.69 | 34.99 | 30.68 | 29.38 |
| 17:0 cyclo | 3.40 | 10.62 | 3.74 | 11.05 |
| 18:1 w7c | 11.71 | 11.45 | 16.63 | 11.05 |
| 18:0 | 0.55 | 0.73 | 0.83 | - |
| 19:0 cyclo w8c | - | 0.62 | 0.66 | 0.95 |
상기 균주의 유류 분해능을 측정하기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다.
〔실험예〕
토양오염 유류분석은 U.S. EPA Method 8015B에 의해서 가스크로마토그래피를 이용하여 잔존기름함량을 분석하였다. 상기 4종의 개별 유류 분해균주를 30%(v/v) 등유가 함유된 35㎖의 상기 무기영양배지에 1%(v/v) 농도로 접종하여 24∼26℃, 150rpm으로 13일간 생장시켰다. 그 다음 동량의 헥산으로 남아있는 등유를 추출하여 가스크로마토그라피로 분석하였다. 균주가 처리되지 않은 무처리구와 개별 균주, 상기 4종의 균주를 혼합한 복합균주 HPLK의 등유 분해능을 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 균주가 처리되지 않은 무처리구는 등유 소비율이 약 36%이고, 개별균주 중 HPLK2-Y3만이 처리된 경우에는 등유소비율이 약 42%, 개별균주 중 HPLK4-Y3만이 처리된 경우에는 약 47%인 반면에, 본 발명에 의한 복합균주의 등유 소비율은 약 74%임을 알 수 있다. 즉, 유류 분해균주가 개별적으로 처리된 경우에는 유류 분해균주가 처리되지 않은 경우보다 등유 소비율이 높기는 하나, 그 효과가 크게 두드러지지 않는 반면에, 개별균주를 모두 혼합한 복합균주를 처리한 경우에는 등유 소비율이 70%이상이 되어 높은 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
본 발명에 의한 복합균주는 저농도 등유뿐만 아니라 30% 정도의 고농도 등유를 효과적으로 분해하여 유류에 의한 토양오염을 정화시킬 수 있다는데 그 우수성이 있다.
또한, 본 발명은 종래의 물리화학적 처리로 인한 2차적인 오염없이 안정적이며, 환경친화적인 토양정화방법을 제공한다는데 그 효과가 있다.
또한, 본 발명은 종래 국내에서 생산되지 않고 수입에 의존해왔던 유류 분해용 미생물 제재를 대체할 수 있으므로 국가경제발전을 도모함과 동시에 외래 미생물에 의한 국내 미생물 생태계의 변화도 막을 수 있는 잇점이 있다.
또한, 본 발명에 의한 복합균주 제조방법은 오염토양에 존재하는 탄소원을그대로 이용하면서 변형 무기영양분을 첨가하여 미생물을 활성화시키는 과정을 포함으므로 종래의 방법에 비해 그 처리과정이 간단하고 경제적인 잇점이 있다.
Claims (2)
- 슈도모나스(Pseudomonas) HPLK1-Y3, 슈도모나스(Pseudomonas) HPLK2-Y3, 슈도모나스(Pseudomonas) HPLK3-Y3, 슈도모나스(Pseudomonas) HPLK4-Y3로 구성된 등유분해용 복합균주 HPLK(기탁번호 : KCTC 0626BP)
- 유류 오염토양으로부터 분리한 균주들에 무기영양분을 공급하여 활성화시켜 배양한 후 유류 분해 균주를 일차 선별한 다음, 상기 유류 분해 균주 중에서 고농도의 등유를 유일한 탄소원으로 하는 조건에서 빠른 성장을 보이는 균주를 선별동정하여 재구성하는 것을 특징으로 하는 제1항의 복합균주(HPLK)의 제조방법.
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| KR1019990025349A KR100301525B1 (ko) | 1999-06-29 | 1999-06-29 | 등유분해용 복합균주 ｈｐｌｋ(기탁번호 : ｋｃｔｃ ０６２６ｂｐ) 및 그 제조방법 |
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| KR100301525B1 true KR100301525B1 (ko) | 2001-09-22 |
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