KR20020031907A

KR20020031907A - 유류분해능을 가지는 신규 아시네토박터 캘코아세티쿠스에이취에스1 및 이를 이용한 유류 분해 방법

Info

Publication number: KR20020031907A
Application number: KR1020000062690A
Authority: KR
Inventors: 정병철; 권오범; 이한기; 임현섭; 한윤전
Original assignee: 정병철
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2000-10-24
Publication date: 2002-05-03
Also published as: KR100389689B1

Abstract

본 발명은 유류 분해능을 가지는 신규한 미생물, 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1 : 수탁번호 KCTC8994P)에 관한 것으로서, 상기 균주는 유류 오염 토양에서 분리한 균주들을 디젤 및 최소 영양 배지(Minimal Salt Medium; MSM) 내에서 농화 배양하여 유류 분해능을 가지는 균주를 일차 선별하고, 선별된 균주들 중 유류를 유일한 탄소원으로 하는 조건에서 빠른 성장을 나타내는 균주를 선별함으로써 얻어졌다. 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1)은 유류를 오염원으로 하는 오염물질 분해에 있어 안정적이며 수질 및 토양에서의 유류 제거에 효과가 있다.

Description

유류분해능을 가지는 신규 아시네토박터 캘코아세티쿠스 에이취에스1 및 이를 이용한 유류 분해 방법{Acinetobacter calcoaceticus HS1 and Oil Degradation Method Using The Same}

본 발명은 유류 오염 토양에서 분리한 우수한 유류분해능을 가지는 신규한 유류 분해 균주 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1: 수탁번호 KCTC 8994P)에 관한 것이다.

토양 오염은 대기나 수질 오염에 비하여 확산 속도가 낮은 반면, 피해정도는 광범위하게 나타날 수 있고 또한 피해가 지속적으로 나타난다. 또한 가스나 액체와는 달리 고체 상태의 토양은 공학적으로 다루기(공정 내로의 이송, 화학적, 생물학적 반응 등)가 어렵기 때문에, 일단 오염된 토양을 정화하기 위해서는 시간과 비용이 많이 소모되고 정화 기술 면에서도 대기 및 수질 오염과는 다른 방법으로 접근을 해야 한다. 토양 오염원은 다양하나, 그 중 관심의 대상이 되는 오염 물질에는 중금속, 원유로부터의 정제된 유류, BTEX(Benzene, Toluen, Ethylbenzene, Xylene: 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 크실렌), 용제 사용 산업 및 제품으로부터 유래된 지방족 및 방향족 염소화합물, 제초제 및 살충제, 원유 정제 및 제지 산업에서 발생하는 PAH(Poly Aromatic Hydrocarbon: 폴리 방향족 탄화수소) 등이 있다.

종래에 토양에 오염된 유류 성분을 제거하는 방법은 그 자체가 문제점을 지니고 있다. 예컨대, 흔히 사용되는 유출 기름의 물리적 처리 방법은 완전한 효과를 기대할 수 없을 뿐만 아니라 방제 비용이 많이 들고, 화학 물질인 유류 분산제를 사용하는 경우 독성으로 인한 2차 오염이 문제점으로 대두되고 있다. 화학적 방법인 소각법은 공기를 오염시키고, 해양 투기는 해양을 오염시켜 해양 생태계를 파괴하는 문제점을 지니고 있다. 또한 지하 혹은 지상 매립은 유독 가스의 발생과 지하수의 오염을 유발한다. 세척에 의한 방법으로 화학 합성 유화제를 이용한 세척, 미생물 유화제를 이용한 세척, 전극과 유화제를 이용한 토양 세척 방법들이 사용되고 있지만, 역시 효과적으로 오염원인 유류를 제거하기는 어렵다.

산업의 급성장으로 유류의 사용량이 폭발적으로 증가하고 있는 실정이며, 이로 인해 유류 유출 사고의 발생 빈도 또한 급증하고 있는 것이 사실이다. 석유화학물질의 대량 소비는 지하 저장 탱크나 이송 파이프와 같은 시설을 필요로 하게 되어 전국에 유류를 보관 이송하는 주유소 등지의 지하저장탱크, 송유관 등의 시설이 급격히 증가하였다. 그러나 이러한 시설의 관리 미흡으로 인한 석유 및 석유화학물질의 누출은 한달 평균 500 리터를 상회하고 있는 실정이다. 결국 유류 누출로 인한 토양 오염 문제가 심각하게 대두되고 있다.

본 발명자들은 대부분의 유류와 각종 유기 오염 물질이 미생물에 의해 분해되며 생물학적인 유류 분해는 이차 오염이 없는 안전하고 경제적인 정화 방법이라는 사실에 착안하여, 유류에 오염된 토양으로부터 미생물을 분리하여 그로부터 유류분해능이 높은 미생물을 발견하고, 이를 이용한 유류 오염 토양의 유류 분해 방법을 제공하고자 하였다.

따라서, 본 발명은 유류분해능을 가지는 신규한 미생물 균주를 제공하는 것을 첫 번째 목적으로 한다.

특히, 본 발명은 유류에 오염된 토양의 유류분해능을 가지는 신규한 미생물 균주를 제공하는 것을 두 번째 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 새로운 미생물을 이용하여 유류에 오염된 토양으로부터 유류를 분해하는 방법을 제공하는 것을 세 번째 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 유류에 오염된 토양으로부터 우수한 유류분해능을 가지는 미생물을 분리하는 방법을 제공하는 것을 네 번째 목적으로 한다.

도 1은 MIDI 분석에 의한 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 세포벽의 지방산 조성 분석 결과를 나타내는 가스 크로마토그래피이다.

본 발명의 상기 목적들은 유류에 오염된 토양에 존재하는 미생물을 채취 배양하여 이로부터 유류 분해에 효과를 갖는 균주를 선별하고, 상기 균주들의 액체 배양액 내에서의 유류분해능 및 디젤 오염된 토양에서의 유류분해능(microcosm)을 측정한 후, 그 중 유류분해능이 높은 균주를 MIDI법에 의해 동정하고 그의 16s rDNA 의 염기서열을 분석하여, 미생물 기탁에 관한 부다페스트조약에 의한 국제기탁기관인 생명공학연구소(KCTC: Korean Collection for Type Cultures)에 2000 년 3 월 9 일에 기탁한 새로운 미생물 균주, 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1: 수탁번호 KCTC 8994P)을 발견함으로써 달성할 수 있었다.

상기 본 발명의 유류 분해 균주 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1을 분리, 동정하고 유류분해능을 확인하는 과정은 다음의 다섯 단계를 포함하여 구성된다:

(1) 유류에 오염된 토양을 채취하는 단계,

(2) 유류 분해 균주를 분리하는 단계,

(3) 선발된 균주를 동정하는 단계,

(4) 액체 배양을 통한 유류분해능 측정 단계, 및

(5) 디젤오염토양에서의 유류분해능(microcosm) 측정 단계.

상기 본 발명의 구성을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

단계 (1)은 유류 분해 효율이 높은 미생물을 분리하기 위하여, 예컨대 저유소 주위의 토양과 같이 유류에 오염된 토양을 채취하는 단계를 포함한다.

단계 (2)는 채취된 오염 토양을 디젤이 함유된 최소영양배지(Minimal Salt Medium, MSM) 내로 첨가하여 농화 배양하는 단계를 포함한다. 이 때, 바람직하게 상기 최소영양배지는 48 시간 간격으로 교체한다. 10 일간 배양한 후, 트립틱 콩 육즙 한천 배지(Tryptic Soy Broth Agar, TSBA) 상에 배양액을 도말하여 유류 오염된 토양 내에 존재하는 균주들을 확인한다. 그 후, 상기 플레이트 상에 형성된 각각의 균주들을, 디젤을 포함하는 최소영양배지에 각각 접종하여, 디젤 분해능을 보이는 균주를 선별하는 단계를 더욱 포함한다.

단계 (3)은 단계 (2)에서 디젤 분해능을 가지는 것으로 선별된 균주들을 동정하는 단계로서, MIDI법의 사용을 포함한다. MIDI법은 가스 크로마토그래피에 의하여 알려지지 않은 미생물의 세포벽의 지방산 조성의 분포를 확인하고, 이를 알려진 미생물의 세포벽 지방산의 조성과 비교, 분석함으로써, 알려지지 않은 미생물을 유추, 동정하는 방법이다.

단계 (4)는 유류 오염 토양의 정화에 사용할 수 있는 최적의 균주를 선별하기 위하여, 각 균주의 유류분해능을 액체 배양액 내에서 시험하는 단계이다. 따라서, 이 단계에서는 일정량의 디젤을 포함하는 최소영양배지 내에서 각 균주의 디젤 분해능을 측정하는 단계를 포함한다.

또한, 최소영양배지 내에서 유류분해능을 갖는 것으로 생각되는 균주에 대해서는, 그것의 탄화수소 분해능을 측정하는 단계를 포함할 수도 있다. 예컨대, 원유 정제 및 제지 산업에서 발생하는 폴리 방향족 탄화수소(PAH: Poly Aromatic Hydrocarbon)에 대한 분해능을 측정할 수도 있다. 탄화수소 분해능은 특정 탄화수소들의 혼합액을 배양액 내에 첨가하여 일정 시간 균주를 배양한 후, 배양액 내 탄화수소의 잔류량을 측정함으로써 결정될 수 있다.

단계 (5)는 디젤을 포함한 액체 배양액 내에서 유류분해능을 가지는 균주가 실제 유류 오염 토양에서도 유효한 유류분해능을 나타낼 수 있는지를 시험하기 위하여, 디젤 오염 토양을 통한 유류분해능, 즉 마이크로코즘(microcosm)을 통한 유류분해능을 시험하는 단계이다. 상기 시험은, 멸균된 일정량의 토양에 최소영양배지에서 24 시간 배양된 균주 현탁액을 접종하고, 여기에 최소영양배지와 디젤을 혼합한 액을 부어 일정 시간 후의 디젤 분해능을 확인하는 과정을 포함한다.

상기 단계들을 통하여, 유류 오염 토양으로부터 탁월한 유류분해능을 가지는 본 발명에 따른 신규한 미생물인 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1)을 분리, 동정하였다. 상기 미생물의 특성을 알기 위하여 세포의 소수성 시험 및 유화능 시험을 하였다. 그 결과, 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 세포는 소수성이 높으며, 이는 상기 균주의 디젤 분해능과 정량적인 상관 관계를 갖는 것으로 보인다. 반면, 상기 균주의 유화능은 낮음을 알 수 있었다. 상기 균주의 16s rDNA의 염기 서열도 확인하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 오염 토양 채취 및 균주 분리

경기도 내 공군 기지의 디젤 저유소에서 유류 오염 토양을 채취한 후, 채취된 토양 시료를 현장에서 채로 걸러 큰 입자를 제거하고 4℃로 냉장 보관하였다.

상기 토양 중 1g을 0.3%(v/v)의 디젤을 함유하는 10 ml의 최소 영양배지(Minimal Salt Medium(MSM); 1 리터 증류수 내 K₂HPO₄: 5.8g, KH₂PO₄: 4.5g, MgCl₂; 0.16, CaCl₂: 0.02g, NaNO₄; 0.002g, FeSO₄; 0.001g, MnCl₂; 0.001g 포함)에 첨가하고 농화 배양하였다. 48시간 간격으로 상기 배양액의 MSM을 교체하였으며, 10일 후 트립틱 콩 육즙 한천 배지(Tryptic Soy Broth Agar, TSBA) 상에 배양액을 도말하였다. 상기 배지를 30℃에서 이틀간 배양한 후 30 개의 균 집락을 얻었다.

상기 균 집락으로부터 채취한 각각의 균주를, 하기 실험예 1에서와 같이 디젤을 함유하는 MSM에 접종하여 디젤 분해능을 보이는 3개의 균주를 선별하였다. 상기 3개의 균주를 각각 TSBA(Tryptic Soy Broth Agar: 트립틱 콩 육즙 한천배지)에서 24시간 동안 배양한 후, MIDI법을 사용한 세포벽의 지방산 조성의 측정을 통해 균주들을 동정하였다. 그 결과, 상기 세가지 균주들을 각각 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1), 슈도모나스 종 HS2(Pseudomonassp. HS2), 및 슈도모나스 종 HS3(Pseudomonassp. HS3)로 명하였다.

실험예 1: 액체 배양을 통한 유류분해능의 측정

2%(v/v) 디젤이 함유된 20ml MSM에, 영양 배지에서 24시간 배양된 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1), 슈도모나스 종 HS2(Pseudomonassp. HS2), 및 슈도모나스 종 HS3(Pseudomonassp. HS3)의 균주를각각 3%(v/v)의 농도로 접종하여, 25℃, pH 7, 150rpm에서 5일간 배양하였다. 또한, 동일한 방법으로, 균주들을 조합하여 배양했을 때의 유류분해능도 측정하였다. 유류분해능은 15ml 헥산으로 잔류 디젤을 추출하여 가스크로마토그래피 GC-FID(HP 6890)로 분석하였다. 단일 균주의 디젤 분해능은 하기 표 1에 나타내었고, 혼합 균주의 디젤 분해능은 하기 표 2에 나타내었다.

[표 1]

단일 균주의 디젤 분해능

균주번호	균주	디젤분해(%)
1	아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoacticusHS1)	88
2	슈도모나스 종 HS2(Pseudomonassp. HS2)	75
3	슈도모나스 종 HS3(Pseudomonassp. HS3)	40

[표 2]

혼합 균주의 디젤 분해능

조합 균주의 번호	디젤분해(%)
1+3	68
1+2	62
2+3	30
1+2+3	28

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1) 균주가 단일 균주 중에서는 디젤 분해능이 88%로 가장 높게 나타났다. 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 균주를 조합하는 경우에는, 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1 균주(1)와 슈도모나스 종 HS3 균주(3)를조합하였을 때 디젤 분해능이 68%로 가장 높게 나타났다.

실험예 2: 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 방향족 탄화수소 분해능 측정

캡 튜브(Cap Tube) 내 2ml의 최소영양배지 내에, 탄소원으로서 아세토니트릴 내 폴리방향족 탄화수소(PAH: Poly Aromatic Hydrocarbon) 혼합물을 최종 10ppm 이 되도록 첨가하였다. 상기 폴리방향족 탄화수소(PAH)는 플루오린(Fluorene), 페난트린(Phenanthrene), 및 피렌(Pyrene)의 1:1:1(v/v) 혼합물로 이루어졌다. 상기 배양액에, 28℃, TSB(트립틱 콩 육즙 배지)에서 12시간 동안 배양한 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1을 2%(v/v) 양으로 접종하여 10일간 배양하였다. 배양 온도는 28℃였고, 교반 속도는 150rpm이었다.

잔류 PAH의 분석은, 배양액 2ml에 에탄올 8ml을 넣어 잔류 PAH를 추출하고, 이를 10,000g 로 원심분리하여 상층액을 분석함으로써 이루어졌다. HPLC 시스템(Thermal Separation Products, U.S.A.)을 이용하여 정량 분석하였다. 사용한 칼럼은 C18 비닥(Vydac) 칼럼이었고, 분석 조건은 다음과 같다: 이동상: 75% 아세토니트릴, 유속: 1ml/분, 감지기: 254nm에서의 UV/VIS 감지기.

상기 분석의 결과는 하기 표 3에 나타나 있다.

[표 3]

아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1)의 방향족 탄화수소 분해능

방향족 탄화수소	벤젠 고리의 수	탄소수	탄화수소 분해(%)
플루오린	2	13	20.8
페난트린	3	14	17.7
피렌	4	16	8.06

상기 표에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 신규한 미생물 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 탄화수소 분해능은 플루오린 분해능이 20.8%로 가장 높았고, 전반적으로 방향족 탄화수소의 탄소수가 많을수록 분해능이 감소하였다.

실험예 3: 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 디젤 오염 토양에서의 유류분해능

경기도 용인시 야산의 토양을 채취하고, 수분보유능, pH, 및 총 유기물량을 통하여 토양의 특성을 분석하였다.

실험 토양을 분석한 결과, 수분보유능은 0.58g(H₂O)/g(토양), 총 유기물량은 9.66%(w/v), pH는 4.17로 산성을 띠고 있었다. 균주의 생장을 위해 CaCO₃를 첨가하여 pH를 7로 보정하여 실험하였다.

1.19mm 체를 통하여 토양을 거른 후, 습열멸균(121℃, 30분, 3번)하고 75℃ 건조기에서 24시간 동안 건조시켜, 50g의 멸균된 토양을 준비하였다. 상기 토양에 2%(w/w)의 디젤을 분주하고, TSB(트립틱 콩 육즙 배지)에서 24시간 동안 배양한 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1 균주를 원심분리하여 균체를 획득한 후, 이를 MSM(최소영양배지)으로 현탁하여 토양 수분보유능의 40%가 되도록 상기 토양에 분주하고 섞어 주었다. 또한, 균주의 성장을 위해 토양 10g당 0.1g의 CaCO₃를 첨가하고 섞어 주었다. 본 실험을 29일 동안 진행하였으며, 배양 시간(일)에 따른 디젤 분해에 대한 실험 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

[표 4]

아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 디젤 오염 토양에서의 유류분해능

배양일	4 일	7 일	11 일	18 일	29 일
디젤 분해 (%)	3	31	41	67	80

실시예 2: 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 세포소수특성

본 발명에 따른 유류 분해 균주, 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 세포소수특성을 알기 위하여, 2%(v/v) 디젤이 함유된 50ml 의 MSM(최소영양배지)에 본 발명 균주를 접종하고 5일 동안 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 얻은 균체를 MSM에 현탁시켰다. 현탁액과 헥사데칸을 10 : 1 로 혼합하여 교반한 후, 정치시켜 생성된 수층을 취하여 흡광도를 측정하였고, 초기치와 비교하여 %로 나타내었다. 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 소수성은 98%로 나타났으며, 이러한 세포소수특성이 균주의 유류분해능과 상관 관계를 가지는 것으로 생각되었다.

실시예 3: 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 유화능

아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 유화능을 알기 위하여, 2%(v/v) 디젤이 함유된 5ml MSM에 본 발명 균주를 접종하여 5일 동안 배양하고, 이 배양액을 여과지로 여과한 후 남은 액을 인산삼칼륨(Potassium Phosphate) 완충액에 첨가하였다. 상기 용액에 헥사데칸을 1/10의 비율로 첨가하여 교반하고 10분간 정치시킨 후, 수층에 유화되어 있는 헥사데칸을 흡광도로 측정하였다. 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 유화능은 10%로 나타났다.

실시예 4: 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 16s rDNA의 염기 서열

아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1의 16s rDAN(리보조말 DNA)의 염기 서열을 분석하였다. 정방향 프라이머로서 하기의 것을 사용하였다 :

5'-CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'

역방향 프라이머로서 하기의 것을 사용하였다:

5'-GCGTGGACTACCAGGGTATC TAATCC-3'

16s rDNA의 염기 서열은 명세서에 첨부된 염기서열 목록에 기재되어 있다.

이상 발명의 상세한 설명에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명 유류 분해 균주 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1)은 실제 디젤 오염 토양에서 탁월한 유류분해능을 보여주었다. 이 결과는 종래의 물리, 화학적인 처리 방법 보다 효율적이며 2차 오염이 없는 환경 친화적인 유류 제거 방법을 보여 준다.

또한, 본 발명 유류 분해 균주 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1)은 방향족 탄화수소의 분해에 대한 가능성도 보여 준다.

Claims

유류분해능을 가지는 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1 : 수탁번호 KCTC 8994P).
유류 오염 토양에 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1(Acinetobacter calcoaceticusHS1 : 수탁번호 KCTC 8994P)을 분주함으로써 유류 오염 토양의 유류를 분해하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 유류는 디젤인 것을 특징으로 하는 방법.
탄화수소 오염 물질에 아시네토박터 캘코아세티쿠스 HS1을 분주함으로써 탄화수소를 분해하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 탄화수소가 방향족 탄화수소인 방법.