KR101198103B1 - 유류 분해능을 가지는 신규 미생물 및 이를 이용한 유류 오염 토양의 생물학적 복원 방법 - Google Patents

유류 분해능을 가지는 신규 미생물 및 이를 이용한 유류 오염 토양의 생물학적 복원 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 우수한 유류 분해능을 가지는 신규 미생물, 이를 포함하는 미생물제제 및 이를 이용한 유류 오염 토양의 복원 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 유류 분해능을 가지는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) MJ32 KCTC11678BP와 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) MJ33 KCTC11679BP로 특정되는 신규균주들과, 이 균주들을 특정 담체에 고정시킨 미생물제제 및 이를 이용하여 유류로 오염된 토양을 생물학적으로 복원하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 종래의 오염 토양복원 방법에 비하여, 더 효과적이고 경제적이며 환경 친화적으로 오염 환경을 정화할 수 있다.

Description

유류 분해능을 가지는 신규 미생물 및 이를 이용한 유류 오염 토양의 생물학적 복원 방법{Novel microorganisms having biodegradation ability for oil and bioremediation method for oil-contaminated sites by using the same}
본 발명은 우수한 유류 분해능을 가지는 신규 미생물 및 이를 이용한 오염 토양의 생물학적 복원 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 우수한 유류 분해능을 갖는 신규 미생물과, 이를 특정 담체에 고정화시킨 미생물제제 및 이를 이용한 오염 토양의 생물학적 복원방법에 관한 것이다.
일반적으로 토양오염복원기술이 적용되는 대상은 공장 등에서 사용된 유류나 화학물질 등으로 오염된 토양, 유류사고 등으로 오염된 해안, 소수성 오염물질이 함유된 슬러지(sludge), 주유소 또는 유류저유소 근방의 토양 등이 이에 해당된다. 상기에 언급된 오염 토양에서 소수성 오염 물질을 제거하는 방법으로서는 토양증기추출법(Soil Vapor Extraction, SVE), 토양세정기법(Soil Flushing), 토양세척기법(Soil Washing), 소각, 저온열탈착법(Low Temperature Thermal Desorption, LTTD), 바이오벤팅법(Bioventing), 생물학적 증가법(Bioaugmentation), 토양경작법(Land Farming), 바이오파일(Biopile), 생물학적 반응기법(Bioreactor), 투수반응벽체(Permeable reactive barrier) 등과 같은 기술을 들 수 있으며, 이러한 방법들에 대해 간략히 기술하면 다음과 같다.
토양세정법은 산화제, 계면활성제, 미생물 등과 같은 첨가제를 함유한 물 또는 순수한 물을 오염된 토양 및 지하수에 주입하고 다시 오염토양 지역 내에서 추출한 다음 오염원을 처리 및 정제한 처리수를 다시 오염 지역에 투입하는 기술이다. 토양세척기법은 적절한 세척제를 사용하여 토양입자에 결합되어 있는 유기오염물질 및 중금속을 분리시켜 처리하는 기법으로 적용하는 방식에 따라 원 장소(in-situ) 토양세정기법(soil flushing)과 다른 장소(ex-situ) 토양세척기법(soil washing)으로 대별 할 수 있다. 소각은 산소를 공급하여 유기물질을 연소시켜 분해하는 열적 파기 공정이다. 저온열탈착법은 저온 열휘발법(Low temeperature thermal volatilzation method)이라고도 하는데 굴착된 토양으로부터 석유계 탄화수소를 물리적으로 분해하기 위해 열(90 ～ 320℃)을 사용하는 다른 장소(ex situ) 처리기법이다. 바이오벤팅법은 생물촉진법(biostimulation method)으로도 불리며 오염된 토양에서의 분해 미생물의 활성화를 촉진시키기 위해 공기, 습기 및 영양 물질 등을 주입시키는 방법이다. 이 경우, 오염지 토양내의 분해 미생물의 활성도를 얼마만큼 증강시키느냐가 중요하며, 최근 보고에 따르면 미생물들이 디젤오일과 같은 미생물학적 영양원을 분해할 경우 유류 오염물과 미생물 간의 표면 접촉이 수반되어야 하는데, 이 경우 생계면활성제가 상호간의 계면장력을 낮추어 줌으로써 미생물의 유류 오염원에 대한 생물학적 이용도(bioavailability)를 증가시켜 준다. 따라서 생계면활성제는 생물촉진법에 있어 중요한 인자가 될 수 있다. 그러나 독성이 강한 합성 계면활성제의 경우에는 미생물을 활성화하기 보다는 오히려 미생물의 생육을 저해할 수가 있으므로 그 사용은 제한적이다. 생물학적 증가법(Bioaugmentation)은 오염된 토양에 대상으로 하는 오염원을 분해하는 미생물의 증식이 원활히 일어나지 않을 경우, 외부에서 따로 배양한 미생물을 도입하여 미생물학적 정화가 일어나도록 하는 방법이다. 토양경작법(Land Farming)은 오염된 토양을 굴착하여 지표면에 깔아 놓고 정기적으로 뒤집어 줌으로써, 토양의 공기 접촉면적을 넓혀 토양 내에 서식하는 유류 분해 미생물의 활성화를 촉진 시키는 방법이다. 바이오파일(Biopile)은 오염원 처리장으로 사용하는 부지 면적이 좁을 경우, 오염된 토양을 굴착하여 지상에 야적하여 처리하는 방법으로 공기 주입 등이 가능한 토양 정화 장치를 통해 영양분과 미생물을 주입시켜 정화하는 방법이다. 생물학적 반응기(Bioreactor)는 굴착된 오염 토양을 적절한 첨가제와 함께 물과 섞어 반응기에 투입하고, 교반하여 미생물을 활성화시킴으로써 유류분해를 촉진 시키는 방법이다. 투수 반응벽체(Permeable reactive barrier)를 이용한 오염정화 공법은 화학적 또는 생물학적 정화를 위한 산화제, 미생물 등으로 충진한 투수 반응벽체를 토양 혹은 지하수를 정화하기 위하여 토양에 매설하고 지하수 혹은 토양세정에 의한 물에 흐름에 따라 오염물질이 투수 반응벽체를 흘러가면서 정화할 수 있는 방법이다.
한편, 종래의 미생물을 이용하는 방법에 있어서는, 오염된 토양은 대부분 한 종류의 유류에 의해서가 아니라, 다양한 종류의 유류에 의해 복합적으로 오염되어 있기 때문에 바람직하게는 각각의 유류에 대해 높은 효율을 가지고 선택적으로 분해할 수 있는 능력을 지닌 미생물들을 함께 조합해서 사용하여야 오염된 토양을 효과적으로 정화할 수 있게 된다. 그러나 현재까지 동정된 미생물 중 많은 종류의 미생물이 유류분해능력을 가지고는 있으나, 각 미생물의 특성에 따라 분해 능력이 낮거나, 유류의 종류에 따라 선택적인 분해력을 나타내고, 더욱이 고농도의 유류오염 지역에서는 오염물질에 의해 증식이 저해되는 등의 많은 문제점이 제기되고 있어 유류 오염 토양의 복원방법으로서 충분히 만족스러운 것은 못 되었다. 또한 상기의 나열한 오염정화 방법들은 각각의 장점을 가지고는 있으나, 여러 종류의 유류에 의해 복합적으로 오염되어 있거나, 토양의 종류, 형상 및 함수율 등에 따라 다양한 토양층을 거의 완전하게 정화하기에는 여러모로 적합하지 않다는 단점이 있었다.
따라서 본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 다양한 난분해성 물질에 대한 분해능을 가짐과 동시에, 고농도 유류오염에 대해 저항력을 가지고 우수한 유류 분해능을 갖는 신규 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 미생물을 효과적으로 이용하기 위하여 상기 신규 미생물들을 특정의 담체에 고정화시킨 미생물제제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
나아가 상기 미생물제제를 고정화시킨 담체로 충진된 생물 반응벽체를 이용하여 토양 및 지하수의 유류오염 확산을 효과적으로 방지하고 생물학적으로 복원하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 유류 분해능을 가지는 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ32(KCTC11678BP)와 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ33(KCTC11679BP)이 신규 균주들로서 제공된다. 상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 상기 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP), 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP) 또는 이들의 혼합물을 함유하는 유류분해용 미생물제제가 제공된다. 상기 미생물제제는 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP), 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP) 또는 이들의 혼합물을 피트모스, 벤토나이트 및 알지네이트를 질량비 1～10:1～10:0.01～1로, 바람직하게는 1～3:2～5:0.01～0.2로, 더욱 바람직하게는 2:3:0.1로 혼합한 담체에 고정화시킨 것임을 특징으로 하는 유류분해용 미생물제제이다. 이 경우 상기 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP) 및 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP)외에 유류분해활성을 가지는 다른 균주들을 함께 상기 담체에 고정화시키는 경우 다양한 오염원에 대한 분해능을 가지는 미생물제제로 사용가능하다. 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 상기 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP), 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP) 또는 상기 균주들을 포함하는 유류분해용 미생물제제를 오염된 토양에 접종하여 유류를 생분해 제거하는 것을 특징으로 하는 유류오염토양의 생물학적 복원방법이 제공된다. 이 경우 유류 분해능을 가지는 균주들을 함께 혼합하여 사용하는 것이 가능하며, 바실러스 속, 크렙실라 속, 노카디아 속, 고르도니아 속, 로도코코스 속, 아씨네토박터 속, 페니바실러스 속, 아조토박터 속, 라이조비움 속, 아조스피릴럼 속, 플라보박테리움 속, 스트렙토마이시스 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 균주를 유류 오염 토양에 추가적으로 접종하여 유류를 생분해 제거할 수 있다. 더욱 상세하게는 본 발명에 있어서 상기 유류오염토양의 생물학적 복원방법은 상기 특정담체에 고정화시킨 미생물제제를 투수반응벽체(Permeable reactive barrier)에 넣어 토양세정방법을 이용하여 유류 오염된 토양을 생물학적으로 복원하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 신규 미생물은 다양한 난분해성 물질에 대한 분해능을 가짐과 동시에, 고농도 유류오염에 높은 저항력을 가지며 생분해능을 보유하므로, 이를 단독으로 또는 유류분해능을 가지는 다양한 균주와 함께 효과적인 담체에 고정화시켜 유류 오염 토양의 생물학적 복원에 사용하는 경우 기존의 오염토양복원 방법에 비하여 효과적이고도 경제적이며 환경친화적으로 오염 환경을 정화 할 수가 있다.
도 1a는 본 발명에서 분리한 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ32 균주의 16S rDNA 유전자의 염기서열이다.
도 1b는 본 발명에서 분리한 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ33 균주의 16S rDNA 유전자의 염기서열이다.
도 2a 내지 2d는 본 발명에 따른 신규 균주 MJ32에 의한 초기 디젤 오일 농도 1,000ppm, 5,000ppm, 15000 ppm 및 20,000ppm에서 일자별 생분해 정도를 나타내는 그래프이다.
도 3a 내지 3d는 본 발명에 따른 신규 균주 MJ33에 의한 초기 디젤 오일 농도 1,000ppm, 5,000ppm, 15000 ppm 및 20,000ppm에서 일자별 생분해 정도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 슈도모나스 속, 아씨네토박터 속, 바실러스 속, 스트렙토마이시스 속을 함께 배양했을 경우, 복합균주의 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 5는 고정화 담체의 종류에 따른 디젤의 흡착능과 미생물에 의한 분해능 정도를 나타내는 그래프이다.
도 6a 및 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 토양세정 및 투수 반응벽체 파일럿 시스템도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 토양세정 및 투수 반응벽체 파일럿시스템에 의해 오염토양 TPH가 일자별로 감소하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 토양세정 및 투수 반응벽체 파일럿시스템에 의한 오염토양 총균수와 유류분해균수 변화를 나타내 그래프이다.
도 9a 내지 9e는 본 발명의 일 실시예에 따른 토양세정 및 투수 반응벽체 파일럿시스템의 투수반응벽체 내부 고정화 담체에 미생물이 효과적으로 고정화되었음을 T-RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)를 통해 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 10은 오염현장의 토양세정시스템 공정도이다.
이하 본 발명에 따른 유류분해능을 가지는 신규 미생물 및 이를 이용한 오염토양의 생물학적 복원방법에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명에 따르면 유류분해능을 가지는 신규 균주 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP)와 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ33(KCTC11679BP)이 제공된다. 상기 균주는 디젤 오일에 의해 오염된 토양으로부터 분리되었으며, 그램 음성이고 구균이다. 상기 균주들은 다양한 난분해성 물질 즉, 윤활유, 디젤오일, 벙커씨유, 고비점 방향족화합물, 염소계 화합물에 대한 분해능을 가짐과 동시에, 고농도 유류오염에 높은 저항력을 가지며 생분해능을 가진다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명의 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP) 균주는 디젤오일농도 20,000ppm의 농도에서도 95% 이상의 분해율을 나타내고, 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP) 균주는 디젤오일농도 20,000ppm의 농도에서도 98% 이상의 분해율을 나타낸다.
또한 본 발명에 따르면 상기 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ32(KCTC11678BP)와 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ33(KCTC11679BP) 균주를 함유하는 유류분해용 미생물제제가 제공된다.
상기 본 발명의 미생물제제는 유효성분인 본 발명의 상기 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ32(KCTC11678BP) 및 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ33(KCTC11679BP) 균주 외에 필요에 따라 담체, 영양물질, 기타 보조제 등을 함유할 수 있는데, 상기 담체는 균체 흡착, 활성유지, 환경에서의 안정화를 위하여 첨가하며, 다공성, 흡착성 및 내구성이 우수한 소재를 사용할 수 있다. 본 발명에서는 피트모스와 벤토나이트를 담체로서 사용하며, 상기 균주를 피트모스, 벤토나이트 및 알지네이트를 질량비 1～10:1～10:0.01～1로, 바람직하게는 1～3:2～5:0.01～0.2로, 더욱 바람직하게는 2:3:0.1로 혼합한 담체에 고정화시켜 사용한다. 다양한 오염원에 작용할 수 있도록 하기 위해 유류분해능을 가지는 다른 미생물을 함께 고정화시켜 사용하는 것도 가능하다.
또한 본 발명은 상기 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ32(KCTC11678BP), 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ33(KCTC11679BP) 또는 상기 균주들을 함유한 유류분해용 미생물제제를 이용하여 유류로 오염된 토양을 생물학적으로 복원하는 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 균주들 또는 미생물 제제를 유류로 오염된 환경에 적절하게 처리하여 오염을 정화시킬 수 있는데, 사용량은 오염 정도 및 대상 환경에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
본 발명에 따른 유류 오염 토양의 생물학적 복원 방법에 사용할 수 있는 미생물은 상기한 본 발명에 따른 신규 미생물들에 한정되는 것은 아니며, 우수한 유류 분해능을 갖는 미생물을 함께 사용할 수 있음은 물론이다. 이러한 미생물로서는 오랜 기간 동안 유류에 오염되었던 토양으로부터 분리된 다양한 유류 오염원에 대한 생분해 능력을 갖는 것들이라면, 이에 특별한 제한은 없다. 보다 구체적으로는 바실러스 속, 크렙실라 속, 노카디아 속, 고르도니아 속, 로도코코스 속, 아씨네토박터 속, 페니바실러스 속, 아조토박터 속, 라이조비움 속, 아조스피릴럼 속, 플라보박테리움 속, 스트렙토마이시스 속의 미생물들이 사용될 수 있으며, 이들 속에 속하는 미생물은 일반적으로 다양한 난분해성 물질 즉, 윤활유, 디젤오일, 벙커씨유, 고비점 방향족화합물, 염소계 화합물 등에 우수한 분해능을 가지며, 이러한 미생물은 자연계에 널리 존재하며 다양한 오염원을 탄소원 및 에너지원으로 사용하여 분해한다.
그러므로 본 발명의 일 실시예에 따른 유류 오염 토양의 생물학적 복원 방법은 본 발명의 상기 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ32(KCTC11678BP), 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP) 균주 또는 이를 함유하는 미생물 제제와 함께, 상기 균주 중 적어도 1종 이상의 균주를 유류 오염 토양에 접종하고 증식시킴으로써 유류를 생분해하여 제거하는 것으로 구성된다. 상기한 균주들은 디젤 오일 농도 1,000ppm의 농도에서는 100% 분해율을 나타내며 5,000ppm, 15,000ppm 및 20,000ppm의 농도에서도 95% 이상의 분해율을 나타낸다.
본 발명에 따른 유류 오염 토양의 생물학적 복원 방법으로서 바람직한 일 실시예는 상기의 균주를 담체에 고정화시킨 미생물제제를 투수반응벽체(Permeable reactive barrier)에 넣어 토양세정방법을 함께 적용하는 것이다. 상기 균주들을 고정화시킨 담체를 투수 반응벽체(Permeable Reactive Barrier)에 충진한 후, 이를 오염토양에 매립하고 토양세정기법(Soil Flushing)과 함께 적용함으로써 복합적인 유류에 의해 오염이 되었거나 토양의 성상이 다양한 지역일지라도 조건에 맞는 정화방법을 선택적으로 결정하여 시행할 수 있게 되어 유류로 오염된 토양 및 지하수를 효율적으로 개선할 수 있게 되는 것이다.
[실시예]
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 슈도모나스( Pseudomonas sp . ) MJ32 ( KCTC11678BP ) 및 슈도모나스( Pseudomonas sp . ) MJ33 ( KCTC11679BP )의 분리, 동정 및 활성시험
(1)유류 분해활성을 가지는 미생물의 분리
경기도 화성시 오랫동안 다양한 유류로 오염된 토양을 접종 시료로 사용하였다. 유류 오염지 토양을 지하 0～2 미터 부위에서 선발한 후 즉시 공구병에 투입하고 4℃ 에서 냉장 보관 하였다.
유류의 분해능이 우수한 미생물을 선별하기 위해, 우선적으로 엘비 고체(LB Agar, Luria-Bertani Agar, DifcoTM) 배지나 트립틱 소이 고체(Tryptic Soy Agar, DifcoTM) 배지로 조성된 평판 배지에 도말하고 30℃ 에서 48시간 동안 배양하였다. 일정시간 동안 배양한 이후, 형성된 균주 단일 콜로니(single colony)를 현미경으로 관찰하여 구균과 간균 500개를 선발하여 새로운 상기의 평판 배지에 다시 도말하여 분리(isolation)한 다음, 삼각 플라스크에 1,000 ppm, 5,000 ppm, 15,000 ppm, 20,000 ppm의 디젤과 미네랄 성분(NH4NO3 1g/L; MgSO4 0.2g/L; CaCl2 0.02g/L; FeCl2 0.05g/L; KH2PO4 1g/L; K2HPO4 1g/L; pH 7.0)을 주입한 액체 배지 성분에 분리된 균주를 접종한 이후, 30℃에서 7일간 배양하였다.
(2)분리된 미생물의 동정
상기 실험에서 디젤과 미네랄 성분의 액체 배지 성분에서 성장이 가장 우수한 균주를 골라내어 미생물 동정을 진행하였다. 분리된 균주의 동정을 위하여, 16S rDNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 우선 균주를 엠알에스 배지(MRS broth, DifcoTM)에서 30℃에서 150 rpm으로 진탕하면서 7일간 배양하였다. 배양액으로부터 균체를 얻기 위해 6,000 rpm에서 20분간 원심분리 한 후, 하층부의 균체를 획득하였다. 이후, DNeasy Tissue Kit(Qiagen)을 사용하여 크로모좀 DNA(chromosomal DNA)를 추출 정제하였다. 다시 크로모좀 DNA를 주형(template)으로 16S rDNA 유전자를 중합효소연쇄반응(PCR) 방법을 사용하여 증폭하였다. 증폭된 16S rDNA를 SeqMan 소프트웨어, BioEdit 프로그램, 그리고 CLUSTAL X 프로그램을 사용하여 MJ32, MJ33 균주의 16S rDNA 유전자 전체 서열을 확인하였다.
신규 미생물 균주 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ32(KCTC11678BP)와 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ33(KCTC11679BP)의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 도 1a와 1b에 나타내었다. 유전자의 염기서열을 분석한 이후, BLAST 조사 프로그램을 사용하여 유전자은행 데이터베이스(GenBank database)로부터 관계되는 균주들의 연관 서열(related sequences)을 확인한 결과, 신규 미생물들로 동정되었으며, 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP)와 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP)은 슈도모나스 니트로리듀선스 DSM14399T(Pseudomonas nitroreducens DSM14399T)와 각각 98%, 96% 유사성을 나타내었다. 새로이 분류된 본 발명에 따른 상기 균주들을 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP)와 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP) 균주라 명명함과 아울러, 상기한 미생물들을 KCTC(Korea Collection for Type Cultures)에 기탁하였으며 수탁번호는 각각 KCTC11678BP, KCTC11679BP 이다.
슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ32(KCTC11678BP)의 형태학적 및 생리, 생화학적 특성은 하기 표 1과 같다.
형태 및 생리, 생화학적 특성 슈도모나스 속 MJ32 KCTC11678BP
그람 염색 -
형태(Morphology) 구균(cocci)
최적 성장 온도 (˚C) 30
질산염 환원(Nitrate reduction) +
인돌 생성 (Production of Indole) -
효소 활성
NAcetyl-β-glucosaminidase +
Acid phosphatase -
Alkaline phosphatase -
α-Chymotrypsin -
Esterase (C4) +
Esterase Lipase (C8) +
Valine arylamidase -
α-Fucosidase -
α-Galactosidase +
α-Glucosidase (starch hydrolysis) -
β-Galactosidase (PNPG) -
β-Glucosidase (esculin hydrolysis) -
Lipase (C14) -
Protease (gelatin hydrolysis) +
Trypsin -
Urease +
Assimilation
4-Hydroxybenzoate +
5-Ketogluconate -
Acetate +
Propionate +
Valerate +
Adipate -
Caprate -
Citrate +
Malate -
L-Alanine -
L-Histidine +
L-proline -
N-Acetylglucosamine -
Glycogen +
(+ : 양성 반응, - : 음성반응)
슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ33(KCTC11679BP)의 형태학적 및 생리, 생화학적 특성은 하기 표 2와 같다.
형태 및 생리, 생화학적 특성 슈도모나스 속 MJ33 KCTC11679BP
그람 염색 -
형태(Morphology) 구균(cocci)
최적 성장 온도 (˚C) 30
질산염 환원(Nitrate reduction) +
인돌 생성 (Production of Indole) -
효소 활성
NAcetyl-β-glucosaminidase +
Acid phosphatase +
Alkaline phosphatase -
α-Chymotrypsin -
Esterase (C4) -
Esterase Lipase (C8) +
Valine arylamidase -
α-Fucosidase -
α-Galactosidase +
α-Glucosidase (starch hydrolysis) -
β-Galactosidase (PNPG) +
β-Glucosidase (esculin hydrolysis) -
Lipase (C14) -
Protease (gelatin hydrolysis) +
Trypsin -
Urease +
Assimilation
4-Hydroxybenzoate +
5-Ketogluconate -
Acetate +
Propionate +
Valerate -
Adipate -
Caprate -
Citrate +
Malate +
L-Alanine -
L-Histidine +
L-proline -
N-Acetylglucosamine +
Glycogen +
(+ : 양성 반응, - : 음성반응)
(3)분리된 미생물의 유류오염 분해 활성도 측정
활성도 측정을 위해 사용된 디젤오일은 GS-Caltex 정유사(대전, 한국)로부터 입수하였으며, 알칸(alkanes) 42.7%, 시클로알칸(cycloalkanes) 33.4%, 그리고 방향족화합물(aromatics) 23.9%로 이루어져 있다.
500ml 플라스크에 100ml의 탄소 및 에너지원을 포함하지 않는 미네랄 배지 성분(NH4NO3, 1g/L; MgSO4, 0.2g/L; CaCl2, 0.02g/L; FeCl2, 0.05g/L; K2HPO4, 1g/L; KH2PO4, 1g/L; pH 7.0)을 첨가한 이후, 100, 500, 1500 그리고 2000mg의 디젤오일을 첨가한 이후 트립틱 소이 고체 배지(tryptic soy agar medium, DifcoTM)에서 배양한 각각의 균주들을 주입한 이후 폴리테트라플루오로에틸렌 씰(polytetrafluoroethylene seals)로 봉입하였다. 여기서 접종 균주의 농도는 6 × 106 cfu/ml이며 최종농도비로 1% (v/v)로 접종하였으며, 이후 pH는 6.9 ～ 7.1로 조정되었다. 따라서 디젤오일이 유일한 탄소 및 에너지원으로 결국 미생물이 성장 할 경우 디젤오일을 분해시키게 된다. 또한 본 실험에서는 비교군으로 균주가 접종되지 않은 디젤오일이 첨가된 미네랄 솔트 배지를 같이 배양하여 TPH를 측정하였는데, 이것은 디젤오일은 다양한 종류의 화합물을 포함하고 있어 시간 경과에 따라 비점이 낮은 화합물은 휘발이 되어 디젤농도가 낮아짐으로 이러한 값을 보정하기 위한 것이다. 또한 측정의 오차를 방지하기 위해 각각 3샘플을 측정하여 평균값으로 기록하였으며, 플라스크에 부착되어 측정되지 않은 디젤 오일의 오차를 최대한 방지하기 위해 각각의 샘플링에서 플라스크 전체를 100ml의 노말헥산으로 추출하여 측정하였다. 배양은 30℃에서 300 rpm으로 7일간 진행하였으며, 1일 간격으로 샘플링하여 가스크로마토그라피(Gas Chromatography)로 디젤분해율을 측정하였다.
우선 디젤오일 분석은 FID detector가 장착되어 있는 가스크로마토그라피(HP 5890 series II, Hewlett-Packard, USA)와 HP-1 컬럼(30 m × 0.32 mm × 1 μm, J&W Scientific, USA)을 사용하였고, 헬륨을 담지 기체(carrier gas)로서 그리고 주입기(injector)와 검출기(detector) 온도는 각각 280℃와 300℃로 설정하였다. 컬럼 온도는 2분간 40℃로 유지한 이후 분당 10℃의 속도로 300℃까지 올렸으며, 이후 15분간 300℃로 유지하였다. 본 실험에서는 2㎕의 샘플을 주입하였으며, 가스크로마토그램(gas chromatogram)의 모든 피크면적들의 합산값 즉, TPH(Total Petroleum Hydrocarbon)으로 남아있는 디젤오일의 양을 측정하였다. 남은 유류오염원에 대한 추출은 N-헥산 추출법을 사용하였고 분해율(%)의 계산은 다음의 수학식 1과 같다.
Figure 112010025436904-pat00001
본 발명자들이 분리 확보한 다양한 미생물 균주들과 함께 배양하였으며, 7일째의 유류분해능 실험 결과를 하기의 표 3에 나타낸다.
균주명 초기 디젤농도에 따른 분해율(%)
1,000ppm 5,000ppm 15,000ppm 20,000ppm
Klebsiella pneumoniae 54.77 32.21 22.54 8.62
Bacillus pumilus 45.22 22.36 16.87 7.32
Bacillus subtilis 42.11 22.30 20.11 6.22
Agromyces mediolanus 24.11 17.54 14.32 5.10
Brevibacterium terrae 42.52 20.68 15.85 8.33
Catellaniella defragrans 12.77 8.52 5.99 2.45
Pseudomonas sp. MJ32 100.00 96.05 95.16 95.39
Pseudomonas sp. MJ33 100.00 99.23 99.19 98.69
상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 Klebsiella pneumoniae, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Agromyces mediolanus, Brevibacterium terrae, Catellaniella defragrans의 경우에 비하여, 상기 Pseudomonas sp. MJ32와 Pseudomonas sp . MJ33은 각 초기 디젤농도에서 높은 분해율을 나타내었다.
Pseudomonas sp . MJ32의 접종 배지와 미접종 배지에 대한 초기 디젤 농도 1000, 5000, 15,000 및 20,000 ppm에서의 디젤오일 분해 결과를 도 2a 내지 도 2d에 각각 나타내었다.
도 2a 내지 도 2d에서 Pseudomonas sp . MJ32의 초기 접종수는 6 × 104 cfu/ml이며, ■ 막대표시는 미생물 미접종군(대조군)을, □ 막대표시는 미생물 접종군을 나타낸다. Pseudomonas sp . MJ32의 접종군에서는 접종 7일째 1000 ppm의 디젤초기농도에서 100%의 분해율을 보였고, 5000, 15,000, 20,000 ppm에서도 각각 96.05%, 95.16%, 95.39%로 높은 분해율을 보여주었다. 디젤오일의 분해는 주로 3일째까지 진행 되었으며, 이후 4일부터 7일째까지는 분해속도가 감소되는 경향을 보였다.
Pseudomonas sp . MJ33의 접종 배지와 미접종 배지에 대한 초기 디젤 농도 1000, 5000, 15,000 및 20,000 ppm에서의 디젤오일 분해 결과를 도 3a 내지 도 3d에 각각 나타내었다.
도 3a 내지 도 3d에서 Pseudomonas sp . MJ33의 초기 접종수는 4 × 104 cfu/ml이며, ■ 막대표시는 미생물 미접종군(대조군)을, □ 막대표시는 미생물 접종군을 나타낸다. Pseudomonas sp . MJ33의 접종군에서는 접종 7일째 1000 ppm의 디젤초기농도에서 100%의 분해율을 보였고, 5000, 15,000, 20,000 ppm에서도 각각 99.23%, 99.19%, 98.69%로 높은 분해율을 보여주었다. 디젤오일의 분해는 주로 3일째까지 진행 되었으며, 이후 4일부터 7일째까지는 분해속도가 감소되는 경향을 보였다.
(4)유류분해능을 가지는 다른 미생물에 대한 유류오염 분해 활성도 측정
상기 신규 균주 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ32(KCTC11678BP) 및 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ33(KCTC11679BP)와 함께 오염토양을 생물학적으로 복원하기 위해 사용되는 다른 균주들의 디젤오일 분해활성을 상기와 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.
균주명 초기 디젤농도에 따른 분해율(%)
1,000ppm 5,000ppm 15,000ppm 20,000ppm
Acinetobacter sp. 100.00 85.32 78.33 72.32
Gordonia sp. 100.00 92.77 89.60 85.09
Streptomyces sp. 100.00 86.22 78.33 72.11
Nocardioides sp. 100.00 80.23 76.32 72.54
Azotobacter sp. 100.00 90.35 86.46 83.44
Bacillus sp. 100.00 82.02 78.29 71.49
Rhodococcus sp. 100.00 92.33 85.13 82.32
상기 표 4에서 확인되는 바와 같이 상기 균주들의 경우에 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP) 및 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP)에 비하여는 낮지만, 우수한 디젤오일의 분해율을 나타내므로, Pseudomonas sp . MJ32 및 Pseudomonas sp . MJ33과 함께 사용하는 경우 다양한 오염원에 대하여 적용할 수 있을 것으로 예상된다.
실시예 2 : 미생물을 담체에 고정화시킨 미생물제제의 제조
(1)고정화 미생물 선정
미생물을 고정화하기 위해, 미생물의 성장 곡선을 파악하고 피트모스를 이용한 담체에 고정화가 용이한지 시도해보았다. 미생물 성장 곡선을 얻기 위해 액체 상태의 엘비 배지 (LB broth, DifcoTM) 100 ml를 멸균한 후 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 한 종, 아씨네토박터(Acinetobacter sp.) 속 한 종, 바실러스(Bacillus sp.) 속 한 종, 스트렙토마이시스 속(Streptomyces sp.) 한 종을 각각 100ul씩 접종(접종 균주 농도; 2 × 109 cfu/ml)하였다. 자외선 분광 광도계(UV-Vis spectrophotometer, Shimadzu)를 사용하여 600nm의 파장에서 광학밀도(O.D.,optical density)를 측정하였다. 성장곡선상의 대수증식기인 상태(도 4의 화살표 부분)의 균주를 이용하여 고정화 미생물로 사용하였다. 광학밀도(O.D.) 값이 1.0에 도달하는데 4시간 가량 소요되었다.
(2)미생물을 고정화하기 위한 담체의 선정
피트모스(Peat moss)를 주담체로 선정하고 보조담체로 제올라이트(Zeolite), 키토산(Chitosan), 벤토나이트(Bentonite)를 선정하여 주담체와 보조담체의 질량비에 따른 pH의 변화를 확인한 결과 보조담체의 혼합량을 증가시킬 경우 pH가 점차 증가하는 것을 알 수 있었다.
피트모스와 보조담체는 혼합비에 따라 선형적인 pH값 상관관계를 가지며, 미생물의 성장 환경이 좋은 중성 pH를 만족시키기 위해서 피트모스와 보조담체의 혼합비는 질량비 2:3이 적합할 것으로 판단하였다.
피트모스와 보조담체를 질량비 2:3으로 혼합하여 미생물의 고정화가 용이한지 알아보았다. 피트모스 2g과 제올라이트(Zeolite), 키토산(Chitosan), 벤토나이트(Bentonite) 각 3g씩 배합한 후, 200ml 엘비 배지(LB broth, DifcoTM)를 주입하여 멸균하고 1ml 복합균주를 접종(접종 균주 농도; 3 × 109 cfu/ml)하였다. 1일 동안 배양 후, 알투에이 한천 배지(R2A agar, DifcoTM)에 도말하여 집락 형성 단위(CFU, colony forming unit)로 총균수를 측정하였다. 피트모스와 보조담체를 질량비 2:3의 비율로 혼합한 담체에 미생물의 고정화 효율을 확인한 결과 제올라이트(Zeolite)와 벤토나이트(Bentonite)를 보조담체로 사용하였을 경우 균주의 고정화정도를 확인할 수 있는 총균수가 약 108가량 되는 것으로 확인되었고, 벤토나이트를 보조담체로 사용하였을 경우 제올라이트를 사용하는 것보다 성능이 조금 향상됨을 알 수 있었다. 이를 통하여 피트모스와 벤토나이트를 질량비 2:3 비율로 혼합한 담체가 가장 좋은 미생물 성장환경을 제공할 수 있음을 확인하였다.
미생물이 실제 담체에 물리적으로 비교적 강하게 고정화된 양을 산정해보고 이를 향상시키 위해 상기 피트모스와 벤토나이트의 혼합 담체에 점성이 뛰어난 알지네이트(alginate)를 첨가하여 미생물의 이동도를 알아보았다.
250ml 삼각 플라스크에 체(체눈 크기 2.00㎜, 10㎜)를 사용하여 거른 피트모스 2g, 벤토나이트 3g 그리고 소디움 알지네이트(sodium alginate) 0.1g(전체 중량의 2%)를 넣었다. 엘비 배지(LB broth, DifcoTM) 5g을 넣고 증류수 200ml를 넣고 잘 혼합한 후 멸균한다. 복합균주 1ml를 접종(접종 균주 농도; 3 × 109 cfu/ml)하고, 37℃, 150rpm에서 3일 동안 배양한다. 삼각플라스크를 정치시킨 후, 상등액을 버리고 멸균해 놓은 증류수로 2번 정도 미생물과 담체를 세척한다. 미생물과 담체의 혼합액 1g을 적출한 다음 9ml 증류수에 넣고 강하게 교반(Vortex)한 후 순차적으로 희석하여 집락 형성 단위(CFU, colony forming unit)값을 측정한다.
알지네이트(Alginate)를 전체 중량의 2%가량 첨가하였을 경우, 고정화 미생물 균수가 1 제곱 정도 향상되는 고무적인 결과를 얻을 수 있었다. 점성이 뛰어난 알지네이트가 접착제의 역할을 하기 때문에 피트모스와 벤토나이트로 이루어진 담체와 함께 사용했을 때 좋은 효과가 있는 것으로 나타났다.
(3)미생물이 고정화된 담체의 디젤 분해능 평가실험
피트모스, 벤토나이트, 알지네이트로 이루어진 담체에 미생물을 고정화한 후, 미네랄 배지와 디젤로 미생물을 배양한 후 디젤의 분해능을 측정하였다.
200ml의 액체 부시넬 하스 배지(Bushnell Haas broth)에 트윈 80 4g(20,00ppm)과 디젤 4g(20,000ppm)을 유화시킨 후 복합균주 1ml를 접종(접종 균주 농도; 3 × 109 cfu/ml)하고, 담체의 조건을 달리해서 37℃, 150rpm에서 7일 동안 배양한다. 삼각플라스크를 정치시킨 후, 상등액 10ml에 40ml 염화메틸(Methyl Chloride)을 넣고 2시간 동안 초음파 처리하여 TPH를 추출한 후 분석하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 대조군(Con)은 미생물이 접종되지 않은 담체를 의미하며 도 5의 대조군에서 확인되는 바와 같이 순수 디젤 흡착량은 피트모스와 벤토나이트 혼합담체가 가장 높게 나왔다. 미생물에 의한 순수 디젤 분해량은 피트모스와 벤토나이트 혼합담체에 부쉬넬하스(BH)-디젤(10,000ppm) 액체 배지에서 활성화시킨 복합균주를 접종한 경우에 가장 뛰어남을 알 수 있었다.
실시예 3 : 미생물제제를 이용한 오염토양 복원
(1)토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템을 이용한 유류분해능 실험
하이브리드 시스템의 운영 및 TPH 제거 효율성을 검토하고 고정화 미생물이 시간이 지남에 따라 어떤 분포 변화를 일으키는 지 분자생물학적 방법으로 모니터링 하고자, 토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템 장치를 운전하여 토양의 TPH 제거 효율을 분석하였다. 도 6b에 나타낸 장치의 개략도와 같이 주입 위치는 상, 중, 하 3 곳으로 나누어 주입하였고, 좌우로 두 곳에 주입구를 두어 주입하였다. 전체 토양의 볼륨을 측정하고, 토양의 공극률을 측정하여 공극률 대비 주입량을 결정하였다. 토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템 장치의 크기를 가로 30㎝, 세로 60㎝, 높이 60㎝로서 채워진 토양의 부피는 약 0.108㎥이고 질량은 약 45㎏이었다. 투수 반응벽체(Permeable reactive barrier)의 크기를 가로 30㎝, 세로 5㎝, 높이 60㎝로서 부피는 약 0.009㎥이고 채워진 혼합 담체의 질량은 약 1.6㎏이었다.
(2)파일럿시스템의 고정화 담체에 접종될 미생물의 배양
토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템 운전을 위해서 접종할 미생물을 다음과 같이 배양하였다. 유류분해능을 가지고 있는 4가지 균주 (슈도모나스 속 MJ33, 아씨네토박터 속 한 종, 고르도니아 속 한 종, 로도코코스 속 한 종)를 글리세롤 스탁으로부터 균주별로 1ml씩(접종 균주 농도; 3 × 109 ～ 8 × 109 cfu/ml) 각각 1L의 엘비 액체 배지(LB Broth, DifcoTM)에 접종하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 미생물 배양액 4 L를 피트모스, 벤토나이트 및 알지네이트를 질량비 2:3:0.1로 혼합한 고정화 담체와 섞고 교반하여 미생물을 접종하였다.
미생물을 배양한 후, 배양액 내 미생물의 수를 측정하기 위하여 희석배수 방법에 의해 집락 형성 단위(CFU)를 측정하였다. 48 시간 동안 배양한 미생물 배양액을 10배씩 희석하여 108, 109, 1010으로 희석한 후, 엘비 고체(LB agar) 배지 위에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하고 집락 형성 단위(CFU)를 측정하였다. 이렇게 배양된 미생물의 집락 형성 단위(CFU)는 슈도모나스 속 MJ33의 경우 7 × 109, 아씨네토박터 속 9 × 108, 고르도니아 속 5 × 109, 로도코코스 속의 경우에는 3 × 109 이었다.
(3)토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템의 오염 토양 TPH 감소
토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템의 토염 토양에 디젤 분해 미생물을 접종하여 미생물의 활성에 의한 디젤분해 효과를 분석하였다. 이 경우, 토양세정(Soil flushing) 효과와 투수 반응벽체(Permeable reactive barrier) 내 생물정화(Biodegradation) 효과가 함께 나타난다. 미생물이 접종된 후 토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템에서 나타난 TPH 변화를 하기의 표 5 및 도 7에 나타내었다.
미생물이 접종된 상태에서 TPH 감소(단위 ppm)
날짜 0 day 1 day 2 day 3 day 4 day 5 day 6 day 7 day
PRB 전 6003 5219 4890 4120 4210 3490 2850 2567
PRB 후 5890 4319 4012 3890 3200 2800 2134 1930
(4)토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템의 토양 내 총균수와 유류분해 균수 측정실험
토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템을 운전하면서 투수 반응벽체 내 고정화 담체의 총균수를 측정하였다. 고정화 담체 샘플 1g을 9ml 증류수에 넣어서 교반(vortex)한 후, 10배씩 희석하여 집락 형성 단위(CFU)를 측정하였다. 105, 106, 107, 108, 109, 1010 으로 희석된 미생물을 엘비 고체(LB agar) 배지 위에 도말하여 30℃에서 24시간 배양한 후 집락 형성 단위(CFU)를 측정하였다. 총균수 측정은 각각 3번 시행하였다.
또한 토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템에서 유류분해균수를 측정하였는데, 유류분해균수를 측정하기 위해 미네랄 배지인 부쉬넬하스 (Bushnell Haas broth) 고체 배지에 디젤을 5000 ppm 농도로 첨가한 후 고체배지를 만들어서 집락 형성 단위(CFU)를 측정하였다. 고정화 담체 샘플 1g을 9ml 증류수에 넣어서 교반(vortex)한 후, 10배씩 희석 하였다. 105, 106, 107, 108, 109, 1010으로 희석된 미생물을 디젤 5000 ppm이 포함된 부쉬넬하스 (Bushnell Haas broth) 고체 배지 위에 도말하여 30℃에서 일주일 동안 배양한 후 집락 형성 단위(CFU)를 측정하였다. 유류분해균수 측정은 각각 3번 시행하였다. 일주일동안 측정한 일자별 총균수와 유류분해균수의 그래프를 도 8에 나타내었다.
(5)T-RFLP(Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism)를 이용한 유류분해 미생물의 고정화 모니터링 실험
토양에서 DNA를 추출하는 FASTDNA® SPIN KIT FOR SOIL(MP BIO)를 이용하여 토양세균의 DNA를 분리한 후, FAM-9F 와 805R 프라이머를 이용하여 약 800 bp(base pair) 크기의 유전자를 중합효소연쇄반응(PCR)을 사용하여 증폭하였다. 이때 프라이머(primer)는 9F와 805R을 사용하였으며, 9F는 형광으로 표지한 6-FAM(carboxyfluorescein)을 이용하였다.
중합효소연쇄반응(PCR)은 95℃에서 15분간 DNA를 변성시킨 후, 5 싸이클은 95에서 30초, 53에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 유지하였다. 이때 증폭단계인 72℃에서 30초 조건에서는 프라이머의 퇴보(priemr degeneracy) 현상 때문에 램프(ramp) 기능을 이용하여 초당 0.1℃씩 온도를 상승시켰다. 그 후 30 싸이클은 95℃에서 30초, 53℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초, 마지막 증폭은 72℃에서 7분간으로 실행하였다.
반응이 끝난 후 중합효소연쇄반응(PCR) 반응액 5 μl 취하여 1.5% 아가로스 젤(Agarose gel)로 전기 영동하여 크기를 확인한 후, 중합효소연쇄반응(PCR) 결과물을 정제하기 위하여 PCR Purification kit(TaKaRa, Japan)를 이용하여 최종 용량이 30 μl가 되게 정제, 농축하였다. 100 ng에서 150 ng 사이의 중합효소연쇄반응(PCR) 산물을 5 유닛(units)의 제한효소와 제한효소 완충용액, 그리고 증류수를 넣어 최종 용량이 10 μl가 되게 하였고, 이를 37℃의 항온배양기에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 T-RFLP를 분석하였다. 이때 16S rDNA 유전자의 제한 효소로 HaeIII(GGCC ; Koschem)을 사용하였다.
T-RFLP 분석은 Genetic Analyzer (ABI PRISMㄾ 3100, Applied Biosystems, USA)를, T-RFLP 분석을 통해 얻은 신호 데이터는 Peak scannerTM (Version 1.0, Applid Biosystem, USA)를 이용하여 각 bp(base pair)의 피크 넓이(peak area)를 구한 후, 그래프로 나타내었다. 각각의 균주별 피크(peak) 결과를 도 9a 내지 도 9d에 그래프로 나타내었다. 이는 토양세정 및 투수 반응벽체 파일럿시스템의 투수반응벽체 내부 고정화 담체에 미생물이 효과적으로 고정화되었음을 나타낸다. 도 9a는 슈도모나스 속 MJ33의 피크(Peak)를, 도 9b는 아씨네토박터 속의 피크(Peak)를, 도 9c는 고르도니아 속의 피크(Peak)를, 그리고 도 9d는 로도코코스 속의 피크(Peak)를 나타낸다.
(6)파일럿시스템 운전 7일 후 T-RFLP 결과
토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템을 운전하면서 투수반응벽체 내 담체에 존재하는 4 가지 디젤분해균주를 T-RFLP로 모니터링 하였다. 모니터링의 결과를 도 9e에 그래프로 나타내었다. 도 9e는 토양세정기법 및 투수 반응벽체 파일럿시스템에서 7일 이후에도 네 균주가 고정화가 잘 되었음을 보여준다.
(7)투수 반응벽체와 토양세정시스템을 이용한 유류오염현장의 TPH 제거
경기도 화성시에 있는 유류오염현장을 제거함에 있어서 유류분해능을 가진 복합 미생물이 고정화 된 투수 반응벽체와 미생물, 산화제, 계면활성제를 이용하는 토양세정시스템을 현장에 적용하였다.
투수 반응벽체(Permeable reactive barrier)의 설계는 H-beam을 양쪽에 설치하고 그 사이에 타공판을 붙여 다공성의 벽면체를 설계하였다. H-beam 간격은 타공판 제작 효율성을 높이기 위하여 2.5m 간격으로 설계하였으며 타공판 내부는 고정화담체로 충진하게 된다. H-beam 설치 깊이는 4m를 삽입하여 보강 콘크리트 없이 자력으로 지탱하도록 하였고, 설치의 편의를 위하여 띠장 작업을 실시하여 설치하였고 설치 완료 후 철거하게 하였다. C-형강은 75㎜를 기준으로 하여 보강을 위하여 60㎝당 1개씩 설치하였고, 타공판은 스테인리스스틸로 제작하여 부식되는 것을 방지하였다.
도 10의 오염현장의 토양세정시스템 공정도에 나타나는 바와 같이 토양세정시스템 공정절차는 다음과 같이 이루어질 수 있다. 탱크에 저장되어있는 생분해성 계면활성제를 펌프를 사용하여 주입정을 통하여 지반에 투입한다. 주입된 생분해성 계면활성제는 토양입자표면에 흡착되어있는 유류를 탈착시킴과 동시에 지반 내 일시적인 수위상승을 유도한다. 수위상승으로 인해 방향성을 갖게 되는 생분해성 계면활성제는 토양공극 사이를 통과하여 생물벽체에 도달하게 된다. 생분해성 계면활성제에 의해 이동된 유류는 생물벽체 내에서 미생물에 의해 서서히 분해되고 생물벽체를 통과한 용액은 추출정을 통하여 브로워탱크에 저장하였다가 유수분리조와 같은 수처리장치를 통과시켜 정화된 배출수를 방류하게 된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 유류 분해능을 가지는 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP).
  2. 유류 분해능을 가지는 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ33(KCTC11679BP).
  3. 슈도모나스(Pseudomonas sp .) MJ32(KCTC11678BP), 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP) 또는 이들의 혼합물을 함유하는 유류분해용 미생물제제.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 미생물제제는 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP), 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP) 또는 이들의 혼합물을 피트모스, 벤토나이트 및 알지네이트를 질량비 2:3:0.1로 혼합한 담체에 고정화시킨 것임을 특징으로 하는 유류분해용 미생물제제.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 미생물제제는 바실러스 속, 크렙실라 속, 노카디아 속, 고르도니아 속, 로도코코스 속, 아씨네토박터 속, 페니바실러스 속, 아조토박터 속, 라이조비움 속, 아조스피릴럼 속, 플라보박테리움 속, 스트렙토마이시스 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 균주를 추가적으로 피트모스, 벤토나이트 및 알지네이트를 질량비 2:3:0.1로 혼합한 담체에 고정화시킨 것임을 특징으로 하는 유류분해용 미생물제제.
  6. 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ32(KCTC11678BP), 슈도모나스(Pseudomonas sp.) MJ33(KCTC11679BP) 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 상기 유류분해용 미생물제제를 이용하는 유류오염토양의 생물학적 복원방법.
  7. 삭제
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