KR101111532B1 - 고니아독소 2와 3의 생물전환능을 가진 균주 및 그 균주를 이용하여 패독을 무독화하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마비성패독인 고니아독소(Gonyautoxin, GTX) 2와 3을 생물전환하는 세균의 분리 및 동정 그리고 세균을 이용한 마비성독소의 생물전환에 관한 것으로, 본 발명은 세균에 의한 고니아독소 2와 3을 특이적으로 생물전환하는 기능을 이용하여 우수 마비성 패독 생물전환세균이 첨가된 생물학적 제제의 안전성과 생물전환적용기술을 제공하는 것으로 소마비성패독을 생성하는 적조생물의 발생과 이를 먹이로 하는 이매패류에 축척됨으로서 이매패류의 생산성에 악영향을 미치는 패독을 저감하기 위한 패류의 독화 방제에 관한 것을 특징으로 하는 고니아독소 2와 3의 생물전환능을 가진 균주 및 그 기능을 이용한 생물전환기술에 관한 것이다.

마비성독소, 제독미생물, 알렉산드리움, 이매패류, 생물전환기술

Description

고니아독소 2와 3의 생물전환능을 가진 균주 및 그 균주를 이용하여 패독을 무독화하는 방법{Bacteria for biotransformation of gonyautoxin 2 and 3 and it application method}

본 발명은 마비성패독을 무독화로 생물전환하는 균주와 이를 이용한 패류독화를 저감하기 위한 기술에 관한 것이다.

마비성 패류독 (paralytic shellfish poison, PSP)은 유독와편모 조류의 일종인 알렉산드리움속, 피로디니움 속, 짐노디니움 속 (Alexandrium spp., Pyrodinium spp., Gymnodinium spp.)등의 해양식물성 플랑크톤이 생산하는 신경마비독으로서 중독되었을 때는 마비증세를 나타내므로 마비성 패류독이라 한다.

현재까지 밝혀진 PSP의 성분으로는 삭시톡소군 (saxitoxin group; STX, neoSTX), 고니아독소군 (gonyautoxin group; GTX1, 2, 3, 4), 엔-설포카바닐 독소군 (N-sulfocarbamoyl toxin group ; GTX5, 6, C1, 2, 3, 4), 탈카바닐 독소군(decarbamoyl toxin group; dcSTX, dcneoSTX, dcGTX1, 2, 3, 4), 탈산소탈카바닐 독소군(deoxydecarbamoyl toxin group ; doSTX, doGTX2, 3) 등 20여개가 알려져 있다 (Oshima 1995, Murakami and Noguchi, 2000). 대부분의 독소는 알렉산드리움(Alexandrium)종으로부터 생성되며 성장기에 환경조건 및 스트레스(stress)의 정도에 따라 독소조성과 생성량의 차이를 보인다.

생성된 독소는 유독성조류의 체내에 축척이 되기 때문에 동물플랑크톤이나 어패류의 섭식에 의한 먹이사슬을 통하여 동물 및 인간에 전달되어 건강상장애를 유발하게 된다. 마비성패류독소(PSP)는 염기성 수용성 물질로 복어독과 유사하게 신경계에 작용한다. 즉 신경계와 근육세포의 나트륨 채널(sodium channel)을 특이적으로 차단(blocking)시켜 근육수축 및 신경자극 (nerve impulse)의 전도에 필수적인 활성 잠재성(action potential)의 전달을 방해함으로서 궁극적으로는 근육 및 호흡 등의 마비를 일으키며, 마비성패류독소(PSP)의 독력은 카바메이드독소(carbamate toxins; STX, neoSTX, GTX1-4)가 엔-설포카바모일 독소(N-sulfocarbamoyl toxins) 및 탈카바모일(decarbamoyl) 유도체보다 월등히 높은 것으로 알려져 있다.

1990년대 들어 유독성 독소의 제어를 위한 방법으로 유독성 조류로부터 생성된 독소를 직접적으로 분해하여 무독화 시키려는 노력이 시작되고 있다(菊池 등, 1995; 박 등, 2000a, b; Smith 등, 2001). 아직은 초보적인 연구단계로 여러 종류의 마비성패류독소(PSP)가 패류내 공생하는 박테리아들에 의하여 유사구조를 지닌 다른 형태의 독소나 미지물질로 효소반응을 통하여 전환된다는 사실이 확인 되었으 며, 이 경우 관여하는 전환 메카니즘으로 환원적 제거(reductive elimination), 탈카바모일화작용(decarbamoylation) 등이 부분적으로 제시된바 있다(Smith 등, 2001).

상기와 같이 마비성 패류독 유발 적조생물에 의해 오염 된 패류에 대한 패류독 구제방법으로는 비오염 해수로 이동 후 자가 정화 유도, 오존처리, 초음파처리 등이 사용될 수 있으나 그 효과 및 경제성 등이 문제가 되고 있으며, 마비성 패류독은 저온이나 고온처리에 의해서도 파괴되지 않는 특성을 가지고 있으며 가공시의 제독이나 감독효과도 보장되지 않음으로 위생안전의 확보가 가능한 기술의 도입이 절실한 문제점으로 대두된다.

따라서, 생물전환을 통하여 독소의 무독화가 가능할 경우 해양환경에 직접적인 적용보다는 패류를 수확한 후 독화여부에 따라 1차 산지에서 무독화공정을 통하여 제독한 후 안전하게 출하하는 기술개발을 통하여 적용한다면 현재 패류독화로 인한 체취금지, 국민의 위해감으로 인한 소비감소 및 사회적인 불신 등을 해소함으로서 지속적인 어민소득증대에 기여할 수 있으며 또한 패류의 안정적인 수출 및 관련기술의 수출을 통한 생물산업에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.

상기의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명에서는 마비성패독인 고니아독소(Gonyautoxin, GTX) 2와 3을 생물전환하는 능력을 가진 3종 (Klepsiella sp. ME1-4, Raultella sp. ME1-3, Planococcus sp. ZMS34)의 균주를 해양환경으로부터 분리하였으며, 이를 2007년 9월 12일자로 한국생명공학연구원내 생물자원센터 (KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 기탁 (기탁번호: Klepsiella sp. ME1-4 [KCTC 11197BP], Raultella sp. ME1-3 [KCTC 11196BP], Planococcus sp. ZMS34 [KCTC 11198BP])하였으며, 국립 생물공학정보센터(NCBI; national center for biotechnology information)에 등록된 균주들과 16에스 알알엔에이(16S rRNA)의 유사성을 조사하고, 염기서열을 분석한 결과, 상기 균주는 Klepsiella 속, Raultella 속, Planococcus 속임을 확인하였다.

이에, 본 발명에서는 상기 균주가 마비성패독인 고니아독소(Gonyautoxin, GTX) 2와 3을 생물전환특성을 규명하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 상기 균주가 마비성패독인 고니아독소 2와 3을 생물전환하는 특성을 규명함으로서 본 발명을 완성하였으며, 먼저, 마비성 패독을 생물전환하는 특성을 가진 세균을 탐색하는 방법과 우수생물전환 세균을 확보하고 분류ㆍ동정하여 제공하는 것과, 탐색된 미생물을 대상으로 우수 마비성 패독 생물전환세균의 생물전환능력을 확인하고 생물전환된 산물의 안전성을 확보하기 위한 기술과 검증결과를 제공하는 것이다.

결과적으로 우수 마비성 패독 생물전환세균이 첨가된 생물학적 제제의 안전성과 생물전환적용기술을 제공하는 것으로, 이를 통하여 매년 봄에 소마비성패독을 생성하는 적조생물의 발생 그리고 이를 먹이로 하는 홍합 및 이매패류에 축척됨으로서 어미 생산성에 지대한 영향을 미치므로 패독을 저감하기 위한 적용기법을 이용하는 데 목적이 있다.

상기와 같이, 본 발명의 마비성패독 생물전환미생물은 마비성패독인 고니아독소(Gonyautoxin, GTX) 2와 3에 대하여 효과적으로 생물전환에 따른 독력을 감소하는 효과를 나타내어 적조원인생물인 알렉산스리움 속으로부터 야기되는 마비성패독의 농축으로 인한 식중독사고를 사전에 예방하고 수산물유통의 수월성과 안전성을 확보하기 위한 처리방법에 유용하게 적용될 수 있으며, 또한 마비성패독 미생물 및 그 세포구성성분(효소)을 이용하여 화장품(원료), 의약품(원료) 및 동물의약품(원료)를 생산할 목적으로 활용할 수 있는 효과를 가질 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 마비성패독 생물전환 우수 미생물의 선별

1. 마비성 패류독의 준비 및 미생물 분리

초기 탐색을 위해 사용된 패독은 2,000 ug/100kg의 독력을 갖는 담치 중장선을 확보하여 식품공전에 따라 추출한 후, 사가와라(sagawara) 등(1997)의 방법에 의해 고형분과 고분자화합물을 제거하기 위해 10kDa의 한외여과막을 이용하여 여과한 후, 분주하여 -70℃ 냉동고에 보존하였으며 탐색을 위한 마비성 패독으로 이용하였다.

해수, 담치내장, 저토 등의 시료로부터 마비성패독 생물전환 미생물의 분리는 최소영양배지(MSM, Mineral salts medium)에 최종농도 100 ug/100kg인 패독을 첨가하여 7일간 농후배양(enrichment culture)하였다. 이후 미생물의 분리를 위해 농후배양된 시료는 연속희석법을 이용한 평판계수법에 의한 조벨 2216이 (Zobell 2216e)고형배지 [펩톤(Peptone) 5g, 이스트 엑스(yeast extract) 1g, 인산철(FePO₄) 10mg, 숙성해수 750ml, 증류수 250ml, 한천 1.5%]에 도말한 후, 25℃에서 5일간 배양하였다. 조벨 2216이 고형배지에서 성장된 콜로니는 형태적인 특성에 따라 무작위로 선별한 후, 순수배양체를 확보하였으며, 확보된 균주는 20% 글리세롤(Glycerol) 용액을 이용하여 stock한 후, -70℃ 냉동고에 보존하였다.

마비성패독의 정제 후, 액체크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 분석한 결과는 도 1의 액체크로마토그래피에 의한 고니아독소(Gonyautoxin, GTX) 1~4 (GTX 1~4)의 크로마토그램에서 나타낸 것과 같이, 고니아독소 1~4 (GTX 1~4)까지의 피크를 확인하였다, 또한 마비성패독이 빈번히 발생하는 마산만, 진해만 및 거제도일원으로부터 얻어진 해수, 저토 및 담치내장으로부터 총 450균주를 분리하였으며 분리된 균주는 독소생물전환능력을 탐색하기 위해 냉동 보존하였다.

2. 마비성 패류독 생물전환 미생물 활성검증

분리된 미생물을 대상으로 마비성 패독 생물전환 활성을 갖는 미생물을 탐색하기 위하여 다음과 같은 진행하였다. 미생물의 전배양은 조벨 2216이 고형배지에서 성장된 군락 한 루프를 50ml의 조벨 2216이 액체배지에 접종하여 2일간 150rpm, 25℃에서 진탕배양하였다. 전 배양액은 원심분리에 의하여 균체를 수확하였으며 조벨 2216이 액체배지를 이용하여 2회 세척하였다. 조벨 2216이 액체배지에 현탁된 미생물은 초기 흡광도(A₆₆₀)를 0.1 이 되도록 조절하였다. 패독 생물전환능력을 검증하기 위하여 패독 추출물이 첨가된 배양액과 전배양액을 일정한 비율 (최소영양배지 : 조벨 2216이 액체배지 : 독소추출물 : 전 배양액 = 6:1:2:1)로 접종한 후, 다시 25℃, 150 rpm에서 5일간 진탕배양 하였으며, 배양 후 시료의 분석은 다음과 같이 수행하였다.

표준독소는 고니아독소(GTX) 1~4를 이용하였으며 마비성패독의 분석은 오시마(Oshima, 1995)방법을, 정제는 사가와라 등(sagawara et al., 1997)의 방법을 변형하여 이용하였으며, 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용한 마비성패독의 분석은 배양액에 동량의 0.1 N HCl 용액을 첨가한 후, pH 4로 조절하였으며 100^oC에서 5분 가열한 후, 자연 냉각하였다. 냉각된 시료는 원심분리(10,000xg)에 의하여 고형분을 제거하였으며 상등액을 다시 센트리콘(Centricon; 10,000 dalton cut-off)에 첨가한 후, 원심분리(10,000xg)하여 얻은 여과액을 분석용 시료로 사용하였다. 마비성패독의 분석은 김(2005)의 조건으로 역상계를 이용한 포스트컬럼(post-column) 변환법을 이용한 형광분석법을 이용하여 배양액중의 고니아독소 1~4 (GTX 1~4)의 상대적 면적비의 변화를 토대로 독소의 변화를 관찰 하였다.

표 1은 우수 마비성 패독 생물전환 균주와 생물전환율을 나타낸 것으로, 총 450균주를 대상으로 실험한 결과 생물전환능이 우수한 17종의 균주를 확보하였으며(표 1). 이들 중 5-2-1를 제외한 대부분의 균주는 고니아독소 3(GTX-3) 보다는 고니아독소 2(GTX-2)의 생물전환능력이 더 높게 나타났으며, 특히 ME1-3, ME1-4, G-1, ZMS15, ZMS34, ZMS13균주의 경우 고니아독소 3(GTX-3)과 고니아독소 2 (GTX-2)에서 모두 60% 이상의 생물전환능력을 나타내었다.

[실시예 2] 마비성 패독 생물전환 세균의 분류동정

우수 마비성 패독 생물전환 균주의 분류동정은 16에스 리보솜 알디엔에이 (16S rDNA) 염기서열을 이용한 계통분석방법을 이용하였으며, 각 균주는 조벨 2216이 액체배지에서 2일간 배양한 후, 원심분리기를 이용하여 균체를 회수하였다.

제노믹 디엔에이(Genomic DNA)는 위자드제노믹 디엔에이 정제 키트(Wizard genomic DNA Purification kit ; Promega, medison, WI)를 이용하여 분리하였다. 16 에스 리보솜 알디엔에이(16S rDNA)는 16에스 리보솜 알디엔에이 프라이머(16S rDNA primer), 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'; Escherichia coli nucleotide 8~27) 와 1518R (5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3'; Escherichia coli nucleotide 1541~1522) (Giovannoni, 1991)을 사용하여 중합반응연쇄반응기(PCR)에 의해 제노믹 디엔에이(genomic DNA)로부터 증폭하였다. 중합반응연쇄반응기(PCR) 산물은 전기영동 (0.8% agarose)에 의해 디엔에이(DNA)가 증폭되었음을 확인하였다. 중합반응연쇄반응기 산물은 분리키트(Wizard PCR Preps DNA Purification System, Promega)를 사용하여 분리한 후, 자동염기서열 결정장치를 이용하여 염기서열을 결정하였다.

16 에스 리보솜 알엔에이(16S rDNA)염기서열의 분석은 Ribosomal Database Project (RDP; Midak et al., 1994)의 SIMILARITY-RANK와 National Center Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST; Altschul et al., 1990)로 부터 얻어진 분류군의 염기서열을 이용하여 서열화하였으며 Phylogenetic Interference Package (PHYLIP; Felsenstein, 1993)로 서열 데이터를 분석하기 위해 사용되었다. Phylogenetic tree는 neighbour-joining (Saitou & Nei, 1987)방법을 이용하였으며, Evolutionary distances matrices는 Jukes & Cantor (1969)모델에 따라 작성되었다. neighbour-joining tree topology는 1000 resampling에 기초한 bootstrap analysis (Felsenstein, 1985)에 의해 평가하였다.

표 2는 16S rDNA염기서열분석에 의한 마비성 패독 생물전환세균의 분류요약된 것을 나타낸 것으로, 15개의 균주에 대한 1.5 kb의 염기서열을 결정하였으며, 인터넷을 이용하여 RDP 및 NCBI에 등록된 균주들과 16S rDNA 유사성을 조사하고 16S rRNA 염기서열로부터 계통수를 작성하였으며. 그 결과는 표 2에 요약 정리하였다.

상기 표 2에서, 15종의 균주 중 10개의 구별되는 속(genus)으로 구분되었으며, 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas) 속은 균주 ZMS25, ZMS10, ZMS31에서 3개의 구별되는 종을 구성하고 있었으며, 속과 종이 일치하는 균주는 각각 2개씩 검출되었으며, 라울텔라 테리제나(Raultella terrigena)는 ME1-3, G-1 와 세라티아 마세센스(Serratia marcescens)는 ME1-1, ME1-2 였다. 그 외 크렙시엘라, 마이크로박터, 테나시바쿠룸, 바실러스, 프라노코커스, 마이크로벌비퍼, 로도코커스(Klepsiella. Microbacterium. Tenacibaculum. Bacillus. Planococcus. Microbulbifer. Rhodococcus) 속(genus)은 각각 1종 씩 검출되었다.

동정된 균주는 대부분 기존에 알려진 종과 유사성이 높아 신종으로 분류되는 종은 검출되지 않았다. ME1-3, ME1-4균주의 계통분석도는 도 2에 ZMS34균주의 경우 도 3과 같다.

[실시예 3] 마비성 패독 생물전환 세균의 특성규명

1. 마비성 패독 생물전환 세균의 성장특성

세균배양을 위하여 우수제독미생물은 조벨 2216이(ZoBell 2216e) 고형배지에 도말하여 25℃에서 2일간 배양하였다. 성장된 군락에서 loop을 이용하여 50 ㎖의 조벨 2216이 액체배지에 접종하여 25℃, 150 rpm에서 1일간 진탕배양 하여 아래의 실험을 위한 접종자로 이용하였다.

세균의 성장측정은 분광광도계(Phamacia co.)를 이용하여 흡광도(A₆₆₀)를 측정하였고, 최적 온도시험을 위해 전 배양된 미생물은 50 ㎖의 조벨 2216이 액체배지에 2%로 접종하였다. 배양은 20, 25, 30 및 37℃로 조절된 진탕배양기(150 rpm)에서 1일간 배양한 후 흡광도를 측정하였다. 최적 pH시험을 위해 기본배지는 50 ㎖의 조 벨 2216이 액체배지를 이용하였으며, 배지의 pH조절은 다음과 같다. pH 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10은 1N HCl과 NaOH를 이용하여 조절하였다. 전 배양액은 각각의 배지에 2%로 접종하여 25℃, 150 rpm에서 1일간 배양한 후, 흡광도를 측정하였다.

NaCl 요구성 조사를 위해 사용된 기본배지는 NaCl이 제외된 인공 해수성분 (ZoBell, 1946)을 이용하여 조벨 2216이 배지를 이용하였다. 실험에 사용된 배지의 NaCl의 농도는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6% (w/v)로 하였다. 전 배양액은 원심분리에 의하여 균체를 수확하였으며 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.2)을 이용하여 2회 세척하였다. HEPES 완충용액에 현탁된 세균은 초기 흡광도(A₆₆₀)를 0.02가 되도록 조절하여 준비된 각각의 배지에 접종한 후, 25℃, 150 rpm에서 1일간 배양한 후, 흡광도를 측정하였다.

표 3 우수 마비성패독 생물전환 세균의 최적성장조건을 나타낸 것으로, 우수 마비성패독 생물전환 세균은 25와 30℃에서 최적성장을 나타내었으며, 균주에 따라서는 15~37℃범위 내에서 성장이 가능하였다. 또한 pH는 6~8범위에서 최적성장을 보였으며 성장 가능한 pH는 5~9범위였다. 염도조건에서는 모든 종이 3~6범위에서 NaCl 에 저항성을 가지고 있음을 알 수 있으며, 해양유래미생물은 EZMS8, ZMS25, PMS7, ZMS15, ZMS34, ZMS13, ZMS31규주로 7종이 그리고 염분에 저항성을 가지고있는 미생물은 ME1-1, ME1-2, ME1-4, ME1-3, G-1, ZMS10, EZMS4균주로 나타났다.

2. 마비성 패독 생물전환 세균의 분해특성

미생물의 전배양은 조벨고형배지에서 성장된 군락 1 루프를 5ml의 저벨 액체배지가 접종하여 2일간 150 rpm, 25℃에서 진탕배양한다. 이후 배양액을 원심분리(10,000 rpm, 4℃, 10분)하여 세포를 수확하였으며 멸균된 50% 해수를 이용하여 2회 세척한 후, 본 배양에 이용하였다. 본 배양은 부영양배지와 빈영양배지에 따른 분해특성을 확인하기 위하여 준비하였으며, 배양액에 패독 추출물의 첨가는 최종 용적을 기준으로 30%씩 첨가하였다. 이후 배지는 여과멸균법(Diameter 47mm, pore size 0.1 ㎛)에 의해 멸균한 후, 멸균된 250ml 삼각플라스크에 각 각 50 ml씩 첨가하여 배양액을 준비하였다. 이후 전 배양체를 660nm에서 흡광도가 0.1 이 되도록 희석하여 접종하였으며, 접종된 배지는 25℃, 150rpm에서 배양하였으며 배양기간 동안 일정시료를 채취하여 흡광도, 독량을 분석하였으며 일정량의 시료는 신경세포분석(neuroblastoma assay)와 효소분해능을 조사하기 위해 -70 초저온냉동고에 보존하였다.

그 결과는 도 4의 빈영양과 부영양조건에서 마비성패독 생물전환세균에 의한 고니아독소(GTX-2와 3)의 생물전환을 나타낸 것과 같이, 빈영양배지에서 보다 부영양배지에서 미생물의 성장은 2배정도 높게 나타났다. 도 4의 A~F를 설명하면, 빈영양조건에서 세균의 성장도(A), GTX-3(B), GTX-2(C), 부영양조건에서 세균의 성장도(D), GTX-3(E), GTX-2(F)를 나타낸 것이다.

빈영양조건에서 GTX-3(도4-B)의 잔존율은 3일째에 ME1-3균주가 37.2%, ME1-4균주가 53.7%, ZMS34균주가 94.5%를 나타내어 ME1-3균주가 가장 빠른 생물전환능력을 보였으며 5일째에는 ME1-3, ME1-4 및 ZMS34균주가 각각 33.1%, 37.5%, 45.6%를 나타내었고 8일째까지 더 이상 잔존율의 변화는 나타나지 않았다. 반면 부영양조건에서 ME1-3, ME1-4 및 ZMS34균주는 GTX-3의 잔존율에서 각 균주마다 구별되는 변화양성을 보이지 않았으며 3일째에 37.0, 41.3, 31.3%로 거의 오차범위 내에서 변화를 보였다(도 4-E). 생물전환 양상은 빈영양보다는 부영양조건에서 보다 빠른 속도를 나타내었으며 이는 균주의 성장과 밀접한 상관관계가 있는 것으로 판단된다. 즉 뚜렷한 전환율은 세균의 성장이 정치기에 도달한 이후 나타났으며 ZMS34의 낮은 전환율 은 ME-3과 4보다 낮은 성장 때문으로 판단된다(도 4-B&E).

빈영양조건에서 GTX-2 (도4-C)의 잔존율은 ME1-3과 4균주가 1일째에 급격한 감소를 보였으며 이후 8일째까지 뚜렷한 변화를 나타내지는 않았다. 반면 ZMS34균주는 3일째까지 유의한 전존율의 변화를 나타내지 않았으나 5일째에 17%로 급격히 전존양이 감소하였다. 이는 GTX-3에서와 같이 균주의 성장패턴과 일치하는 것으로 판단된다. 부영양조건에서 GTX-2의 잔존율(도 4-F)은 ME-3과 4균주의 경우 빈영양조건과 유사한 전환양상을 보였으며 다만 ZMS34의 경우 3일째에 GTX-2가 10%대로 급격한 감소하여 ME-3과 4균주 보다는 전환율이 다소 더딘 것으로 판단된다.

결론적으로 미생물에 의한 생물전환은 GTX-3 보다는 GTX-2가 더 빠른 전환속도를 나타내었으며 분해능력은 세균의 성장과 밀접한 상관관계를 보였다. 특히 성장단계에서 정치기에 도달하였을 때 최대 분해속도를 보였다. 또한 세균간의 분해속도는 ME-3, ME-4 그리고 ZMS34의 순으로 나타났다. 그러나 이러한 기준은 세균의 성장과 밀접한 상관관계가 있을 알 수 있었다.

3. 신경세포분석(neuroblastoma assay)

신경세포분석(neuroblastoma assay)은 표준품 및 시료로부터 독력을 비교 또는 안전성 확보를 위해 확립하였으며, 분석방법은 아래와 같다.

먼저, 96 well에 neuroblasma cell을 1.0~5.0x10⁴ 정도로 한 well에 200㎕씩 넣는다. 이후 37℃, CO₂ 인쿠베이터에 24시간 배양한다. STX standard (100㎍/ml in 20% 에탄올/물, pH 3.5)를 10㎕ 넣는다. 독력검색을 위한 추출시료인 마비성패류독 (paralytic shellfish poison, PSP) 독소를 10㎕ 넣는다. 와베인(ouabain)과 베라트리딘(veratridine) stock 용액을 농도에 맞게 10㎕씩 3과 4의 well에 각각 넣는다. 그리고 cell control well은 30㎕의 배지를 넣는다. Ouabain/veratridine control well은 10㎕의 배지와 10㎕의 와베인/베라트리딘(ouabain/veratridine)을 각각 넣는다. 37℃, CO₂ incubator에 24 시간 배양한 후, well의 배지를 비우고 PBS buffer로 세척해준다. 10% 포르말린(formalin)으로 고정한 후, 크리스탈바이오렛(crystal violet)을 5분간 처리한다. 잔류한 염색액을 세척 후 상온에서 건조하고 595nm에서 측정한다.

MTT 신경세포분석(neuroblastoma assay)은 신경세포의 Na 채널(channel)을 와베인/베라트리딘(ouabain/veratridine)을 이용하여 차단하고 PSP 독소를 통하여 Na 채널(channel)을 개방함으로서 세포의 성장 즉 생존을 유도하는 방식으로 분석을 수행한다.

따라서, 도 5의 STX의 농도와 신경세포 억제와의 상관관계에서와 같이, 와베인/베라트리딘(ouabain/veratridine)을 처리함으로서 사멸을 유도하는 농도(억제농 도)를 70%로 결정하였으며 이후 PSP가 존재하면 생존율은 올라가 억제효과의 정도 (inhibition rate)는 감소한다. 그러나 미생물을 처리하여 독소가 감소 즉 생물전환 또는 분해가 일어나 독력이 사라지면 신경세포는 다시 사멸하게 되므로 억제율은 증가한다.

이러한 방법을 기초로 하여 마비성패독이 첨가된 빈영양 및 부영양조건에서 미생물을 처리하지 않은 대조구 그리고 미생물들을 처리한 실험구를 대상으로 마비성패독의 독성을 분석한 결과는 도 6에 수록하였다.

도 6은 빈영양 및 부영양배지에서 마비성독소와 미생물을 첨가한 후 5일간 배양한 배양여액을 이용한 신경세포 검사법(neuroblatoma assay)결과를 나타내는 것으로,

도 6에서 1~8을 설명하면, 배지조건이 빈영양조건에서 대조구(1), ME1-3(2), ME1-4(3), ZMS34(4), 부영양조건에서 대조구(5), ME1-3(6), ME1-4(7), ZMS34(8)을 나타내는 것이다.

그 결과, 빈영양과 부영양조건에서 미생물을 처리하지 않은 대조구는 처리한 농도에 의존하여 70에서 50까지 억제효과가 타나났다(도 6-1, 5). 이는 마비성패독이 분해되지 않았음을 의미한다. 반면에 미생물을 처리한 경우 빈영양 및 부영양조건에서는 대조구와 비교하여 성장억제가 유의하게 감소하지 않음을 볼 수 있다. 이는 결과적으로 미생물(ME1-3, ME1-4 및 ZMS3균주)의 처리에 의해 마비성패독이 생물전 환 또는 분해되었음을 의미한다. 특히 ME1-4균주가 가장 우수한 것으로 나타났다(도 6-3, 7).

4. 패독의 대사경로

분해특성조사에서 패독의 HPLC자료를 이용하여 대사경로의 예측이 가능하다. 크로마토그램 상에서 ME1-4균주는 GTX-2와 3이 GTX 1/4로 전환되지 않아 STX로 빠르게 전환된 것으로 판단되며 이후 탈카바메이트화과정을 거쳐 분해될 것으로 판단된다(도 7-A). ME1-3균주는 크로마토그램상에서 GTX-4가 배양8일까지 지속적으로 잔류하고 있음을 확인하였다. 따라서 ME1-3균주는 GTX-2에서 STX로 그리고 GTX-3에서 GTX-4, NEO로 생물전환된 것으로 판단된다. ZMS34는 ME1-4균주와 유사한 전환경로를 거치는 것으로 판단된다. 3종의 제독미생물에서 GTX-2는 GTX-3보다 높은 전환율을 나타내어 OSO₃ ^-의 전환효소는 GTX-3보다는 GTX-2에 대한 높은 친화력을 가지고 있는 것으로 판단된다.

도 7은 부영양배지에서 마비성독소와 미생물을 첨가한 후 8일의 배양기간 동안 대사물질의 변화를 나타낸 결과로, ME1-4(A), ME1-3(B), ZMS34(C)균주를 나타낸 것이다.

도 1은 액체크로마토그래피에 의한 고니아독소 1~4(GTX 1~4)의 크로마토그램

도 2는 ME1-3과 ME1-4균주의 16S rDNA염기서열을 이용한 계통분석도

도 3은 ZMS34 균주의 16S rDNA염기서열을 이용한 계통분석도

도 4는 빈영양과 부영양조건에서 마비성패독 생물전환세균에 의한 고니아독소(GTX-2와 3)의 생물전환 [빈영양조건 : 세균의 성장도(A), GTX-3(B), GTX-2(C), 부영양조건 : 세균의 성장도(D), GTX-3(E), GTX-2(F)]

도 5는 STX의 농도와 신경세포 억제와의 상관관계

도 6은 빈영양 및 부영양배지에서 마비성독소와 미생물을 첨가한 후 5일간 배양한 배양여액을 이용한 신경세포 검사법(neuroblatoma assay)결과[빈영양조건 : 대조구(1), ME1-4(2), ME1-3(3), ZMS34(4), 부영양조건: 대조구(5), ME1-4(6), ME1-3(7), ZMS34(8)]

도 7은 부영양배지에서 마비성독소와 미생물을 첨가한 후 8일의 배양기간 동안 대사물질의 변화를 나타낸 결과 [A : ME1-4, B: ME1-3, C: ZMS34균주]

도 8은 마비성패독 생물전환 미생물의 분리 및 선정의 흐름도

<110> Silla University Industry-University Cooperation Foundation <120> Bacteria for biotransformation of gonyautoxin 2 and 3 and it application method <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 430 <212> DNA <213> Raultella sp. ME1-3 <400> 1 gcaagtcgag cggtagcaca gaagagcttg ctcttngggt gacgagcggc ggacgggtga 60 gtaatgtctg ggaaactgcc tgatggaggg ggataactac tggaaacggt agctaatacc 120 gcataacgtc gcaagaccaa agtgggggac cttcgggcct catgccatca gatgtgccca 180 gatgggatta gctagtaggt acggtaatgg ctcacctagg cgacgatccc tagctggtta 240 nngaggangn cccagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagg 300 cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag ccatgccgcg tgtatgaaga 360 aggccttcgg gttgttaaag tactttcagc gaggaggaag gcantaaggt taataacctt 420 ggtgangacg 430 <210> 2 <211> 432 <212> DNA <213> Klepsiella sp. ME1-4 <400> 2 agatgaacgc tggcttcagg cctaacacat gctagtngaa cggtagcaca gagagcntgc 60 tctcgggtga cgagtggcgg acttgtgagt aatgtctggg aaactgcctg atggaggggg 120 ataactactg gaaacggtag ctaataccgc ataacgtcgc aagaccaaag agggggacct 180 tcgggcctct tgccatcaga tgtgcccaga tgggattagc tagtaggtgg ggtaacggct 240 cacctaggcg acgatcccta gctggttann gtggangncc tgccacactg gaactgagac 300 acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg 360 atgcagccat gccgcgtgta tgaagaaggc cttcgggttg taaagtactt tcagcgggga 420 ggaaggtgtt gt 432 <210> 3 <211> 1454 <212> DNA <213> Planococcus sp. ZMS34 <400> 3 ggagcttgct cctttggttt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggca acctgccctg 60 cagatcggga taactccggg aaaccggtgc taataccgaa tagtttgcgg cctctcatga 120 ggctgtacgg aaagacggtt tcggctgtca ctgcaggatg ggcccgcggc gcattagcta 180 gttggtgggg taatggccta ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg 240 ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 300 gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt tcggatcgta 360 aaactctgtt gtgagggaag aacaagtacc aattaactac tggtaccttg acggtacctc 420 accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 480 tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggtcc tttaagtctg atgtgaaagc 540 ccacggctca accgtggagg gtcattggaa actgggggac ttgagtgcag aagaggaaag 600 tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg 660 cgactttctg gtctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag 720 ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct 780 tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac 840 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 900 gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc gctgaccgcc taggagacta ggctttccct 960 tcggggacag cggtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1020 gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc 1080 taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1140 cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac aaagggctgc aaacccgcga 1200 gggggagcca atcccagaaa accgttctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctgca 1260 tgaagccgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1320 ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tggggtaacc 1380 cttacgggag ccagccgccg aaggtgggac agatgattgg ggtgaagtcg taacaaggta 1440 gccgtatcgg aagg 1454

Claims (2)

1. 마비성패독인 고니아독소(Gonyautoxin) 2와 3을 무독화로 생물전환하는 능력을 가진 균주로 Klepsiella sp. ME1-4(기탁번호 : KCTC 11197BP), Raultella sp. ME1-3(기탁번호 : KCTC 11196BP), Planococcus sp. ZMS34 (기탁번호 : KCTC 11198BP) 균주로부터 선택된 하나의 균주인 것을 특징으로 하는 마비성패독을 무독화로 생물전환하는 균주
2. 마비성패독을 무독화로 생물전환하는 미생물인 Klepsiella sp. ME1-4(기탁번호 : KCTC 11197BP), Raultella sp. ME1-3(기탁번호 : KCTC 11196BP), Planococcus sp. ZMS34 (기탁번호 : KCTC 11198BP) 균주로부터 선택된 하나의 균주를 이용하여,

   조벨 2216이(ZoBell 2216e) 액체배지에 마비성패독 추출물과 함께 혼합 및 첨가하여, 25~30℃, pH 6~8, 염도 3~6 (w/v)의 조건에서 배양함으로서 고니아독소(Gonyautoxin) 2와 3을 무독화하는 것을 특징으로 하는 마비성 패독을 무독화하는 방법

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