KR100466933B1 - 바실러스 서브틸리스 및 이를 함유하는 기능성 생균제 - Google Patents

Abstract

축산농가에서 수거한 돼지 뇨로부터 다양한 미생물 선별배지를 이용하여 성장률이 우수하고, 악취를 감소시키며, 병원성 세균에 대한 길항력이 뛰어난 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) TS1을 분리·동정하였다. 이것은 병원성 세균, 특히 악취를 생성하는 세균의 증식을 억제하는 길항능력이 뛰어날 뿐만 아니라, 강한 프로테아제 활성과 내산성을 지니고 있어 생균제로의 유용성을 가진다.

Description

바실러스 서브틸리스 및 이를 함유하는 기능성 생균제{Bacillus subtilis TS1 and Thereof Probiotics}

본 발명은 신균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) TS1 및 이를 이용한 악취를 감소시키는 생균제(probiotics)에 관한 것이다.

축산분야에서 오폐수 처리시에 발생하는 악취는 상수도원을 위협할 뿐만 아니라, 이로 인한 주위환경에 많은 불쾌감을 준다. 이렇게 오폐수 및 생활 폐기물에서 발생하는 악취는 생활환경을 열악하게 하며, 축산농가의 악취는 축산발전을 막고 있는 현실이고, 농산물 증대를 위해 사용하는 농약은 우리들의 건전한 식생활을 위협하고 있어서 필히 개선해야할 분야이다.

즉 악취를 제거하기 위해 사용하는 화학적인 살균제는 악취원을 죽이므로 일시적으로 악취제거의 효과는 있으나 오폐수 처리에 유용한 미생물까지 제거하므로 후공정인 정화처리에 막대한 지장을 초래한다.

또한 농작물에 뿌린 살균제 등은 단기간의 효과는 있으나 장기간 사용하게 되면 토지에 축적되어 인간 식생활에 위험한 요소가 되므로 이러한 화학적 살균제 및 항균제로부터 환경친화적인 미생물 제품의 대체 재료개발이 시급한 실정이다.

또한 항생제의 사용이 가축의 질병치료는 물론 사료 이용률 재고라는 측면에서 지대한 공헌은 한 것은 사실이나, 이러한 항생제가 우유, 계란, 육류 등 축산물에 잔류하여 인체내 항생제 내성이라는 커다란 문제점을 야기시켰고, 최근에는 어떠한 항생제에도 내성을 갖는 슈퍼 박테리아가 출현하기에 이르렀다.

유럽의 일부 국가에서는 축산에 이용되는 항생제에 대한 규제를 강화하기 시작하였으며, 일부 항생제 품목을 사료에 첨가하지 못하도록 강력한 제제를 가하고 있는 실정이다. 따라서, 이러한 항생제의 대체제 개발이 필요하게 되었고, 현재 가장 많은 연구가 진행중인 것이 미생물을 이용한 생균제이다.

생균제란 장내 미생물 균형에 도움을 주는 미생물이나 물질 또는 가축의 장내 미생물 균총의 균형을 개선시키는 효과를 갖는 것으로 정의되고 있다. 생균제는 동물의 장내에 서식하면서 유해세균을 억제하고 설사를 예방하므로 가축사료의 이용률을 향상시키고 가축의 면역력을 어는 정도 증강시키는 효과가 있다.

현재 국내 항균제 시장을 보면, 수입제품을 비롯하여 여러 중소기업에서 다양한 생균제가 생산·판매되고 있지만, 이들 제품이 갖고 있는 가장 근본적인 문제점은 유용효소를 제대로 분비하지 못하고, 항균활성이 약하다는 점이다. 더욱 중요한 것은, 이들의 내산성이 약하여 동물의 장내에서 생존하지 못하므로, 분뇨에 살아 남아 분뇨의 악취를 제거하지 못한다는 점이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로 일반적인 생균제의 기능은 물론, 악취를 생성하는 미생물과 유해한 병원성 미생물에 대하여 강력한 항균활성을 갖는 동시에, 생균제가 체외로 배설되어 가축의 분뇨에서 발생하는 악취를 감소시킬 수 있는 고기능성 생균제의 유용성을 갖는 신규 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적은 돼지 오줌으로부터 신규 미생물을 분리·동정하고, 악취제거 및 생균제로서의 활성을 확인함으로써 완성하였다.

따라서, 본 발명은 신규 미생물 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) TS1을 제공한다. 또한, 상기 미생물을 포함하는 것을 특징으로 하는 악취를 감소시키는 기능성 생균제를 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 1.0% 아가로스 겔로 전기영동한 TS1 균주의 게놈 DNA에서 16S rRNA 프라이머를 이용한 PCR 결과이다.

도 2는 본 발명에 따른 16S rRNA 염기서열분석을 통해 분리된 박테리아의 속(genus)과 TS1의 유연관계를 나타낸 계통구조(phylogenetic tree)이다.

도 3은 본 발명에 따른 TS1 균주의 존재하에서 병원성세균의 시간대별 성장률이다.

도 4는 본 발명에 따른 TS1 균주의 병원성균에 대한 길항능력 시험 결과에 대한 사진이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

실시예 1. 균주의 분리

경기도와 충청도에 소재하고 있는 축산농가로부터 돼지의 오줌을 수거한 후, 다음과 같은 선택배지와 분류방법을 사용하여 균주를 분리하였다. 평판배지로 YMA 배지 (이스트 추출물(yeast extract) 3g/ℓ, 말트 추출물(malt extract) 3g/ℓ, 펩톤 (pepton) 5g/ℓ, 포도당(dextrose) 10g/ℓ, 아가(agar) 20g/ℓ, pH7.2), NA 배지 (펩톤 5g/ℓ, 아가 15g/ℓ, 비프 추출물(beef extract) 3g/ℓ, pH 6.8) 및 PDA 배지 (잘게 자른 감자(diced potato) 300g/ℓ, 포도당 20g/ℓ, 아가 15g/ℓ, PH 5.4)를 사용하였다. 배양은 NA 및 YMA 배지에서 37℃에서 24시간, PDA 배지에서 28℃에서 7일간 배양하였다. 배양이 끝난 후, 고체배지에 출현한 콜로니(colony)들의 순수분리를 위하여 검경하고, 색과 크기, 모양 등의 형태학적 수준에서 분류하였고, 이들 배지에서 우점하는 균주를 우선적으로 선택하여 임의로 레이블링(labeling)을 실시하였다.

상기 고체배지에서 우점하는 콜로니를 TS1으로 명명하였다. TS1의 순수한 단일 콜로니를 얻기 위하여 NA 배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다.

실시예 2. 균주의 동정

분리된 균주를 동정하기 위하여 광학현미경하에서 균주의 형태를 확인하였고, 그람 염색(Gram staning)을 실시하였다. 상기 균주의 게놈 DNA를 분리한 후, PCR(Perkin Elmer 480, USA)을 이용한 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 센스 프라이머(sense primer)로 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 안티센스 프라이머(antisense primer)로 5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3', 인터널 프라이머(internal primer)로 5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'을 이용하여 PCR을 이용하였다.

증폭된 16S rRNA는 PCR 정제키트(OIAGEN, Germany)를 사용하여 정제하였고, 서열은 SOLGENT에 의뢰하여 결정하였다 (도 1참조). 결정된 서열을 현재까지 알려진 속(genus) 내의 표준균주와 비교하였다.

그 결과 TS1은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 판명되었으며, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터(유전자은행)(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2002년 4월 18일에 각각 KCTC 10235BP 로 기탁하였다. Knuc 값을 구하여 evolutionary distance를 계산하였다. 이를 토대로 계통구조를 구성하였다(도 2 참조).

※바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) TS1 KCTC 10235BP의 특성

(1)형태 및 배양학적 특성

서브틸리스 스트립(Subtilis Strip)의 성분표 및 결과

번호	성 분	결과	번호	성 분	결과	번호	성 분	결과
0	Control	-	20	α-Methyl-D-mannoside	-	40	D-turanose	-
1	Grycerol	+	21	α-Methyl-D-glucoside	+	41	D lyxose	-
2	Erythritol	-	22	N-acethyl-glucosamine	-	42	D tagatose	-
3	D arabinose	-	23	Amygdalin	+	43	D fucose	-
4	L arabinose	+	24	Arbutin	+	44	L fucose	-
5	Ribose	+	25	Esculin	+	45	D arabitol	-
6	D xylose	+	26	Salicin	+	46	L arabitol	-
7	L xylose	-	27	Celobiose	+	47	Gluconate	-
8	Adonitol	-	28	Maltose	+	48	2-keto- gluconate	-
9	β-methyl- D-xylose	-	29	Lactose	-	49	5-Keto Gluconate	-
10	Galactose	-	30	Melibiose	-
11	Glucose	+	31	Sucrose	+
12	Fructose	+	32	Trehalose	+
13	Mannose	+	33	Inulin	+
14	Sorbose	-	34	Melezitose	-
15	Rhamnose	-	35	Raffinose	-
16	Dulcitol	-	36	Starch	+
17	Inositol	-	37	Glycogen	+
18	Mannitol	+	38	Xylitol	-
19	Sorbitol	+	39	Gentiobiose	+

(2)생리·생화학적 특성

악취제거의 효과를 위한 관능검사는 한 가지 항목(냄새)에 대하여 5개의 등급(1. 매우 심하다. 2. 심하다. 3. 보통이다. 4. 안난다. 5. 전혀 안난다.)으로 나누어 실시하였다. 성인 남성의 동일한 소변 15ml에 TS1 배양액 1ml을 원심분리하여 혼합하였다. 이 검사는 분뇨냄새를 전혀 접하지 않는 도시에서 성장한 한남대학교 대학원생 및 학부생 10명의 패널을 대상으로 2회 실시하였다. 관능검사의 결과 TS1을 첨가한 경우가 그렇지 않은 대조구보다 현격하게 악취가 줄었음이 판명되었다.

실시예 3. 병원성균 억제효과

상기 TS1 균주의 병원성균 성장억제 효과를 확인하기 위하여, 병원성 균으로는 대장균(E. coli)O157을 NB배지(펩톤 5g/ℓ, 비프 추출물 3g/ℓ, pH 6.8)와 Tergiol 7 아가(DIFCO) 배지를 사용하여 37℃, 150rpm에서 18시간 이상 배양한 후, 생균수 (1.0x106cfu/㎖ 이상)를 확인하였다.

사람의 뇨 150㎖와 상기 균주의 배양액 200㎖을 혼합하고, 병원성 균주 배양액을 약 600㎕ 첨가하여 배양하였다. TS1과 대장균 (E. coli) O157을 혼합하여 배양한 결과, 생존율은 40% 이하였다 (도 3 참조).

실시예 4. 프로테아제(protease) 활성

프로테아제의 활성을 확인하기 위하여 TS1 균주를 스킴 밀크 (Skim milk) 아가 배지 (펩톤 5g/ℓ, 아가 15g/ℓ, 비프 추출물 3g/ℓ, pH 6.8)에 도말한 후, 라벨을 붙이고, 37℃ 인큐베이터에서 배양하면서 투명환(clear zone)의 생성 유무를 관찰하였다. TS1은 10시간 후에 강한 활성을 나타냈다.

실시예 5. 병원성 세균의 길항능력

병원성균은 대장균 (E. coli) O157 이외에 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)과 스트렙토코커스 인터메디어스 (Streptococcus intermedius)를 추가로 사용하였다. 에세이(assay)는 Henry D. Isenberg 등(Clinical Microbiology Procedures Handbook, 1: 5,1-5.24, American Socuety for Microbiology, Washington D.C.)의 방법에 따라 수행하였으며, 페이퍼 디스크 (8mm, Toyo Roshi Kaisha, Japan)을 이용하여 억제환의 직경을 측정하였다. 분리균주는 NB 브로쓰에서, 병원성 균은 NB, Bennett's 브로쓰(포도당 10g/ℓ, 용해성 전분 10g/ℓ, 비프 추출물 1g/ℓ, pH 7.0), BHI 브로쓰 (brain heart infusion 37g/ℓ, pH 7.4)에서 배양하였고, 18시간 배양한 병원성 균액 (1.0x106cfu/㎖) 100㎕를 NA, Bennett's, BHI 아가 배지에 도말한 후 멸균된 디스크에 분리균 배양액, 상등액, 펠렛(pellet) 20㎕Tlr을 접종하여 24시간 배양하였다. 대조구는 멸균 증류수를 사용하였다.

TS1의 경우, 대장균 (E. coli) O157과 살모넬라 타이피뮤리움에 대하여 큰 길항활성을 나타냈고 (max:13mm, min:12mm), 스트렙토코커스 인터메디어스(Streptococcus intermedius)에 대해서도 큰 길항활성(max:13mm, mim:11mm)을 나타냈다. (도5 및 표1 참조). 따라서, 상기 TS1 균주를 가축의 장내에 투여할 경우, 병원성균과 같은 유해세균의 증식이 억제될 것이다.

병원성균 길항능력 시험에 사용된 균주들의 생균수 및 환(ring) 크기

시험균주106cfu/㎖	병원성균*(cfu/㎖)	길항능력(mm)
		배양액	상등액	펠렛200㎕	펠렛1000㎕	대조구
TS1	Sal	12	12	13	12
	E	13	12	12	12
	Strep	13	13	12	11

위 표에서 Sal:살모넬라 타이피뮤리움이고, E는 대장균(E. coli) O157이며, Sterp : 스트렙토코커스 인터메디어스(Streptococcus intermedius)를 나타낸다.

실시예 6. 내산성 확인

따라서, 상기 TS1 균주는 강한 내산성을 가지므로 이들이 분변으로 배출되어가축의 분뇨를 퇴비화시킬 수 있는 기능성 생균제로 유용할 것이다.

이상의 실시예에서 설명한 바와 같이 본 발명은 신규 미생물인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) TS1을 제공하며, 이것은 병원성 세균을 억제하는 길항능력이 뛰어날 뿐만 아니라, 강한 프로테아제 활성과 내산성을 지니고 있어 생균제로의 산업적 유용성을 가진다.

Claims (2)

1. 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) TS1 KCTC 10235BP.
2. 제1항의 미생물을 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제.