ES2961516T3 - Composiciones y métodos para elaborar (r)-reticulina y precursores de la misma - Google Patents

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Abstract

Métodos que pueden utilizarse para la fabricación del compuesto químico (R)-Reticulina y precursores de síntesis del mismo. También se proporcionan composiciones útiles para la síntesis de (R)-reticulina y precursores de síntesis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para elaborar (r)-reticulina y precursores de la misma
CAMPO DE LA DIVULGACIÓN
Las composiciones y métodos divulgados en la presente se refieren a metabolitos secundarios y procesos para la fabricación de los mismos. Más particularmente, la presente divulgación se refiere a (Rí-Reticulina y ciertos precursores de la misma y métodos y composiciones para la fabricación de (Rí-Reticulina y tales precursores.
ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN
Los párrafos siguientes se proporcionan a modo de antecedentes de la presente divulgación. Sin embargo, no suponen la admisión de que todo lo que en ellos se analiza sea estado de la técnica o forme parte de los conocimientos de los expertos en la técnica.
Las vías bioquímicas de los organismos vivos se clasifican comúnmente como parte o del metabolismo primario o como parte del metabolismo secundario. Las vías que forman parte del metabolismo primario de una célula viva están implicadas en el catabolismo para la producción de energía o en el anabolismo para la producción de bloques de construcción para la célula. Los metabolitos secundarios, por otro lado, son producidos por las células vivas sin tener ninguna función anabólica o catabólica obvia. Sin embargo, desde hace tiempo se reconoce que muchos metabolitos secundarios son útiles en muchos aspectos, por ejemplo como agentes terapéuticos o disuasorios naturales.
El metabolito secundario (Rí-Reticulina es producido por la adormidera(Papaver somniferum)y otros miembros de las familias de plantas Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae y Moraceae, y puede usarse como material de partida para producir compuestos farmacéuticamente activos que incluyen la morfina y la codeína.
Se sabe que la (Rí-Reticulina en planta se produce a partir de la (Sí-Reticulina. Sin embargo, no está claro qué genes y polipéptidos están implicados en la catalización de las reacciones de conversión.
Actualmente, la (Rí-Reticulina puede obtenerse de fuentes naturales, como la adormidera. Alternativamente, la (Rí-Reticulina puede prepararse sintéticamente. Sin embargo, los métodos actuales de fabricación de (Rí-Reticulina tienen un bajo rendimiento y/o son caros. No existen métodos para fabricar biosintéticamente (Rí-Reticulina a partir de (S)-Reticulina. Por lo tanto, en la técnica existe una necesidad de métodos mejorados para la síntesis de (Rí-Reticulina.
Desgagné-Penix et al. (BMC Plant Biol, 2010, 10:252) describen análisis del transcriptoma y del proteoma de genes implicados en el metabolismo de alcaloides en cultivos celulares de adormidera, en particular en la vía biosintética que produce sanguinarina y morfina. La WO 00/58333 A1 se refiere a la codeinona reductasa, una enzima implicada en el metabolismo de la (R)-Reticulina en plantas alcaloides de adormidera. La WO 2015/173590 A1 describe un polipéptido citocromo P450 dePapaver somniferum.Unterlinner et al. (The Plant Journal, 1995, 18: 465 475) describe la clonación y expresión funcional de una codeinona reductasa dePapaver somniferum.
SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN
Se pretende que los siguientes párrafos introduzcan al lector en la descripción más detallada que sigue y no que definan o limiten la materia reivindicada de la presente divulgación.
La presente divulgación se refiere al metabolito secundario (Rí-Reticulina y ciertos precursores del mismo, así como a métodos de elaboración de (Rí-Reticulina y ciertos precursores de la misma.
La invención proporciona un método para preparar (Rí-Reticulina que comprende:
(a) proporcionar un ácido nucleico quimérico que comprenda como componentes operativamente enlazados:
(i) una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido del citocromo P450 (CYP450) que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 85% a la SEQ ID NO: 325; (ii) una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de aldo-cetorreductasa (AKR) que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 327; y (iii) una o más secuencias de ácidos nucleicos capaces de controlar la expresión en una célula de levadura; y
(b) introducir el ácido nucleico quimérico en una célula de levadura y cultivar la célula de levadura para producir el polipéptido CYP450 y el polipéptido AKR y para producir (Rí-Reticulina; y
(c) recuperar la (Rj-Reticulina.
La invención también proporciona un vector de expresión recombinante que comprende como componentes operativamente enlazados (a) una secuencia de ácidos nucleicos capaz de controlar la expresión en una célula de levadura; y (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica: (i) un polipéptido CYP450 que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 325 y que es capaz de oxidar (S)-Reticulina para formar 1,2-dehidroticulina; y (ii) un polipéptido AKR que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 327 y que es capaz de reducir 1,2-dehidroticulina para formar (R) -Reticulina; en donde el vector de expresión es adecuado para la expresión en la célula de levadura.
La invención proporciona además una célula huésped de levadura que comprende un ácido nucleico quimérico que comprende como componentes operativamente enlazados (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido CYP450 que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 325 y que es capaz de oxidar (S)-Reticulina para formar 1,2-dehidroticulina; y (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AKR que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 327 y que es capaz de reducir 1,2-dehidroticulina para formar (R)-Reticulina.
La invención proporciona además un método de fabricación de (Rj-Reticulina en una célula de levadura que comprende: (a) proporcionar (Sj-Reticulina; (b) poner en contacto la (Sj-Reticulina con una mezcla enzimática capaz de convertir (S)-Reticulina en (R)-Reticulina en condiciones que permitan la conversión de (S)-Reticulina en (R)-Reticulina en una célula de levadura, en donde la mezcla enzimática comprende un primer polipéptido capaz de oxidar (S) -Reticulina para formar 1,2-dehidroticulina y un segundo polipéptido capaz de reducir la 1,2-dehidroticulina para formar (R)-Reticulina, y en donde el primer polipéptido es un polipéptido CYP450 que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 325 y el segundo polipéptido es un polipéptido AKR que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 327.
La mezcla enzimática comprende un primer polipéptido capaz de oxidar (S)-Reticulina para formar 1,2-Dehidro-Reticulina y un segundo polipéptido capaz de reducir 1,2-Dehidro-Reticulina para formar (R)-Reticulina.
El primer polipéptido capaz de oxidar el derivado de bencilisoquinolina para formar el derivado de bencilisoquinolina oxidado es un citocromo P450 y el segundo polipéptido capaz de reducir el derivado de bencilisoquinolina oxidado para formar (R)-Reticulina es una aldo-ceto reductasa (AKR).
El método para preparar o elaborar (R)-Reticulina se lleva a caboin vivoen una célula de levadura.
Se proporciona además un método para preparar (Rj-Reticulina que comprende:
(a) proporcionar una secuencia quimérica de ácido nucleico que comprende como componentes operativamente enlazados
(i) una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido CYP450 que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 85% a la SEQ ID NO: 325;
(ii) una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AKR que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 327; y
(iii) una o más secuencias de ácidos nucleicos capaces de controlar la expresión en una célula de levadura;
(b) introducir la secuencia quimérica de ácido nucleico en la célula de levadura y cultivar la célula de levadura para producir el polipéptido CYP450 y el polipéptido AKR y para producir (Rj-Reticulina; y
(c) recuperar la (Rj-Reticulina.
En realizaciones preferidas, la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos se enlazan operativamente para producir un polipéptido de fusión que comprende CYP450 y AKR.
Las composiciones pueden comprender secuencias de ácidos nucleicos que codifican un primer polipéptido capaz de oxidar (Sj-Reticulina para formar 1,2-Dehidro-Reticulina y un segundo polipéptido capaz de reducir 1,2-Dehidroreticulina para formar(Rj-Reticulina, es decir una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un citocromo P450 y una aldo-ceto reductasa, capaces conjuntamente de oxidar (Sj-Reticulina para formar 1,2-Dehidroticulina y un segundo polipéptido capaz de reducir 1,2-Dehidroticulina para formar (Rj-Reticulina.
Otras características y ventajas de la presente divulgación resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, aunque indica implementaciones preferidas de la divulgación, se proporciona sólo a modo de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención, que se define en las reivindicaciones anexas, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La divulgación se describe en los párrafos proporcionados en la presente en lo sucesivo en relación con sus Figuras. Las Figuras proporcionadas en la presente se proporcionan con propósitos ilustrativos y no se pretende que limiten la presente divulgación.
LaFIGURA 1representa la vía de síntesis de varios precursores de bencilisoquinolina a (RJ-Reticulina, precursores de (RJ-Reticulina, morfina y salutaridina. Se incluyen las estructuras químicas de los compuestos mostrados. LaFIGURA 2representa una vía de síntesis para la fabricación de (RJ-Reticulina a partir de (SJ-Reticulina y sus productos intermedios de síntesis de la misma. Se incluyen las estructuras químicas de los productos intermedios de síntesis y las enzimas capaces de catalizar la conversión química de los productos intermedios de síntesis. LaFIGURA 3representa una serie de trazas de HPLC de una realización de la divulgación que proporciona la conversión de (SJ-Reticulina a (RJ-Reticulina como se describe adicionalmente en el Ejemplo 1.
LaFIGURA 4representa una serie de trazas de HPLC de una realización de la divulgación que proporciona la conversión de (SJ-Reticulina a 1,2-Dehidro-Reticulina como se describe adicionalmente en el Ejemplo 2.
LaFIGURA 5representa una serie de trazas de HPLC de una realización de la divulgación que representa la conversión de 1,2-Dehidroreticulina a (RJ-Reticulina como se describe adicionalmente en el Ejemplo 3.
LaFIGURA 6representa una serie de trazas de HPLC de una realización de la divulgación que representa la conversión de (sJ-N-metilcoclaurina a (RJ-N-metilcoclaurina como se describe adicionalmente en el Ejemplo 4. LaFIGURA 7representa los resultados obtenidos en relación con un experimento de silenciamiento génico descrito en el Ejemplo 5. El objetivo fueron dos regiones diferentes del genREPI(FIG. 7A; FIG. 7C)y una región del genCOR1.3(FIG. 7B). En cadaFIG. 7A-7Clos diferentes paneles representan lo siguiente:(Panel A)Fragmento (recuadro gris) del ADNc deREPIoCOR1.3usado para ensamblar el constructo pTRV2. El recuadro negro representa la región codificante, mientras que las líneas negras son las regiones no traducidas flanqueantes. Las flechas representan los sitios de apareamiento de los cebadores usados para el análisis qRT-PCR.(Panel B)Geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio que representan la detección del vector pTRV2 mediante RT-PCR usando ARN total extraído de plantas individuales infiltradas conAgrobacterium tumefaciensque albergan los constructos pTRV2-REPI-a, pTRV2-REPI-5', o pTRV2-COR1.3, o el control de vector vacío pTRV2. Los cebadores de PCR (TRV2-MCS) se diseñaron para aparearse en las regiones que flanquean el sitio de clonación múltiple (MCS) de pTRV2.(Panel C)Niveles relativos de transcripciónREPIoCOR1.3en los tallos y raíces de plantas silenciadasREPI(pTRV2-REPI-a; pRTV2-REPI-5') o silenciadasCOR1.3(pRTV2-COR1.3) en comparación con los controles (pTRV2).(Panel D)Cromatogramas de iones totales que muestran los perfiles de alcaloides principales de plantas silenciadas porREPI(pTRV2-REPI-a; pRTV2-REPI-5') o silenciadas por COR1.3 (pRTV2-COR1.3) en comparación con controles (pTRV2).(Panel E)Abundancia relativa de los principales alcaloides del látex, y otros alcaloides que muestran niveles suprimidos en plantas silenciadas porREPI(pTRV2-REPI-a; pRTV2-REPI-5') o silenciadas por COR1.3 (pRTV2-COR1.3) en comparación con los controles (pTRV2).(Panel F)Relación entre (SJ-Reticulina y (RJ-Reticulina en plantas silenciadas conREPI(pTRV2-REPI-a; pRTV2-REPI-5') o silenciadas con COR1.3 (pRTV2-COR1.3) en comparación con los controles (pTRV2). Los asteriscos indican diferencias significativas determinadas usando una pruebat deStudent no apareada de dos colas (p <0,05). Las barras representan la media ± desviación estándar de los valores obtenidos a partir de 3 réplicas técnicas para cada una de las 6 plantas infiltradas individualmente.
LaFIGURA 8representa los resultados obtenidos al evaluar la actividad del polipéptido AKR en presencia de agentes reductores y oxidantes, como se describe con más detalle en el Ejemplo 6. LaFIG. 8Amuestra la actividad del componente 1,2-Dehidroticulina reductasa (PsDRR) dePapaver somniferumReticulina epimerasa (REPI). En presencia de NADH o NADPH, la PsDRR convierte la 1,2-Dehidroreticulina [1] en (R)-Reticulina [2] (FIG.8A, Panel A). En presencia de NAD+ o NADP+, la PsDRR convierte la (RJ-Reticulina [2] en 1,2-Dehidroticulina [1](FIG. 8A, Panel B). LaFIG. 8Bmuestra la actividad de la 1,2-Dehidroticulina reductasa (PrDRR) dePapaver rhoeas.En presencia de NADH o NADPH, la PrDRR convierte la 1,2-dehidroticulina [1] en (R)-Reticulina [2] (FIG. 8B, Panel A). En presencia de NAD+ o NADP+, la PrDRR convierte la (RJ-Reticulina [2] en 1,2-dehidroticulina [1](FIG. 8B, Panel B).
LaFIGURA 9representa los resultados obtenidos cuando se evalúa la dependencia del pH del polipéptido CYP450 y AKR, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 7. Se representan los resultados obtenidos usandoPapaver somniferumCYP450 (PsDRS) y AKR en presencia de NADPH (PsDRS directo) y en presencia de NADP+ (PsDRS inverso) (Panel A). Se muestran adicionalmente los resultados obtenidos usandoPapaver rhoeasCYP450 (PrDRS) y AKR en presencia de NADPH (PrDRS directo) y en presencia de NADP+ (PrDRS inverso) (Panel B). LaFIGURA 10representa la cosupresión de los niveles de transcripción deREPIyCORen plantas de adormidera sometidas a silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) como se describe adicionalmente en el Ejemplo 8. Las plantas en las que el silenciamiento deCORes el objetivo (pTRV2-COR1.3) mostraron una supresión significativa deCOR(FIG. 10 -panel inferior), y adicionalmente mostraron supresión deREPI(FIG. 10- panel superior). Las plantas en las que el objetivo era el silenciamiento deREPIusando una región conservada que se encuentra tanto enREPIcomo enCOR(pTRV2-REPIa) también mostraron una supresión significativa deCOR(FIG. 10 -panel inferior) y REPI (FIG. 10 -panel superior). Las plantas en las que el objetivo era el silenciamiento deREPIusando una región única de REPI (pTRV2-REPIb), una región que no se encuentra también enCOR,no mostraron el cosilenciamiento deCOR(FIG. 10 -panel inferior). pTRV2 es el control de vector vacío. Los asteriscos indican valores que son significativamente diferentes en comparación con los controles mediante una prueba t de Student no apareada (P < 0,05). Las barras de error representan la media ± desviación estándar.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN
A continuación se describirán varias composiciones y métodos para proporcionar un ejemplo de una realización de cada materia reivindicada. Ninguna realización descrita a continuación limita cualquier materia reivindicada y cualquier materia reivindicada puede abarcar métodos, procesos, composiciones o sistemas que difieran de los descritos a continuación. La materia reivindicada no se limita a composiciones o métodos que tengan todas las características de cualquier composición, método, sistema o proceso descrito a continuación o a características comunes a múltiples o a todas las composiciones, sistemas o métodos descritos a continuación. Es posible que una composición, sistema, método o proceso descrito a continuación no sea una realización de cualquier materia reivindicada. Cualquier materia divulgada en una composición, sistema, método o proceso descrito a continuación que no se reivindique en este documento puede ser objeto de otro instrumento protector, por ejemplo, una solicitud de patente en curso, y los solicitantes, inventores o propietarios no pretenden abandonar, renunciar o dedicar al público ninguna de tales materias mediante su divulgación en el presente documento.
Cabe señalar que los términos de grado como "sustancialmente", "esencialmente", "alrededor de" y "aproximadamente", como se usan en la presente, significan una desviación razonable del término modificado de tal manera que el resultado final no cambie significativamente. Debe interpretarse que estos términos de grado incluyen una desviación del término modificado si esta desviación no anula el significado del término que modifica.
Como se usa en la presente, se pretende que la expresión "y/o" represente un -o- inclusivo. Es decir, se pretende que "X y/o Y" signifique X o Y o ambos, por ejemplo. Como ejemplo adicional, se pretende que "X, Y, y/o Z" signifique X o Y o Z o cualquier combinación de los mismos.
Como se ha mencionado anteriormente en la presente, la presente divulgación se refiere al metabolito secundario (RJ-Reticulina y precursores de la misma, así como a métodos de elaboración de (RJ-Reticulina y precursores de la misma. La presente divulgación se refiere además a ciertas enzimas capaces de catalizar reacciones que dan como resultado la conversión de (S)-Reticulina para formar (RJ-Reticulina. Los métodos proporcionados en la presente representan un medio novedoso y eficiente de fabricar (RJ-Reticulina y precursores de la misma. Los métodos proporcionados en la presente no dependen de la síntesis química y pueden llevarse a cabo a escala comercial. Según el mejor conocimiento de los inventores, la presente divulgación proporciona por primera vez una metodología para fabricar (RJ-Reticulina y precursores de la misma usando células vivas que normalmente no son capaces de sintetizar (RJ-Reticulina y precursores de la misma. Tales células pueden usarse como fuente de la que extraer (RJ-Reticulina y precursores de la misma económicamente. La (RJ-Reticulina y precursores de la misma producidos de acuerdo con la presente divulgación son útiles, entre otras cosas, en la fabricación de composiciones farmacéuticas que incluyen morfina y codeína.
Definiciones
El término "derivado de bencilisoquinolina", como se usa en la presente, se refiere a compuestos que tienen la fórmula química (VII):
en donde R<1>, R<2>, R<3>y R<4>son cada uno, independiente o simultáneamente, un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alquilo (por ejemplo C<1>-C<10>-alquilo) o un grupo alcoxi (por ejemplo C<1>-C<10>-alcoxi), y en donde R<5>representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (por ejemplo C<1>-C<10>-alquilo).
El término "precursor de (RJ-Reticulina", como se usa en la presente, se refiere a un compuesto que tiene la fórmula química (VIII):
en donde Ri, R<2>, R<3>y R<4>son cada uno, independiente o simultáneamente, un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alquilo (por ejemplo C<1>-C<10>-alquilo) o un grupo alcoxi (por ejemplo C<1>-C<10>-alcoxi), y en donde R<5>representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (por ejemplo C<1>-C<10>-alquilo), con la salvedad de que la fórmula química (II) exceptúa (RJ-Reticulina, es decir. se exceptúa específicamente del término precursor de (R)-Reticulina, como se usa en la presente, el compuesto químico en el que R<1>es un grupo metoxi; R<2>es un grupo hidroxilo, R<3>es un grupo hidroxilo, R<4>es un grupo metoxi y R<5>es un grupo metilo.
El término "(SJ-Reticulina", como se usa en la presente, se refiere al enantiómero (S) de la Reticulina y a un compuesto químico que tiene la estructura química (III):
El término "derivado de bencilisoquinolina oxidado" se refiere a un compuesto que tiene la fórmula química (IX):
en donde R<1>, R<2>, R<3>y R<4>son cada uno, independiente o simultáneamente, un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alquilo (por ejemplo C<1>-C<10>-alquilo) o un grupo alcoxi (por ejemplo C<1>-C<10>-alcoxi), y en donde R<5>representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (por ejemplo C<1>-C<10>-alquilo).
El término "(RJ-Reticulina", como se usa en la presente, se refiere al enantiómero(R)de la Reticulina y a un compuesto químico que tiene la estructura química (V):
El término "1,2-Dehidroreticulina", como se usa en la presente, se refiere a un compuesto químico que tiene la estructura química (VI):
Los términos "vía de la (RJ-Reticulina" o "vía de síntesis de la (RJ-Reticulina", que pueden usarse indistintamente en la presente, se refieren a la vía metabólica para la síntesis de la (RJ-Reticulina representada en laFIG. 1.Cuando se hace referencia a un primer compuesto químico dentro de la vía de la (R)-Reticulina como"" de un segundo compuesto químico en la vía, se entiende que la síntesis del primer compuesto químico precede a la síntesis del segundo compuesto químico. A la inversa, cuando se hace referencia a un primer compuesto químico como "en sentido descendente" de un segundo compuesto químico en la vía de la (RJ-Reticulina, se entiende que la síntesis del segundo compuesto químico precede a la síntesis del primer compuesto químico.
El término "mezcla enzimática", como se usa en la presente, se refiere a una mezcla que comprende una o dos o más enzimas. Cabe señalar que en las mezclas que contienen dos o más enzimas, las enzimas pueden ser biológicamente activas independientemente sin interacción o coordinación para formar la mezcla. En una realización, las enzimas contenidas en la mezcla enzimática pueden asociarse o interactuar como cadenas polipeptídicas no contiguas independientes. En otra realización, la mezcla enzimática puede prepararse como un polipéptido de fusión entre dos polipéptidos.
Los términos "citocromo P450", "CYP450" o "P450", que pueden usarse indistintamente en la presente, se refieren a todas y cada una de las enzimas que comprenden una secuencia de residuos de aminoácidos que es (i) sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier polipéptido CYP450 expuesto en la presente incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID NO: 219 a SEQ.ID NO: 321; SEQ.ID NO: 325; y SEQ.ID NO: 338, o (ii) codificada por una secuencia de ácidos nucleicos capaz de hibridar en condiciones por lo menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifique cualquier polipéptido CYP450 expuesto en la presente, pero para el uso de codones sinónimos.
Los términos "aldo-ceto reductasa" o "AKR", que pueden usarse indistintamente en la presente, en referencia a cualquiera y todas las enzimas que comprenden una secuencia de residuos de aminoácidos que es (i) sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos que constituyen cualquier polipéptido AKR expuesto en la presente incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID NO: 59 a SEQ.ID NO: 115; SEQ.ID NO: 327; SEQ.ID NO: 329; SEQ.ID NO: 330; y SEQ.ID NO: 340, o (ii) codificada por una secuencia de ácidos nucleicos capaz de hibridar en condiciones por lo menos moderadamente estrictas con cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifique cualquier polipéptido AKR expuesto en la presente, pero para el uso de codones sinónimos.
El término "secuencia de ácidos nucleicos", como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de monómeros de nucleósidos o nucleótidos que consiste en bases, azúcares y enlaces interazúcares (estructura principal) de origen natural. El término también incluye secuencias modificadas o sustituidas que comprenden monómeros de origen no natural o partes de los mismos. Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente divulgación pueden ser secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) o secuencias de ácido ribonucleico (ARN) y pueden incluir bases de origen natural como adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo. Las secuencias también pueden contener bases modificadas. Los ejemplos de tales bases modificadas incluyen aza y deaza adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo, y xantina e hipoxantina.
Los términos "secuencia de ácidos nucleicos que codifica CYP450" y "secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido CYP450", usados indistintamente en la presente, se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido CYP450 incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID NO: 116 a SEQ.ID NO: 218; SEQ.ID NO: 324; y SEQ.ID NO: 337. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido CYP450 incluyen además todas y cada una de las secuencias de ácidos nucleicos que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias de polipéptidos CYP450 expuestas en la presente; o (ii) hibridan con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos CYP450 expuestas en la presente en condiciones de hibridación por lo menos moderadamente estrictas o que hibridarían con las mismas en condiciones por lo menos moderadamente estrictas de no ser por el uso de codones sinónimos.
Los términos "secuencia de ácidos nucleicos que codifica AKR" y "secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AKR" usados indistintamente en la presente, se refieren a todas y cada una de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido AKR incluyendo, por ejemplo, SEQ.ID NO: 1 a SEQ.ID NO: 58; SEQ.ID NO: 326; SEQ.ID NO: 328; y SEQ.ID NO: 339. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido AKR incluyen además todas y cada una de las secuencias de ácidos nucleicos que (i) codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos a las secuencias de polipéptidos AKR expuestas en la presente; o (ii) hibridan con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos AKR expuestas en la presente en condiciones de hibridación por lo menos moderadamente estrictas o que hibridarían con ellas en condiciones por lo menos moderadamente estrictas de no ser por el uso de codones sinónimos.
Por el término "sustancialmente idénticas" se entiende que dos secuencias polipeptídicas son preferiblemente por lo menos un 70% idénticas, más preferiblemente por lo menos un 85% idénticas y más preferiblemente por lo menos un 95% idénticas, por ejemplo un 96%, 97%, 98% o 99% idénticas. Para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptídicas se alinean las secuencias de aminoácidos de dichas dos secuencias usando, por ejemplo, el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443), revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482), de tal manera que se obtenga la coincidencia de mayor orden entre las dos secuencias y se determine el número de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias. Los métodos para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos son generalmente reconocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos por Carillo y Lipton (SIAM J. Applied Math., 1988, 48:1073) y los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects. En general, se emplearán programas informáticos para tales cálculos. Los programas informáticos que pueden usarse a este respecto incluyen, entre otros, GCG (Devereux et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12: 387) Bl a St P, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Molec. Biol., 1990:215:403). Un método particularmente preferido para determinar el porcentaje de identidad entre dos polipéptidos implica el algoritmo Clustal W (Thompson, J D, Higgines, D G y Gibson T J, 1994, Nucleic Acid Res 22(22): 4673-4680 junto con la matriz de puntuación b Lo SUM 62 (Henikoff 5 & Henikoff, J G, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 usando una penalización de apertura de huecos de 10 y una penalización de extensión de huecos de 0,1, de manera que la coincidencia de orden más alto obtenida entre dos secuencias en donde por lo menos el 50% de la longitud total de una de las dos secuencias está implicada en el alineamiento.
Por "condiciones de hibridación por lo menos moderadamente estrictas" se entiende que se seleccionan condiciones que promueven la hibridación selectiva entre dos moléculas de ácidos nucleicos complementarias en solución. La hibridación puede producirse en la totalidad o en una parte de una molécula de secuencia de ácidos nucleicos. La parte tiene típicamente por lo menos 15 (por ejemplo, 20, 25, 30, 40 o 50) nucleótidos de longitud. Los expertos en la técnica reconocerán que la estabilidad de un dúplex de ácidos nucleicos, o híbridos, está determinada por la Tm, que en tampones que contienen sodio es una función de la concentración de iones sodio y la temperatura (Tm=81,5° C.-16,6 (Log10 [Na+])+0,41(% (G+C)-600/l), o ecuación similar). Por consiguiente, los parámetros de las condiciones de lavado que determinan la estabilidad híbrida son la concentración de iones de sodio y la temperatura. Para identificar moléculas que sean similares, pero no idénticas, a una molécula de ácido nucleico conocida, puede suponerse que un malapareamiento del 1% da como resultado una disminución de aproximadamente 1° C en la Tm, por ejemplo, si se buscan moléculas de ácidos nucleicos que tengan una identidad >95%, la temperatura de lavado final se reducirá en aproximadamente 5° C. Basándose en estas consideraciones, los expertos en la técnica podrán seleccionar fácilmente las condiciones de hibridación apropiadas. Pueden seleccionarse condiciones de hibridación estrictas. A modo de ejemplo, pueden emplearse las siguientes condiciones para lograr una hibridación estricta: hibridación a 5x cloruro sódico/citrato sódico (SSC)/5xsolución de Denhardt/1,0% SDS a Tm (sobre la base de la ecuación anterior) -5° C, seguido de un lavado de 0.2xSSC/0,1% SDS a 60° C. Las condiciones de hibridación moderadamente estrictas incluyen un paso de lavado en 3xSSC a 42° C. Se entiende, sin embargo, que pueden lograrse condiciones equivalentes usando tampones, sales y temperaturas alternativos. Información adicional referente a las condiciones de hibridación pueden encontrarse en: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 6 Sons, N.Y., 1989, 6.3.1.-6.3.6 y en: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol. 3.
El término "quimérico", como se usa en la presente en el contexto de las secuencias de ácidos nucleicos, se refiere a por lo menos dos secuencias de ácidos nucleicos enlazadas que no están enlazadas de manera natural. Las secuencias de ácidos nucleicos quiméricas incluyen secuencias de ácidos nucleicos enlazadas de diferentes orígenes naturales. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos que constituye un promotor de levadura unido a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína COR se considera quimérica. Las secuencias de ácidos nucleicos quiméricas también pueden comprender secuencias de ácidos nucleicos del mismo origen natural, siempre que no estén enlazadas de manera natural. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos que constituye un promotor obtenido a partir de un tipo celular particular puede estar enlazada a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido obtenido a partir de ese mismo tipo celular, pero no normalmente enlazada a la secuencia de ácidos nucleicos que constituye el promotor. Las secuencias de ácidos nucleicos quiméricas también incluyen secuencias de ácidos nucleicos que comprenden cualquier secuencia de ácidos nucleicos de origen natural enlazada a cualquier secuencia de ácidos nucleicos de origen no natural.
Los términos "sustancialmente puro" y "aislado", que pueden usarse indistintamente en la presente, describen un compuesto, por ejemplo, un producto intermedio de síntesis de una vía o un polipéptido, que se ha separado de los componentes que lo acompañan de manera natural. Típicamente, un compuesto es sustancialmente puro cuando por lo menos el 60%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 90%, 95%, 96%, 97%, o 98%, y lo más preferible por lo menos el 99% del material total (por volumen, por peso húmedo o seco, o por porcentaje molar o fracción molar) en una muestra es el compuesto de interés. La pureza puede medirse mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, en el caso de polipéptidos, por cromatografía, electroforesis en gel o análisis HPLC.
El término "recuperado", como se usa en la presente en asociación con una enzima o proteína, se refiere a una forma más o menos pura de la enzima o proteína.
El término"in vivo"como se usa en la presente para describir métodos de elaboración de (Rí-Reticulina o un precursor de (Rí-Reticulina se refiere a poner en contacto un derivado de bencilisoquinolina con una enzima capaz de catalizar la conversión del derivado de bencilisoquinolina dentro de una célula viva (es decir, una célula de levadura) para formar (Rí-Reticulina o un precursor de (Rí-Reticulina.
El término"in vitro"como se usa en la presente para describir métodos de elaboración de (Rí-Reticulina o un precursor de (Rí-Reticulina se refiere a poner en contacto un derivado de bencilisoquinolina con una enzima capaz de catalizar la conversión del derivado de bencilisoquinolina en un entorno fuera de una célula viva incluyendo, sin limitación, por ejemplo, en una placa de micropocillos, un tubo, un matraz, un vaso de precipitados, un tanque, un reactor y similares, para formar (Rí-Reticulina o un precursor de (Rí-Reticulina.
Implementación general
Síntesis de (R)-Reticulina y precursores de (R)-Reticulina
Para el compuesto conocido como (Sí-Reticulina consultar:FIG. 1;compuesto (III).
Se proporciona un método de elaboración de (Rí-Reticulina que comprende:
(a) proporcionar (Sí-Reticulina; y
(b) poner en contacto la (Sí-Reticulina con una mezcla enzimática capaz de convertir la (Sí-Reticulina en (Rí-Reticulina en condiciones que permitan la conversión de la (Sí-Reticulina en (Rí-Reticulina, en donde la mezcla enzimática comprende un primer polipéptido capaz de oxidar (Sí-Reticulina para formar 1,2-Dehidroreticulina y un segundo polipéptido capaz de reducir 1,2-Dehidroreticulina para formar (Rí-Reticulina (ver:FIG. 2), y en donde el primer polipéptido es un polipéptido CYP450 que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 325 y el segundo polipéptido es un polipéptido AKR que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 327.
En realizaciones particularmente preferidas, los polipéptidos AKR se obtienen o pueden obtenerse deP. somniferum, P. bracteatumyP. rhoeas.
En ciertas realizaciones, el primer y el segundo polipéptidos se proporcionan en forma de dos polipéptidos separados, es decir, polipéptidos que no están conectados por enlaces químicos covalentes. En ciertas realizaciones preferidas, el primer y el segundo polipéptidos se preparan como un polipéptido de fusión que comprende una primera porción que codifica un polipéptido CYP450 y una segunda porción que codifica un polipéptido AKR. Dicho polipéptido de fusión puede prepararse recombinantemente o puede usarse un polipéptido de fusión de origen natural.
Los ejemplos de un polipéptido CYP450 incluyen los polipéptidos expuestos en las SEQ.ID NO: 219 a SEQ.ID NO: 321; SEQ.ID NO: 325; y SEQ.Id NO: 338. Los ejemplos de polipéptidos AKR incluyen los polipéptidos expuestos en las SEQ.ID NO: 59 a SEQ.ID NO: 115; SEQ.ID NO: 327; SEQ.ID NO: 329; SEQ.ID NO: 330: y SEQ.ID NO: 340.
Las reacciones anteriores se llevan a cabo en condiciones que permiten la conversión del precursor de bencilisoquinolina en (Rí-Reticulina. Las condiciones incluyen condicionesin vivooin vitro,como se detalla adicionalmente en la presente más adelante. Las condiciones incluyen además típicamente la presencia de agua y agentes de tamponamiento. Además se incluyen típicamente un agente reductor para permitir una reacción de reducción que dé como resultado la conversión del precursor de bencilisoquinolina oxidado en (Rí-Reticulina. El agente reductor puede ser nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), y en otras realizaciones, el agente reductor es nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH). Además típicamente en la reacción se incluye una reductasa capaz de reducir la enzima que convierte la bencilisoquinolina derivado en la bencilisoquinolina oxidada y un agente reductor. En realizaciones preferidas, la reductasa es una citocromo P450 reductasa, como por ejemplo la citocromo P450 reductasa de adormidera, capaz de reducir CYP450, y el agente reductor es NADH, o más preferiblemente, NADPH. Se observa además que las reacciones pueden llevarse a cabo a varios pH, por ejemplo, a aproximadamente pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH, 9 o pH 10. Estará claro para los expertos en la técnica que puede identificarse un pH óptimo para una reacción llevando a cabo la reacción a un intervalo de diferentes pH y evaluando la velocidad de reacción, como se ilustra en el Ejemplo 7 de la presente. El pH óptimo puede variar dependiendo, por ejemplo, del sustrato y la enzima seleccionados de acuerdo con la presente. Por tanto, a modo de ejemplo solamente, el Ejemplo 7 documenta un pH óptimo de aproximadamente pH 8 para la conversión de (S)-Reticulina en 1,2-Dehidroticulina, un pH óptimo de aproximadamente pH 7 para la conversión de 1,2-Dehidroticulina en (R)-Reticulina, y un pH óptimo de aproximadamente pH 9 para la conversión de (R)-Reticulina en 1,2-Dehidroticulina.
Se observa que, de acuerdo con la presente, dependiendo de las condiciones de reacción seleccionadas, la reacción que implica la conversión de 1,2-Dehidroreticulina a (Rí-Reticulina puede invertirse, o invertirse parcialmente. Por tanto, como se documenta en el Ejemplo 6, la Rí-Reticulina puede convertirse en 1,2-DehidroReticulina. Tal método para elaborar 1,2-Dehidroreticulina puede comprender:
(a) proporcionar Rí-Reticulina; y
(b) Poner en contacto Rí-Reticulina con un polipéptido AKR capaz de convertir (Rí-Reticulina en 1,2-Dehidroticulina en condiciones que permitan la conversión de (Rí-Reticulina en 1,2-Dehidroticulina. Los polipéptidos AKR que pueden usarse para llevar a cabo la reacción anterior incluyen cualquier polipéptido expuesto en las SEQ.ID NO: 59 a SEQ.ID NO: 115; SEQ.ID NO: 327; SEQ.ID NO: 329; SEQ.ID NO: 330; y SEQ.ID NO: 340. Las condiciones de reacción que permiten la conversión incluyen la presencia en la mezcla de reacción de un agente oxidante, preferentemente NAD+ o NADP+. Como se ha indicado anteriormente, el pH de la reacción puede optimizarse. La reversibilidad de la reacción anterior se ilustra adicionalmente en laFIG. 2
El primer polipéptido capaz de oxidar el derivado bencilisoquinolina para formar el derivado de bencilisoquinolina oxidado 1,2-dehidroticulina es un citocromo P450 y el segundo polipéptido capaz de reducir el derivado bencilisoquinolina oxidado para formar Rí-Reticulina es una aldo-ceto reductasa (AKR). En realizaciones particularmente preferidas, la AKR se obtiene de o puede obtenerse deP. somniferum, P. bracteatumyP. rhoeas.
En ciertas realizaciones, el primer y el segundo polipéptidos se proporcionan en forma de dos polipéptidos separados, es decir, polipéptidos que no están conectados por enlaces químicos covalentes. En ciertas realizaciones preferidas, el primer y el segundo polipéptidos se preparan como un polipéptido de fusión que comprende una primera porción que codifica un polipéptido CYP450 y una segunda porción que codifica un polipéptido AKR. Dicho polipéptido de fusión puede prepararse recombinantemente, o puede usarse un polipéptido de fusión de origen natural.
Los ejemplos de un polipéptido CYP450 que puede usarse de acuerdo con la presente divulgación incluyen polipéptidos CYP450 que pueden obtenerse de varias especies dePapaver,incluyendoPapaver somniferum, Papaver rhoeasyPapaver bracteatum;especies deArgemone,incluyendoArgemone mexicana;especies de Berberis, incluyendo especies deBerberis thunbergii; Corydalis,incluyendoCorydalis chelantifolia; Chelidonium,incluyendoChelidonium majus; Cissampelos,incluyendoCissampelos mucronata;especies deCocculus,incluyendoCocculus trilobus;especies deCorydalis,incluyendoCorydalis chelantifolia;especies deGlaucium,incluyendoGlaucium flavum;especies deHydrastis,incluyendoHydrastis canadensis;especies deJeffersonia,incluyendoJeffersonia diphylla;especies deMahonia,incluyendoMahonia aquifolium;especies deMenispermum,incluyendoMenispermum canadense;especies deNandina,incluyendoNandina domestica;especies deNigella,incluyendoNigella sativa;especies deSanguinaria,incluyendoSanguinaria canadensis;especies deStyplophorum,incluyendoStylophorum diphyllum;especies deThalictrum,incluyendoThalictrumflavum;especies deTinospora,incluyendoTinospora cordifolia;y especies deXanthoriza,incluyendoXanthoriza simplicissima.Lo anterior incluye específicamente los polipéptidos de las especies mencionadas expuestos en la presente en las SEQ.ID NO: 219 a SEQ.ID NO: 321; SEQ.ID NO: 325; y SEQ.ID NO: 338. Los ejemplos de un polipéptido AKR que puede usarse de acuerdo con la presente divulgación incluyen polipéptidos AKR que pueden obtenerse de varias especies dePapaver,incluyendoPapaver somniferum, Papaver rhoeasyPapaver bracteatum;especies deArgemone,incluyendoArgemone mexicana;especies de Berberis, incluyendoBerberis thunbergii;especies deCorydalis,incluyendoCorydalis chelantifolia;especies deChelidonium,incluyendoChelidonium majus;especies deCissampelos,incluyendoCissampelos mucronata;especies deCocculus,incluyendoCocculus trilobus;especies deCorydalis,incluyendoCorydalis chelantifolia;especies deGlaucium,incluyendoGlaucium flavum;especies deHydrastis,incluyendoHydrastiscanadensis;especies deJeffersonia,incluyendoJeffersonia diphylla;especies deMahonia,incluyendoMahonia aquifolium;especies deMenispermum,incluyendoMenispermum canadense;especies deNandina,incluyendoNandina domestica;especies deNigella,incluyendoNigella sativa;especies deSanguinaria,incluyendoSanguinaria canadensis;especies deStyplophorum,incluyendoStylophorum diphyllum;especies deThalictrum,incluyendoThalictrum flavum;especies deTinospora,incluyendoTinospora cordifolia;y especies deXanthoriza,incluyendoXanthoriza simplicissima.Lo anterior incluye específicamente los polipéptidos de las especies mencionadas que se exponen en la presente en las SEQ.ID NO: 59 a SEQ.ID NO: 115; SEQ.ID NO: 327; SEQ.ID NO: 329; SEQ.ID NO: 330; y SEQ.ID NO: 340.
Las reacciones anteriores se llevan a cabo en condiciones que permiten la conversión del precursor de bencilisoquinolina en (RJ-Reticulina. Las condiciones incluyen condicionesin vivooin vitro,como se detalla adicionalmente más adelante. Las condiciones incluyen típicamente además la presencia de agua y agentes de tamponamiento. También se incluyen típicamente un agente reductor para permitir una reacción de reducción que dé como resultado la conversión del precursor de bencilisoquinolina oxidado en (RJ-Reticulina. El agente reductor puede ser nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), y en otras realizaciones, el agente reductor es nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH). Además típicamente se incluyen en la reacción es una reductasa capaz de reducir la enzima que convierte la bencilisoquinolina derivada a la bencilisoquinolina oxidada y un agente reductor. En realizaciones preferidas, la reductasa es una citocromo P450 reductasa capaz de reducir CYP450, y el agente reductor es NADH, o más preferiblemente, NADPH.
Síntesis in vitro de (R)-Reticulina o derivados de (R)-Reticulina
En condiciones de reacciónin vitro,los constituyentes iniciales de la reacción se proporcionan en forma más o menos pura y se mezclan en condiciones que permitan que se produzcan sustancialmente las reacciones químicas requeridas. Pueden adquirirse formas sustancialmente puras del derivado inicial de la bencilisoquinolina. La(S)-Reticulina, por ejemplo, puede adquirirse (por ejemplo, de Santa Cruz Biotechnology Inc.) como un compuesto químico sustancialmente puro, sintetizarse químicamente a partir de compuestos precursores, o aislarse de fuentes naturales, incluyendoPapaver somniferumy otros miembros de las familias Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae o Moraceae de plantas que comprenden tales compuestos según se desee. Los miembros adecuados de Papaveraceae incluyen, pero no se limitan a, especies pertenecientes al géneroPapaver; Corydalis; Chelidonium;yRomeria.Tales especies pueden ser capaces de producir (SJ-Reticulina, incluyendo, pero no limitadas a, especies de plantas seleccionadas de las especiesChelidonium majus; Corydalis bulbosa; Corydalis cava; Corydalis ochotenis; Corydalis ophiocarpa; Corydalis platycarpa; Corydalis tuberosa; Papaver armeniacum; Papaver Bracteatum; Papaver cylindricum; Papaver decaisnei; Papaver fugax; Papaver oreophyllum; Papaver orientale; Papaver paeonifolium; Papaver persicum; Papaver pseudo-orientale; Papaver rhoeas; Papaver rhopalothece; Papaver setigerum; Papaver somniferum; Papaver tauricolum; Papaver triniaefolium;yRomeria carica.La síntesis química de (SJ-Reticulina puede realizarse usando métodos estándar como se describe, por ejemplo, en S. Teitel y A. Bross, Journal of Heterocyclic Chemistry 5, 825-829, 1968. De acuerdo con la presente, pueden aislarse formas más o menos puras de las enzimas a partir de fuentes naturales, incluyendo, entre otras,Papaver somniferum, Papaver bracteatumyPapaver rhoeas,o pueden prepararse de manera recombinante o sintética. La secuencia de ácidos nucleicos puede obtenerse de cualquier fuente natural, por ejemplo, una fuente vegetal, que contenga tales secuencias. Las fuentes vegetales preferidas incluyen especies dePapaver,incluyendoPapaver somniferum, Papaver rhoeasyPapaver bracteatum;especies deArgemone,incluyendoArgemone mexicana;especies de Berberis, incluyendoBerberis thunbergii;especies deCorydalis,incluyendoCorydalis chelantifolia;especies deChelidonium,incluyendoChelidonium majus;especies deCissampelos,incluyendoCissampelos mucronata;especies deCocculus,incluyendoCocculus trilobus;especies deCorydalis,incluyendoCorydalis chelantifolia;especies deGlaucium,incluyendoGlaucium flavum;especies deHydrastis,incluyendoHydrastis canadensis;especies deJeffersonia,incluyendoJeffersonia diphylla;especies deMahonia,incluyendoMahonia aquifolium;especies deMenispermum,incluyendoMenispermum canadense;especies deNandina,incluyendoNandina domestica;especies deNigella,incluyendoNigella sativa;especies deSanguinaria,incluyendoSanguinaria canadensis;especies deStyplophorum,incluyendoStylophorum diphyllum;especies deThalictrum,incluyendoThalictrum flavum;especies deTinospora,incluyendoTinospora cordifolia;y especies deXanthoriza,incluyendoXanthoriza simplicissima.Con respecto a CYP450, las secuencias de ácidos nucleicos que pueden obtenerse u obtenidas a partir de las especies vegetales mencionadas incluyen la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en las SEQ.ID NO: 116 a SEQ.<i>D NO: 218; SEQ.ID NO: 324; y SEQ.ID NO: 337. Con respecto a AKR, las secuencias de ácidos nucleicos que pueden obtenerse u obtenidas de las especies de plantas mencionadas incluyen la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la presente como las SEQ.<i>D NO: 1 a SEQ.ID NO: 58; SEQ.ID n O: 326; SEQ.ID NO: 328; y SEQ.ID NO: 339. En realizaciones preferidas adicionales, puede usarse una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de fusión natural entre CYP450 y AKR.
El crecimiento de las células huésped lleva a la producción de los polipéptidos CYP450 y/o AKR. Posteriormente, los polipéptidos pueden recuperarse, aislarse y separarse de otros componentes de la célula huésped mediante una variedad de técnicas de purificación de proteínas incluyendo, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de afinidad, cromatografía por interacción hidrofóbica, cromatografía en fase inversa, filtración en gel, etc. Orientación general adicional con respecto a la purificación de proteínas puede encontrarse, por ejemplo, en: Cutler, P. Protein Purification Protocols, Humana Press, 2004, segunda edición. Por tanto, pueden obtenerse preparaciones sustancialmente puras de los polipéptidos CYP450 y/o AKR.
Síntesis in vivo de (R)-Reticulina o de un precursor de (R)-Reticulina
De acuerdo con ciertos aspectos de la invención, un derivado de la bencilisoquinolina se pone en contacto con cantidades catalíticas de una o más de las enzimas CYP450 y AKR en condiciones de reacción que permiten una conversión química catalizada enzimáticamente del derivado de la bencilisoquinolina en condiciones de reacciónin vivo.En tales condiciones de reacciónin vivo,las células vivas se modifican de tal manera que producen (RJ-Reticulina. Las células vivas son células fúngicas (es decir, células de levadura).
En una realización, las células vivas se seleccionan para ser células huésped no capaces de manera natural de producir un derivado de la bencilisoquinolina, (SJ-Reticulina, un precursor de (R)-Reticulina o (RJ-Reticulina. En otra realización, las células huésped son capaces de manera natural de producir (SJ-Reticulina o un derivado de bencilisoquinolina pero no (RJ-Reticulina o un precursor de (RJ-Reticulina, es decir, las células no son capaces de manera natural de realizar la reacción de epimerización del enantiómero(S)al enantiómero(R).En otra realización, las células son capaces de producir un derivado de bencilisoquinolina o (SJ-Reticulina y (RJ-Reticulina o un precursor de (RJ-Reticulina, pero los niveles de (RJ-Reticulina o precursor de (RJ-Reticulina son inferiores a los deseables y los niveles de (RJ-Reticulina o precursor de (RJ-Reticulina están modulados en relación con los niveles en las células no modificadas.
Para producir (RJ-Reticulina o precursor de (RJ-Reticulina, en la presente se proporciona además un método para preparar (RJ-Reticulina que comprende:
(a) proporcionar una secuencia quimérica de ácidos nucleicos que comprende como componentes operativamente enlazados
(i) una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido CYP450 que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 325;
(ii) una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AKR que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 327; y
(iii) una o más secuencias de ácidos nucleicos capaces de controlar la expresión en una célula de levadura;
(b) introducir la secuencia quimérica de ácidos nucleicos en una célula de levadura y cultivar la célula de levadura para producir CYP450 y AKR y para producir (RJ-Reticulina; y
(c) recuperar la (RJ-Reticulina.
En realizaciones preferidas, la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos se enlazan operativamente para producir un polipéptido de fusión que comprende CYP450 y AKR.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican CYP450 y AKR pueden obtenerse o se obtienen a partir dePapaver somniferumy otros miembros de la familia de plantas Papaveraceae, Lauraceae, Annonaceae, Euphorbiaceae o Moraceae que comprendan tales compuestos según se desee. Los miembros adecuados de Papaveraceae incluyen, pero no se limitan a, especies pertenecientes al géneroPapaver; Corydalis; Chelidonium;yRomeria.Tales especies pueden ser capaces de producir (RJ-Reticulina, incluyendo, pero no limitadas a, especies de plantas seleccionadas de las especiesChelidonium majus; Corydalis bulbosa; Corydalis cava; Corydalis ochotenis; Corydalis ophiocarpa; Corydalis platycarpa; Corydalis tuberosa; Papaver armeniacum; Papaver Bracteatum; Papaver cylindricum; Papaver decaisnei; Papaverfugax; Papaver oreophyllum; Papaver orientale; Papaver paeonifolium; Papaver persicum; Papaver pseudo-orientale; Papaver rhoeas; Papaver rhopalothece; Papaver setigerum; Papaver somniferum; Papaver tauricolum; Papavertriniaefolium;yRomeria carica.En realizaciones particularmente preferidas, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican CYP450 y AKR son secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican CYP450 y AKR que pueden obtenerse o se obtienen dePapaver somniferum, Papaver bracteatumyPapaver rhoeas.En realizaciones adicionales preferidas, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el CYP450 es la SEQ.ID NO: 324. En realizaciones preferidas, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el AKR es la SEQ.ID NO: 326.
De acuerdo con lo anterior, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica CYP450 y AKR está enlazada a una secuencia de ácidos nucleicos capaz de controlar la expresión de CYP450 y AKR en una célula huésped. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica CYP450 y AKR puede enlazarse a un promotor capaz de controlar la expresión en una célula huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos capaces de controlar la expresión en células huésped que pueden usarse en la presente incluyen cualquier promotortranscripcional capaz de controlar la expresión de polipéptidos en células huésped. Generalmente, los promotores obtenidos a partir de células bacterianas se usan cuando se selecciona un huésped bacteriano de acuerdo con la presente, mientras que un promotor fúngico se usará cuando se seleccione un huésped fúngico, un promotor vegetal se usará cuando se seleccione una célula vegetal, y así sucesivamente. Elementos adicionales de ácidos nucleicos capaces de controlar la expresión en una célula huésped incluyen terminadores transcripcionales, potenciadores y similares, todos los cuales pueden incluirse en las secuencias de ácidos nucleicos quiméricas de la presente divulgación. Los expertos en la técnica entenderán que el ligamiento operativo de secuencias de ácidos nucleicos incluye el ligamiento de promotores y secuencias capaces de controlar la expresión a secuencias codificantes en la dirección 5' a 3' de la transcripción.
De acuerdo con la presente divulgación, las secuencias de ácidos nucleicos quiméricas que comprenden un promotor capaz de controlar la expresión en la célula huésped enlazado a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica CYP450 y AKR, pueden integrarse en un vector de expresión recombinante que garantice una buena expresión en la célula huésped.
La presente divulgación incluye además un vector de expresión recombinante que comprende como componentes operativamente enlazados:
a) una secuencia de ácidos nucleicos capaz de controlar la expresión en una célula de levadura; y
b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica: (i) un polipéptido CYP450 que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 325 y que es capaz de oxidar (S)-Reticulina para formar 1,2-dehidroticulina; y (ii) un polipéptido AKR que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 327 y que es capaz de reducir la 1,2-dehidroticulina para formar (R)-Reticulina;
en donde el vector de expresión es adecuado para la expresión en la célula de levadura. El término "adecuado para la expresión en una célula huésped" significa que el vector de expresión recombinante comprende la secuencia de ácidos nucleicos quimérica de la presente divulgación enlazada a elementos genéticos necesarios para lograr la expresión en una célula huésped. Los elementos genéticos que pueden incluirse en el vector de expresión a este respecto incluyen una región de terminación transcripcional, una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican genes marcadores, uno o más orígenes de replicación y similares. En realizaciones preferidas, el vector de expresión comprende además elementos genéticos necesarios para la integración del vector o de una parte del mismo en el genoma de la célula huésped.
De acuerdo con la presente divulgación, el vector de expresión puede contener además un gen marcador. Los genes marcadores que pueden usarse de acuerdo con la presente divulgación incluyen todos los genes que permiten distinguir las células transformadas de las no transformadas, incluyendo todos los genes marcadores seleccionables y filtrables. Un gen marcador puede ser un marcador de resistencia, como un marcador de resistencia a antibióticos contra, por ejemplo, kanamicina o ampicilina. Los marcadores seleccionables que pueden emplearse para identificar transformantes mediante inspección visual incluyen p-glucuronidasa (GUS) (Patentes de Estados Unidos N° 5,268,463 y 5,599,670) y proteína fluorescente verde (G<f>P) (Niedz et al., 1995, Plant Cell Rep., 14: 403).
La preparación de los vectores deE. colipuede llevarse a cabo usando técnicas comúnmente conocidas, como la digestión por restricción, la ligadura, la electroforesis en gel, la secuenciación del ADN, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras metodologías. Hay disponibles una amplia variedad de vectores de clonación para realizar los pasos necesarios para preparar un vector de expresión recombinante. Entre los vectores con un sistema de replicación funcional en E. coli, se encuentran vectores como pBR322, la serie de vectores pUC, la serie de vectores M13 mp, pBluescript, etc. Típicamente, estos vectores de clonación contienen un marcador que permite la selección de las células transformadas. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden introducirse en estos vectores, y los vectores pueden introducirse enE. colipreparando células competentes, electroporación o usando otras metodologías bien conocidas por un experto en la técnica. ElE. colipuede cultivarse en un medio apropiado, incluyendo pero no limitado al medio Luria-Broth, y recogerse. Los vectores de expresión recombinantes pueden recuperarse fácilmente de las células tras la recogida y la lisis de las mismas. Además, puede encontrarse orientación general con respecto a la preparación de vectores recombinantes y el crecimiento de organismos recombinantes en, por ejemplo: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, Tercera Edición.
En la presente divulgación se incluye además, una célula huésped en donde la célula huésped comprende una secuencia de ácidos nucleicos quimérica que comprende como componentes operativamente enlazados una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican uno o más de los polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en CYP450 y AKR. Como se ha mencionado anteriormente en la presente, la célula huésped es preferiblemente una célula huésped que no es capaz de producir de manera natural un derivado de bencilisoquinolina, (S)-Reticulina, o (R)-Reticulina o un precursor de (R)-Reticulina. En otra realización, la célula huésped es capaz de manera natural de producir (S)-Reticulina, un derivado de la bencilisoquinolina, pero no (R)-Reticulina o un precursor de (R)-Reticulina. En otra realización, la célula huésped es capaz de producir un derivado de bencilisoquinolina, (S)-Reticulina, o(R)-Reticulina o un precursor de (R)-Reticulina, pero los niveles de (R)-Reticulina o del precursor de (R)-Reticulina son inferiores a los deseables y los niveles de (R)-Reticulina o del precursor de (R)-Reticulina están modulados con respecto a los niveles de (R)-Reticulina o del precursor de (R)-Reticulina en las células nativas no modificadas. En las realizaciones en las que las células son incapaces de producir de manera natural (S)-Reticulina o un derivado de la bencilisoquinolina, la (S)-Reticulina o el derivado de la bencilisoquinolina pueden proporcionarse a las células como parte del medio de crecimiento celular. En otras realizaciones, en las que las células son incapaces de producir de manera natural (S)-Reticulina o un derivado de la bencilisoquinolina, puede proporcionarse un compuesto precursor de (SJ-Reticulina o un derivado de la bencilisoquinolina capaz de ser convertido por las células en (SJ-Reticulina o un derivado de la bencilisoquinolina, respectivamente. Los sustratos alternativos que pueden proporcionarse a las células como parte del medio de crecimiento celular incluyen, entre otros, (SJ-Norcoclaurina, (SJ-N-metilnorcoclaurina, (S)-Norlaudanosalina, (SJ-N-metilnorlaudanosalina, (SJ-Coclaurina, (SJ-N-metilcoclaurina, (S)-3'-Hidroxicoclaurina, (S)-3'-Hidroxi-N-metilcoclaurina), (S)-Higenamina, (S)-N-metilhigenamina, (S)-Laudanosolina, (SJ-NorReticulina,(S)-Colletina y (SJ-Orientalina. Las células que pueden usarse de acuerdo con la presente son células de levadura.
En algunas realizaciones, los polipéptidos AKR y CYP450 se enlazan operativamente para formar un polipéptido de fusión.
Las cantidades de (RJ-Reticulina que se acumulan en la célula huésped pueden variar. En las realizaciones de la divulgación en las que la célula huésped produce de manera natural (RJ-Reticulina y (SJ-Reticulina, la proporción de (RJ-Reticulina con respecto a la (SJ-Reticulina sintetizadain vivopor dichas células preparadas para comprender secuencias de ácidos nucleicos quiméricas de acuerdo con la presente divulgación, supera la proporción de (RJ-Reticulina con respecto a la (SJ-Reticulina presente en las células huésped naturales (es decir, células que no comprenden secuencias de ácidos nucleicos quiméricas o extractos de células huésped). Preferiblemente, la proporción de (RJ-Reticulina con respecto a la (SJ-Reticulina en las células huésped o extractos de células huésped es mayor de21:79, por ejemplo, por lo menos 0,3:1, por lo menos 0,4:1, por lo menos 0,5:1, por lo menos 1:1, por lo menos 2:1, por lo menos 3:1 o por lo menos 4:1.
Uso de ÍRj-Reticulina y precursores de ÍRj-Reticulina
La (RJ-Reticulina obtenida de acuerdo con la presente divulgación puede formularse para su uso como fármaco farmacéutico, agente terapéutico o agente medicinal. Por tanto, la presente divulgación incluye además una composición farmacéutica que comprende (RJ-Reticulina preparada de acuerdo con los métodos de la presente divulgación. Las preparaciones de fármacos farmacéuticos que comprenden (RJ-Reticulina de acuerdo con la presente divulgación comprenden preferiblemente además vehículos, excipientes, diluyentes y sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares. Estos vehículos, excipientes y sustancias auxiliares son generalmente agentes farmacéuticos que pueden administrarse sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, líquidos como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol y etanol. También pueden incluirse en la misma sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales como clorhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y sales de ácidos orgánicos como acetatos, propionatos, benzoatos y similares. También se prefiere, aunque no es necesario, que la preparación contenga un excipiente farmacéuticamente aceptable que sirva como estabilizante. Los ejemplos de portadores adecuados que también actúan como estabilizadores para los péptidos incluyen, sin limitación, grados farmacéuticos de dextrosa, sacarosa, lactosa, sorbitol, inositol, dextrano y similares. Otros portadores adecuados incluyen, de nuevo sin limitación, almidón, celulosa, fosfatos de sodio o calcio, ácido cítrico, glicina, polietilenglicoles (PEG) y combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica puede formularse para administración oral e intravenosa y otras vías de administración según se desee. La dosificación puede variar y puede optimizarse usando experimentación rutinaria. La composición farmacéutica que comprende (RJ-Reticulina puede usarse para tratar la calvicie o la tensión muscular.
Además, la (RJ-Reticulina proporcionada en la presente es útil como agente para fabricar otros metabolitos secundarios o composiciones medicinales que incluyen, sin limitación, salutaridina, codeína y morfina, e incluyen adicionalmente tebaína, papaverina, noscapina, codamina, laudina y laudanosina (+)-palidina, (-)-isoboldina, y (-)-coritortuberina.
Los precursores de (R)-Reticulina proporcionados en la presente son útiles como agente para fabricar otros metabolitos secundarios, en particular (RJ-Reticulina. Como se ilustra en laFIG. 1,la (RJ-N-metilcoclaurina puede usarse como agente para fabricar (RJ-3'-hidroxi-N-metilcoclaurina. La (RJ-3'-Hidroxi-N-metilcoclaurina puede usarse como agente para fabricar (RJ-Reticulina.
Usos alternativos de las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos AKR y CYP450
En la técnica generalmente se conocen los métodos para analizar el ADN genómico, e incluyen, por ejemplo, el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y cebadores polinucleotídicos específicos para amplificar porciones específicas de la secuencia nucleotídica que codifica AKR y/o CYP450. Pueden usarse además la digestión de restricción y el análisis de transferencia Southern. El análisis puede dirigirse además a intrones, exones o regiones en sentido ascendente o en sentido descendente de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica AKR y/o CYP450. El análisis puede dirigirse además a identificar un locus genómico que comprenda una secuencia de ácidos nucleicos que codifique AKR y/o CYP450, en donde dicho locus está enlazado a niveles modulados de expresión de AKR y/o CYP450.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican AKR y/o CYP450 pueden usarse para producir una célula que tenga niveles modulados de expresión de AKR y/o CYP450. Los métodos pueden dar como resultado además la modulación de la proporción de (S)-Reticulina, (R)-Reticulina. Dicha modulación se ilustra en el Ejemplo 5.
EJEMPLOS
En lo sucesivo se proporcionan ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo los métodos de la presente divulgación, así como realizaciones que representan las composiciones de la presente divulgación. Los ejemplos se proporcionan solamente con propósitos ilustrativos y no se pretende que limiten en modo alguno el alcance de la presente divulgación.
Ejemplo 1 - Conversión de (SJ-Reticulina en (RJ-Reticulina
Este Ejemplo demuestra la conversiónin vitrode (S)-Reticulina a (R)-Reticulina usando una mezcla enzimática en forma de polipéptido de fusión dePapaver somniferumcompuesto por una fracción de CYP450 y una de AKR (SEQ.ID: NO 323).
Se cultivó la cepa YPH499 deSaccharomyces cerevisiaecon pESC-leu2d::PsCPR/PsREPI y se purificaron los microsomas como se describe a continuación. Brevemente, la cepa de levadura se cultivó en medio sintético completo (SC) carente de leucina suplementado con un 2% de glucosa durante 16 horas a 30° C y 250 rpm. Se añadió un mililitro de cultivo a 50 ml de medio SC carente de leucina, suplementado con 1,8% de galactosa, 0,2% de glucosa y 1% de rafinosa y se cultivó durante 72 horas a 30° C y 250rpm. Luego, los cultivos se centrifugaron a 4.000g durante 5 minutos y se lavaron con 5ml de tampón TEK (50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 100 mM KCl). Los gránulos se volvieron a suspender en 1ml de tampón TESB (50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 0,6 M sorbitol) y se añadió un volumen igual de perlas de vidrio de 0,5 mm. Los tubos se agitaron a mano a 10° C durante 4 minutos. Las perlas se lavaron con TESB y los lavados se recogieron y centrifugaron a 14.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se ultracentrifugó durante 1 hora a 125.000 g y se descartó el sobrenadante. Luego, los microsomas se volvieron a suspender en 50 mM HEPES pH 7,5.
Los ensayos enzimáticos contenían 500 pM de NADPH y 50 pM de (S)-Reticulina en tampón HEPES (pH 7.5) y microsomas preparados como se ha descrito anteriormente. Los ensayos se incubaron durante la noche a 30° C. Tras la reacción, las muestras del ensayo se analizaron en un HLPC Agilent 1260 a un caudal de 0,2 ml/min y los compuestos se separaron usando una columna quiral LUX de celulosa-1 (150 mm x 2,1 mm i.d.; Phenomenex) con bicarbonato de amonio al 75% suplementado con detilamina al 0,1% (solvente A) y acetonitrilo al 25% con dietilamina al 0,1% (solvente B). La (R)-Reticulina y la (S)-Reticulina se monitorizaron a una longitud de onda de 284 nm.
Los resultados se muestran en laFIG. 3.Como puede verse en laFIG. 3,el tiempo de retención de los controles estándar auténticos (R)-Reticulina y (S)-Reticulina en la columna quiral es de aproximadamente 13,5 minutos (panel superior); y 15 minutos (segundo panel desde arriba), respectivamente. El panel inferior muestra los resultados de un ensayo en el que no hay enzima presente en la mezcla y demuestra que en estas condiciones de reacción ninguna (S)-Reticulina se epimeriza a (R)-Reticulina. El tercer panel desde arriba muestra que en presencia de la mezcla enzimática la (S)-Reticulina se epimeriza a (R)-Reticulina (consultar la flecha y la aparición de un pico en un tiempo de retención de aproximadamente 15 min).
Ejemplo 2 - Conversión de (SJ-Reticulina en 1,2-Dehidroticulina
Este ejemplo demuestra la conversiónin vitroen levadura de (SJ-Reticulina a 1,2-Dehidroticulina usando el CYP450 dePapaverrhoeas(SEQ.ID: NO 325). Se cultivó la cepa YPH499 deSaccharomyces cerevisiaeque alberga pESC-leu2d::PsCPR/PrDRS y se purificaron los microsomas como se describe a continuación. Brevemente, la cepa de levadura se cultivó en medio sintético completo (SC) carente de leucina suplementado con un 2% de glucosa durante 16 horas a 30° C y 250 rpm. Se añadió un mililitro de este cultivo a 50ml de medio SC carente de leucina, suplementado con 1,8% de galactosa, 0,2% de glucosa y 1% de rafinosa y se cultivó durante 72 horas a 30° C y 250 rpm. Luego, los cultivos se centrifugaron a 4.000 g durante 5 minutos y se lavaron con 5ml de tampón TEK (50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 100 mM KCl). Luego las perlas se volvieron a suspender en 1 ml de tampón TESB (50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 0,6 M sorbitol) y se añadió un volumen igual de perlas de vidrio de 0,5 mm. Los tubos se agitaron a mano a 10° C durante 4 minutos. Las perlas se lavaron con TESB y los lavados se recogieron y centrifugaron a 14.000 g durante 10 min. Luego, el sobrenadante se ultracentrifugó durante 1 hora a 125.000 g y se descartó el sobrenadante. Luego, los microsomas se volvieron a suspender en 50 mM HEPES pH 7,5.
Los ensayos enzimáticos contenían 500 pM de NADPH y 50 pM de (S)-Reticulina en tampón HEPES (pH 7.5) y microsomas preparados como se ha descrito anteriormente. Los ensayos se incubaron durante la noche a 30° C. Tras la reacción, las muestras de ensayo se ejecutaron en un HLPC Agilent 1260 acoplado a un espectrómetro de masas 6400 B con una fuente de ionización por pulverización de electrones que funcionaba en modo positivo. El espectrómetro de masas escaneó de 200-400 m/z. Los compuestos se separaron usando el método HLPC para ensayos enzimáticos descrito anteriormente (Farrow SC y Facchini, PJ, (2013), J. Biol. Chem. (288) pp 28,997-29,012; las dioxigenasas catalizanlaO-desmetilación y la 0,0-desmetilación con funciones generalizadas en el metabolismo de los alcaloides de bencilisoquinolina en la adormidera).
Los resultados se muestran en laFIG. 4. Como puede verse en laFIG. 4(panel superior), se observa un pico con un tiempo de retención de aproximadamente 3,1 minutos en la columna de HPLC en una muestra de control que no contiene la enzima. Este pico se corresponde con el tiempo de retención previsto de 3,13 minutos para el fragmento más grande del espectro de disociación inducida por colisión para la ('S)-Reticulina enm/z330 (consultar:Tabla 1). El segundo panel de la parte superior muestra que no se observan picos a m/z 328 en la misma muestra de control, lo que indica la ausencia de 1,2-Dehidroreticulina en la muestra de control. El tercer panel desde arriba muestra que se observa un pico con un tiempo de retención de aproximadamente 3,1 minutos a m/z 330 en la muestra que comprende la enzima, lo que indica la presencia de ('S)-Reticulina en la muestra de ensayo. El panel inferior muestra que se observa un pico con un tiempo de retención de aproximadamente 3,0 a m/z 328 en la muestra del ensayo. Este pico se corresponde con el tiempo de retención previsto de 3,02 minutos del fragmento más grande del espectro de disociación inducida por colisión para la 1,2-Dehidroreticulina am/z328 (consultar:Tabla 1), lo que indica la presencia en la muestra de ensayo de 1,2-Dehidroreticulina en presencia de la enzima.
Ejemplo 3 - Conversión de 1,2-Dehidroticulina en (RJ-Reticulina
Este ejemplo demuestra la conversiónin vitroen levadura de 1,2-DehidroReticulina a ('R)-Reticulina usando AKRde Papaver rhoeas(SEQ.ID: NO 327).
Se añadió un cultivo de 16 horas, 50 ml LB suplementado con 50 jg/m l de monosulfato de kanamicina y 35 |jg/ml de cloranfenicol de la cepa Rosetta (DE3) deEscherichia colique contenía pET47b::PrDRR a 11 del mismo medio y cultivada a 37° C, 180 rpm hasta una DO600 de 0,6. Luego, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y se dejó crecer a 25° C, 180 rpm durante 4 horas y el sedimento celular se recogió por centrifugación. Las células se lisaron en tampón A (tampón de fosfato sódico 100 mM pH 7,0, NaCl 300 mM, glicerol 10% (v/v)) suplementado con 2 mM de fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF) con una prensa French. Los desechos celulares se eliminaron por centrifugación a 14.000 g durante 15 minutos. El extracto de proteína soluble total se combinó con resina TALON (Clonetech) equilibrada con tampón A durante 45 minutos a 4° C, 65 rpm. La resina se lavó dos veces con tampón A, y la proteína se eluyó paso a paso usando un gradiente de imidazol en tampón A (2,5, 10, 100, 200 mM). La proteína purificada se eluyó en imidazol 100 mM. Los ensayos enzimáticos contenían 500 jM de NADPH, 50 jM de 1,2-Dehidroreticulina en tampón de fosfato sódico (pH 7,0) y proteína preparada como se ha descrito anteriormente. Los ensayos se dejaron toda la noche a 30° C. Después de la reacción, las muestras de ensayo se ejecutaron en un HLPC Agilent 1260 acoplado a un espectrómetro de masas 6400 B con una fuente de ionización por pulverización de electrones que funcionaba en modo positivo. El espectrómetro de masas escaneó de 200-400m/z.Los compuestos se separaron usando el método HLPC para ensayos enzimáticos descrito anteriormente (Farrow SC y Facchini, PJ, (2013), J. Biol. Chem. (288) pp 28,997-29,012; las dioxigenasas catalizanlaO-desmetilación y la 0,0-desmetilación con funciones generalizadas en el metabolismo de los alcaloides de bencilisoquinolina en la adormidera).
Los resultados se muestran en laFIG. 5.Como puede verse en laFIG. 5(panel superior), se observa un pico con un tiempo de retención de aproximadamente 3,0 minutos en la columna de HPLC en una muestra de control que no contiene la enzima. Este pico se corresponde con el tiempo de retención previsto de 3,02 minutos para el fragmento más grande del espectro de disociación inducida por colisión para la 1,2-Dehidroticulina enm/z328 (consultar:Tabla 1). El segundo panel desde arriba muestra que no se observa ningún pico en un tiempo de retención de aproximadamente 3,1 minutos, por lo que la (R)-Reticulina está ausente en la muestra. En la misma muestra de control se observa un pico pequeño a aproximadamente 3,0 minutos. Este pico representa una forma isotópica del sustrato de 1,2-Dehidroreticulina. El tercer panel desde la parte superior muestra que se observa un pico con un tiempo de retención de aproximadamente 3,0 minutos a m/z 328 en la muestra que contiene la enzima, lo que indica la presencia de una pequeña cantidad de 1,2-Dehidroreticulina no consumida en la muestra de ensayo. El panel inferior muestra que se observa un pico con un tiempo de retención de aproximadamente 3,1 am/z330 en la muestra del ensayo. Este pico se corresponde con el tiempo de retención previsto de 3,13 minutos del fragmento más grande del espectro de disociación inducida por colisión para la (R)-Reticulina am/z330 (consultar:Tabla 1), lo que indica la presencia en la muestra de ensayo de (R)-Reticulina en presencia de la enzima.
Ejemplo 4 - Conversión de (S)-N-metilcoclaurina en (RJ-N-metilcoclaurina
Este ejemplo demuestra la conversiónin vitroen levadura de (S)-N-metilcoclaurina a ('R)-N-metilcoclaurina usando una mezcla enzimática en forma de polipéptido de fusiónde Papaver somniferumcompuesto por una fracción de CYP450 y una de AKR (SEQ.ID NO 2).
Se cultivó la cepa YPH499 deSaccharomyces cerevisiaeque alberga pESC-leu2d::PsCPR/PsREPI y se purificaron los microsomas como se describe a continuación. Brevemente, la cepa de levadura se cultivó en medio sintético completo (SC) carente de leucina suplementado con un 2% de glucosa durante 16 horas a 30° C y 250 rpm. Se añadió un mililitro de cultivo a 50 ml de medio SC carente de leucina, suplementado con 1,8% de galactosa, 0,2% de glucosa y 1% de rafinosa y se cultivó durante 72 horas a 30° C y 250rpm. Luego, los cultivos se centrifugaron a 4.000g durante 5 minutos y se lavaron con 5ml de tampón TEK (50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 100 mM KCl). Los sedimentos se volvieron a suspender en 1ml de tampón TESB (50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 0,6 M sorbitol) y se añadió un volumen igual de perlas de vidrio de 0,5 mm. Los tubos se agitaron a mano a 10° C durante 4 minutos. Las perlas se lavaron con TES<b>y los lavados se recogieron y centrifugaron a 14.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se ultracentrifugó durante 1 hora a 125.000 g y se descartó el sobrenadante. Luego, los microsomas se volvieron a suspender en 50 mM HEPES pH 7,5.
Los ensayos enzimáticos contenían 500 pM de NADPH y 50 pM de (S)-N-metilcoclaurina en tampón HEPES (pH 7,5) y microsomas preparados como se ha descrito anteriormente. Los ensayos se incubaron durante la noche a 30° C. Tras la reacción, las muestras del ensayo se analizaron en un HLPC Agilent 1260 a un caudal de 0,2 ml/min y los compuestos se separaron usando una columna quiral LUX de celulosa-1 (150 mm x 2,1 mm i.d.; Phenomenex) con bicarbonato de amonio al 75% suplementado con detilamina al 0,1% (solvente A) y acetonitrilo al 25% con dietilamina al 0,1% (solvente B). La(R)-y la (S)-N-metilcoclaurina se monitorizaron a una longitud de onda de 230 nm.
Los resultados se muestran en laFIG. 6.Como puede verse en laFIG. 6,el tiempo de retención del control estándar auténtico (S)-N-metilcoclaurina en la columna quiral es de aproximadamente 13,9 minutos (panel superior). El panel inferior muestra los resultados de un ensayo en el que no hay enzima presente en la mezcla y demuestra que en estas condiciones de reacción ninguna (S)-N-metilcoclaurina se epimeriza a (R)-N-metilcoclaurina. El panel del medio muestra que en presencia de la mezcla enzimática la (S)-N-metilcoclaurina se epimeriza a (R)-N-metilcoclaurina. (ver la flecha, y la aparición de un pico en un tiempo de retención de aproximadamente 16,3 min).
Ejemplo 5 - Silenciamiento génico de AKR y del gen de fusión AKR-CYP450
Este ejemplo muestra el silenciamiento de genes que codificanAKRy/oCYP450usando el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS).
Los niveles de transcripción deREPIy/oCOR1.3(que codifica la codeinona reductasa) de la adormidera(Papaver somniferum)(transcritos por la SEQ.ID. NO: 322 y la SEQ.ID NO: 328, respectivamente) en el quimiotipo Bea's Choice de la adormidera(Papaver somniferum)se suprimieron usando el sistema de vectores del virus del cascabel del tabaco (TRV).
Se amplificaron dos regiones (REPI-a (FIG. 7A;Panel A) y REPI-5' (FIG. 7C;Panel A)) del ADNc deREPIy una región del ADNc deCOR1.3(FIG. 7B;Panel A) usando los siguientes pares de cebadores:
pTRV2-COR1.3
COR1.3-F, ggatccCATCAGTTCCATGCTCTGGT
COR1.3-R, ggtaccGGGCTCATCTCCACTTGATT
pTRV2-REPI-a
REPI-a-F, ggatccCATCACTTCCAAGCTCTGGT
REPI-a-R, ggtaccGGGCTCATCTCCACTTGAT
pTRV2-REPI-5'
REPI-5'-F, gaattcCCTACATACTGTATTGGGTTGAATCATG
REPI-5'-R, ggtaccTAACGGGATAGGACGGTTT
La región REPI-a y la región COR1.3 presentan una similitud considerable que resulta en el cosilenciamiento recíproco de REPI y COR1.3 en cada caso. Por el contrario, la región REPI-5' es única y sólo da como resultado al silenciamiento de REPI, pero no de COR1.3.
Los amplicones se clonaron individualmente en pTRV2 y los vectores se movilizaron enAgrobacterium tumefacienscomo se ha descrito anteriormente. Se infiltraron meristemos apicales de plántulas de dos a tres semanas de edad con una mezcla 1:1 deA. tumefaciensque albergaba pTRV1 y pTRV2 construido que contenía los fragmentos específicos de los genes. Se usó pTRV2 vacío como control negativo y el constructo pTRV2-PDS que codifica la fitoeno desaturasa como control positivo de la infiltración. Las plantas infiltradas se cultivaron en invernadero durante 8-10 semanas. La infiltración con A.tumefaciensy la recogida y procesamiento de muestras de látex, tallo y raíz para los análisis de alcaloides y transcritos se realizaron como se ha descrito anteriormente. Típicamente, se infiltraron 20 30 plantas con A.tumefaciensque albergaban pTRV1 y un constructo pTRV2. En aproximadamente el 70-80% de las plantas infiltradas, se detectó por RT-PCR un fragmento movilizado del constructo pTRV2 (FIG.7A(Panel B);FIG. 7B(Panel B);FIG. 7C,Panel B), que muestra que estas plantas fueron infectadas con éxito. Los alcaloides se extrajeron del látex liofilizado usando metanol. La abundancia relativa de transcritos se determinó mediante qRT-PCR (FIG.7A (Panel C);FIG. 7B(Panel C);FIG. 7C,Panel C). Los datos de contenido de alcaloides y abundancia relativa de transcritos se generaron a partir de 6 plantas infiltradas individualmente, y se realizaron tres réplicas técnicas de cada muestra. Las muestras de látex de las plantas infiltradas se analizaron por LC-MS/MS. Los efectos en el contenido de alcaloides de las plantas de adormidera infiltradas con A.tumefaciensque albergaban pTRVI y cada una de 2 regiones deREPIoCOR1.3en constructos pTRV2 separados se evaluaron usando cromatogramas de iones totales (FIG.7A(Panel D);FIG. 7B(Panel D);FIG. 7C, Panel D) y determinando la abundancia relativa de 9 alcaloides diferentes (morfina, codeína, tebaína, papaverina, noscapina, codamina, laudina y laudanosina) en látex y raíces (FIG.7A(Panel E);FIG. 7B(Panel E);FIG. 7C,Panel E). Además de un menor contenido de morfina, el silenciamiento deREPIoCOR1.3provocó una reducción significativa de los niveles de codeína y tebaína. El silenciamiento deREPI(es decir, el gen AKR-CYP450), así como el silenciamiento deCOR1.3 (esdecir, el gen AKR) dio como resultado un aumento significativo de la acumulación de reticulina, codamina, laudanina, laudanosina y, de manera menos consistente, papaverina y noscapina. La proporción entre (RJ-Reticulina y (SJ-Reticulina era de aproximadamente 21:79 en el látex de las plantas de control (pTRV2), pero la proporción entre (R)-Reticulina y (S)-Reticulina disminuyó a aproximadamente 2:98 en el látex de las plantas pTRV2-REPI-a (FIG.7A (Panel F) y plantas pTRV2-COR1.3;FiG. 7B(Panel F); y a aproximadamente 5:95 en el látex de plantas pTRV2-REPI-5' en látex y raíces (FIG. 7C,Panel F).
Ejemplo 6 - Actividad catalítica de AKR en presencia de NADPH/NADH y NADP+/NAD+
Este Ejemplo muestra la conversión de 1,2-Dehidroreticulina en (R)-Reticulina catalizada por el polipéptido AKR en presencia de los agentes reductores NADH o NADPH. Este ejemplo muestra además la reversibilidad de la reacción anterior en presencia de los agentes oxidantes NAD+ o NADP+.
Los experimentos se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 3 anterior, excepto que las reacciones se realizaron usando AKR obtenido dePapaver somniferumy dePapaver rhoeas,y que en la reacción inversa se proporcionó (R)-Reticulina como sustrato, y se usó cualquiera de NAD+ o NADP+ como agente oxidante para realizar la reacción enzimática. La última reacción mencionada se llevó a cabo a pH 9. Como se muestra en laFIG. 8,tanto en presencia de NADH como de NADPH la 1,2-Dehidroreticulina se convierte, usando cantidades catalíticas del polipéptido AKR tanto dePapaver somniferum(PsDRR) (FIG. 8A, Panel A) como dePapaver rhoeas(PrDRR) (FIG. 8B, Panel A), en (R)-Reticulina. Como se muestra enla FIG. 8,usando tanto el polipéptido AKR dePapaver somniferumP<s>D<r>R (FIG. 8a , Panel B) como el polipéptido PrDRR dePapaver Rhoeas(FIG. 8B, Panel B) la reacción puede ser revertida, y en presencia de NAD+ o NADP+ la (R)-Reticulina es convertida en 1,2-Dehidroreticulina.
Ejemplo 7 - Dependencia del pH de la actividad AKR
Este Ejemplo muestra la dependencia del pH del polipéptido AKR tanto en presencia de agente reductor como de agente oxidante.
Se examinó la dependencia del pH de los polipéptidos CYP450 y AKR dePapaver somniferumyPapaver rhoeas.Las reacciones enzimáticas se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 3 y el Ejemplo 6, excepto que el pH en cada reacción se incrementó gradualmente de pH 3,5 a pH 10. La actividad enzimática a cada pH evaluado se cuantificó mediante análisis de muestra en un HLPC Agilent 1260 acoplado a un espectrómetro de masas 6400 B con una fuente de ionización por pulverización de electrones funcionando en modo positivo. El espectrómetro de masas escaneó de 200-400m/z.Los compuestos se separaron usando el método HLPC para ensayos enzimáticos descritos anteriormente (Farrow SC y Facchini, PJ, (2013), J. Biol. Chem. (288) pp 28,997 29,012; las dioxigenasas catalizan la O-desmetilación y la O,O-desmetilación con funciones generalizadas en el metabolismo de los alcaloides de bencilisoquinolina en la adormidera).
Los resultados se proporciona en laFIG. 9.En elPanel Ase muestran gráficos que muestran la actividad enzimática en función del pH usando CYP450 (PsDRS) y AKR dePapaver somniferumen presencia de NADPH (PsDRS directo) y en presencia de NADP+ (PsDRS inversa). En elPanel Bse muestran gráficos de la actividad enzimática en función del pH usando CYP450 (PrDRS) y AKR dePapaver rhoeasen presencia de NADPH (PrDRS directo) y en presencia de NADP+ (PrDRS inverso). Como puede verse en laFIG. 9,la PsDRS y la PrDRS convierten la (S)-Reticulina en 1,2-Dehidroreticulina a un óptimo de aproximadamente pH 8. En presencia de NADPH, PsDRR y PrDRR convierten la 1,2-Dehidroticulina en (RJ-Reticulina en un óptimo de aproximadamente pH 7. En presencia de NADP+, PsDRR y PrDRR convierten la (R)-Reticulina en 1,2-Dehidroticulina en un óptimo de aproximadamente pH 9.
Ejemplo 8 - Silenciamiento génico de AKR y del gen de fusión AKR-CYP450
Este ejemplo muestra el silenciamiento adicional de los genes que codifican elAKRy/o elCYP450usando el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS).
Los experimentos de silenciamiento génico se realizaron a cabo esencialmente como se describe en el Ejemplo 5, excepto que los genesCOR (AKR)y REPI(CYP450Jse dirigieron usando los siguientes constructos:REPIa, REPIbyCOR.1.3. REPIarepresenta un constructo dirigido a una secuencia conservada tanto en el genCORcomo en el genREPI.Por el contrario, REPIb se dirige a una región que es única paraREPI. COR 1.3se dirige a una región exclusiva deCOR.Los niveles de transcripción deREPIyCORse determinaron como se describe en el Ejemplo 5. Se usó un vector vacío como control (PTRV2). Como puede observarse en laFIG. 10, las plantas en las queREPIse dirige únicamente a REPIb muestran niveles reducidos de transcripción de REPI en relación con el control (FIG. 10 - panel superior), mientras que los niveles de transcripción de COR permanecen prácticamente iguales (FIG. 10 - panel inferior). Las plantas en las que REPI y COR se dirigen a través de REPIa muestran niveles reducidos de transcripción de REPI (FIG. 10 - panel superior) y COR (FIG. 10 - panel inferior). Cuando COR se dirigió usando COR1.3, los niveles de transcripción de COR disminuyeron (FIG. 10 - panel inferior). Además, los niveles de transcripción de REPI también disminuyeron con respecto al control (FIG. 10 - panel superior) en respuesta al silenciamiento de los niveles de transcripción de COR mediante COR1.3.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar (RJ-Reticulina que comprende:
(a) proporcionar un ácido nucleico quimérico que comprenda como componentes operativamente enlazados:
(i) una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido del citocromo P450 (CYP450) que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 325;
(ii) una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de aldo-cetorreductasa (AKR) que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 327; y (iii) una o más secuencias de ácidos nucleicos capaces de controlar la expresión en una célula de levadura; y
(b) introducir el ácido nucleico quimérico en una célula de levadura y cultivar la célula de levadura para producir el polipéptido CYP450 y el polipéptido AKR y para producir (RJ-Reticulina; y
(c) recuperar la (RJ-Reticulina.
2. Un vector de expresión recombinante que comprende como componentes operativamente enlazados:
(a) una secuencia de ácidos nucleicos capaz de controlar la expresión en una célula de levadura; y
(b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica: (i) un polipéptido CYP450 que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 325 y que es capaz de oxidar (S)-Reticulina para formar 1,2-dehidroticulina; y (ii) un polipéptido AKR que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 327 y que es capaz de reducir 1,2-dehidroticulina para formar (R)-Reticulina;
en donde el vector de expresión es adecuado para la expresión en la célula de levadura.
3. Una célula huésped de levadura que comprende un ácido nucleico quimérico que comprende componentes operativamente enlazados:
(a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido CYP450 que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 325 y que es capaz de oxidar (S)-Reticulina para formar 1,2-dehidroticulina; y
(b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AKR que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la s Eq ID NO: 327 y que es capaz de reducir 1,2-dehidroticulina para formar (R)-Reticulina.
4. La célula huésped de levadura de la reivindicación 3, en donde el polinucleótido comprende un promotor de levadura.
5. Un método para elaborar (RJ-Reticulina en una célula de levadura que comprende:
(a) proporcionar (SJ-Reticulina;
(b) poner en contacto la (SJ-Reticulina con una mezcla enzimática capaz de convertir la (S)-Reticulina en (R)-Reticulina en condiciones que permitan la conversión de la (S)-Reticulina en (R)-Reticulina en una célula de levadura,
en donde la mezcla enzimática comprende un primer polipéptido capaz de oxidar la (S)-Reticulina para formar 1,2-dehidroticulina y un segundo polipéptido capaz de reducir la 1,2-dehidroticulina para formar (R)-Reticulina, y en donde el primer polipéptido es un polipéptido CYP450 que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 325 y el segundo polipéptido es un polipéptido AKR que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 85% idéntica a la SEQ ID NO: 327.
6. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 5, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 2 o la célula de levadura de la reivindicación 3 o de la reivindicación 4, en donde:
(a) el polipéptido CYP450 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 95%, por lo menos un 96%, por lo menos un 97%, por lo menos un 98% o por lo menos un 99% idéntica a la SEQ ID NO: 325, o tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 325; y/o
(b) el polipéptido AKR comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 95%, por lo menos un 96%, por lo menos un 97%, por lo menos un 98% o por lo menos un 99% idéntica a la SEQ ID NO: 327, o tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 327.
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