CN110179859B - 防己提取物及防己诺林碱在制药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种防己提取物及防己诺林碱在制药中的应用；防己提取物及防己诺林碱用作乙酰胆碱酯酶抑制剂的组分，乙酰胆碱酯酶抑制剂用于制备阿尔茨海默症的防治药物。本发明提供了一种防己提取物及防己诺林碱在制药中的应用，为预防和治疗阿尔茨海默症提供了新的药物候选来源，在提高阿尔茨海默症临床治疗效果、降低药物毒副作用等方面具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及防己提取物及其效用成分防己诺林碱在抗乙酰胆碱酯酶活性方面的新用途，及它们在与其它中药提取物或效用成分配伍后增强乙酰胆碱酯酶抑制活性方面的应用，以用于阿尔茨海默症的防治药物的制备中。
背景技术
阿尔茨海默症(AD)是一类常见的中枢神经系统退行性变疾病，以认知功能障碍或伴随语言、活动能力下降为主要临床特征，具有发病隐匿、病程进展快等特点，严重影响患者的生活质量。由于生活方式改变、工作压力增加及人口老龄化等因素，AD在我国发病率呈现逐年上升趋势。AD发病机制复杂，已有的研究表明，胆碱能神经损伤或传递功能障碍与AD患者临床认知障碍密切相关。乙酰胆碱酯酶是神经递质乙酰胆碱的水解酶，它在大脑中大量存在，是治疗AD等神经退行性疾病药物开发的重要靶点；乙酰胆碱酯酶抑制剂(如他克林、加兰他敏、多奈哌齐及利凡斯的明等)是目前AD的主要临床治疗药物，能够改善AD患者大脑神经突触传递效果，改善患者认知功能障碍，延缓AD进一步发展。但已有的这些临床药物只能部分缓解AD患者临床症状，多存在疗效弱、副作用大等不足，目前尚缺少治疗AD特效药。亟待通过多种途径筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂，并在此基础上开发针对此靶点的AD治疗药物。
中医对AD具有较好临床疗效。根据中医传统理论，精神情志活动尤其是谋虑、决断等高级智能活动与中医肝、胆、肾脏腑功能关系密切。经临床辨证配伍相应药味施治后，中医对AD精神情志障碍具有较好调治效果，在改善AD患者相关临床症状，提高AD患者生活质量等方面具有积极意义。如黄连解毒汤能够通过清泻肝火、解郁开窍，对善忘颠倒、面赤口苦、烦躁易怒等肝火旺盛型AD临床症状具有较好缓解作用；知柏地黄汤能够通过滋阴降火、益肾填精，对髓海空虚所致善忘、健忘等常见AD临床症状具有较好改善作用；此外，还有基于滋阴利水的防己地黄汤，在临床上能够有效改善血管性痴呆临床症状。
已有的研究表明，上述治疗AD的中药复方黄连解毒汤、知柏地黄汤中的黄连、黄柏等代表性药味所含主要效用成分均为生物碱类化合物，且多数成分(如黄连碱、小檗碱、巴马汀等)具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性。治疗血管性痴呆的防己地黄汤中的主要配伍药味防己所含主要效用成分亦为生物碱类化合物，而关于防己及其效用成分对于乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究尚未有相关报道。因此，研究防己及其效用成分对AD靶点乙酰胆碱酯酶抑制作用，及它们与已知乙酰胆碱酯酶抑制剂间的协同配伍药效作用，对于提高AD的临床治疗效果，降低药物毒副作用，加快AD临床治疗药物研发等方面具有重要意义。
本发明还从上述中药复方中筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂或先导化合物，并借鉴中药复方配伍思路，研究其与已知乙酰胆碱酯酶抑制剂间的协同配伍效应，这对于发现新型AD治疗药物、提高AD临床治疗效果、降低药物副作用等具有重要意义。
发明内容
本发明于针对上述技术问题，提出一种防己提取物及防己诺林碱在制药中的应用，尤其涉及防己提取物及其效用成分防己诺林碱在抗乙酰胆碱酯酶活性方面的新用途，及它们在与其它中药提取物或效用成分配伍后增强乙酰胆碱酯酶抑制活性方面的应用，以用于阿尔茨海默症的防治药物的制备中。
本发明所提出的技术方案如下：
本发明提出了一种乙酰胆碱酯酶抑制剂，包括防己提取物。
本发明上述的乙酰胆碱酯酶抑制剂中，防己提取物通过水煎煮的处理方式从防己中提取，再浓缩至干得到。
本发明上述的乙酰胆碱酯酶抑制剂中，还包括黄连提取物或黄柏提取物。
本发明上述的乙酰胆碱酯酶抑制剂中，黄连提取物通过水煎煮的处理方式从黄连中提取，再浓缩至干得到；
黄柏提取物通过水煎煮的处理方式从黄柏中提取，再浓缩至干得到。
本发明还提出了一种乙酰胆碱酯酶抑制剂，包括防己诺林碱。
本发明上述的乙酰胆碱酯酶抑制剂中，还包括小檗碱、或黄连碱、或石杉碱甲、或盐酸多奈哌齐。
本发明还提出了一种如上所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂的应用，乙酰胆碱酯酶抑制剂用于制备阿尔茨海默症的防治药物。
乙酰胆碱酯酶抑制剂是目前治疗AD主要药物，但由于现有的AD临床治疗药物乙酰胆碱酯酶抑制剂如他克林、多奈哌齐等药物多存在疗效弱、毒副作用大等不足，亟待通过多种途径筛选新型高效、低毒的乙酰胆碱酯酶先导化合物，开发AD临床治疗药物。本发明提供了一种新发现的具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的中药提取物及效用成分防己诺林碱在制备预防和治疗AD药物中的应用，并进一步借鉴中药复方配伍的思路与方法，提供了能够发挥协同增效抑制乙酰胆碱酯酶活性的防己-黄连、防己-黄柏提取物配伍组合物，以及防己诺林碱分别与黄连碱、小檗碱、石杉碱甲、盐酸多奈哌齐配伍的组合物在制备预防和治疗AD药物中的应用，为预防和治疗AD提供了新的药物候选来源，在提高AD临床治疗效果、降低药物毒副作用等方面具有重要意义。
附图说明
图1为防己、黄连提取物及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图；
图2为防己、黄连提取物在质量比85：1配伍下的Fa-C曲线图；
图3为防己、黄柏提取物及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图；
图4为防己、黄柏提取物在质量比4.7：1配伍下的Fa-C曲线图；
图5为防己诺林碱、黄连碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图；
图6为防己诺林碱、黄连碱在摩尔浓度比1：5配伍下的Fa-C曲线图；
图7为防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图；
图8为防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：5配伍下的Fa-C曲线图；
图9为防己诺林碱、石杉碱甲及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图；
图10为防己诺林碱、石杉碱甲在摩尔浓度比50：1配伍下的Fa-C曲线图；
图11为防己诺林碱、盐酸多奈哌齐及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图；
图12为防己诺林碱、盐酸多奈哌齐在摩尔浓度比1000：1配伍下的Fa-C曲线图。
具体实施方式
本发明的目的是从具有AD临床治疗作用的中药复方、对药、单味药中寻找新型乙酰胆碱酯酶抑制剂，筛选其效用成分，研究它们与现有的乙酰胆碱酯酶抑制剂配伍后，对乙酰胆碱酯酶抑制活性的协同配伍药效作用，为预防及治疗AD提供新的药物来源。
发明人首次发现防己提取物具有一定的抗乙酰胆碱酯酶活性，并且将其与黄连提取物、黄柏提取物分别按一定比例配伍后，均能够针对治疗AD的关键靶标乙酰胆碱酯酶，产生较好的协同配伍抑制作用。
进一步的，本发明活性组分为防己单个提取物，防己、黄连提取物配伍组合物，防己、黄柏提取物配伍组合物。对于防己提取物，其单独使用具有抗乙酰胆碱酯酶活性作用；对于防己、黄连提取物配伍组合物，其质量比为85：1；对于防己、黄柏提取物，其质量比为4.7：1。
进一步的，本发明发现，防己提取物中的效用成分防己诺林碱具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性，并且将其与黄连碱、小檗碱、盐酸多奈哌齐、石杉碱甲等已知的乙酰胆碱酯酶抑制剂分别按一定比例配伍后，均能够针对AD治疗的关键靶标乙酰胆碱酯酶，产生明显的协同配伍抑制作用。
进一步的，本发明活性成分为单个防己诺林碱，防己诺林碱与黄连碱配伍组合物，防己诺林碱与小檗碱配伍组合物，防己诺林碱与盐酸多奈哌齐配伍组合物，防己诺林碱与石杉碱甲配伍组合物。对于防己诺林碱，其单个化合物具有抗乙酰胆碱酯酶活性作用；对于防己诺林碱与黄连碱的配伍组合物，其摩尔比为1：5；对于防己诺林碱与小檗碱的配伍组合物，其摩尔比为1：5；对于防己诺林碱与盐酸多奈哌齐的配伍组合物，其摩尔比为1000：1；对于防己诺林碱与石杉碱甲的配伍组合物，其摩尔比为50：1。
进一步的，上述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的防己提取物和其效用成分防己诺林碱，具有协同抑制乙酰胆碱酯酶活性的防己、黄连或防己、黄柏提取物配伍组合物，和具有协同效应的防己诺林碱与黄连碱、小檗碱、石杉碱甲、盐酸多奈哌齐分别配伍后的组合物，它们可以应用于制备预防和治疗阿尔茨海默症的药物或保健品。药物或保健品的剂型为粉剂、片剂、冲剂、胶囊剂或口服液，根据不同剂型，选择合适的药物上可接受的载体，为本领域常规技术，在此不再详述。
本发明中活性提取物、提取物中活性成分所涉及的相关中药复方、对药及单味药在乙酰胆碱酯酶活性调节、治疗AD方面相关报道如下：
黄连、黄柏、防己均有以复方配伍形式治疗AD的临床应用记载。已有较多研究报道表明，黄连、黄柏提取物及其所含主要效用成分生物碱(黄连碱、小檗碱等)能够针对AD靶点乙酰胆碱酯酶发挥较好的活性抑制作用。治疗血管性痴呆的防己地黄汤中的主要配伍药味防己所含主要效用成分亦为生物碱类化合物，而关于防己及其效用成分对于乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究尚未有相关报道。此外，关于防己与其它中药提取物配伍抑制乙酰胆碱酯酶活性，或防己效用成分防己诺林碱与现有的乙酰胆碱酯酶抑制剂(如小檗碱、黄连碱、石杉碱甲、盐酸多奈哌齐等)配伍协同抑制乙酰胆碱酯酶活性亦未见相关报道。
发明人首次发现防己提取物及效用成分防己诺林碱抑制乙酰胆碱酯酶活性的新用途。进一步的，将防己与黄连或黄柏提取物分别按一定比例进行配伍，或将防己中效用成分防己诺林碱与黄连、黄柏中效用成分及现有的乙酰胆碱酯酶抑制剂盐酸多奈哌齐、石杉碱甲分别按一定比例配伍后，均能发挥明显的协同抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。防己、黄连、黄柏为临床常用中药，将防己与黄连、黄柏配伍，或将活性成分防己诺林碱与黄连碱、小檗碱、石杉碱甲、盐酸多奈哌齐等配伍，用于增强AD靶点治疗作用，是本发明首次发现，为防治AD提供了新的候选药物来源，对于提高AD临床治疗效果、降低药物毒副作用等具有重要意义。
为了使得发明的技术方案、技术目的以及技术效果更为清楚，以使得本领域技术人员能够理解和实施本发明，下面将结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1防己、黄连提取物及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性研究
1材料与试剂
1.1药物与试剂
防己提取物、黄连提取物为实验室自制(取单味药材，水煎煮提取2次，每次10倍量水，合并提取物，浓缩至干，即得药材提取物)。
DTNB(Lot 16262)、碘化乙酰胆碱(ATCh，Lot BCBV4822)、四异丙基焦磷酸亚胺(iso-OMPA，Lot BCBW4257)购于西格玛奥德里奇(美国)公司；NP-40(Lot C10297258)，亮抑肽酶(Lot C10079991)，抑肽酶(Lot C10060365)，胃蛋白酶抑制剂(Lot B10084382)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Lot B10094032)、苯甲脒盐酸盐(Lot C10089171)及其它分析试剂均购于上海麦克林生化科技有限公司。
1.2动物脑裂解液的制备
选择C57BL/6雄性小鼠(香港科技大学，动、植物护理中心)，小鼠脱颈处死，分取大脑置-80℃脱水4h。精密称取小鼠大脑，用低盐裂解液在冰上研磨大脑组织15min(1:10w/v,包含10mM HEPES、1mM乙二胺四乙酸、1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、150mM氯化钠、0.5％聚乙二醇辛基苯基醚、10μg/mL亮抑肽酶、10μg/mL抑肽酶、10μg/mL胃蛋白酶抑制剂及50μg/mL苯甲脒盐酸盐)，进行组织匀浆。匀浆混合液在4℃下，以16000g离心15min，分取上清，即得含有乙酰胆碱酯酶的小鼠大脑裂解液，-80℃保存，待用。
2实验方法
2.1药物配制
取防己提取物适量，用DMSO溶解至83.6mg/mL，并从起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。取黄连提取物提适量，用DMSO溶解并稀释至0.98mg/mL，并从起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。按质量比85：1，分别取防己与黄连提取物适量进行混合，用DMSO进行溶解，得到防己、黄连提取物配伍组合物溶液(防己83.6mg/mL、黄连0.98mg/mL)，并从起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。
各实验药物浓度梯度设置如下：防己提取物浓度为83.600、41.800、20.900、10.450、5.225、2.612、1.306mg/mL；黄连提取物浓度为0.980、0.490、0.245、0.122、0.062、0.031、0.015mg/mL；防己、黄连提取物配伍后的组合物浓度(以川黄连计)为0.980、0.490、0.245、0.122、0.062、0.031、0.015mg/mL。
2.2Ellman法测试防己、黄连提取物及二者配伍组合物抗乙酰胆碱酯酶活性
采用改良的Ellman法测定防己、黄连提取物及二者配伍组合物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用，每个药物浓度设置3个复孔。选取96孔细胞培养板进行Ellman法反应，反应液终体系体积为200μL。反应液包含80mM Na2HPO4(pH 7.4)、0.1mM iso-OMPA、0.625mMATCh、0.5mM DTNB。
药物、动物大脑裂解液与反应液在37℃孵育15分钟后，加入底物10μLATCh(12.5mM)、10μL DTNB(12.5mM)，将反应液在37℃孵育30分钟，采用BioTek EPOCH2酶标读数仪在405nm下测定各组药物吸光度(扣除背景及药物本身颜色干扰)，计算药物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率。抑制率计算公式如下：
抑制率＝(1－加药组OD值/空白对照组OD值)×100％。
2.3防己、黄连提取物配伍组合物抗乙酰胆碱酯酶活性的协同效应分析
采用中效原理和Chou-Talalay联合指数法对防己、黄连提取物配伍组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用进行测定。根据中效方程Fa/Fu＝(D/Dm)m计算单个或两个药物特定抑制率下的使用剂量。将中效方程转化为线性方程log(Fa/Fu)＝mlogD-mlogDm，D代表药物剂量，Fa代表小数抑制率，Fu＝1-Fa，Dm为中效浓度，代表50％效应时的药物浓度，m为线性方程直线的斜率。
根据Chou-Talalay方程(CI＝(D)1/(Dx)1+(Dx)2/(Dx)2)计算防己与黄连提取物的合用指数(CI)，D1、D2为防己与黄连提取物配伍组合物在X药物效应(乙酰胆碱酯酶活性抑制率)时各自的浓度，(Dx)1、(Dx)2为达到上述X药物效应时防己、黄连提取物单独使用时的浓度。评价二者对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用。当CI<1，两药合用效应为协同效应；当CI＝1，两药合用效应为相加效应；当CI>1，两药合用效应为拮抗效应。
3实验结果
3.1防己、黄连提取物及二者组合物的抗乙酰胆碱酯酶活性
图1为防己、黄连提取物及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图。结果表明，防己、黄连提取物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率均呈现浓度依赖性增加，其中防己提取物的IC50为577.71μg/mL，黄连提取物的IC50为4.11μg/mL。
在本实施例中，防己与黄连提取物的质量比为85：1。图1结果显示，二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率亦呈现浓度依赖性增加，且在低浓度配伍下，与防己、黄连提取物单独使用相比，达到特定药物效应时，组合物中单药的浓度明显降低。
3.2防己、黄连提取物配伍对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制效应分析
根据中效原理和Chou-Talalay联合指数法评价防己、黄连提取物在质量比85：1配伍下，二者的协同配伍效应。根据计算结果绘制不同效应下，防己与黄连提取物的合用指数(Fa-C曲线)，通过合用效应与合用指数曲线图评价防己、黄连的协同配伍效应。
图2为防己、黄连提取物在质量比85：1配伍下的Fa-C曲线图。结果表明，在低浓度配伍下，防己、黄连提取物配伍组合物(85：1)具有协同抑制乙酰胆碱酯酶活性作用，但随着配伍浓度升高，二者对乙酰胆碱酯酶的协同抑制作用降低。
结论：本发明采用改良的Ellman法测定防己、黄连提取物及二者配伍组合物对乙酰胆碱酯酶活性的影响，发现在低浓度配伍下，防己、黄连提取物配伍组合物(85：1)具有协同抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。
实施例2防己、黄柏提取物及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性研究
1材料与试剂
1.1药物与试剂
防己提取物、黄连提取物为实验室自制(取单味药材，水煎煮提取2次，每次10倍量水，合并提取物，浓缩至干，即得药材提取物)。
其余试剂同实施例1中1.1项药物与试剂。
1.2动物脑裂解液的制备
同实施例1中1.2项方法。
2实验方法
2.1药物配制
取防己提取物适量，用DMSO溶解至83.6mg/mL，并从起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。取黄柏提取物提适量，用DMSO溶解至17.92mg/mL，并从起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。按质量比4.7：1，分别取防己与黄柏提取物适量进行混合，用DMSO进行溶解，得到防己、黄柏提取物配伍组合物溶液(防己83.6mg/mL、黄柏17.92mg/mL)，并从起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。
各实验药物浓度梯度设置如下：防己提取物浓度为83.60、41.80、20.90、10.45、5.22、2.61、1.31mg/mL；黄柏提取物浓度为17.92、8.96、4.48、2.24、1.12、0.56、0.28mg/mL；防己、黄连提取物配伍后的组合物浓度(以黄柏计)为17.92、8.96、4.48、2.24、1.12、0.56、0.28mg/mL。
2.2Ellman法测试防己、黄柏提取物及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性同实施例1中2.2项方法。
2.3防己、黄柏提取物配伍组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用分析
同实施例1中2.3项方法。
3实验结果
3.1防己、黄柏提取物及二者组合物的抗乙酰胆碱酯酶活性
图3为防己、黄柏提取物及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图。结果表明，防己、黄柏提取物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率均呈现浓度依赖性增加，其中防己提取物的IC50为642.94μg/mL，黄柏提取物的IC50为22.19μg/mL。
在本实施例中，防己与黄柏提取物的质量比为4.7：1。图3结果显示，二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率亦呈现浓度依赖性增加，且与防己、黄柏提取物单独使用相比，达到特定药物效应时，组合物中单药的浓度明显降低。
3.2防己、黄柏提取物配伍对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制效应分析
根据中效原理和Chou-Talalay联合指数法评价防己、黄柏提取物在质量比4.7：1配伍下，二者的协同配伍效应。根据计算结果绘制不同效应下，防己与黄柏提取物的合用指数(Fa-C曲线)，通过合用效应与合用指数曲线图评价防己、黄柏的协同配伍效应。
图4为防己、黄柏提取物在质量比4.7：1配伍下的Fa-C曲线图。结果表明，防己、黄柏提取物在配伍组合物(4.7：1)具有明显的协同抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。由表1可知，当Fa＝0.5时，防己、黄柏提取物配伍组合物(4.7：1)能明显降低单药使用剂量。
表1
结论：本发明采用改良的Ellman法测定防己、黄柏提取物及二者配伍组合物对乙酰胆碱酯酶活性的影响，发现质量比为4.7：1时，防己、黄柏提取物的配伍组合物对乙酰胆碱酯酶活性具有明显的协同抑制作用。
实施例3防己诺林碱、黄连碱及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性研究
1材料与试剂
1.1药物与试剂
防己诺林碱(Lot S090409-10，purity 99％)和盐酸黄连碱(Lot DST170711-003，purity 99％)购于成都曼斯特生物科技有限公司。
其余试剂同实施例1中1.1项。
1.2动物脑裂解液的制备
同实施例1中1.2项方法。
2实验方法
2.1药物配制
精密称取防己诺林碱、盐酸黄连碱对照品适量，分别用DMSO溶解至50mM、25mM。
取防己诺林碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从0.4mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。取黄连碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从2mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。分别取适当体积的防己诺林碱、盐酸黄连碱母液进行混合，得到摩尔比1:5的防己诺林碱、盐酸黄连碱组合物溶液，用DMSO进行稀释，并从起始浓度(防己诺林碱0.4mM、盐酸黄连碱2mM)2倍梯度连续稀释成7个梯度。
各实验药物浓度梯度设置如下：防己诺林碱浓度为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mM；黄连碱浓度为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mM；防己诺林碱、黄连碱组合物浓度(以防己诺林碱计)为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mM。
2.2Ellman法测试防己诺林碱、黄连碱及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性同实施例1中2.2项方法。
2.3防己诺林碱、黄连碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用分析同实施例1中2.3项方法。
3实验结果
3.1防己诺林碱、黄连碱及二者组合物的抗乙酰胆碱酯酶活性
图5为防己诺林碱、黄连碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图。结果表明，防己诺林碱、黄连碱对乙酰胆碱酯酶活性抑制率均呈现浓度依赖性增加，其中防己诺林碱的IC50为2.04μM，黄连碱的IC50为14.83μM。
在本实施例中，防己诺林碱与黄连碱配伍的摩尔浓度比为1：5。图5结果显示，二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率亦呈现浓度依赖性增加，且与防己诺林碱、黄连碱单独使用相比，达到特定药物效应时，组合物中单药的浓度明显降低。
3.2防己诺林碱、黄连碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制效应分析
根据中效原理和Chou-Talalay联合指数法评价防己诺林碱、黄连碱在摩尔浓度比1：5配伍下，二者的协同配伍效应。根据计算结果绘制不同效应下，防己诺林碱与黄连碱的合用指数(Fa-C曲线)，通过合用效应与合用指数曲线图评价防己诺林碱、黄连碱的协同配伍效应。
图6为防己诺林碱、黄连碱在摩尔浓度比1：5配伍下的Fa-C曲线图。结果表明，防己诺林碱、黄连碱在摩尔浓度比1：5配伍下能够发挥明显的协同增强抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。由表2可知，当Fa＝0.5时，防己诺林碱、黄连碱按摩尔浓度1：5配伍后，能明显降低单药使用剂量。
表2
结论：本发明采用改良的Ellman法测定防己诺林碱、黄连碱、二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性的影响，发现摩尔比为1：5时，防己诺林碱和黄连碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性具有明显的协同抑制作用。
实施例4防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性研究
1材料与试剂
1.1药物与试剂
防己诺林碱(Lot S090409-10，purity 99％)和盐酸小檗碱(Lot S071016-5，purity 99％)购于成都曼斯特生物科技有限公司。
其余试剂同实施例1中1.1项。
1.2动物脑裂解液的制备
同实施例1中1.2项方法。
2实验方法
2.1药物配制
精密称取防己诺林碱、盐酸小檗碱对照品适量，分别用DMSO溶解至50mM、25mM。
取防己诺林碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从0.8mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。取盐酸小檗碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从4mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。分别取适当体积的防己诺林碱、盐酸小檗碱母液进行混合，得到摩尔比1：5的防己诺林碱、盐酸小檗碱组合物溶液，用DMSO进行稀释，并从起始浓度(防己诺林碱0.8mM、盐酸小檗碱4mM)2倍梯度连续稀释成7个梯度。
各实验药物浓度梯度设置如下：防己诺林碱浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125mM；盐酸小檗碱浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM；防己诺林碱、盐酸小檗碱组合物浓度(以防己诺林碱计)为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125mM。
2.2Ellman法测试防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性研究
同实施例1中2.2项方法。
2.3防己诺林碱、小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用分析同实施例1中2.3项方法。
3实验结果
3.1防己诺林碱、小檗碱及二者组合物的抗乙酰胆碱酯酶活性
图7为防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图。结果表明，防己诺林碱、小檗碱对乙酰胆碱酯酶活性抑制率均呈现浓度依赖性增加，其中防己诺林碱的IC50为2.18μM，小檗碱的IC50为2.58μM。
在本实施例中，防己诺林碱与小檗碱配伍的摩尔浓度比为1：5。图7结果显示，二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率亦呈现浓度依赖性增加，且与防己诺林碱、小檗碱单独使用相比，达到特定药物效应时，组合物中单药的浓度明显降低。
3.2防己诺林碱、小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制效应分析
根据中效原理和Chou-Talalay联合指数法评价防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：5配伍下，二者的协同配伍效应。根据计算结果绘制不同效应下，防己诺林碱与小檗碱的合用指数(Fa-C曲线)，通过合用效应与合用指数曲线图评价防己诺林碱、小檗碱的协同配伍效应。
图8为防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：5配伍下的Fa-C曲线图。结果表明，防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：5配伍下能够发挥明显的协同增强抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。由表3可知，当Fa＝0.5时，防己诺林碱、小檗碱按摩尔浓度1：5配伍后，能明显降低单药使用剂量。
表3
结论：本发明采用改良的Ellman法测定防己诺林碱、小檗碱、二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性的影响，发现摩尔比为1：5时，防己诺林碱和小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性具有明显的协同抑制作用。
实施例5防己诺林碱、石杉碱甲及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性研究
1材料与试剂
1.1药物与试剂
防己诺林碱(Lot S090409-10，purity 99％)购于成都曼斯特生物科技有限公司，石杉碱甲(Lot 102518-79-6，purity 99％)由香港赛马会中药研究院提供。
其余试剂同实施例1中1.1项。
1.2动物脑裂解液的制备
同实施例1中1.2项方法。
2实验方法
2.1药物配制
精密称取防己诺林碱、石杉碱甲对照品适量，分别用DMSO溶解至50mM、1mM。
取防己诺林碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从1mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。取石杉碱甲母液适量，用DMSO进行稀释，并从20μM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。分别取适当体积的防己诺林碱、石杉碱甲母液进行混合，得到摩尔比50：1的防己诺林碱、石杉碱甲组合物溶液，用DMSO进行稀释，并从起始浓度(防己诺林碱1mM、石杉碱甲20μM)2倍梯度连续稀释成7个梯度。
各实验药物浓度梯度设置如下：防己诺林碱浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156mM；石杉碱甲浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μM；防己诺林碱、石杉碱甲组合物浓度(以石杉碱甲计)为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μM。
2.2Ellman法测试防己诺林碱、石杉碱甲及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性
同实施例1中2.2项方法。
2.3防己诺林碱、石杉碱甲组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用分析
同实施例1中2.3项方法。
3实验结果
3.1防己诺林碱、石杉碱甲及二者组合物的抗乙酰胆碱酯酶活性
图9为防己诺林碱、石杉碱甲及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图。结果表明，防己诺林碱、石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶活性抑制率均呈现浓度依赖性增加，其中防己诺林碱的IC50为1.97μM，石杉碱甲的IC50为0.06μM。
在本实施例中，防己诺林碱与石杉碱甲配伍的摩尔浓度比为50：1。图9结果显示，二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率亦呈现浓度依赖性增加，且与防己诺林碱、石杉碱甲单独使用相比，达到特定药物效应时，组合物中单药的浓度明显降低。
3.2防己诺林碱、石杉碱甲组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制效应分析
根据中效原理和Chou-Talalay联合指数法评价防己诺林碱、石杉碱甲在摩尔浓度比50：1配伍下，二者的协同配伍效应。根据计算结果绘制不同效应下，防己诺林碱与石杉碱甲的合用指数(Fa-C曲线)，通过合用效应与合用指数曲线图评价防己诺林碱、石杉碱甲的协同配伍效应。
图10为防己诺林碱、石杉碱甲在摩尔浓度比50：1配伍下的Fa-C曲线图。结果表明，防己诺林碱、石杉碱甲在摩尔浓度比50：1配伍下能够发挥明显的协同增强抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。由表4可知，当Fa＝0.5时，防己诺林碱、石杉碱甲按摩尔浓度50：1配伍后，能明显降低单药使用剂量。
表4
结论：本发明采用改良的Ellman法测定防己诺林碱、石杉碱甲、二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性的影响，发现摩尔比为50：1时，防己诺林碱和石杉碱甲组合物对乙酰胆碱酯酶活性具有明显的协同抑制作用。
实施例6防己诺林碱、盐酸多奈哌齐及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性研究
1材料与试剂
1.1药物与试剂
防己诺林碱(Lot S090409-10，purity 99％)和盐酸多奈哌齐(Lot DST180603-749，purity 99％)购于成都曼斯特生物科技有限公司。
其余试剂同实施例1中1.1项。
1.2动物脑裂解液的制备
同实施例1中1.2项方法。
2实验方法
2.1药物配制
精密称取防己诺林碱、盐酸多奈哌齐对照品适量，分别用DMSO溶解至50mM、1mM。
取防己诺林碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从1mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。取盐酸多奈哌齐母液适量，用DMSO进行稀释，并从1μM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。分别取适当体积的防己诺林碱、盐酸多奈哌齐母液进行混合，得到摩尔比1000：1的防己诺林碱、盐酸多奈哌齐组合物溶液，用DMSO进行稀释，并从起始浓度(防己诺林碱1mM、盐酸多奈哌齐1μM)2倍梯度连续稀释成7个梯度。
各实验药物浓度梯度设置如下：防己诺林碱浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156mM；盐酸多奈哌齐浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156μM；防己诺林碱、盐酸多奈哌齐组合物浓度(以盐酸多奈哌齐计)为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156μM。
2.2Ellman法测试防己诺林碱、盐酸多奈哌齐及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性
同实施例1中2.2项方法。
2.3防己诺林碱、盐酸多奈哌齐组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用分析
同实施例1中2.3项方法。
3实验结果
3.1防己诺林碱、盐酸多奈哌齐及二者组合物的抗乙酰胆碱酯酶活性
图11为防己诺林碱、盐酸多奈哌齐及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图。结果表明，防己诺林碱、盐酸多奈哌齐对乙酰胆碱酯酶活性抑制率均呈现浓度依赖性增加，其中防己诺林碱的IC50为2.10μM，盐酸多奈哌齐的IC50为1.39nM。
在本实施例中，防己诺林碱与盐酸多奈哌齐配伍的摩尔浓度比为1000：1。图11结果显示，二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率亦呈现浓度依赖性增加，且与防己诺林碱、盐酸多奈哌齐单独使用相比，达到特定药物效应时，组合物中单药的浓度明显降低。
3.2防己诺林碱、盐酸多奈哌齐组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制效应分析
根据中效原理和Chou-Talalay联合指数法评价防己诺林碱、盐酸多奈哌齐在摩尔浓度比1000：1配伍下，二者的协同配伍效应。根据计算结果绘制不同效应下，防己诺林碱与盐酸多奈哌齐的合用指数(Fa-C曲线)，通过合用效应与合用指数曲线图评价防己诺林碱、盐酸多奈哌齐的协同配伍效应。
图12为防己诺林碱、盐酸多奈哌齐在摩尔浓度比1000：1配伍下的Fa-C曲线图。结果表明，防己诺林碱、盐酸多奈哌齐在摩尔浓度比1000：1配伍下能够发挥明显的协同增强抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。由表5可知，当Fa＝0.5时，防己诺林碱、盐酸多奈哌齐按摩尔浓度1000：1配伍后，能明显降低单药使用剂量。
表5
结论：本发明采用改良的Ellman法测定防己诺林碱、盐酸多奈哌齐、二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性的影响，发现摩尔比为1000：1时，防己诺林碱和盐酸多奈哌齐组合物对乙酰胆碱酯酶活性具有明显的协同增效抑制作用。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (1)
1.一种乙酰胆碱酯酶抑制剂，其特征在于，由防己诺林碱与盐酸多奈哌齐组成，或者由防己诺林碱与石杉碱甲组成；
对于防己诺林碱与盐酸多奈哌齐的配伍组合物，其摩尔比为1000：1；对于防己诺林碱与石杉碱甲的配伍组合物，其摩尔比为50：1。
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