CN110179794B - 用于抑制乙酰胆碱酯酶活性的技术 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种用于抑制乙酰胆碱酯酶活性的技术，其包括用于抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物组合物、阿尔茨海默病防治药及其生产方法；所述药物组合物，包括防己诺林碱与小檗碱，防己诺林碱和小檗碱的摩尔比为1：5～2：1。发明人借鉴中药复方配伍的思路与方法，将防己诺林碱与小檗碱进行组合，在乙酰胆碱酯酶抑制方面能够产生明显的协同配伍作用，降低了单味药使用剂量和毒性。

Description

用于抑制乙酰胆碱酯酶活性的技术
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种用于抑制乙酰胆碱酯酶活性的技术，其包括用于抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物组合物、阿尔茨海默病防治药及其生产方法；具体地，本发明涉及防己诺林碱的抗乙酰胆碱酯酶活性新用途，及防己诺林碱与小檗碱的配伍组合物在抗乙酰胆碱酯酶活性方面的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)为常见神经退行性疾病，其发病隐匿，疾病进程发展快，临床表现为认知、记忆、语言、活动能力等障碍，并伴随不同程度人格及行为等改变，是死亡率较高的神经退行性疾病。随着我国人口老龄化速度加快，其发病率呈逐年上升趋势。AD发病机制复杂，现代临床多用他克林、加兰他敏等乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂治疗，通过降低AChE对乙酰胆碱(ACh)的水解，改善中枢胆碱能神经传递效果，改善AD临床症状或延缓其进一步发展，但多存在副作用大、疗效弱等不足。目前尚缺乏治疗AD特效药。因此，亟待通过多种途径筛选新型高效、低毒的乙酰胆碱酯酶先导化合物，开发AD临床治疗药物。
中医、中药对精神情志系统疾病具有较好治疗效果，它们在AD治疗方面具有丰富临床经验。根据中医传统理论，精神情志活动尤其是谋虑、决断等高级智能活动与中医肝胆功能关系密切，根据临床辨证，通过清肝泻火、解郁开窍等手段，配伍相应药味施治，对AD认知能力下降、善忘颠倒、烦躁易怒、哭笑无常、多疑善虑等精神情志障碍具有较好调治效果，如基于清肝泻火的黄连解毒汤、基于滋阴降火的知柏地黄汤、基于滋阴利水的防己地黄汤等；基于清肝泻火法的黄连解毒汤能够通过清泻肝火、解郁开窍，对善忘颠倒、面赤口苦、烦躁易怒等肝火旺盛型AD临床症状具有较好缓解作用；基于滋阴降火法的知柏地黄汤能够通过清泻下焦火热、益肾填精，对髓海空虚所致善忘、健忘等AD临床症状具有较好缓解作用；此外，还有基于滋阴利水的防己地黄汤，在临床上能够有效改善血管性痴呆临床症状。它们临床应用历史悠久，疗效确切，安全性强，在改善AD临床症状，提高AD患者生活质量方面具有较好效果。
上述复方的主要结构类型为生物碱，其中代表性药味黄连、黄柏、防己所含成分均以生物碱为主，且多数表现出较好AChE靶点抑制作用。此外，含有这些成分的中药材具有多年临床使用经验，在药性、剂量及安全性等方面具有较多积累。因此，以AChE为靶标，从上述中药复方、对药及单味药中筛选AChE抑制活性生物碱先导化合物，研究它们之间的协同配伍药效，是筛选AD治疗药物的有效途径，对于提高AD临床治疗效果具有重要意义。
因此，本发明从具有AD治疗作用的中药复方、对药或单味药中寻找AChE抑制活性生物碱先导化合物，研究它们之间的协同配伍作用，对于增强AChE靶点抑制作用，降低用药剂量和毒性，提高AD治疗效果等具有重要意义。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提出一种用于抑制乙酰胆碱酯酶活性的技术。
本发明所提出的技术方案如下：
本发明提出了一种用于抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物组合物，包括防己诺林碱与小檗碱，防己诺林碱和小檗碱的摩尔比为1：5～2：1。
本发明还提出了一种如上所述的药物组合物的生产方法，包括将防己诺林碱母液、小檗碱母液进行混合的步骤。
本发明还提出了一种阿尔茨海默病防治药，包括如上所述的药物组合物。
本发明还提出了一种如上所述的阿尔茨海默病防治药的生产方法，包括将防己诺林碱母液、小檗碱母液进行混合的步骤。
本发明提供了一种新发现的具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的生物碱化合物(防己诺林碱)在制备预防和治疗AD药物中的应用，并进一步提供了能够发挥协同增效抑制乙酰胆碱酯酶活性的防己诺林碱和小檗碱组合物在制备预防和治疗AD药物中的应用，为预防和治疗AD提供了新的药物候选来源。发明人提供的具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的活性成分防己诺林碱、小檗碱均来自于临床已应用多年的常见中药，它们均有与其它中药配伍治疗痴呆的确切临床疗效。此外，发明人借鉴中药复方配伍的思路与方法，将防己诺林碱与小檗碱进行组合，在乙酰胆碱酯酶抑制方面能够产生明显的协同配伍作用，降低了单味药使用剂量和毒性。因此，将防己诺林碱及其与小檗碱的配伍组合物作为预防和治疗AD的临床治疗候选药物，成功率更高。
附图说明
图1为防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图；
图2为防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：5配伍下的Fa-C曲线图；
图3为防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图；
图4为防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：2配伍下的Fa-C曲线图；
图5为防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图；
图6为防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：1配伍下的Fa-C曲线图；
图7为防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图；
图8为防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比2：1配伍下的Fa-C曲线图。
具体实施方式
本发明的目的是从具有AD临床治疗作用的中药复方、对药、单味药中寻找得到具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的生物碱，将不同乙酰胆碱酯酶作用靶点生物碱进行组合，增强对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，为预防及治疗AD提供一种新的药物来源。
发明人首次发现防己地黄汤中防己所含的防己诺林碱具有较好乙酰胆碱酯酶抑制作用，并且将其与知柏地黄汤中黄柏所含小檗碱按一定比例配伍后，能够针对治疗AD的关键靶标乙酰胆碱酯酶，产生协同配伍抑制作用。
进一步的，本发明活性成分为单个防己诺林碱、防己诺林碱与小檗碱配伍后的组合物。对于防己诺林碱，其单个化合物具有抗乙酰胆碱酯酶活性作用，对于防己诺林碱与小檗碱的配伍组合物，二者的摩尔比为1：5～2：1。
发明人发现，将防己诺林碱与小檗碱按照上述摩尔比配伍形成的组合物，具有明显的协同抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。如果改用其他重量份数进行配伍，得到的配伍组合物虽然仍具有抑制乙酰胆碱酯酶活性，但其协同配伍作用下降或消失。尤其是，当防己诺林碱与小檗碱的摩尔比为1：5时，二者组合物对乙酰胆碱酯酶的协同抑制作用最佳。
进一步的，上述具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的防己诺林碱、具有协同增强抑制乙酰胆碱酯酶活性的防己诺林碱与小檗碱组合物可以应用于制备预防和治疗AD的药物或保健品。药物或保健品的剂型为粉剂、片剂、冲剂、胶囊剂或口服液，根据不同剂型，选择合适的药物上可接受的载体，为本领域常规技术，在此不再详述。
本发明中的活性成分，及活性成分所涉及的相关中药复方、对药及单味药在乙酰胆碱酯酶活性调节、治疗AD方面的相关报道如下：
防己诺林碱为中药防己中的生物碱类成分，也是药材中的主要活性成分。现有技术中未发现防己药材及其效用成分防己诺林碱在抗乙酰胆碱酯酶活性方面的报道。小檗碱是中药黄柏、黄连、三颗针中共有的生物碱化合物，亦是这些药材中主要药效成分。现有技术中已有其作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的报道，而关于黄连、黄柏与防己药材配伍，或它们主要效用成分小檗碱与防己诺林碱配伍抑制乙酰胆碱酯酶活性尚未有报道。
发明人首次发现防己中防己诺林碱抑制乙酰胆碱酯酶活性的新用途。进一步的，将防己诺林碱与小檗碱按一定比例配伍后的组合物，能发挥显著的协同抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。防己、黄柏为临床常用中药，将它们中所含有的防己诺林碱、防己诺林碱与小檗碱组合物用于预防和治疗AD是本发明首次发现，能够为治疗AD提供新的候选药物来源。
为了使得发明的技术方案、技术目的以及技术效果更为清楚，以使得本领域技术人员能够理解和实施本发明，下面将结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1防己诺林碱、小檗碱及二者组合物(1：5)抗乙酰胆碱酯酶活性研究
1材料与试剂
1.1药物与试剂
防己诺林碱(Lot S090409-10，purity 99％)和盐酸小檗碱(Lot S071016-5，purity 99％)购于成都曼斯特生物科技有限公司。DTNB(Lot 16262)、碘化乙酰胆碱(ATCh，Lot BCBV4822)、四异丙基焦磷酸亚胺(iso-OMPA，Lot BCBW4257)购于西格玛奥德里奇(美国)公司；NP-40(Lot C10297258)，亮抑肽酶(Lot C10079991)，抑肽酶(Lot C10060365)，胃蛋白酶抑制剂(Lot B10084382)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Lot B10094032)、苯甲脒盐酸盐(Lot C10089171)及其它分析试剂均购于上海麦克林生化科技有限公司。
1.2动物脑裂解液的制备
选择C57BL/6雄性小鼠(香港科技大学，动、植物护理中心)，小鼠脱颈处死后，分取小鼠大脑置-80℃脱水4h。精密称取小鼠大脑，用低盐裂解液在冰上研磨大脑组织15min(1:10w/v,包含10mM HEPES、1mM乙二胺四乙酸、1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、150mM氯化钠、0.5％聚乙二醇辛基苯基醚、10μg/mL亮抑肽酶、10μg/mL抑肽酶、10μg/mL胃蛋白酶抑制剂及50μg/mL苯甲脒盐酸盐)，进行组织匀浆。匀浆混合液在4℃下，以16000g离心15min，分取上清，即得含有乙酰胆碱酯酶的小鼠大脑裂解液，-80℃保存，待用。
2实验方法
2.1药物配制
精密称取防己诺林碱、盐酸小檗碱对照品适量，分别用DMSO溶解至50mM、25mM。
取防己诺林碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从0.8mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。取盐酸小檗碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从4mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。分别取适当体积的防己诺林碱、盐酸小檗碱母液进行混合，得到摩尔比1：5的防己诺林碱、盐酸小檗碱组合物溶液，用DMSO进行稀释，并从起始浓度(防己诺林碱0.8mM、盐酸小檗碱4mM)2倍梯度连续稀释成7个梯度。
各实验药物浓度梯度设置如下：防己诺林碱浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125mM；盐酸小檗碱浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM；防己诺林碱、盐酸小檗碱组合物浓度(以防己诺林碱计)为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125mM。
2.2Ellman法测试防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性
采用改良的Ellman法测定防己诺林碱、小檗碱及二者组合物的乙酰胆碱酯酶抑制活性，每个药物浓度设置3个复孔。选取96孔细胞培养板进行Ellman法反应，反应液终体系体积为200μL。反应液包含80mM Na2HPO4(pH 7.4)、0.1mM iso-OMPA、0.625mM ATCh、0.5mMDTNB。
药物、动物大脑裂解液与反应液在37℃孵育15分钟后，加入底物10μL ATCh(12.5mM)、10μL DTNB(12.5mM)，37℃孵育30分钟，采用BioTek EPOCH2酶标读数仪在405nm下测定各组药物吸光度(扣除背景及药物本身颜色干扰)，计算药物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率。
抑制率计算公式如下：
抑制率＝(1－加药组OD值/空白对照组OD值)×100％。
2.3防己诺林碱、小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用分析
采用中效原理和Chou-Talalay联合指数法对防己诺林碱、小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用进行测定。根据中效方程Fa/Fu＝(D/Dm)m计算单个或两个药物特定抑制率下的使用剂量。将中效方程转化为线性方程log(Fa/Fu)＝mlogD-mlogDm，D代表药物剂量，Fa代表小数抑制率，Fu＝1-Fa，Dm为中效浓度，代表50％效应时的药物浓度，m为线性方程直线的斜率。
根据Chou-Talalay方程(CI＝(D)1/(Dx)1+(Dx)2/(Dx)2)计算防己诺林碱与小檗碱的合用指数(CI)，D1、D2为防己诺林碱与小檗碱组合物在X药物效应(乙酰胆碱酯酶活性抑制率)时各自的浓度，(Dx)1、(Dx)2为达到上述X药物效应时防己诺林碱、小檗碱单独使用时的浓度。评价二者对乙酰胆碱酯酶的协同抑制作用。当CI<1，两药合用效应为协同效应；当CI＝1，两药合用效应为相加效应；当CI>1，两药合用效应为拮抗效应。
3实验结果
3.1防己诺林碱、小檗碱及二者组合物的抗乙酰胆碱酯酶活性
图1为防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线。结果表明，防己诺林碱、小檗碱对乙酰胆碱酯酶活性抑制率均呈现浓度依赖性增加，其中防己诺林碱的IC50为2.18μM，小檗碱的IC50为2.58μM。
在本实施例中，防己诺林碱与小檗碱配伍的摩尔浓度比为1：5。图1结果显示，二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率亦呈现浓度依赖性增加，且与防己诺林碱、小檗碱单独使用相比，达到特定药物效应时，组合物中单药的浓度明显降低。
3.2防己诺林碱、小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制效应分析
根据中效原理和Chou-Talalay联合指数法评价防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：5配伍下，二者的协同配伍效应。根据计算结果绘制不同效应下，防己诺林碱与小檗碱的合用指数(Fa-C曲线)，通过合用效应与合用指数曲线图评价防己诺林碱、小檗碱的协同配伍效应。
图2为防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：5配伍下的Fa-C曲线图。结果表明，防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：5配伍下能够发挥明显的协同增强抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。由表1可知，当Fa＝0.5时，防己诺林碱、小檗碱按摩尔浓度1：5配伍后，能明显降低单药使用剂量。
表1
Figure BDA0002109546320000071
Figure BDA0002109546320000081
结论：本发明采用改良的Ellman法测定防己诺林碱、小檗碱、二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性的影响，发现摩尔比为1：5时，防己诺林碱和小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性具有明显的协同抑制作用。
实施例2防己诺林碱、小檗碱及二者组合物(1：2)抗乙酰胆碱酯酶活性研究
1材料与试剂
1.1药物与试剂
同实施例1中1.1项药物与试剂。
1.2动物脑裂解液的制备
同实施例1中1.2项方法。
2实验方法
2.1药物配制
精密称取防己诺林碱、盐酸小檗碱对照品适量，分别用DMSO溶解至50mM、25mM。
取防己诺林碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从2mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。取盐酸小檗碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从4mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。分别取适当体积的防己诺林碱、盐酸小檗碱母液进行混合，得到摩尔比1:2的防己诺林碱、盐酸小檗碱组合物溶液，用DMSO进行稀释，并从起始浓度(防己诺林碱2mM、盐酸小檗碱4mM)2倍梯度连续稀释成7个梯度。
各实验药物浓度梯度设置如下：防己诺林碱浓度为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mM；盐酸小檗碱浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM；防己诺林碱、盐酸小檗碱组合物浓度(以防己诺林碱计)为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mM。
2.2Ellman法测试防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性
同实施例1中2.2项方法。
2.3防己诺林碱、小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用分析
同实施例1中2.3项方法。
3实验结果
3.1防己诺林碱、小檗碱及二者组合物的抗乙酰胆碱酯酶活性研究
图3为防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线。结果表明，防己诺林碱、小檗碱对乙酰胆碱酯酶活性抑制率均呈现浓度依赖性增加，其中防己诺林碱的IC50为2.10μM，小檗碱的IC50为2.19μM。
在本实施例中，防己诺林碱与小檗碱配伍组合物中二者的摩尔浓度比为1：2。图3结果显示，二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率亦呈现浓度依赖性增加，且与防己诺林碱、小檗碱单独使用相比，达到特定药物效应时，组合物中单药的浓度明显降低。
3.2防己诺林碱、小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制效应分析
根据中效原理和Chou-Talalay联合指数法评价防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1:2配伍下，二者的协同配伍效应。根据计算结果绘制不同效应下，防己诺林碱与小檗碱的合用指数(Fa-C曲线)，通过合用效应与合用指数曲线图评价防己诺林碱、小檗碱的协同配伍效应。
图4为防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：2配伍下的Fa-C曲线图。结果表明，防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：2配伍下能够发挥明显的协同增强抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。由表2可知，当Fa＝0.5时，防己诺林碱、小檗碱按摩尔浓度1：2配伍后，能明显降低单药使用剂量。
表2
Figure BDA0002109546320000091
Figure BDA0002109546320000101
结论：本发明采用改良的Ellman法测定防己诺林碱、小檗碱、二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性的影响，发现摩尔比为1：2时，防己诺林碱和小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性具有明显的协同增效抑制作用。
实施例3防己诺林碱、小檗碱及二者组合物(1：1)抗乙酰胆碱酯酶活性研究
1材料与试剂
1材料与试剂
1.1药物与试剂
同实施例1中1.1项药物与试剂。
1.2动物脑裂解液的制备
同实施例1中1.2项方法。
2实验方法
2.1药物配制
精密称取防己诺林碱、盐酸小檗碱对照品适量，分别用DMSO溶解至50mM、25mM。
取防己诺林碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从2mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。取盐酸小檗碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从4mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。分别取适当体积的防己诺林碱、盐酸小檗碱母液进行混合，得到摩尔比1：1的防己诺林碱、盐酸小檗碱组合物溶液，用DMSO进行稀释，并从起始浓度(防己诺林碱4mM、盐酸小檗碱4mM)2倍梯度连续稀释成7个梯度。
各实验药物浓度梯度设置如下：防己诺林碱浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM；盐酸小檗碱浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM；防己诺林碱、盐酸小檗碱组合物浓度(以防己诺林碱计)为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM。
2.2Ellman法测试防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性
同实施例1中2.2项方法。
2.3防己诺林碱、小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用分析
同实施例1中2.3项方法。
3实验结果
3.1防己诺林碱、小檗碱及二者组合物的抗乙酰胆碱酯酶活性研究
图5为防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线。结果表明，防己诺林碱、小檗碱对乙酰胆碱酯酶活性抑制率均呈现浓度依赖性增加，其中防己诺林碱的IC50为2.23μM，小檗碱的IC50为2.26μM。
在本实施例中，防己诺林碱与小檗碱配伍的摩尔浓度比为1：1。图5结果显示，二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率亦呈现浓度依赖性增加，且与防己诺林碱、小檗碱单独使用相比，达到特定药物效应时，组合物中单药的浓度明显降低。
3.2防己诺林碱、小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制效应分析
根据中效原理和Chou-Talalay联合指数法评价防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：1配伍下，二者的协同配伍效应。根据计算结果绘制不同效应下，防己诺林碱与小檗碱的合用指数(Fa-C曲线)，通过合用效应与合用指数曲线图评价防己诺林碱、小檗碱的协同配伍效应。
图6为防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：1配伍下的Fa-C曲线图。结果表明，防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1：1配伍下能够发挥明显的协同增强抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。由表3可知，当Fa＝0.5时，防己诺林碱、小檗碱按摩尔浓度1：1配伍后，能明显降低单药使用剂量。
表3
Figure BDA0002109546320000111
Figure BDA0002109546320000121
结论：本发明采用改良的Ellman法测定防己诺林碱、小檗碱、二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性的影响，发现摩尔比为1：1时，防己诺林碱和小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性具有明显的协同抑制作用。
实施例4防己诺林碱、小檗碱及二者组合物(2：1)抗乙酰胆碱酯酶活性研究
1材料与试剂
1.1药物与试剂
同实施例1中1.1项药物与试剂。
1.2动物脑裂解液的制备
同实施例1中1.2项方法。
2实验方法
2.1药物配制
精密称取防己诺林碱、盐酸小檗碱对照品适量，分别用DMSO溶解至50mM、25mM。
取防己诺林碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从4mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。取盐酸小檗碱母液适量，用DMSO进行稀释，并从2mM起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。分别取适当体积的防己诺林碱、盐酸小檗碱母液进行混合，得到摩尔比2：1的防己诺林碱、盐酸小檗碱组合物溶液，用DMSO进行稀释，并从起始浓度(防己诺林碱4mM、盐酸小檗碱2mM)2倍梯度连续稀释成7个梯度。
各实验药物浓度梯度设置如下：防己诺林碱浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM；盐酸小檗碱浓度为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mM；防己诺林碱、盐酸小檗碱组合物浓度(以防己诺林碱计)为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM。
2.2Ellman法测试防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性
同实施例1中2.2项方法。
2.3防己诺林碱、小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用分析
同实施例1中2.3项方法。
3实验结果
3.1防己诺林碱、小檗碱及二者组合物的抗乙酰胆碱酯酶活性研究
图7为防己诺林碱、小檗碱及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线。结果表明，防己诺林碱、小檗碱对乙酰胆碱酯酶活性抑制率均呈现浓度依赖性增加，其中防己诺林碱的IC50为2.25μM，小檗碱的IC50为2.23μM。
在本实施例中，防己诺林碱与小檗碱配伍的摩尔浓度比为2：1。图7结果可知，二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性抑制率亦呈现浓度依赖性增加，且与防己诺林碱、小檗碱单独使用相比，达到特定药物效应时，组合物中单药的浓度明显降低。
3.2防己诺林碱、小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制效应分析
根据中效原理和Chou-Talalay联合指数法评价防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比1:2配伍下，二者的协同配伍效应。根据计算结果绘制不同效应下，防己诺林碱与小檗碱的合用指数(Fa-C曲线)，通过合用效应与合用指数曲线图评价防己诺林碱、小檗碱的协同配伍效应。
图8为防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比2：1配伍下的Fa-C曲线图。结果表明，防己诺林碱、小檗碱在摩尔浓度比2：1配伍下能够发挥明显的协同增强抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。由表4可知，当Fa＝0.5时，防己诺林碱、小檗碱按摩尔浓度2：1配伍后，能明显降低单药使用剂量。
表4
Figure BDA0002109546320000131
Figure BDA0002109546320000141
结论：本发明采用改良的Ellman法测定防己诺林碱、小檗碱、二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性的影响，发现摩尔比为2：1时，防己诺林碱和小檗碱组合物对乙酰胆碱酯酶具有明显的协同抑制作用。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (4)

1.一种药物组合物应用于制备预防和治疗阿尔茨海默病的药物的应用，其特征在于，所述药物组合物由防己诺林碱与小檗碱组成，防己诺林碱和小檗碱的摩尔比为1：5、1：2、1：1、或2：1。
2.一种如权利要求1所述的药物组合物的生产方法，其特征在于，包括将防己诺林碱母液、小檗碱母液进行混合的步骤。
3.一种阿尔茨海默病防治药，其特征在于，包括如权利要求1所述的药物组合物。
4.一种如权利要求3所述的阿尔茨海默病防治药的生产方法，其特征在于，包括将防己诺林碱母液、小檗碱母液进行混合的步骤。
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