WO2015076286A1 - エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスと、その製法及び用途 - Google Patents

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ephedrine
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ephedrine alkaloid
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壽彦 花輪
須美子 日向
幸広 合田
昌司 日向
吉章 天倉
守生 好村
忠俊 山下
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株式会社常磐植物化学研究所
学校法人北里研究所
国立医薬品食品衛生研究所長
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Definitions

  • the present invention relates to a safer ephedrine alkaloid-depleted extract of rhubarb, a method for producing the same, and an anti-cancer and anti-metastatic drug, a pain suppressant, and an anti-influenza virus drug containing the same as an active ingredient.
  • Ephedra is the above-ground stalk of the Ephedra sinica Stapf, Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer or Ephedra equisetina Bunge (Ephedraceae).
  • Mao is the most important herbal medicine that has been used since ancient times, and is a traditional Chinese medicine that contains mao as a herbal medicine (prescription for Chinese medicine): Tori-tou (suzukito), toriyaku-jiyokuto (uyaku-jito-to), Eppiteu (Eppi-to), Ekikajatsu-to (Eppika-jutsu-to), Circulation powder (Kaishosanryo), Karada-no-ri (Kagasanryo), Sakage-to (Cucoch), Sakone-yukagawa Kyushin (Kudarenkyushini), Soneka Koshi-tsuto (Kokkonkanjuto), Sone Kakan Hengsyu-to (Kokk
  • Ephedra alkaloids As the active ingredient of Ephedra, ephedrine alkaloids ((-)-ephedrine, (+)-pseudoephedrine,) are famous, and in the Japanese Pharmacopoeia, Ephedra sinica Stapf, Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer or Ephedra equisetina When quantifying the dried ground stalk of Bunge (Ephedraceae), it is defined to contain 0.7% or more of total alkaloids (ephedrine and pseudoephedrine).
  • Non-patent Document 1 It is known that the central nervous system has central nervous system excitatory activity, sympathetic nervous system excitatory activity, sweating activity, antitussive activity, anti-inflammatory activity and anti-allergic activity (Non-patent document 1), and these pharmacological effects are considered to be derived from ephedrine alkaloid (Non-Patent Document 2). Furthermore, Ephedra has been used for various symptoms of physical pain, and the analgesic action of Ephedra has been explained by the anti-inflammatory action of pseudoephedrine (Non-patent Document 3).
  • the inventors of the present invention as a new pharmacological action of Ephedra, have an effect of suppressing cancer metastasis through the action of suppressing the motility of cancer cells, and an antitumor effect of suppressing the growth of cancer cells.
  • the molecular mechanism is that by suppression of HGF-Met-Akt signal by Met inhibition which is a receptor of hepatocyte growth factor (HGF) Have been reported (Patent Document 1, Non-Patent Document 5).
  • Non-patent Document 6 the flavonoid compound Herbacetin glycoside was found (Non-patent Document 6).
  • the content of helvacetin glycoside is as low as about 0.005%, and this component alone can not explain the new pharmacological action of Ephedra, and it is considered that a plurality of components are involved (Non-patent Document 7). Therefore, in order to make effective use of the medicinal effect of narcissus, it is desirable to use the narcissus extract as a medicine.
  • Non-patent Document 8 Because it has sympathetic nerve stimulation and central nervous system stimulation, people with angina pectoris, myocardial infarction, and high blood pressure are in principle contraindicated. In addition, for the elderly, it is necessary to use with caution. In addition, people with weak gastrointestinal tract can cause abdominal pain due to anorexia or acute gastric mucosal lesions. In addition, attention should be paid to palpitations, excitement, dysuria, insomnia, rash and the like (Non-patent Document 8). These side effects are considered to be derived from ephedrine alkaloids (Non-patent Document 9).
  • Ephesrae herba a major component of maoto, inhibitors the HGF-induced motility of human breast cancer MDA-MB-231 cells through suppression of c-Met tyrosine phosphorylation and c-Met expression. , 2011. Characterization of phenochemicals from Ephedra Herba extract. Molecules, 18, 5326-5334, 2013. Research on ingredients contained in Mao extract, Abstracts of the Annual Meeting of the Pharmaceutical Society of Japan, 133, No. 2, 185, 2013.
  • the present invention is a method for producing a safer ephedrine alkaloid-depleted Ephedra extract by removing ephedrine alkaloid from Ephedra extract while retaining some medicinal effects of Ephedra, and an antiprosthetic containing it as an active ingredient. It aims to provide cancer and antimetastatic drugs, pain control drugs and anti-influenza virus drugs.
  • Non-Patent Document 2 describes a method of removing alkaloid by treating Ephedra with NH 4 OH and ether to produce a de-alkaloid Ephedra extract.
  • the de-alkaloid extract prepared by this method contains residual total alkaloid at a high concentration (0.33-0.5%), and further, NH 4 OH treatment causes a chemical change in the structure of plant components.
  • NH 4 OH treatment causes a chemical change in the structure of plant components.
  • the alkaloid extract of alkaloids described in non-patent document 2 has lost all of the pharmacological effects possessed by Ephedra, it is a production method that affects the efficacy of Ephedra, and it is a pharmaceutical product by removing ephedrine alkaloid from Ephedra. It is an inappropriate way to use it.
  • the present inventors have intensively researched to solve the above problems by overcoming the problems such as high alkaloid content of the alkaloid extract of alkaloids, chemical structural change of the components, and loss of efficacy.
  • the present invention has succeeded in developing a mild manufacturing method for simply removing ephedrine alkaloid from majyu extract while maintaining the medicinal effect without affecting the structure of the components contained in majang extract. Furthermore, it is found that the ephedrine alkaloid-depleted extract of maphos extract obtained has an anti-cancer and anti-metastatic action, and also has an action for suppressing pain and an anti-influenza virus to complete the present invention. It reached.
  • the present invention provides the following (1) to (9).
  • Ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract obtained by removing ephedrine alkaloid from Ephedra extract.
  • the ephedrine alkaloid-depleted majo extract according to (1) which comprises ephedrine alkaloid in an amount of 0.23% or less.
  • the ephedrine alkaloid-depleted majo extract according to (1) which comprises ephedrine alkaloid in an amount of 0.023% or less.
  • a traditional Chinese medicine preparation comprising the ephedrine alkaloid-depleted maem extract according to any one of (1) to (5).
  • An anti-cancer and anti-metastatic drug comprising as an active ingredient the ephedrine alkaloid-depleted extract of cooked according to any one of (1) to (5).
  • a pain inhibitor comprising as an active ingredient the ephedrine alkaloid-depleted extract of sexual according to any one of (1) to (5).
  • An anti-influenza virus agent comprising the ephedrine alkaloid-depleted extract of majyu extract according to any of (1) to (5) as an active ingredient.
  • the method of the present invention it is possible to remove ephedrine alkaloid to 0.23% or less, or 0.023% or less, or 0.05ppm (detection limit) or less simply by passing the cooked extract through certain cation exchange columns. It is a simple and useful manufacturing method.
  • the ephedrine alkaloid-depleted extract of Ephedorin of the present invention suppresses the inhibitory activity of Met kinase, which has been clarified as a mechanism of the antimetastatic action of Ephedra, to the same extent as the original Ephedra extract, The cell growth of strain H1975 was inhibited in a concentration dependent manner as with the original E. coli extract.
  • the production method of the present invention can remove ephedrine alkaloid while maintaining the anti-cancer and anti-metastatic action through the MET inhibition possessed by Ephedra extract. It has become clear that it can provide anti-cancer and anti-metastatic drugs.
  • the ephedrine alkaloid-free extract of the present invention may be used as a safer anti-cancer and anti-metastatic drug, a pain-suppressing drug and an anti-influenza virus drug.
  • ephedrine alkaloid-depleted extract of cooked extract is a new type of cancer drug that can simultaneously treat cancer and cancer pain.
  • Ephedra is widely used as a component of herbal medicine, replacing Ephedra of the herbal medicine containing Ephedra with ephedrine alkaloid-depleted Ephedra extract can provide a more safe novel Kampo preparation.
  • Mao-to when Mao-to is used as an anti-cancer and anti-metastatic drug, it can be extended to patients susceptible to conventional Mao-to while imparting novel efficacy and effects.
  • Arthralgia in the elderly is one of the causes of poor quality of life (QOL), many of which are caused by osteoarthritis.
  • QOL quality of life
  • Such arthralgia accounts for about 10% of the causes of need-support and needs-care for the elderly and is the top cause of the need-support (Matsui, Y., National Center for Geriatrics & Gerontology, 42, 1 -4, 2013).
  • treatment for arthralgia mainly consists of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), it is difficult to take long-term side effects due to gastrointestinal disorders, and an analgesic drug that replaces NSAIDs is required.
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • Chinese herbal medicines including mao (Sakane-to, Ma-so-yu-kan-to, Yuk-ja-ka-to-yu, Hato-jin-to, etc.) are effective for treating arthralgia and their analgesic effect is moderate, so the patient's acute It is unlikely to cause an increase in activity and does not cause deterioration of osteoarthritis.
  • due to the side effects (such as palpitations, elevated blood pressure, insomnia, dysuria, etc.) of nausea it is necessary to be careful about the administration of the nauseum-containing traditional Chinese medicine to the elderly.
  • Mao-to which is used for the treatment of the initial stage of influenza, has an influenza therapeutic effect equivalent to that of the western drug oseltamivir (Nabeshima, S., et al., J. Trad. Med., 27, 148-156, 2010; M. Motomoto, Therapeutics, 40, 385-388, 2006), It is necessary to refrain from administration to elderly people and patients with sensitivity to asthma because of the side effects caused by asthma. However, if you use mao-to, which has been replaced with ephedrine-alkaloid-depleted mao extract, it will be possible to administer it to elderly people and patients with mapo-sensitivity.
  • mao-to was a traditional Chinese medicine that is difficult to be administered for a long time due to side effects caused by mapo, but if maho-to using ephedrine alkaloid-removed majo extract is used for prevention of influenza infection, prevention for people with high risk of infection It is possible to perform long-term
  • ephedrine alkaloid-depleted Ephedra extract has an action as anti-cancer and anti-metastatic drug, pain inhibitor and anti-influenza virus drug possessed by Ephedra extract, and is a causative agent of side effect It was confirmed that the ephedrine alkaloid can be used as a highly safe drug from which the alkaloid is selectively removed.
  • the present invention is a very important basic technology for providing ephedrine alkaloid-depleted majo extract as a pharmaceutical. The use of the present invention in the clinical field is expected.
  • FIG. 6 shows an HPLC chart of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract before and after ion exchange chromatography purification described in Example 4.
  • FIG. 6 shows the fingerprints of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract before and after ion exchange chromatography purification as described in Example 5.
  • FIG. FIG. 6 shows an LC-MS chart of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract before and after ion exchange chromatography purification described in Example 6.
  • Fig. 7 shows the MET kinase inhibitory action of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-depleted Ephedra extract described in Example 7.
  • Fig. 14 shows the suppressive action of the extract of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract on proliferation of human non-small cell lung cancer H1975 cells described in Example 8.
  • Fig. 10 shows the pain suppressive action of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-depleted Ephedra extract described in Example 9.
  • Fig. 10 shows the influenza virus infection inhibitory action of the extract of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract described in Example 10.
  • Fig. 10 shows the influenza virus infection inhibitory action of the extract of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract described in Example 10.
  • Ephedra extract Ephedra used in the present invention is the above-ground stalk of the phylum Ephedra sinica Stapf, Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer or Ephedra equisetina Bunge (Ephedraceae). Raw, dried or processed ground stems can be used.
  • the step of extraction of maem yellow performed in the manufacturing method of the present invention can be performed based on any of known methods.
  • the extraction solvent water or hot water, hot water, alcohol solvents, and other organic solvents such as acetone can be used.
  • alcohol solvents include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol and the like. These solvents may be used alone or in combination.
  • the amount of the extraction solvent is preferably 2 to 100 parts by weight based on the dry weight of hemp.
  • the extraction temperature is preferably 4-98 ° C.
  • the extraction time is preferably 30 minutes to 2 hours.
  • the extraction method can be performed by any method such as stirring extraction, immersion extraction, countercurrent extraction, ultrasonic extraction, supercritical extraction and the like.
  • the extract obtained, or the filtrate obtained by filtering the extract, or the concentrated solution obtained by concentrating the filtrate, and the dried product obtained by drying the concentrated solution obtained in this manner have the following cation components: Although it may be subjected to a purification step by exchange chromatography, it is preferred to roughly separate the components prior to that. For example, fine solid components can be easily removed by filtering or centrifuging using a suitable filter to prevent problems such as clogging of the column during the next chromatography. Can.
  • Example 1 the ephedrine alkaloid in the thus obtained Hemp extract was 4.74% (3.19% of ephedrine and 1.55% of pseudoephedrine).
  • Ephedrine Alkaloid-Depleted Enamel Extract The Ephedra extract obtained by the above-mentioned steps can be subjected to cation exchange chromatography to remove ephedrine, and after concentration and drying, an ephedrine alkaloid-removed Epileptic extract can be obtained.
  • the ephedrine alkaloid-depleted extract is sometimes abbreviated as EFM (ephedrine alkaloids free Mao extract).
  • ion exchange chromatography fillers for the preparation of the ephedrine alkaloid-depleted extract of the present invention. After treating the yellow extract with various ion exchange resins, ephedrine alkaloid contained in the extract was analyzed by TLC and HPLC. The ion exchange resin examined is a total of 22 types of 13 types of cation exchange resin, 1 type of amphoteric ion exchange resin, and 8 types of anion exchange resin. As a result, it was found that an ion effect resin suitable for ephedrine alkaloid removal is a cation exchange resin.
  • a cation exchange column suitable for the preparation of ephedrine alkaloid-depleted majo extract is as follows.
  • EFM with an ephedrine alkaloid content of 0.23% or less
  • EFM production with an ephedrine alkaloid content of 0.023% or less select as a column filler from weak acid cation exchange resin WK20, strong acid cation exchange resin SK104, SK110, SK110, SK1B, UBK530, PK216, IR120B, 1060H Can.
  • the strongly acidic cation exchange resin PK216 can be selected as a column filler, and from Example 2 and Example 3, strongly acidic cation exchange resins SK1B, IR120B Can also be selected.
  • the drying method can be performed by any method such as vacuum drying, lyophilization, spray drying and the like. If necessary, an excipient such as dextrin may be added.
  • the ephedrine alkaloid-free extract of the present invention is an ephedrine alkaloid-free extract derived from an extract of ephedrine alkaloid, preferably comprising ephedrine alkaloid (total of ephedrine and pseudoephedrine) in an amount of 0.23% or less. Is an ephedrine alkaloid in an amount of 0.023% or less, more preferably in an amount of 0.05 ppm (detection limit) or less.
  • Ephedra contains 0.7% or more of total alkaloids (ephedrine and pseudoephedrine) with respect to the dry matter of crude drug, and this amount is about 2.3% to 3.5% when converted to Ephedra extract. Since it is calculated that it contains as above, the ephedrine alkaloid-depleted majo extract according to the present invention is clearly distinguished from the lively extract currently used.
  • the alkaloid content of this EFM was determined from the following non-patent literature.
  • the active drug Yoshi Terasawa, Toshiaki Kita edited by "EBM Kampo" p8, March 20, 2003, Dental Dental Publishing Co., Ltd.
  • 10 minutes A content of 1 or less is considered to be extremely unlikely to appear in the pharmacological action.
  • the Ephedra extract contains 2.3% to 3.5% or more of ephedrine alkaloid, it is considered that the possibility of the appearance of the side effect of ephedrine alkaloid is extremely small by setting it to 0.23% to 0.35% or less of 1/10 of that. .
  • Chinese medicine preparations containing ephedrine alkaloid-removing extract from yellowtail extract Since lysotropin is widely used as a component herbal medicine for Chinese traditional medicine, replacing ephedrine alkaloid with ephedrine alkaloid-removed lyophilus extract eliminates the side effect caused by ephedrine alkaloid Provide a safer and more safe traditional Chinese medicine preparation.
  • Marikoku-kanto which is used for treatment of arthralgia, is composed of majo, apricot kernel, yokinin and licorice, it can be used to make herbal medicines other than makoto, ie, an extract prepared from mongolan, yokinin and licorice, By adding the ephedrine alkaloid-depleted majo extract, it is possible to produce kato well with less side effects.
  • Mao-to which is used in the early stage of influenza, is composed of Ephedra, Cinnamon, Apricot kernel, licorice
  • the addition of ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract to extracts prepared from Cinnamon, Apricot kernel, Licorice produces fewer adverse effects. Hot water can be made.
  • compositions comprising ephedrine alkaloid-depleted extract of rhubarb, which composition can be used as an anti-cancer / anti-metastatic drug, pain-suppressing drug, or anti-influenza virus drug, food, nutrition It may be in the form of a supplement or medicine.
  • the ephedrine alkaloid-depleted extract of macular yellow used in the composition one having an ephedrine alkaloid content as described above of 0.23% or less or 0.023% or less is preferable. More preferably, the ephedrine alkaloid content is 0.05 ppm (detection limit) or less.
  • composition of the present invention is a pharmaceutical composition
  • an orally administrable dosage form is preferred.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be in various dosage forms.
  • tablets, capsules, powders, granules, pills, solutions, emulsions, suspensions, solutions, perfuming agents, syrups, extracts, elixirs may be used. Not limited to these.
  • various pharmaceutically acceptable carriers can be added to the preparation.
  • excipients for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, colorants, sweeteners, flavoring agents, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, coatings, vitamin C, antioxidants
  • excipients binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, colorants, sweeteners, flavoring agents, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, coatings, vitamin C, antioxidants
  • it can contain, it is not limited to these.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be used in the range of 100 mg to 3 g as a daily dose for adults, when converted to ephedrine alkaloid-depleted majo extract. Based on the general dosage of Ephedra extract, it can be estimated as 740 mg to 770 mg as a daily dose for adults when converted to Ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract, but the side effects caused by ephedrine alkaloid are excluded, so administration It is possible to increase the quantity.
  • the daily dose can also be divided into several doses. It can also be administered in combination with other pain suppressing agents or anticancer agents.
  • compositions of the invention may also be in the form of food or nutraceuticals.
  • ephedrine alkaloid-depleted majo extract by blending ephedrine alkaloid-depleted majo extract with raw materials, it can be in the form of noodles, bread, candy, jelly, cookies, soup, health drink.
  • the types of cancer which can use the composition of the present invention as anticancer and antimetastatic drugs are mainly MET-expressing cancers.
  • MET is expressed on the surface of various cancer cells such as gastric cancer, colon cancer, lung cancer, ovarian cancer, breast cancer, osteosarcoma, brain tumor and so can be used for treatment of these cancers.
  • HGF-c-Met signals promote cancer cell proliferation, motility, cell dispersion, survival, angiogenesis, and are key to cancer cell proliferation, invasion, and metastasis. Therefore, the composition of the present invention is also effective as a cancer recurrence / metastatic drug.
  • Pain-suppressing drugs Diseases in which the composition of the present invention can be used as a pain-suppressing agent include muscle pain, arthralgia, back pain, rheumatism, gout, cancer pain and the like.
  • compositions of the present invention are effective for the prophylaxis and treatment of influenza virus infection.
  • Example 1 Preparation of Ephedra Extract.
  • the dried yellowish raw material was ground by a mixer, 500 mL of water was added to 50 g of the ground product, and the mixture was extracted with stirring at 95 ° C. for 1 hour. After solid-liquid separation, the extract was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The obtained supernatant was concentrated under reduced pressure at 60 ° C., and then dried under reduced pressure overnight at 60 ° C. to obtain 9.6 g of a sexual yellow extract.
  • Example 2 Preparation of Ephedrine Alkaloid-Depleted Ephedra Extract with Ion Exchange Resin SK1B.
  • Example 3 Preparation of Ephedrine Alkaloid-Depleted Ephedra Extract by Ion Exchange Resin IR120B.
  • Example 4 Comparison of the contents of ephedrine contained in the extract of Ephedra extract (Example 1) and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract (Example 2 and Example 3) by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC chart of the shiny extract (Example 1) and the ephedrine alkaloid-removed majo extract (Example 2) is shown in FIG.
  • Example 5 Comparison of the compositional components of Ephedra extract (Ex. 1) and Ephedrine alkaloid removed Ephedra extract (Ex. 2) by three dimensional high performance liquid chromatography (3D-HPLC).
  • the fingerprint of 3D-HPLC is shown in FIG.
  • Example 6 Compositional analysis and comparison study of Ephedra extract (Ex. 1) and Ephedrine alkaloid removed Ephedra extract (Ex. 2) by LC / MS Analysis condition column: Inertsil ODS-3 (2.1 ⁇ 150 mm I.D.
  • Example 7 MET Kinase Inhibitory Action of Ephedra Extract (Example 1) and Ephedrine Alkaloid-Depleted Ephedra Extract (Example 2)
  • the MET kinase activity is ADP associated with ATP consumption by the recombinant MET kinase domain using Poly E 4 Y 1 peptide as a substrate was used as an indicator.
  • Ephedra extract or Ephedrine alkaloid-depleted Ephedra extract (2 lots) will be 1 ⁇ g / mL, 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL, respectively Added and incubated for 1 hour at room temperature. After termination of the reaction, the ADP-Glo reagent was used to measure the luminol luminescence intensity depending on the amount of ADP, and the relative MET kinase activity was examined.
  • Example 8 Inhibitory Effect of Hemp Extract (Example 1) and Ephedrine Alkaloid-Depleted Extract (Example 2) on the Growth of Human Lung Cancer-Derived H1975 Cells
  • H1975 cells were purchased from the United States BioResource Bank (ATCC).
  • H1975 cells were suspended in 10% FCS-RPMI medium and seeded at 2 ⁇ 10 3 cells / 100 ⁇ L per well of a 96-well culture plate. After overnight culture, the culture supernatant is removed, and the extract of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract (3 lots) are added at 50, 100, 150, 200 ⁇ g / mL, respectively, and the control is 10% FCS-RPMI medium. Added.
  • Example 9 Inhibitory Effect of Ephedra Extract (Example 1) and Ephedrine Alkaloid-Depleted Ephedra Extract (Example 2) in Animal Studies on Pain
  • the experimental animals used were 48 4-week-old male ICR mice. Body weight was measured on the day of the experiment start, and divided into a control group, a playful extract 2 group and an ephedrine alkaloid-depleted hemp extract 2 group (the daily dose is 350 and 700 mg / kg, respectively) so as to be almost the same in each group.
  • Ephedra extract and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract were added with distilled water for injection and suspended with stirring at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the suspension was vortexed and homogenized just prior to oral administration and then dosed with a sonde.
  • a single dose of 175 mg / kg and 375 mg / kg was given twice a day (9 o'clock and 17 o'clock).
  • day 3 only one dose of 350 mg / kg or 700 mg / kg was given in the morning.
  • mice Six hours after the final administration in the morning on the third day, 20 ⁇ L of 2.5% formalin solution was subcutaneously administered to the plantar region. Immediately after administration, the mice were placed in a cylindrical plastic container (inner diameter 116 mm, height 152 mm) and videotaped for 45 minutes. Pain-related behaviors included the first phase, which occurred 10 minutes after administration, and the second phase, which occurred 15 minutes to 30 minutes, and measured the behavior time of licking or biting treatment legs at regular intervals. Statistical analysis was performed using Dunnett's tests for the pain behavior time of the control group and the test substance administration group, and the significance level was 5%.
  • the cooked extract significantly suppressed the phase 2 pain related behavior when administered at 700 mg / kg.
  • doses of ephedrine alkaloid-depleted extract of sau extract significantly suppress the pain-related behavior of the second phase in a concentration-dependent manner, and the pain suppressive action is better than that of the extract before ephedrine removal. It was high ( Figure 6). From the above results, it has become clear that ephedrine alkaloid-depleted Ephedra extract has a higher pain-suppressing effect than Ephedra extract.
  • Example 10 Influenza Virus Infection Inhibitory Effect of Ephedra Extract (Example 1) and Ephedrine Alkaloid-Depleted Ephedra Extract (Example 2)
  • the assay utilizes the fact that MDCK cells are lysed by infection with influenza virus, and residual cells are stained Detected by staining with
  • Ephedra extract and ephedrine alkaloid-depleted Ephedra extract were each prepared in a solution of 200 ⁇ g / mL in 10% FBS-MEM, and 10-step 2-fold dilution series were prepared and used as sample solutions.
  • a solution containing influenza virus (A / WSN / 33 (H1N1 strain)) was diluted to 1000 TCID 50 / mL with 10% FBS-MEM to obtain an influenza virus solution.
  • MDCK cells were suspended in 10% FBS-MEM and seeded at 3 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L per well of a 96-well culture plate.
  • the culture supernatant was removed, 100 ⁇ L of the sample solution was added to each well, and 100 ⁇ L of influenza virus solution or 10% FBS-MEM was further added. After culturing for 72 hours, the cells were stained with crystal violet, and the absorbance at 560 nm of each well was measured with a microplate reader.

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Abstract

　麻黄エキスからエフェドリンアルカロイドを除いたエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスおよびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造方法並びにそれを有効成分とする抗がん・抗転移薬、疼痛抑制薬、抗インフルエンザウイルス薬を提供する。

Description

エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスと、その製法及び用途
　本発明は、より安全性の高いエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスと、それを製造するための方法並びにそれを有効成分とする抗がん・抗転移薬、疼痛抑制薬、及び抗インフルエンザウイルス薬に関する。
　麻黄はマオウ科植物Ephedra sinica Stapf、Ephedra intermedia Schrenk et C. A. MeyerまたはEphedra equisetina Bunge（Ephedraceae）の地上茎である。麻黄は古来より使われてきた最重要の生薬であり、麻黄を構成生薬として含有する漢方薬（漢方処方）としては、鳥頭湯（うずとう）、鳥薬順気湯（うやくじゅんきとう）、越婢湯（えっぴとう）、越婢加朮湯（えっぴかじゅつとう）、回首散料（かいしゅさんりょう）、華蓋散料（かがいさんりょう）、葛根湯（かっこんとう）、葛根湯加川きゅう辛夷（かっこんとうかせんきゅうしんい）、葛根加朮附湯（かっこんかじゅつぶとう）、葛根加半夏湯（かっこんかはんげとう）、甘草麻黄湯（かんぞうまおうとう）、桂姜棗草黄辛附湯（けいきょうそうそうおうしんぶとう）、桂枝芍薬知母湯（けいししゃくやくちもとう）、桂枝二越婢一湯（けいしにえっぴいっとう）、桂枝麻黄各半湯（けいしまおうかくはんとう）、厚朴麻黄湯（こうぼくまおうとう）、五虎湯（ごことう）、五虎二陳湯（ごこにちんとう）、五積散料（ごしゃくさんりょう）、柴葛解肌湯（さいかつげきとう）、小青竜湯（しょうせいりゅうとう）、小続命湯（しょうぞくめいとう）、神秘湯（しんぴとう）、続命湯（ぞくめいとう）、大青竜湯（だいせいりゅうとう）、独活葛根湯（どっかつかっこんとう）、防風通聖散料（ぼうふうつうしょうさんりょう）、麻黄湯（まおうとう）、麻黄附子細辛湯（まおうぶしさいしんとう）、麻杏甘石湯（まきょうかんせきとう）、麻杏よく甘湯（まきょうよくかんとう）、射干麻黄湯（やかんまおうとう）、よく苡仁湯（よくいにんとう）、麗沢通気湯（れいたくつうきとう）などが挙げられる。また、現在、健康保険収載漢方処方中で麻黄を構成生薬として含む漢方処方は以下の16処方ある：越婢加朮湯（えっぴかじゅつとう）、葛根湯（かっこんとう）、葛根湯加川きゅう辛夷（かっこんとうかせんきゅうしんい）、葛根加朮附湯（かっこんかじゅつぶとう）、桂枝麻黄各半湯（けいしまおうかくはんとう）、五虎湯（ごことう）、五積散料（ごしゃくさんりょう）、小青竜湯（しょうせいりゅうとう）、神秘湯（しんぴとう）、続命湯（ぞくめいとう）、防風通聖散料（ぼうふうつうしょうさんりょう）、麻黄湯（まおうとう）、麻黄附子細辛湯（まおうぶしさいしんとう）、麻杏甘石湯（まきょうかんせきとう）、麻杏よく甘湯（まきょうよくかんとう）、よく苡仁湯（よくいにんとう）が挙げられる。
　麻黄の有効成分としては、エフェドリンアルカロイド類（(-)-ephedrine, (+)-pseudoephedrine,）が有名であり、日本薬局方においては、Ephedra sinica Stapf，Ephedra intermediaSchrenk et C. A. Meyer 又はEphedra equisetina Bunge（Ephedraceae）の地上茎を乾燥したものを定量するとき，総アルカロイド（エフェドリンおよびプソイドエフェドリン）０．７％以上を含むと規定されている。麻黄には中枢神経興奮作用、交感神経興奮作用、発汗作用、鎮咳作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用が知られており（非特許文献１）、これらの薬理作用は、エフェドリンアルカロイドに由来すると考えられてきた（非特許文献２）。さらに、麻黄は身体疼痛の諸症状に用いられており、麻黄の鎮痛作用はプソイドエフェドリンの抗炎症作用によって説明されている（非特許文献３）。一方、本発明者らは、麻黄の新たな薬理作用として、がん細胞の運動能抑制作用を介したがん転移抑制効果や、がん細胞の増殖抑制効果を介した抗腫瘍効果を、マウスを用いたin vivoの解析から明らかにし（非特許文献４）、その分子機構として、肝細胞増殖因子（HGF）の受容体であるMet阻害によるHGF-Met-Aktシグナルの抑制によるものであることを報告した（特許文献１、非特許文献５）。これらの作用はエフェドリンアルカロイド単独では観察されなかったため、活性成分を探索した結果、フラボノイド化合物ヘルバセチン（Herbacetin）配糖体を見出した（非特許文献６）。しかしながら、ヘルバセチン配糖体の含有量は約0.005%と低く、本成分のみで麻黄の新たな薬理作用を説明できず、複数の成分が関与していると考えられる（非特許文献７）。したがって、麻黄の薬効を有効に利用するためには、麻黄エキスのまま医薬品として用いることが望ましい。
　麻黄には、交感神経刺激作用及び中枢神経刺激作用があるので、狭心症、心筋梗塞、高血圧の既往のある人は原則として禁忌である。また、高齢者に対しては、注意して使用する必要がある。さらに、胃腸の弱い人は、食欲不振や急性胃粘膜病変による腹痛を引き起こす可能性がある。その他、動悸、興奮、排尿障害、不眠、発疹などに注意が必要である（非特許文献8）。これらの副作用は、エフェドリンアルカロイドに由来すると考えられている（非特許文献9）。米国では、麻黄をサプリメントとして使用していたが、過剰摂取などの不適切な使用から、死亡事故が発生したことを受け、FDAは、麻黄などのエフェドリンアルカロイドを含むものについては、一切の販売を禁止することを定め、消費者に対しても注意喚起している（2004年エフェドラ禁止令）。その根拠となったランドレポートでは、膨大な数の論文とFDAに届けられた百数十件の死亡例を含む1万数千件の副作用報告を綿密に検証し、麻黄製剤には動悸や悪心嘔吐などの軽度から中等度の副作用があると結論付けている（非特許文献10）。日本においては、麻黄は、専ら医薬品として使用される材料に分類されており、医薬品として承認されたものが使用を許されているが、医療の現場では、患者の体質や病状によっては重篤な副作用が生じることが懸念されているのが現状である。
　これまで、麻黄の薬効は、ほとんど全てエフェドリンアルカロイドに起因するものと信じられてきた。その根拠は、非特許文献２に記載の脱アルカロイド麻黄エキスが、麻黄の有する薬効を全て失っていたことによる。このことから、麻黄の主作用と副作用を分離することは困難であると考えられ、麻黄の副作用を除くために、麻黄からエフェドリンアルカロイドを除去するという発想は、これまで全くなかった。しかし、発明者らは、前述したように、麻黄に、エフェドリンアルカロイドに依存しない有用な薬効を見出だし、副作用の原因物質であるエフェドリンアルカロイドを選択的に除去することで、安全性の高い医薬品として麻黄エキスを提供できるとの発想に至った。
「麻黄を成分とするMET阻害剤」特願2009-86363（2009年3月31日）
麻黄の薬効・薬理、現代東洋医学、１５（４）、５５１－５５４、１９９４。 麻黄の薬理、現代東洋医学、１（２）、３４－３９、１９８０。 漢方薬の中での鎮痛剤の位置づけと種類、痛みと臨床、５（３）、２６２―２６８、２００５。 Basic research on the use of Kampo medicines to protect against cancer recurrence and metastasis, J. Trad. Med., ３０(1), 19-26, 2013。 Ephedrae herba, a major component of maoto, inhibits the HGF-induced motility of human breast cancer MDA-MB-231 cells through suppression ofc-Met tyrosine phosphorylation and c-Met expression. J. Trad. Med., 28, 128-138, 2011. Characterization of phenolic constitutes from Ephedra Herba extract. Molecules, 18, 5326-5334, 2013. 麻黄エキスに含まれる成分研究, 日本薬学会年会要旨集133年会2号, 185, 2013. 花輪壽彦著「漢方診療のレッスン」増補版、p46-47、金原出版、2003年 Haller CA, Benowitz NL., Adverse cardiovascular and central nervous system events associated with dietary supplements containing ephedra alkaloids, N Engl J Med. 2000 Dec 21;343(25):1833-8. Final Rule Declaring Dietary Supplements Containing Ephedrine Alkaloids Adulterated Because They Present an Unreasonable Risk. Federal Register: 69 (28), pp 6787-6854, 2004
　本発明は、麻黄の有するいくつかの薬効を保持したまま麻黄エキスからエフェドリンアルカロイドを除去することにより、安全性の高いエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを製造するための方法並びにそれを有効成分とする抗がん・抗転移薬、疼痛抑制薬及び抗インフルエンザウイルス薬を提供することを目的とする。
　非特許文献２には、麻黄をNH4OH及びエーテルで処理することによってアルカロイドを除去し、脱アルカロイド麻黄エキスを作製する方法が記載されている。しかし、この方法で作製した脱アルカロイド麻黄エキスは、残存総アルカロイドを高濃度（0.33-0.5%）で含んでおり、さらに、NH4OH処理は、植物成分の構造に化学的変化を起こすことから（大原誠資、木材学会誌、55, 59-68, 2009；D. Ferreira et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 203-208、1990）、元の麻黄エキスとは異なるartificialな成分を含有していると考えられる。非特許文献２の著者もこの件については言及している。また、非特許文献２に記載の脱アルカロイド麻黄エキスは、麻黄の有する薬理効果が全て失われていたことから、麻黄の薬効に影響を与える製造方法であり、麻黄からエフェドリンアルカロイドを除去して医薬品として利用するには、不適切な方法である。
　本発明者らは、脱アルカロイド麻黄エキスの高いアルカロイド含量や、含有成分の化学的な構造変化、さらに薬効消失といった問題点を克服し、上記の課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、麻黄エキスの含有する成分の構造に影響を与えず、薬効を保持したままで、麻黄エキスから簡便にエフェドリンアルカロイドを除去するマイルドな製造法の開発に成功した。さらに、得られるエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスが抗がん・抗転移作用を保持していること、加えて疼痛抑制作用及び抗インフルエンザウイルス作用も保持していることを見いだして、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明はより具体的には以下（１）～（９）を提供するものである。
（１）麻黄エキスからエフェドリンアルカロイドを除いたエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス。
（２）エフェドリンアルカロイドを0.23 %以下の量で含む（１）に記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス。
（３）エフェドリンアルカロイドを0.023 %以下の量で含む（1）に記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス。
（４）エフェドリンアルカロイドを０．０５ｐｐｍ（検出限界）以下の量で含む（1）に記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス。
（５）麻黄の抽出液／または抽出物の水溶液に含まれる成分のうち陽イオン交換樹脂に吸着されない成分を含む（１）～（４）のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス。
（６）（１）～（５）のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを含む漢方製剤。
（７）麻黄の抽出液および／または抽出物からイオン交換クロマトグラフィーによりエフェドリンアルカロイドを除去することを特徴とする（１）～（５）のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造方法。
（８）（１）～（５）のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを有効成分とする抗がん・抗転移薬。
（９）（１）～（５）のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを有効成分とする疼痛抑制薬。
（１０）（１）～（５）のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを有効成分とする抗インフルエンザウイルス薬。
本発明の方法は、麻黄エキスをある種の陽イオン交換カラムに通液させるだけで0.23％以下、あるいは0.023 ％以下、あるいは0.05ppm(検出限界)以下までエフェドリンアルカロイドを除去することが可能な極めて簡便で有用な製造方法である。また、本発明のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは、麻黄の抗転移作用の機構として明らかにされているMetキナーゼの阻害活性を元の麻黄エキスと同程度に抑制し、さらに、Met高発現ヒト肺癌細胞株H1975の細胞増殖を元の麻黄エキスと同様に濃度依存的に抑制した。これらの結果から、本発明の製造方法は、麻黄エキスの有するMET阻害を介した抗がん・抗転移作用を保持したままエフェドリンアルカロイドを除去できることを示しており、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを有効成分とする抗がん・抗転移薬を提供できることが明らかとなった。
　麻黄剤（麻黄を主薬とする漢方薬）は関節痛の治療薬としても頻用されることから、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの鎮痛効果に着目し、マウスを用いた疼痛試験（ホルマリン試験）によって評価した。その結果、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの経口投与によって、疼痛が有意に抑制され、麻黄エキスよりも高い疼痛抑制効果を示した。これまで、麻黄の鎮痛効果はプソイドエフェドリンに由来すると考えてられてきたことから、この結果はこれまでの麻黄に対する考えを覆す発見であった。したがって、本発明によって、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを有効成分とする疼痛抑制薬を提供できることが明らかとなった。
　麻黄剤のひとつである麻黄湯は、インフルエンザ初期の治療に用いられていることから、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスがインフルエンザウイルスの感染を抑制できるか、MDCK細胞を用いたインフルエンザウイルス感染試験で評価した。その結果、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは、元の麻黄エキスと同程度にインフルエンザウイルス感染を抑制した。したがって、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを有効成分とする抗インフルエンザウイルス薬を提供できることが明らかとなった。
　以上のことから、本発明のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスはより安全性の高い抗がん・抗転移薬、疼痛抑制薬及び抗インフルエンザウイルス薬としての利用が期待される。さらに、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは、がん治療とがん性疼痛の治療を同時に行うことができる新しいタイプのがん治療薬となる。
　麻黄は漢方薬の構成生薬として幅広く用いられていることから、麻黄を含有する漢方薬の麻黄を、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスに置き換えることで、より安全性の高い新規の漢方製剤を提供できる。
　例えば、麻黄湯を抗がん・抗転移薬として利用する際、新規の効能効果を付与しつつ、従来の麻黄湯に感受性の患者にも適応拡大できる。
　また、例えば、高齢者の関節痛利用への応用が可能である。高齢者の関節痛は、クオリティ・オブ・ライフ(QOL)低下の原因のひとつであり、その多くは変形性関節症によって生じる。このような関節痛は、高齢者の要支援・要介護の原因の約1割を占め、要支援の原因のトップとなっている（Matsui, Y., National Center for Geriatrics & Gerontology, 42, 1-4, 2013）。関節痛の治療は、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）が中心であるが、副作用の胃腸障害から長期の服用が困難であり、NSAIDsに代わる鎮痛薬が求められている。最近、ある製薬企業が、鎮痛作用を有する抗体医薬品の開発を行い、臨床治験を行ったが、一部の患者で変形性関節症が悪化し治験が中止となった（Yamaguchi, A, Drug Delivery System, 26(5), 457-460, 2011）。この症状悪化は、強い鎮痛効果により、患者の行動が急激に増加したことが原因と考えられている。一方、麻黄を含む漢方薬（葛根湯、麻杏よく甘湯、越婢加朮湯、よく苡仁湯など）は、関節痛の治療に有効であり、その鎮痛効果は緩やかなため、患者の急激な活動増加を招きにくく、変形性関節症の悪化を起こすことがない。しかし、麻黄の副作用（動悸、血圧上昇、不眠、排尿障害など）のため、麻黄含有漢方薬の高齢者への投与は注意を要する。これらの漢方薬の麻黄をエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスに置き換えた漢方製剤を用いることで、変形性関節症の悪化を起こすことなく、安全に、高齢者の関節痛をコントロールすることができ、QOLの改善に寄与できる。
　さらに、インフルエンザ初期の治療に用いられる麻黄湯は、臨床研究から、西洋薬のオセルタミビルと同程度のインフルエンザ治療効果を有することが報告されているが（Nabeshima, S., et al., J. Trad. Med., 27, 148-156, 2010；木本博史, 治療学, 40, 385-388, 2006）、麻黄による副作用から、高齢者や麻黄感受性の患者への投与は控える必要がある。しかし、麻黄をエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスに置き換えた麻黄湯を用いれば高齢者や麻黄感受性の患者への投与が可能になる。また、麻黄湯は麻黄による副作用から、長期投与が難しい漢方薬であったが、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを用いた麻黄湯を用いれば、インフルエンザ感染予防の目的で、感染の危険性が高い人に予防的投与を長期に行うことが可能となる。
　本願発明により、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスが、麻黄エキスの有する抗がん・抗転移薬、疼痛抑制薬、及び抗インフルエンザウイルス薬としての作用を有することが明らかになり、かつ副作用の原因物質であるエフェドリンアルカロイドが選択的に除去された、安全性の高い医薬品として用いうることが確認された。本発明は、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを医薬品として提供するための極めて重要な基盤技術である。本願発明の臨床分野における利用が期待される。
実施例４に記載する、イオン交換クロマトグラフィー精製前後の麻黄エキス及びエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスのHPLCチャートを示す。 実施例５に記載する、イオン交換クロマトグラフィー精製前後の麻黄エキス及びエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスのフィンガープリントを示す。 実施例６に記載する、イオン交換クロマトグラフィー精製前後の麻黄エキス及びエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスのLC-MSチャートを示す。 実施例７に記載する、麻黄エキスおよびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスのMETキナーゼ阻害作用を示す。 実施例８に記載する、麻黄エキスおよびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスのヒト非小細胞肺がんH1975細胞の増殖に対する抑制作用を示す。 実施例９に記載する、麻黄エキスおよびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの疼痛抑制作用を示す。 実施例１０に記載する、麻黄エキスおよびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスのインフルエンザウイルス感染抑制作用を示す。 実施例１０に記載する、麻黄エキスおよびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスのインフルエンザウイルス感染抑制作用を示す。
麻黄エキス
　本発明に用いられる麻黄はマオウ科植物Ephedra sinica Stapf、Ephedra intermedia Schrenk et C. A. MeyerまたはEphedra equisetina Bunge （Ephedraceae）の地上茎を用いる。生、乾燥もしくは地上茎を加工したものを利用できる。
　本発明の製造方法において行なう麻黄の抽出工程は、周知の方法のいずれかに基づいて行なうことができる。抽出溶媒としては、水または温水、熱水、アルコール系溶媒、およびアセトンなどその他の有機溶媒を用いることができる。アルコール系溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノールなどを例示することができる。これらの溶媒は単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
　抽出溶媒の量は麻黄の乾燥重量に対して、２－１００重量部が好ましい。抽出温度は４－９８℃が好ましい。抽出時間は３０分－２時間が好ましい。抽出方法は攪拌抽出、浸漬抽出、向流抽出、超音波抽出、超臨界抽出などの任意の方法で行うことができる。
　得られた抽出液、または抽出液を濾過し得られた濾液、もしくは濾液を濃縮した濃縮液、濃縮液を乾燥して得られる乾燥物をこのようにして得られた抽出成分は次の陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程に付してもよいが、その前に構成成分を粗く分離しておくのが好ましい。例えば、適当なフィルターを用いて濾過したり、遠心分離したりすることによって、細かい固体成分を簡単に除去することができ、次のクロマトグラフィーを行なう際にカラムが詰まるなどのトラブルを防止することができる。
　後述する実施例１では、このようにして得られた麻黄エキス中のエフェドリンアルカロイドは４．７４％（エフェドリンが３．１９％、プソイドエフェドリンが１．５５％）であった。
エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス
　上記工程を経ることによって得られる麻黄エキスは、陽イオン交換クロマトグラフィーによってエフェドリンを除去し、濃縮乾燥を経て、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを得ることができる。エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは、EFM（ephedrine alkaloids free Mao extract）と略記されることもある。
　本発明のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造に適したイオン交換クロマトグラフィーの充填剤を決定するために検討を行った。麻黄エキスを各種イオン交換樹脂で処理した後に、エキスに含まれるエフェドリンアルカロイドをTLC及びHPLCで解析した。検討したイオン交換樹脂は、陽イオン交換樹脂13種類、両性イオン交換樹脂1種類、陰イオン交換樹脂8種類の計22種類である。その結果、エフェドリンアルカロイド除去に適したイオン効果樹脂は、陽イオン交換樹脂であることがわかった。そこで、弱酸性陽イオン交換樹脂WK１０、WK１１、WK２０、WK４０L、FPC３５００、強酸性陽イオン交換樹脂SK１０４、SK１１０、SK１B、UBK５３０、UBK１２、PK２１６、IR１２０B、１０６０Hを用いて、麻黄エキスを処理した後のエキスに含まれるエフェドリンアルカロイド含量をHPLCにより定量した。その結果を下記の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上の結果から、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造に適した陽イオン交換カラムは、次のようになる。エフェドリンアルカロイド含量が0.23%以下のEFMの製造には、弱酸性陽イオン交換樹脂WK２０、強酸性陽イオン交換樹脂SK１０４、SK１１０、SK１B、UBK５３０、PK２１６、IR１２０B、FPC3500、１０６０Hの中からカラム充填剤として選択することができる。エフェドリンアルカロイド含量が0.023 %以下のEFM製造には、弱酸性陽イオン交換樹脂WK２０、強酸性陽イオン交換樹脂SK１０４、SK１１０、SK１B、UBK５３０、PK２１６、IR１２０B、１０６０Hの中からカラム充填剤として選択することができる。さらに、エフェドリンアルカロイド含量が0.05ppm以下のEFMの製造には、強酸性陽イオン交換樹脂PK216をカラム充填剤として選択できるほか、実施例2及び実施例3から、強酸性陽イオン交換樹脂SK１B、IR１２０Bも選択することができる。
　クロマトグラフィーの具体的な実施方法は、当業者に周知な方法のいずれかによる。
　乾燥方法は、減圧乾燥、凍結乾燥、スプレー乾燥などの任意の方法で行うことができる。必要な場合にはデキストリンなどの賦形剤を入れてもよい。
　本発明のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは、麻黄エキスからエフェドリンアルカロイドを除いたエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスであり、エフェドリンアルカロイド（エフェドリンとプソイドエフェドリンの合計）を0.23 %%以下の量で含むものが好ましく、より好ましくはエフェドリンアルカロイドを0.023 %%以下の量で含むものであり、さらに好ましくは0.05ppm(検出限界)以下の量で含む。
　日本薬局方では、麻黄は生薬の乾燥物に対し，総アルカロイド（エフェドリン及びプソイドエフェドリン）を０．７％以上含むと規定されており、この量は麻黄エキスで換算した場合、約2.3 %～3.5 ％以上含むものと計算されるので、本発明のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは現在使用されている麻黄エキスと明確に区別される。
　なお、上記の麻黄エキス中の総アルカロイド含量の換算は、非特許文献（成川一郎「漢方の主張―現代科学と漢方製剤」ｐ１６２－１６３、（株）健友館、1991年発行）及び実施例1から求められる。EFMの製造に用いた日本薬局方の麻黄から、麻黄エキスを作製すると、麻黄に含まれるエフェドリンアルカロイドは、ほぼ全て麻黄エキスへ移行する。しかし、麻黄から得られる麻黄エキスの収率は20%から30%になるため、麻黄エキスに含まれる総アルカロイドは、3.3倍～5倍に濃縮される。したがって、局方で規定される麻黄の総アルカロイド0.7%以上を3.3倍～5倍にした数値 2.3 %～3.5 %以上が麻黄エキスの総アルカロイドの規定値となる。
　本EFMのアルカロイド含量は、以下の非特許文献から定めた。漢方薬のプラセボを作製する場合、10%の実薬を混合することから（寺澤捷年、喜多敏明 編集「EBM漢方」p8, 2003年3月20日,医歯薬出版株式会社）、１０分の１以下の含量ならば、その薬理作用が出現する可能性が極めて低いと考えられる。麻黄エキスでは2.3 %～3.5 %以上エフェドリンアルカロイドを含有することから、その１０分の１の0.23 %～0.35 %以下とすることで、エフェドリンアルカロイドの副作用の出現の可能性が極めて少ない数値と考えられる。本発明では、非特許文献2の脱アルカロイド麻黄エキス（残存アルカロイド含量0.33 %～0.5 %）と明確に区別するために、0.23%以下とした。さらに確実性を高めるために0.023%以下を規定した。また、より好ましいのは、実施例1に示す0.05ppm以下（検出限界以下）である。
エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス含有漢方製剤
　麻黄は漢方薬の構成生薬として幅広く用いられていることから、麻黄を含有する漢方薬の麻黄を、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスに置き換えることで、エフェドリンアルカロイドに起因する副作用が排除された、より安全性の高い漢方製剤を提供できる。たとえば、関節痛の治療に用いられている麻杏よく甘湯は、麻黄、杏仁、ヨクイニン、甘草から構成されるので、麻黄以外の構成生薬、すなわち、杏仁、ヨクイニン、甘草から調製したエキスに、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを添加することで、副作用の少ない麻杏よく甘湯を作製することができる。
　また、インフルエンザの初期に用いられる麻黄湯は、麻黄、桂皮、杏仁、甘草から構成されるので、桂皮、杏仁、甘草から調製したエキスにエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを添加することで、副作用の少ない麻黄湯を作製することができる。
医薬組成物
　本発明はさらに、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを含む組成物を提供し、組成物は抗がん・抗転移薬、疼痛抑制薬、または抗インフルエンザウイルス薬として用いることができ、食品、栄養補助食品または医薬品の形でありうる。
　組成物に用いるエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスとしては、上述したエフェドリンアルカロイド含量が0.23%以下もしくは0.023%以下であるものが好ましい。より好ましいのは、エフェドリアルカロイド含量が0.05ppm(検出限界)以下である。
　本発明の組成物が医薬用組成物であるときの投与方法は特に限定されるものではないが、経口投与可能な剤形が好ましい。本発明の医薬用組成物は種々の剤形とすることができる。
　例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができるが、これらに限定されない。また、製剤には薬剤的に許容できる種々の担体を加えることができる。
　例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、コーティング剤、ビタミンＣ、抗酸化剤を含むことができるが、これらに限定されない。
　本発明の医薬用組成物の投与量は、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスに換算すると、成人１日用量として１００ｍｇ～３ｇの範囲で用いることができる。一般的な麻黄エキスの投与量を根拠として、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスに換算すると、成人１日用量として７４０ｍｇ～　７７０ｍｇと見積もることができるが、エフェドリンアルカロイドに起因する副作用が排除されているため、投与量を増加させることが可能である。
　もちろん個別的に、投与されるヒトの年齢、体重、症状、投与経路、投与期間、治療経過等に応じて変化させることもできる。
　１日あたりの量を数回に分けて投与することもできる。また、他の疼痛抑制剤または抗癌剤と組み合わせて投与することもできる。
　本発明の組成物は、食品又は栄養補助食品の形態とすることもできる。例えば、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを原材料に配合することにより、麺類、パン、キャンディー、ゼリー、クッキー、スープ、健康飲料の形態とすることができる。
　このような食品、栄養補助食品にはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの他に、鉄、カルシウム等の無機成分、種々のビタミン類、オリゴ糖、キトサン等の食物繊維、大豆抽出物等のタンパク質、レシチンなどの脂質、ショ糖、乳糖等の糖類を加えることができる。
抗がん・抗転移薬
　本発明の組成物を抗がん・抗転移薬として用いることができるがんの種類は、主にMET発現がんである。METは胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、骨肉腫、脳腫瘍など種々のがん細胞表面に発現していることから、これらのがんの治療に用いることが可能である。HGF-c-Metシグナルは、がん細胞の増殖、運動能、細胞分散、生存、血管新生を促進し、癌細胞の増殖、浸潤及び転移の鍵となる。したがって、本発明の組成物は、がんの再発・転移防止薬としても有効である。
疼痛抑制薬
　本発明の組成物を疼痛抑制剤として用いることができる疾患としては、筋肉痛、関節痛、腰痛、リューマチ、痛風、がん性疼痛などが挙げられる。
抗インフルエンザウイルス薬
　本発明の組成物は、インフルエンザウイルスの感染予防及び感染初期の治療に有効である。
これより本発明を以下の実施例で詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。
実施例１：麻黄エキスの作製。
　麻黄の乾燥原料をミキサーにより粉砕し、その粉砕物５０ｇに５００ｍLの水を加え、攪拌しながら、９５℃、１時間抽出した。固液分離し、抽出液を３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った。得られた上清液を６０℃にて減圧濃縮したと、６０℃で一晩減圧乾燥を行い、麻黄エキスとして９．６ｇを得た。
　実施例２：イオン交換樹脂SK１Bによるエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの作製。
　麻黄の乾燥原料をミキサーにより粉砕し、その粉砕物５０ｇに５００ｍLの水を加え、攪拌しながら、９５℃、１時間抽出した。固液分離し、抽出液を３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、得られた上清液を２５ｍLの強酸型陽イオン交換樹脂SK１B（三菱化学製）に通液させた。通過液を５％のNaHCO3でpH＝５．２まで調整し、６０℃にて減圧濃縮したと、６０℃で一晩減圧乾燥を行い、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスとして６．３ｇを得た。
実施例３：イオン交換樹脂IR１２０Bによるエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの作製。
　麻黄の乾燥原料をミキサーにより粉砕し、その粉砕物５０ｇに５００ｍLの水を加え、攪拌しながら、９５℃、１時間抽出した。固液分離し、抽出液を３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、得られた上清液を２５ｍLの強酸型陽イオン交換樹脂IR１２０B（オルガノ社製）に通液させた。通過液を５％のNaHCO3でpH＝５．２まで調整し、６０℃にて減圧濃縮したと、６０℃で一晩減圧乾燥を行い、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスとして６．３ｇを得た。
　実施例４：高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による麻黄エキス（実施例１）およびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（実施例２と実施例３）に含まれるエフェドリンの含量比較。
　麻黄エキス（実施例１）およびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（実施例２）のHPLCチャートを図1に示す。
　分析条件
カラム ：SHISEIDO　AG１２０　４．６×１５０ｍｍ　５μ
移動相 ：ラウリル硫酸ナトリウム溶液（１→１２８）／アセトニトリル／リン酸混液（６４０：３６０：１）
温度 ：４５℃
検出 ：紫外線吸光光度計（測定波長：２１０nm）
流速 ：０．６ｍL／分（エフェドリンが１４分付近になるよう調整）
サンプル ：麻黄エキス、またはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの乾燥物を各１０ｍｇ取り、メタノール１ｍLを加え混合し、各２０μLを注入した。
標準溶液 ：エフェドリン標準溶液（１．０ｍｇ／５０％メタノール１０ｍL）およびプソイドエフェドリン標準溶液（１．０ｍｇ／５０％メタノール１０ｍL）を各２０μL注入した。
　得られた結果を以下の表１に示す。これらの結果から、強酸型陽イオン交換樹脂ＳＫ１Ｂ、あるいはＩＲ１２０Ｂを用いたカラムクロマトグラフィーによって、麻黄エキスからエフェドリンアルカロイド(エフェドリン及びプソイドエフェドリン)を検出限界（0.05ppm）以下まで除去できることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例５：３次元高速液体クロマトグラフィー（３D-HPLC）による麻黄エキス（実施例１）およびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（実施例２）の組成成分の比較。
　分析条件
カラム ：TSK－GEL ８０TS　４．６×２５０ｍｍ　５μ
移動相 ：（A）０．０５M酢酸アンモニウム（ｐH３．６）
 　　　　（B）アセトニトリル
０分：B液１０％　→　６０分：B液１００％
温度 ：４０℃
検出 ：フォトダイオードアレイ（PDA）
流速 ：１．０ｍL／分
サンプル ：麻黄エキス、またはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの乾燥物を各１０ｍｇ取り、メタノール１ｍLを加え混合し、各２０μLを注入した。
標準溶液 ：エフェドリン標準溶液（１．０ｍｇ／１０ｍLメタノール）およびプソイドエフェドリン標準溶液（１．０ｍｇ／１０ｍLメタノール）を各２０μL注入した。
　３D-HPLCのフィンガープリントは図2に示す。
　３D-HPLCにより麻黄エキスとエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの組成成分を比較した結果、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスにおいてはエフェドリンアルカロイドのピークが消失したが、他の成分のパターンは麻黄エキスとほぼ同じであった。
　実施例６：LC/MSによる麻黄エキス（実施例１）とエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（実施例2）の組成解析および比較検討
　分析条件
カラム：Inertsil ODS-3 (2.1×150 mmI.D. 5 mm)
移動相：0.1% HCOOH in water (A)－0.1% HCOOH in MeOH (B) in a gradient mode: 5%B (0－10 min)→75%B (70 min)
温度：40 ℃
検出 1：PDA 検出器 (200-400 nm) 
検出 2：MS 検出器
Interface, ESI positive/negative; ESI source voltage, 4.0 kV; capillary voltage, 10V; source temperature, 300℃; sheath gas flow rate, 50; auxiliary gas flow rate, 25; scan range, m/z 150-2000; mass resolution, 30,000 full width.  
流速：0.2 mL/min
サンプル：); injection volume, 1 μL at 5 mg/mL
　LC/MSのチャートは図3に示す。
　LC/MSにより麻黄エキスとエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの組成成分を比較した結果、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスにおいては、l-ephedrine、pseudoephedrine、methylephedrine、norephedrineの各ピークが消失していることを確認した（図3）。
　実施例７：麻黄エキス(実施例1)およびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（実施例２）のMETキナーゼ阻害作用
　METキナーゼ活性は，Poly E4Y1ペプチドを基質とした組換えMETキナーゼドメインによるATP消費に伴うADPの産生量を指標とした。組換えMETキナーゼドメインにPoly E4Y1ペプチドとATPを含む反応緩衝液の混合物に、麻黄エキス、あるいはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（2ロット）を、それぞれ1μg/mL、5μg/mL、及び10μg/mLとなるように添加し、室温で1時間インキュベートした。反応停止後、ADP-Glo試薬を用いてADP量に依存したルミノール発光強度を測定し、相対METキナーゼ活性を調べた。
　その結果、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは麻黄エキスと同程度にMETキナーゼ作用を阻害することが明らかとなった。麻黄エキス（実施例１）とエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（実施例２）のMETキナーゼ阻害曲線を図4に示す。
　実施例８：麻黄エキス（実施例１）およびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（実施例２）のヒト肺癌由来H1975細胞の増殖に対する抑制効果
　H1975細胞は、米国生物資源バンク（ATCC）より購入した。H1975細胞を10%FCS-RPMI培地に懸濁し、96穴培養プレートの各ウエルあたり、2×103個／100μLでまいた。一晩培養した後、培養上清を除去し、麻黄エキスおよびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（3ロット）を、それぞれ50、100、150、200μg／mLで添加し、コントロールは10%FCS-RPMI培地を添加した。72時間培養した後、Cell counting kit-8を10μL各ウエルに添加し、4時間を培養した後、各ウエルの吸光度（450 nm)をプレートリーダーにて測定した。各エキスの濃度ごとに4ウエル測定し、その平均値から相対細胞数を算出した（図5）。
　その結果、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは麻黄エキスと同様にヒト肺癌由来H1975細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。
　実施例９：動物試験における麻黄エキス（実施例１）およびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（実施例２）の疼痛に対する抑制効果
　実験動物は４週齢の雄性ICRマウスを４８匹用いた。実験開始日に体重測定を行い、各群でほぼ同じになるようにコントロール群，麻黄エキス２群及びエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス２群（１日投与量はそれぞれ３５０と７００ｍｇ/ｋｇ）に分けた。麻黄エキスおよびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスには注射用蒸留水を加え、３７℃、３０分間撹拌しながら懸濁させた。懸濁液は、経口投与直前にボルテックスをかけて均一にしてからゾンデで投与した。１日目と２日目は、単回の投与量が１７５ ｍｇ／ｋｇ、また３７５ ｍｇ／ｋｇとし、一日２回（９時と１７時）を投与した。３日目は、午前中に３５０ｍｇ/ｋｇ または７００ ｍｇ／ｋｇの１回のみを投与した。
　３日目の午前中の最終投与６時間後に２．５％ホルマリン溶液を２０μL足底部皮下に投与した。投与後速やかにマウスを円柱プラスチック容器（内径１１６ｍｍ、高１５２ｍｍ）に入れ、４５分間ビデオ撮影した。疼痛関連行動は投与直後から１０分後までに生じる第１相と１５分以降30分まで生じる第２相を対象とし、一定時間ごとの処置の足を舐めるまたは噛む行動時間を計測した。統計学的解析はコントロール群と被験物質投与群の疼痛行動時間をDunnett’s testsにて行い、有意水準は５％とした。
　その結果、麻黄エキスは、700 mg/kg投与した場合、第２相の疼痛関連行動を有意に抑制した。エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは、350 mg/kg、及び700mg/kgの両投与量で、第２相の疼痛関連行動を濃度依存的に有意に抑制し、エフェドリン除去前の麻黄エキスより疼痛抑制作用が高かった（図6）。以上の結果より、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは麻黄エキスより、高い疼痛抑制効果を有することが明らかとなった。
　実施例１０：　麻黄エキス（実施例１）およびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（実施例２）のインフルエンザウイルス感染阻害作用
　アッセイは、インフルエンザウイルスの感染によりMDCK細胞が溶解することを利用し、残存細胞を色素で染色することで検出した。
　麻黄エキスおよびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスについて、それぞれ10%FBS-MEMで200μg/mLの溶液に調製し、さらに10段階の2倍希釈系列を作製し、試料溶液とした。インフルエンザウイルス（A/WSN/33 (H1N1)株）を含む液を10%FBS-MEMで1000TCID50/mLに希釈し、インフルエンザウイルス液とした。MDCK細胞を10%FBS-MEMで懸濁し、96穴培養プレートの各ウエルあたり、3x104個/100μLで播種した。24時間培養した後、培養上清を除去し、試料溶液100μLを各ウエルに添加し、さらに100μLのインフルエンザウイルス液もしくは10%FBS-MEMを添加した。72時間培養した後、クリスタルバイオレットで染色し、マイクロプレートリーダーで各ウエルの560nmにおける吸光度を測定した。
　その結果、10%FBS-MEMを添加した系列では、試料濃度1.56～25μg/mLの範囲において、いずれのエキスにおいても細胞数の低下は観察されなかったことから、この添加濃度域では細胞毒性は示していないことが確認された（図7B）。一方、インフルエンザウイルス液を添加した系列では、いずれのエキスも、この試料濃度域で濃度依存的に細胞が溶解していることが観察された（図7A）。4パラメーターロジスティック曲線の近似式を求め、そのパラメーターよりIC50値を算出した結果、麻黄エキスでは8.6μg/mL、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスでは8.3μg/mLであった。以上の結果より、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは麻黄エキスと同程度にMDCK細胞に対するインフルエンザウイルスの感染を阻害することが明らかとなった。

Claims (10)

  1. 麻黄エキスからエフェドリンアルカロイドを除いたエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス。
  2. エフェドリンアルカロイドを0.23％以下の量で含む請求項１に記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス。
  3. エフェドリンアルカロイドを0.023%以下の量で含む請求項1に記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス。
  4. エフェドリンアルカロイドを0.05ppm(検出限界)以下の量で含む請求項1に記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス。
  5. 麻黄の抽出液／または抽出物の水溶液に含まれる成分のうち陽イオン交換樹脂に吸着されない成分を含む請求項1～4のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス。
  6. 請求項1～5のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを含む漢方製剤。
  7. 麻黄の抽出液および／または抽出物からイオン交換クロマトグラフィーによりエフェドリンアルカロイドを除去することを特徴とする請求項1～5のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造方法。
  8. 請求項1～5のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを有効成分とする抗がん・抗転移薬。
  9. 請求項1～5のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを有効成分とする疼痛抑制薬。
  10. 請求項1～５のいずれかに記載のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを有効成分とする抗インフルエンザウイルス薬。
     
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