WO2022071576A1 - 新型コロナウイルス感染症の予防又は治療のための抗ウイルス剤 - Google Patents

新型コロナウイルス感染症の予防又は治療のための抗ウイルス剤 Download PDF

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ephedra
ephedrine
condensed tannin
alkaloid
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壽彦 花輪
須美子 日向
浩 小田口
幸広 合田
昌司 日向
匡 上間
宏 朝倉
奈穂子 内山
吉章 天倉
守生 好村
金緯 楊
和臣 溝口
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学校法人北里研究所
国立医薬品食品衛生研究所長が代表する日本国
学校法人松山大学
株式会社常磐植物化学研究所
株式会社ツムラ
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention contains a new type of corona as an active ingredient of Ephedra extract, Ephedra alkaloids-free Ephedra Herb extract: EFE, which is obtained by removing ephedrine alkaloids from Ephedra extract, and / or Ephedra-derived polymer-condensed tannin.
  • EFE Ephedra alkaloids-free Ephedra Herb extract
  • the present invention relates to an antiviral agent characterized by being used for the prevention or treatment of a viral infection.
  • Non-Patent Document 1 Guideline for the treatment of new coronavirus infectious diseases, Edition 5.3, August 29, 2021 / Daily Pharmaceutical Industry, September 2021) May 27.
  • the antibody drugs Ronapreve and Zebudy they are therapeutic agents for patients with moderate or higher illness.
  • Ronapreve and Zebudy are intravenous drip infusions, there are restrictions on the medical institutions that can be treated, and the drug price is said to be 100,000 yen or more, and it is difficult to increase production due to antibodies. Therefore, there is a demand for an oral therapeutic drug that can be safely and inexpensively administered to mildly ill persons undergoing home medical treatment.
  • crude drugs are used as traditional medicines such as Chinese herbal medicines. Crude drugs are cultivated in alleys or harvested and dried. Therefore, even if the species is the same, the component content may fluctuate due to the influence of uncertain factors such as the collection season and the weather. Although it is possible to empirically use crude drugs and herbal medicines that have antiviral activity, the titer of the collected lot is uncertain, so it is appropriate to provide it as a drug advocating efficacy and effect. Tests must be performed to ensure compliance with the appropriate standards.
  • Ephedra is a drug listed in the Japanese Pharmacopoeia, and it has been believed that its efficacy is almost entirely due to ephedrine alkaloids.
  • the inventors have found a useful medicinal effect of ephedrine alkaloid that does not depend on ephedrine alkaloid, and by selectively removing ephedrine alkaloid, which is a causative agent of side effects, the ephedrine extract can be provided as a highly safe drug.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 5
  • Patent Document 2 Non-Patent Document 6
  • Ephedra extract As described above, Ephedra extract, ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract, and Ephedra-derived polymer condensed tannin have been shown to have some medicinal properties, but no antiviral effect against the new coronavirus has been reported. In addition, it was unclear from the findings so far whether it showed anti-coronavirus activity or even those skilled in the art.
  • the hemp yellow extract, the ephedrine alkaloid-removed hemp yellow extract, and the hemp yellow-derived polymer condensed tannin have anti-coronavirus activity, they can be used for the prevention or treatment of new coronavirus infections. It can be provided as an anti-coronavirus agent characterized by this.
  • Ephedra extract and ephedrine alkaloid-free Ephedra extract but also Ephedra-containing Chinese herbal medicines that are empirically used for the treatment of new coronavirus infections. It can be provided as a drug that guarantees the antiviral effect of Ephedra, which is used as a constituent crude drug.
  • An object of the present invention is to provide an antiviral agent characterized by being used for the prevention or treatment of a new type coronavirus infection (COVID-19).
  • the present invention requires verification of the anti-coronavirus action of existing drugs and drug candidate compositions by evaluation experiments at the molecular level and cell level based on the infection mechanism of coronavirus.
  • compositions that can be used for the prevention or treatment of new coronavirus infections the present inventors have described the new coronavirus with respect to the hemp yellow extract, the ephedrine alkaloid-removed hemp yellow extract, and the hemp yellow-derived polymer-condensed tannin.
  • the present invention has been completed by finding a method for ensuring effectiveness by a technique for separating by chromatography.
  • the present invention provides the following (1) to (11) as typical embodiments.
  • An antiviral agent containing a polymer condensed tannin derived from hemp yellow as an active ingredient and used for the prevention or treatment of a new type of coronavirus infection.
  • the above-mentioned antiviral agent in the form of a pharmaceutical product or a Chinese medicine product.
  • the antiviral agent according to (2) or (3) which is in the form of food.
  • Methods for the prevention of new coronavirus infections including oral ingestion of foods and drinks containing ephedrine alkaloid-removed ephedra extract or ephedra-derived polymer condensed tannins (preferably excluding medical practice). ..
  • a method for preventing or treating a new type of coronavirus infection which comprises administering to a drug containing ephedra extract or ephedrine alkaloid-removed ephedra extract or ephedra-derived polymer condensed tannin as an active ingredient.
  • ephedra extract ephedrine alkaloid-removed ephedra extract (EFE)
  • polymer condensed tannin can be provided as an anti-new coronavirus agent.
  • the main component of the anti-new coronavirus action was polymer condensed tannin with a molecular weight of 10,000 to 500,000, and a quantification method by gel permeation chromatography was established to ensure the effectiveness as an antiviral agent.
  • the therapeutic agents other than EFE are RNA polymerase inhibitors and main protease inhibitors, and there is no oral therapeutic agent with the same mechanism of action as EFE.
  • EFE binds to the SARS-CoV2 peplomer and blocks its binding to host cells by the same mechanism of action as Ronapreve and Zebudy. Even if the oral therapeutic agents in the above table are commercialized before EFE, they can be used in combination with EFE because of their different mechanisms of action. In addition, safety is of the utmost importance for oral therapeutic agents because they are taken by patients at home, but EFE is highly safe because it removes side effect components.
  • EFE can be supplied at a lower cost than Ronapreve and Zebudy, and the mechanism of action of EFE suggests that it can be administered prophylactically to healthcare workers, close contacts, and those who cannot be vaccinated. Recently, it has become clear that EFE is also effective against SARS-CoV-2 mutants. As shown in the examples, EFE inhibits infection of various mutants of SARS-CoV-2. Therefore, it is possible to respond to the threat of newly emerging mutations.
  • the active component of FEF is considered to be a mixture of polymer condensed tannins (mao-derived polymer condensed tannins), and has various structures and various molecular weights.
  • the inventors are not bound by theory, but such diverse structures and diverse molecular weights of Ephedra extract or ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract (EFE) or Ephedra-derived polymer condensed tannins. We believe that it may be the reason for various medicinal effects (use as anti-cancer / anti-metalytic drug, pain suppressant, anti-influenza virus drug).
  • EFE ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract
  • the structural differences between the influenza virus and the new coronavirus are greater than the mutations in the new coronavirus, but given that both viruses can be inhibited, EFE and mao-derived polymer-condensed tannins will emerge in the future. It is expected that it will be able to respond widely to mutations in the new coronavirus (SARS-CoV-2).
  • the anti-new coronavirus agent which is a medical or general-purpose drug containing hemp yellow extract, ephedrine alkaloid-removed hemp yellow extract, and / or hemp yellow-derived polymer-condensed tannin as an active ingredient, is used for new coronavirus infections.
  • a medical or general-purpose drug containing hemp yellow extract, ephedrine alkaloid-removed hemp yellow extract, and / or hemp yellow-derived polymer-condensed tannin as an active ingredient is used for new coronavirus infections.
  • it is possible to suppress the aggravation of mildly ill patients in the early stage of infection during medical treatment at home or accommodation facilities without the need for hospitalization management.
  • the anti-new coronavirus agent can be provided as an over-the-counter drug, medical professionals and close contacts can perform early preventive treatment by self-medication. Furthermore, since ephedrine alkaloid-removed mahuang extract and mahuang-derived polymer condensed tannin do not contain ephedrine alkaloid, which is a side effect component, they can be used as foods in terms of food category, thus preventing new coronavirus infections. It can also be provided as a food with health claims that is expected.
  • the behavior of the control condition (black circle) and the ephedrine alkaloid-free Ephedra extract addition condition (triangle) is shown for the N1 RNA copy number of the new coronavirus in VeroE6 / TMPRSS2 cells.
  • X-axis elapsed time after virus inoculation
  • y-axis SARS-CoV-2 RNA copy count. It shows the infection-inhibiting effect of ephedrine alkaloid-removing Ephedra extract on the new coronavirus mutant strain.
  • the present invention uses a mahuang extract, an ephedrine alkaloid-free hemp yellow extract, and a hemp yellow-derived polymer condensed tannin as an antiviral agent for the prevention or treatment of a new type of coronavirus infection, and uses these as active ingredients.
  • compositions such as pharmaceuticals and foods containing.
  • Ephedra extract used in the present invention uses the above-ground stems of Ephedra sinica Stapf, Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer or Ephedra equisetina Bunge (Ephedraceae). Raw, dried or processed rhizomes are available.
  • the extraction step of Ephedra extract can be carried out based on any of the well-known methods.
  • As the extraction solvent water or hot water, hot water, an alcohol solvent, and other organic solvents such as acetone can be used.
  • the alcohol solvent include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol and the like. These solvents may be used alone or in combination.
  • the amount of the extraction solvent is preferably 2-100 parts by weight, 4-50 parts by weight, or 8-25 parts by weight with respect to the dry weight of Ephedra.
  • the extraction temperature is preferably 4-98 ° C.
  • the extraction time is preferably 30 minutes-2 hours.
  • the extraction method can be any method such as stirring extraction, immersion extraction, countercurrent extraction, ultrasonic extraction, and supercritical extraction.
  • the extraction solvent is water and the mao extract can be a hot water extract and / or a hot water extract of mao.
  • the hot water extract and / or hot water extract of hemp yellow is 2-100 parts by weight, 4-50 parts by weight, or 8-25 parts by weight, or about 10 parts by weight of hot water with respect to the dry raw material of hemp yellow. Obtained by extraction at (eg, about 95 ° C.) for 30 minutes-2 hours.
  • the obtained extract, the filtrate obtained by filtering the extract, the concentrate obtained by concentrating the filtrate, and the dried product obtained by drying the concentrate are efedrin alkaloid-removed hemp yellow extract or hemp yellow-derived polymer-condensed tannin. It can be used as a raw material for the production of.
  • an antiviral agent characterized by being used for the prevention or treatment of a new type of coronavirus infection is used as a hemp yellow extract drug substance or a Chinese herbal medicine raw material extract, which will be described later
  • a polymer condensed tannin having a molecular weight of 10,000 to 500,000 will be described later. Is preferably contained in an amount of 0.01% or more, and more preferably 0.1% or more. Ephedra extracts shown to contain 0.01% or more or 0.1% or more of such polymer condensed tannins having a molecular weight of 10,000 to 500,000 are also within the scope of the present invention.
  • Ephedrine Alkaloid-Removed Ephedra Extract used in the present invention is made from ephedrine extract, ephedrine is removed by cation exchange chromatography, concentrated and dried, and then ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract. Can be obtained.
  • the ephedrine alkaloid-removed mahuang extract is an ephedrine alkaloid-removed mahuang extract obtained by removing ephedrine alkaloids from the ephedrine extract, and preferably contains ephedrine alkaloid (total of ephedrine and pseudoephedrine) in an amount of 0.23% or less, more preferably ephedrine alkaloid. It is contained in an amount of 0.023% or less, more preferably 0.05 ppm (detection limit) or less.
  • Ephedra contains 0.7% or more of total alkaloids (ephedrine and pseudoephedrine) in the dried crude drug, and this amount contains about 2.3% to 3.5% or more when converted to Ephedra extract.
  • Ephedrine alkaloid-free Ephedra extract is clearly distinguished from Ephedra extract as it is calculated to be.
  • Ephedra extract is obtained from "Chinese Claims-Modern Science and Chinese Physics" (Ichiro Narukawa, p162-163, Kenyukan Co., Ltd., published in 1991) and Reference Example 1. Be done.
  • Ephedra extract is prepared from Ephedra of the Japanese Pharmacopoeia, almost all ephedrine alkaloids contained in Ephedra are transferred to Ephedra extract.
  • the yield of Ephedra extract obtained from Ephedra is 20% to 30%, the total alkaloids contained in Ephedra extract are concentrated 3.3 to 5 times.
  • the value of 2.3% to 3.5% or more which is 3.3 to 5 times the total alkaloid of Ephedra specified by the Japanese Pharmacopoeia, is the specified value of the total alkaloid of Ephedra extract. It is considered that the ephedrine alkaloid-removing ephedrine extract used in the present invention has an ephedrine alkaloid content of 1/10 or less of that of the ephedrine alkaloid extract, so that the possibility of side effects of the ephedrine alkaloid is extremely low.
  • a filler can be selected according to the ephedrine alkaloid removal efficiency.
  • ephedrine alkaloid-removed hemp yellow extract having an ephedrine alkaloid content of 0.23% or less, among weakly acidic cation exchange resins WK20, strongly acidic cation exchange resins SK104, SK110, SK1B, UBK530, PK216, IR120B, FPC3500, 1060H It can be selected as a column filler.
  • a column filler from weak acid cation exchange resin WK20, strong acid cation exchange resin SK104, SK110, SK1B, UBK530, PK216, IR120B, and 106H Can be selected as.
  • the strong acid cation exchange resin PK216 can be selected as the column filler, and the strong acid cation exchange resins SK1B and IR120B can also be selected. can.
  • an antiviral agent characterized by being used for the prevention or treatment of a new type of coronavirus infection is used as an ephedrine alkaloid-removing hemp yellow extract drug substance
  • a polymer-condensed tannin having a molecular weight of 10,000 to 500,000 which will be described later, is used. It is preferably contained in an amount of 0.01% or more, and more preferably 0.1% or more.
  • Such ephedrine alkaloid-free Ephedra extract which has been shown to contain 0.01% or more or 0.1% or more of polymer condensed tannins having a molecular weight of 10,000 to 500,000, is also within the scope of the present invention.
  • ephedrine alkaloid-removed ephedra extract a specific method for performing chromatography is one of those well known to those skilled in the art.
  • the drying method can be any method such as vacuum drying, freeze drying, and spray drying. Excipients such as dextrin may be added if necessary.
  • the Mao-derived polymer condensed tannin of the present invention is a polymer condensed tannin having a molecular weight of 10,000 to 500,000, which is a polymerized proanthocyanidin A type and proanthocyanidin B type. More specifically, in the polymer condensed tannin, as an extension unit, catechol type or pyrogallol type flavan-3-ols are condensed mainly with proanthocyanidin B type, and a part thereof is proanthocyanidin A type condensed tannin.
  • the molecular weight is a molecular weight converted using standard polystyrene for GPC as a standard substance.
  • the hemp-derived polymer-condensed tannin of the present invention is made from hemp yellow extract or ephedrine alkaloid-removed hemp yellow extract, and the concentration of alcohol or acetone is concentrated by column chromatography using a mixed solvent of water and alcohol or water and acetone. It can be obtained by sequentially elution while increasing the value.
  • the solvent can be distilled off from the extract fraction containing the polymer condensed tannin having a molecular weight of 10,000 to 500,000, and the dried product can be used as the drug substance.
  • a hemp yellow extract or an efedrin alkaloid-removed hemp yellow extract dissolved in water is sequentially distributed from a low-polarity organic solvent to a high-polarity organic solvent, and the obtained water extract is subjected to water by column chromatography.
  • a mixed solvent of and an organic solvent selected from methanol, ethanol or acetone the mixture is sequentially eluted while increasing the organic solvent concentration, and the molecular weight of each obtained fraction is measured to obtain a polymer having a molecular weight of 10,000 to 500,000.
  • low-polarity organic solvents examples include hexane, diethyl ether, ethyl acetate and the like
  • high-polarity organic solvents examples include n-butanol, ethanol, methanol, water and the like.
  • a styrene-divinylbenzene-based synthetic adsorbent such as Diaion HP-20 or another aromatic synthetic adsorbent such as LH-20 can be used.
  • a viscosity method, gel permeation chromatography (GPC), mass spectrometry, osmotic pressure method or the like can be used.
  • the following chromatography is obtained by dissolving the hemp yellow extract or the ephedrine alkaloid-removed hemp yellow extract in water, or by sequentially distributing these extracts with ethyl acetate and water-saturated n-butanol. It is used as a starting material for.
  • These extracts were sequentially eluted and fractionated in the order of H 2 O, 20% MeOH, 40% MeOH, MeOH using Diaion HP-20 column chromatography, H 2 O fraction, 20% MeOH. Obtain fractions, 40% MeOH fractions, and MeOH fractions. Of these, as a 20% MeOH fraction, a 40% MeOH fraction, and an MeOH fraction, Ephedra-derived polymer condensed tannins having a molecular weight of 10,000 to 500,000 can be obtained.
  • the hemp-derived polymer condensed tannin of the present invention can be prepared by using a 20% MeOH fraction, a 40% MeOH fraction, or an arbitrary combination of MeOH fractions. It is preferable that the fraction contains 10% or more of the above-mentioned polymer condensed tannin having a molecular weight of 10,000 to 500,000, and more preferably 40% or more.
  • Ephedra-derived polymer condensed tannin of the present invention is obtained by dissolving Ephedra extract or ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract in water, or using Sephadex LH-20 column chromatography to dissolve the above-mentioned water extract. After washing with 50% MeOH and then 80% MeOH, Ephedra-derived polymer condensed tannins can be obtained as a 70% acetone fraction.
  • Ephedra-derived polymer condensed tannin In the production of Ephedra-derived polymer condensed tannin, a specific method for performing chromatography is one of those well known to those skilled in the art. Further, a solution containing a polymer condensed tannin derived from hemp yellow obtained by chromatography, or a powder obtained by drying by any method such as vacuum drying, freeze drying, and spray drying can be used as a drug substance. .. Further, it is also possible to prepare a drug substance having improved physical properties as a powder by adding an excipient such as dextrin and then drying by the above method.
  • hemp yellow extract ephedrine alkaloid-removed hemp yellow extract, or hemp yellow-derived polymer condensed tannin can be used as an active ingredient of an anti-new coronavirus agent.
  • compositions containing hemp extract, ephedrine alkaloid-removed hemp extract, or hemp-derived polymer condensed tannin as an active ingredient require such prophylaxis or treatment for the prevention or treatment of new coronavirus infections.
  • the administration method of the pharmaceutical preparation of the present invention is not particularly limited, but a dosage form that can be orally administered is preferable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be in various dosage forms.
  • tablets, capsules, powders, granules, pills, liquids, emulsions, suspensions, solutions, liquor, syrups, extracts, and elixirs can be used. , Not limited to these.
  • various pharmaceutically acceptable carriers can be added to the formulation.
  • excipients for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, colorants, sweeteners, flavoring agents, solubilizing agents, suspending agents, emulsifiers, coating agents, vitamin C, antioxidants.
  • Ephedra is widely used as a constituent crude drug of Chinese herbal medicine, it is possible to provide a Chinese herbal medicine containing Ephedra and a Chinese herbal medicine in which Ephedra is replaced with an ephedrine alkaloid-removing Ephedra extract as an anti-coronavirus drug.
  • the ephedrine alkaloid-removed ephedra extract and ephedra-derived polymer condensed tannins of the present invention do not contain ephedrine alkaloids, which are side effects, and can be used as foods. Therefore, the ephedrine alkaloid-removed ephedra extract and the ephedra-derived polymer condensed tannin of the present invention can be contained in foods. For example, by blending ephedrine alkaloid-removed ephedra extract into raw materials, various food forms can be obtained.
  • the food is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose.
  • beverages such as soft drinks, carbonated drinks, nutritional drinks, fruit drinks, lactic acid drinks; candy, candy, chewable, jelly, gum, etc.
  • Confectionery such as chocolate
  • various forms of health foods such as granules, tablets, capsules and drinks, foods with functional claims and nutritional supplements can be mentioned.
  • the food may be a food with a label (so-called health claim) indicating that it is suitable for a special purpose, but does not include food that is ingested as a medicine.
  • An example of a health claim could be an indication to reduce a particular disease risk (eg, the risk of contracting a new coronavirus infection (COVID-19)).
  • such foods include inorganic components such as calcium, various vitamins, oligosaccharides, dietary fiber such as chitosan, and proteins such as soybean extract. , Lipids such as lecithin, sugars such as sucrose and lactose can be added.
  • the present invention also includes quantifying the content of polymer condensed tannins derived from Mao, which has a specified range of molecular weight.
  • polymer condensed tannins derived from Mao which has a specified range of molecular weight.
  • the high-condensed tannin should be used as an index component of anti-new coronavirus action. Can be done.
  • the quantification of polymer condensed tannins is performed by gel permeation chromatography (GPC). Specific methods are exemplified by the method described in Example 7, but the method is not limited thereto.
  • the amount (mg) of the polymer condensed tannin in 1 mg of the sample can be calculated from the peak areas A T and AS of the sample solution and the polymer condensed tannin standard substance solution.
  • GPC analysis can be used as a test method for the acceptance test of Ephedra, which is a raw material crude drug, and the content standard of the active ingredients of various drug substances and foods.
  • the liquid can be used as it is, and the solid can be used as a measurement sample by using an arbitrary solvent as a solution.
  • the method for preparing the polymer condensed tannin described in the present specification that is, the extraction method, column chromatography, etc. as the pretreatment method, the substance can be quantified, and the sensitivity, accuracy, and linearity of the quantification can be achieved. In some cases, it can be improved.
  • a hemp yellow extract or an ephedrine alkaloid-removed hemp extract is prepared, and the obtained hemp yellow extract or ephedrine alkaloid-removed hemp yellow extract is quantified as a polymer-condensed tannin having a molecular weight of 10,000 to 500,000 and has a polymer-condensed tannin content.
  • Use 0.01% or more of tannin extract or ephedrine alkaloid-free tannin extract as a drug substance for anti-new coronavirus agents.
  • Non-Patent Document 5 (Oshima N, Yamashita T, Hyuga S, Hyuga M, Kamakura H, Yoshimura M, Maruyama T, Hakamatsuka T, Amakura Y, Hanawa T, Goda Y, Efficiently prepared ephedrine alkaloids-free Ephedra Herb extract: a putative marker and antiproliferative effects. J Nat Med.
  • Non-Patent Document 6 Yoshimura M, Amakura Y, Hyuga S, Hyuga M, Nakamori S, Maruyama T, Oshima N, Uchiyama N, Yang J, Oka H, Ito H, Kobayashi Y, Odaguchi H, Hakamatsuka H, Hanawa T, Goda Y, Quality Evaluation and characterization of Fractions with Biological Activities in Ephedra Herb Extract and Ephedrine Alkaloids- Free Ephedra Herb Extract. Chem Pharm Bull. 2020; 68 (2): 140-149).
  • Example 1 Inhibiting action of new coronavirus infection of ephedrine alkaloid-removing hemp yellow extract Does the addition of ephedrine alkaloid-removing hemp yellow extract have an inhibitory effect on the growth of new coronavirus in VeroE6 / TMPRSS2 cells, which are new coronavirus-sensitive cells? It was investigated.
  • the concentration of ephedrine alkaloid-removed ephedra extract added was set to 50 ⁇ g / mL after confirming the highest concentration in which no toxicity of ephedrine alkaloid-removed ephedra extract was observed for VeroE6 / TMPRSS2 cells in advance.
  • a comparative control a control group to which ephedrine alkaloid-free Ephedra extract was not added was examined at the same time.
  • VeroE6TMPRSS2 cells are infected with the new coronavirus, cultured for a certain period of time, then RNA is extracted, quantified as the amount of virus RNA by the PCR method, and the number of copies is obtained from the calibration curve of the standard substance. rice field.
  • VeroE6 / TMPRSS2 cells were suspended in 10% FBS-DMEM to 5x10 5 cells / mL, 200 ⁇ L per well was seeded in 3 48-well plates, and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours.
  • the ephedrine alkaloid-removed ephedra extract-added group was replaced with 50 ⁇ g / mL ephedrine alkaloid-removed ephedra extract-added serum-free DMEM, and the control group was replaced with serum-free DMEM and kept warm in a CO 2 incubator for 1 hour.
  • a calibration curve was prepared using the N gene plasmid of the US CDC, and the number of copies of the virus was determined (Table A).
  • the copy number of WK-521 at the start of the assay was reduced to 20% by the addition of ephedrine alkaloid-removing Ephedra extract, confirming that the initial stage of coronavirus infection was suppressed.
  • the virus growth rate over time was also significantly suppressed by the addition of ephedrine alkaloid-removing Ephedra extract, and the number of virus copies after 24 hours was 0.17% of the number of copies of the control, which was extremely small.
  • the ephedrine alkaloid-removed ephedra extract has an inhibitory effect on the viral growth in the early stage of infection and the stage of infection of the new coronavirus.
  • Example 2 Infection-inhibiting effect on the new coronavirus mutant strain Among the mutant strains reported in each country since the outbreak in Wuhan in 2019, WHO is particularly concerned about the spread of infection in the United Kingdom, South Africa, and Brazil. Alpha, Beta, Gamma strains, etc. derived from are designated and monitored. Since these mutant strains have invaded Japan since 2020 and have replaced the original epidemic strain WK-521 closely related strains, VeroE6 / TMPRSS2 cells, which are new coronavirus-sensitive cells, were added by adding ephedrine alkaloid-removed mao extract. It was examined whether an inhibitory effect would appear on the growth of the new coronavirus mutant strain in Severe acute respiratory syndrome. Table B shows the domestic coronavirus isolates used in Examples 1 and 2.
  • the concentration of ephedrine alkaloid-removed ephedra extract added was set to 50 ⁇ g / mL after confirming the highest concentration in which no toxicity of ephedrine alkaloid-removed ephedra extract was observed for VeroE6 / TMPRSS2 cells in advance.
  • a comparative control a control group to which ephedrine alkaloid-free Ephedra extract was not added was examined at the same time.
  • Infection evaluation of the new coronavirus is performed by infecting VeroE6 / TMPRSS2 cells with each strain, culturing for 1 hour, extracting RNA, quantifying it as the amount of virus RNA by the PCR method, and calculating the number of copies from the calibration curve of the standard substance. I asked. The titer of the infectious virus in the culture supernatant after 24 hours was determined.
  • VeroE6 / TMPRSS2 cells were suspended in 10% FBS-DMEM to 2x10 4 cells / well, seeded in 96-well plates, and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours.
  • the ephedrine alkaloid-removed ephedra extract-added group was replaced with 50 ⁇ g / mL ephedrine alkaloid-removed ephedra extract-added serum-free DMEM, and the control group was replaced with serum-free DMEM and kept warm in a CO 2 incubator for 3 hours.
  • a calibration curve was prepared using the N gene plasmid of the US CDC, and the number of copies of the virus was determined.
  • CPE cytopathic effect
  • RNA proliferation was significantly suppressed by about 2.5% compared to the group (Fig. 2: N gene copy count after 24 hours for each mutant strain).
  • the average infectious virus in the culture supernatant after 24-hour culture was 4.9x10 5 TCID 50 / mL in the control group, whereas the average 1.8x10 4 TCID 50 in the ephedrine alkaloid-removed hemp yellow extract-added group.
  • the value was / mL, which was about 3.7% on average in the addition group with respect to the control group 100, and the production of infectious virus was also significantly suppressed. From these results, it was clarified that the ephedrine alkaloid-removed ephedra extract has an inhibitory effect on viral growth even in various variants of the new coronavirus.
  • Example 3 Binding ability of efedrin alkaloid-removing hemp yellow extract component to spike protein involved in new coronavirus infection
  • the viral spike protein binds to a receptor molecule of the target cell. If a component of the ephedrine alkaloid-removing Ephedra extract binds to the peplomer of the new coronavirus, the binding between the virus and the target cells is inhibited. Therefore, the binding ability of the ephedrine alkaloid-removing ephedra extract to the spike protein of the new coronavirus was investigated using an intramolecular interaction analyzer.
  • BIACORE GE Healthcare
  • S1 domain (recombinant S1) of the spike protein of the new coronavirus produced by the gene recombination method was immobilized on the sensor chip CM5 by the amine coupling method at about 500 RU.
  • Ephedra extract and ephedrine alkaloid-free Ephedra extract strongly bind to the S1 domain of the peplomer protein, which plays an important role in the infection of the new coronavirus, thereby suppressing the infection of the new coronavirus. It was considered.
  • Example 4 Binding of Mao-derived polymer-condensed tannin to a spike protein involved in new coronavirus infection
  • Mao-derived polymer condensation considered to be the active ingredient of Mao extract or ephedrine alkaloid-removed Mao extract to the spike protein of new coronavirus. Whether or not the type tannin binds was examined using an intermolecular interaction analyzer.
  • the intramolecular interaction analysis was examined under the same conditions using the apparatus and sensor chip described in Example 3.
  • the hemp-derived polymer condensed tannin was dissolved in HEPES buffer and adjusted to 40 ⁇ g / mL, 20 ⁇ g / mL, and 10 ⁇ g / mL to prepare a sample solution.
  • the sample solution was applied for 60 seconds at a flow rate of 30 ⁇ L / min and then washed with HEPES buffer for 120 seconds.
  • a sensorgram was obtained by subtracting the response of the non-immobilized flow cell from the response of the flow cell in which the recombinant S1 was immobilized.
  • the polymer condensed tannin derived from Ephedra was bound to the recombinant S1 in a concentration-dependent manner (Fig. 4). Since the average molecular weight of the mahuang-derived polymer condensed tannin is about 100,000, the concentration of each sample is regarded as 400 nM, 200 nM, 100 nM, and the mahuang-derived polymer condensed type is used by the curve fitting method for the sensorgram. As a result of kinetic analysis of the binding model of tannin and recombinant S1, the dissociation constant KD was calculated to be 30.7 nM, and the mao-derived polymer condensed tannin could function sufficiently as a binding inhibitor to the spike protein of the new coronavirus. It was revealed that it has a binding ability.
  • Ephedra-derived polymer-condensed tannin which is a component of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-free Ephedra extract, strongly binds to the S1 domain of spike protein, which plays an important role in infection with the new coronavirus. Therefore, it was considered that Ephedra-derived polymer-condensed tannin could be an antiviral agent that suppresses infection with the new coronavirus, similar to Ephedra extract and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract.
  • Example 5 Inhibition of binding between the spike protein of the new coronavirus and ACE2 It has been clarified that the binding of the spike protein of the new coronavirus to ACE2 in the host cell is the first step of infection.
  • Ephedra-derived polymer condensed tannin which is considered to be the active ingredient of Ephedra extract or ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract shown in Example 4, inhibits binding to ACE2 or is enzyme-labeled by binding to peplomer. The study was carried out using a spike protein.
  • Ephedra-derived polymer-condensed tannin which is a component of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-removed mahuang extract, inhibits the first stage of infection with the new coronavirus. Similar to the extract, it was considered that ephedra-derived polymer-condensed tannin could be an antiviral agent that suppresses infection with the new coronavirus.
  • Example 6 Effect of oral administration of EFE on a mouse coronavirus infection model
  • MHV mouse coronavirus belonging to the family Coronavirus of the order Nidovirus.
  • MHV has been reported to cause pneumonia in mice (Albuquerque, N., et al., J Virol., 80, 10382-10394, 2006).
  • mice (BALB / cCrSlc, female) were nasally inoculated with MHV (MHV-1 / ATCCVR-261), and EFE was orally administered for 6 days from 1 hour after inoculation.
  • the non-infected group and the infected symmetric group were administered with water for injection.
  • EFE was administered to the infected group 700 mg / kg x 2 times / day [EFE 700 x 2 (1400)], 700 mg / kg x 1 time / day (EFE 700), 350 mg / kg x 2 times. / Daily administration [EFE 350 ⁇ 2 (700)].
  • Ten mice in each group were used.
  • the number of viral plaques in the right lung and liver was significantly reduced in all EFE-administered groups compared with the infected control group.
  • the number of viral plaques in the right lung was 1622.3 ⁇ 271.9 ( ⁇ 10 ⁇ SUP> 2 ⁇ / SUP> PFU / g) in the infected control group, 96.1 ⁇ 10.7 in the EFE 700 ⁇ 2 (1400) group, and 250.1 ⁇ 67.9 in the EFE 700 group.
  • EFE 350 ⁇ 2 (700) group was 417.5 ⁇ 121.5 (Fig. 6).
  • the respiratory dysfunction observed in the infected control group showed an improving tendency in all EFE-administered groups (Fig. 7).
  • Example 7 Method for Quantifying Polymer Condensed Tannin
  • the column length is doubled to enhance the ability to separate from contaminants. Quantitative method was established. As a result of calculating the polymer condensed tannin content for 3 lots of Ephedra extract using this quantification method, it was 0.03 to 0.69% (average 0.36%). The polymer condensed tannin content of one lot of ephedrine alkaloid-removed ephedra extract was calculated to be 0.49%.
  • Quantitative method The sample and the polymer condensed tannin standard were precisely weighed and dissolved in the mobile phase to a concentration of about 10.0 mg / mL to prepare a sample solution and a polymer condensed tannin standard solution.
  • GPC was performed on the sample solution and the polymer condensed tannin standard solution under the following conditions, and the peak areas A T and AS of the sample and the polymer condensed tannin standard were measured using the data processing software LabSolutions GPC.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 5
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2019-131536
  • Reference Example 1 Preparation of Ephedra Extract
  • the dried raw material of Ephedra was pulverized by a mixer, 500 mL of water was added to 50 g of the pulverized product, and the mixture was extracted at 95 ° C. for 1 hour while stirring. The solid and liquid were separated, and the extract was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The obtained supernatant was concentrated under reduced pressure at 60 ° C. and dried under reduced pressure at 60 ° C. overnight to obtain 9.6 g of Ephedra extract.
  • Reference Example 2 Examination of packing material for ion exchange chromatography An examination was conducted to determine a packing material for ion exchange chromatography suitable for producing an ephedrine alkaloid-removing hemp yellow extract. After treating the ephedra extract with various ion exchange resins, the ephedrine alkaloids contained in the extract were analyzed by TLC and HPLC. The ion exchange resins examined were 13 types of cation exchange resins, 1 type of amphoteric ion exchange resins, and 8 types of anion exchange resins, for a total of 22 types. As a result, it was found that the ion effect resin suitable for removing the ephedrine alkaloid was a cation exchange resin.
  • Reference Example 3 Preparation of Ephedra Alkaloid-Removed Ephedra Extract Using Ion Exchange Resin SK1B or IR120B
  • the dried raw material of Ephedra was crushed with a mixer, 500 mL of water was added to 50 g of the crushed product, and the mixture was extracted at 95 ° C. for 1 hour while stirring. .. Solid-liquid separation is performed, the extract is centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant is used as a 25 mL strong acid cation exchange resin SK1B (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) or a strong acid cation exchange resin IR120B (Organo Corporation). Made).
  • Reference Example 4 Comparison of Ephedra Content Contained in Ephedra Extract (Reference Example 1) and Ephedrine Alkaloid-Removed Ephedra Extract (Reference Example 3) by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Ephedra Extract (Reference Example 1) and Ephedrine Alkaloid-Removed Ephedra Extract The results obtained from the HPLC analysis of (Reference Example 3) are shown in the table below. From these results, it was found that ephedrine alkaloids (ephedrine and pseudoephedrine) can be removed from the ephedra extract to the detection limit (0.05 ppm) or less by column chromatography using the strong acid type cation exchange resin SK1B or IR120B.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • Reference Example 5 Comparison of compositional components of Ephedra extract (Reference Example 1) and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract (Reference Example 3) Compositional components of Ephedra extract and ephedrine alkaloid-removed Ephedra extract by three-dimensional high-speed liquid chromatography (3D-HPLC) As a result of comparison, the peak of ephedrine alkaloid disappeared in the ephedrine alkaloid-free ephedra extract, but the pattern of other components was almost the same as that of the ephedra extract (data not shown).
  • 3D-HPLC three-dimensional high-speed liquid chromatography
  • Reference Example 7 Preparation of polymer condensed tannin standard substance About 100 mg of polymer condensed tannin was precisely weighed, and 10 mL of a 50% dimethylformamide solution was accurately added to completely dissolve the polymer condensed tannin. As a result of gel permeation chromatography (GPC) analysis of this solution, it was confirmed that the weight average molecular weight was 85642 and no peak was confirmed in the low molecular weight range, and the polymer condensed tannin standard substance solution (10.0 mg / mL) was confirmed. And said.
  • GPC gel permeation chromatography
  • Reference Example 8 Evaluation of polymer condensed tannin content by GPC A GPC test was conducted on 3 lots of hemp yellow extract under the following conditions, and the polymer condensed tannin content was calculated to be 2.84 mg / mL.
  • GPC test method The sample was precisely weighed and dissolved in a 50% dimethylformamide solution to a concentration of about 10.0 mg / mL to prepare a sample solution. GPC was performed on the sample solution and the polymer condensed tannin standard substance solution under the following conditions, and the peak areas AT and A of the sample solution and the polymer condensed tannin standard substance solution were used using the data processing software Chromato-PRO-GPC. S and the weight average molecular weight were calculated.

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Abstract

新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防又は治療のための、麻黄エキス、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス、または麻黄エキス由来の高分子縮合型タンニンを有効成分として含む医薬品製剤、漢方製剤、食品その他の組成物の使用。好ましくは、これらの組成物は経口摂取可能な形態で提供される。

Description

新型コロナウイルス感染症の予防又は治療のための抗ウイルス剤
　本発明は、麻黄エキス、麻黄エキスからエフェドリンアルカロイドを除いたエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（Ephedrine alkaloids-free Ephedra Herb extract: EFE）、及び／又は、麻黄由来高分子縮合型タンニンを有効成分とし、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス剤に関する。
　新型コロナウイルス感染症（COVID-19）は、世界的な感染拡大が生じており、その予防法及び治療法の確立が喫緊の課題となっている。このような背景から、様々な既存の医薬品からCOVID-19の治療に有効であるものを早急に見出す研究が進められている。しかしながら、コロナウイルス以外のウイルスに対して有効性が確認されている薬剤であっても、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）に対して有効であるかは、容易に予想できず、感染機構に基づいた分子レベルや細胞レベルでの評価実験によって有効性を検証する必要がある。
　現在までに、日本国内で承認されている治療薬を以下の表に示す(非特許文献1：新型コロナウイルス感染症診療の手引き 第5.3版, 2021年8月29日/日刊薬業　2021年9月27日)。抗体医薬品のロナプリーブとゼビュディ以外は、中等症以上の患者に対する治療薬である。ロナプリーブとゼビュディは、点滴静注のため、治療できる医療機関に制限があり、薬価も10万円以上すると言われており、抗体のために増産も難しい。このため、自宅療養中の軽症者に安全かつ安価に投与できる経口治療薬が求められている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　漢方薬は、複数の生薬を組み合わせた漢方処方のエキスであり、伝統的に様々な疾病の治療に用いられてきた。漢方薬の適用は、現代医学とは異なる漢方医学的概念に基づいて処方されている。したがって、COVID-19に対する漢方治療が期待されている。このような背景から、漢方医学的概念に加え、これまでの知見を踏まえ、いくつかの漢方薬が候補薬として提案されている（非特許文献2、非特許文献3）。しかしながら、具体的なエビデンスは無く、可能性の提示に留まっている。また、中国で伝統的に使用されている複数の生薬のエキスである中医薬、清肺排毒湯について、候補薬となることが提案されている（非特許文献2、非特許文献4）。しかしながら、清肺排毒湯は抗ウイルス剤としての作用機序は不明であり、すべての生薬、あるいは、特定の複数の生薬の組み合わせで効果を示すのか、特定の生薬エキス単独でも有効であるかについては報告されていない。
　上述したように、生薬は漢方薬等の伝統薬として用いられている。生薬は、路地での栽培、あるいは、自生しているものを収穫し、乾燥して用いている。したがって、同じ種であっても、採取季節や天候等の不確定因子の影響を受け、成分含量が変動することがある。抗ウイルス作用を有する生薬や漢方薬等を経験的に用いることは可能であるが、採取されたロットの力価は不確定であるため、効能効果を標榜した医薬品として提供するためには、適切な試験を実施し、適切な規格に適合していることを確認しなければならない。
　麻黄は、日本薬局方に収載されている医薬品であり、その薬効は、ほとんど全てエフェドリンアルカロイドに起因するものと信じられてきた。しかし、発明者らは、麻黄に、エフェドリンアルカロイドに依存しない有用な薬効を見出だし、副作用の原因物質であるエフェドリンアルカロイドを選択的に除去することで、安全性の高い医薬品として麻黄エキスを提供できるとの発想に至り、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの抗がん・抗転移薬、疼痛抑制薬、抗インフルエンザウイルス薬としての用途を示してきた（特許文献1、非特許文献5）。さらに、発明者は、重量平均分子量45,000以上の麻黄由来高分子縮合型タンニンがこれらの薬効に関与していることを明らかにしている（特許文献2、非特許文献6）。
　このように、麻黄エキス、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス、及び、麻黄由来高分子縮合型タンニンは、いくつかの薬効を有することが示されているが、新型コロナウイルスに対する抗ウイルス作用は報告がない。また、これまでの知見から抗新型コロナウイルス作用を示すか、当業者であっても不明であった。
　しかし、麻黄エキス、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス、及び、麻黄由来高分子縮合型タンニンが、抗コロナウイルス作用を有していることが明らかとなれば、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗コロナウイルス剤として提供できる。また、主たる薬効成分を定量する方法を開発することで、麻黄エキスやエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスだけでなく、経験的に新型コロナウイルス感染症の治療に用いられている麻黄を含有する漢方薬についても、構成生薬として用いている麻黄の抗ウイルス作用を担保した医薬品として提供できる。
WO2015/076286（特願2015-549167号） 特開2019-131536号
新型コロナウイルス感染症診療の手引き 第5.3版, 2021年8月29日 渡辺賢治、金成俊、柴山周乃、劉建平、賈立群、金、顔宏融、[緊急寄稿]新型コロナウイルス感染症（COVID-19）に対する漢方の役割、週刊日本医事新報  5008号、p44（2020年04月18日発行） 小川恵子、（特別寄稿）COVID-19感染症に対する漢方治療の考え方（改訂第2版）、（一財）日本感染症学会ウエブサイト、http://www.kansensho.or.jp/modules/news/index.php?content_id=147 有田龍太郎、▲高▼山真、石沢興太、石井正、中国における COVID-19 に対する清肺排毒湯の報告、（一財）日本感染症学会ウエブサイト、http://www.kansensho.or.jp/modules/news/index.php?content_id=147 Oshima N, Yamashita T, Hyuga S, Hyuga M, Kamakura H, Yoshimura M, Maruyama T, Hakamatsuka T, Amakura Y, Hanawa T, Goda Y, Efficiently prepared ephedrine alkaloids-free Ephedra Herb extract: a putative marker and antiproliferative effects. J Nat Med. 2016; 70: 554-62. Yoshimura M, Amakura Y, Hyuga S, Hyuga M, Nakamori S, Maruyama T, Oshima N, Uchiyama N, Yang J, Oka H, Ito H, Kobayashi Y, Odaguchi H, Hakamatsuka H, Hanawa T, Goda Y, Quality Evaluation and Characterization of Fractions with Biological Activities in Ephedra Herb Extract and Ephedrine Alkaloids-Free Ephedra Herb Extract. Chem Pharm Bull. 2020; 68(2): 140-149.
　本発明の課題は、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス剤を提供することにある。
　本発明には、既存薬や医薬品候補組成物の抗コロナウイルス作用について、コロナウイルスの感染機構に基づいた分子レベルや細胞レベルでの評価実験による検証が必要である。
　本発明者らは、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療に用いることができる有用な組成物として、麻黄エキス、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス、及び、麻黄由来高分子縮合型タンニンについて、新型コロナウイルスの感染機構に基づいた分子レベルや細胞レベルでの評価実験を行った結果、抗新型コロナウイルス作用を有することを見出し、さらに、抗新型コロナウイルス作用の主成分である高分子縮合型タンニンをゲル浸透クロマトグラフィーで分離する技術で有効性を担保する方法を見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、代表的な態様として、以下の（１）～（１１）を提供するものである。
（１）麻黄エキスを有効成分とし、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス剤。
（２）麻黄エキスからエフェドリンアルカロイドを除いたエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを有効成分とし、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス剤。
（３）麻黄由来高分子縮合型タンニンを有効成分とし、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス剤。
（４）医薬品製剤又は漢方製剤の形態である、上記の抗ウイルス剤。
（５）食品の形態である、（２）又は（３）に記載の抗ウイルス剤。
（６）エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスまたは麻黄由来高分子縮合型タンニンを含む飲食物を経口的に摂取させることを含む、新型コロナウイルス感染症の予防のための方法（望ましくは、医療行為を除く）。
（７）麻黄エキスまたはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスまたは麻黄由来高分子縮合型タンニンを有効成分として含有する医薬品を対象に投与することを含む、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療のための方法。
（８）高分子縮合型タンニンをゲル浸透クロマトグラフィーで定量することにより、上記（１）～（５）に記載の組成物の抗ウイルス剤としての有効性を担保する方法。
（９）麻黄エキスが高分子縮合型タンニンを0.01％以上含む、（１）の抗ウイルス剤。
（１０）エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスが高分子縮合型タンニンを0.01％以上含む、（２）の抗ウイルス剤。
（１１）他のCOVID-19治療薬を対象に投与することをさらに含む、（６）または（７）の方法。
　本願発明により、麻黄エキス、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（EFE）、及び、高分子縮合型タンニンを抗新型コロナウイルス剤として提供できることが明らかとなった。また、抗新型コロナウイルス作用の主成分が分子量10,000～500,000の高分子縮合型タンニンであることが明らかとなり、抗ウイルス剤としての有効性を担保するゲル浸透クロマトグラフィーによる定量法が確立できた。
　既に述べたように、COVID-19の患者に安全かつ安価に投与できる経口治療薬が求められている。2021年9月現在、世界で開発中の経口治療薬を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　EFE以外の治療薬はRNAポリメラーゼ阻害剤とメインプロテアーゼ阻害剤であり、EFEと同じ作用機序の経口治療薬はない。EFEはロナプリーブ及びゼビュディと同じ作用機構で、SARS-CoV2のスパイクタンパク質に結合して、宿主細胞への結合を阻止する。上の表の経口治療薬がEFEよりも先に医薬品化されても、作用機序が異なるため、EFEとの併用も可能である。また、経口治療薬は患者が自宅で服用するために、安全性が最も重要であるが、EFEは副作用成分を除去しているため安全性が高い。さらにロナプリーブやゼビュディよりも安価に供給でき、EFEの作用機序から、医療従事者、濃厚接触者や、ワクチン接種ができない者に対する予防的投与が可能であると考えられる。最近、EFEがSARS-CoV-2の変異株に対しても有効であることが明らかになった。実施例で示すように、EFEはSARS-CoV-2の様々な変異株の感染を阻害する。したがって、新たに出現する変異への脅威にも対応が可能である。
　FEFの有効成分は高分子縮合型タンニンの混合物（麻黄由来高分子縮合型タンニン）であると考えられ、多様な構造と多様な分子量を有している。発明者らは、理論に拘束される意図はないが、このように多様な構造と多様な分子量を持つことが、麻黄エキスまたはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（EFE）または麻黄由来高分子縮合型タンニンの様々な薬効（抗がん・抗転移薬、疼痛抑制薬、抗インフルエンザウイルス薬としての用途）の理由であろうと考えている。本発明者らは、EFEおよび麻黄由来高分子縮合型タンニンがインフルエンザウイルスの感染阻害作用を奏することを確認している。インフルエンザウイルスと新型コロナウイルスの構造の差異の方が、新型コロナウイルスの変異よりも大きいが、どちらのウイルスも阻害できることを考えると、EFEや麻黄由来高分子縮合型タンニンは、将来的に出現する新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）の変異に対しても幅広く対応可能であると期待される。
　以上のことから、麻黄エキス、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス、及び／又は、麻黄由来高分子縮合型タンニンを有効成分とする医療用または一般用医薬品である抗新型コロナウイルス剤を新型コロナウイルス感染症の治療に用いることで、入院管理を必要とせず、自宅や宿泊施設療養中の感染初期の軽症患者の重症化を抑制することが可能である。
　また、抗新型コロナウイルス剤を一般用医薬品として提供できるため、医療従事者や濃厚接触者がセルフメディケーションによる早期の予防的治療が可能となる。さらに、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスや麻黄由来高分子縮合型タンニンは、副作用成分であるエフェドリンアルカロイドを含まないため、食薬区分上、食品としての利用が可能であるため、新型コロナウイルス感染症の予防を期待した保健機能食品として提供することもできる。
　さらに、麻黄を含有する漢方薬をはじめ、麻黄エキス、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス、及び、高分子縮合型タンニンについて、抗新型コロナウイルス剤としての有効性を担保する方法を提供することができる。
新型コロナウイルス感染細胞に対するエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加によるウイルスコピー数の影響を示すグラフである。VeroE6/TMPRSS2細胞における新型コロナウイルスのN1 RNAコピー数について、コントロール条件（黒丸）及びエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加条件（三角）の挙動を示す。　x軸：ウイルス接種後の経過時間　ｙ軸：SARS-CoV-2　RNAコピー数。 新型コロナウイルス変異株に対するエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの感染阻害効果を示す。 新型コロナウイルスの感染に関連するスパイクタンパク質のS1ドメインに対するエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス成分の結合を示すセンサーグラムである。実測値（実線）にフィッティングする結合モデルによる予測値（破線）を示した。 新型コロナウイルス感染に関わるスパイクタンパク質に対する麻黄由来高分子縮合型タンニンの結合を示すセンサーグラムである。400 nM、200 nM、及び100 nM高分子縮合型タンニンについて、各実測値（実線）にフィッティングする結合モデルによる予測値（各破線）を示した。 麻黄由来高分子縮合型タンニン（EMCT）による新型コロナウイルスのスパイクタンパク質とACE2の結合阻害作用を示すグラフである。50％結合阻害濃度（IC50）は、4パラメーターロジスティック回帰の結果（実線）、3 ng/mLと算出された。 MHV感染5日目の右肺のウイルス量を示す。 MHV感染5日目の呼吸状態を示す。 プロアントシアニジンAタイプ及びプロアントシアニジンBタイプの構造及びその構成ユニットの構造を示す図である。
　本発明は、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用の抗ウイルス剤として、麻黄エキス、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス、及び、麻黄由来高分子縮合型タンニンを使用すること、及び、これらを有効成分として含む医薬品や食品等の組成物を提供する。
　麻黄エキスの製造
　本発明に用いられる麻黄エキスは、マオウ科植物Ephedra sinica Stapf、Ephedra intermedia Schrenk et C. A. MeyerまたはEphedra equisetina Bunge （Ephedraceae）の地上茎を用いる。生、乾燥もしくは地上茎を加工したものを利用できる。麻黄エキスの抽出工程は、周知の方法のいずれかに基づいて行なうことができる。抽出溶媒としては、水または温水、熱水、アルコール系溶媒、およびアセトンなどその他の有機溶媒を用いることができる。アルコール系溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノールなどを例示することができる。これらの溶媒は単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
　抽出溶媒の量は麻黄の乾燥重量に対して、２－１００重量部、４－５０重量部、または８―２５重量部であることが好ましい。抽出温度は４－９８℃が好ましい。抽出時間は３０分－２時間が好ましい。抽出方法は攪拌抽出、浸漬抽出、向流抽出、超音波抽出、超臨界抽出などの任意の方法で行うことができる。一態様において、抽出溶媒は水であり、そして、麻黄エキスは、麻黄の熱水抽出液および／または熱水抽出物であることができる。麻黄の熱水抽出液および／または熱水抽出物は、麻黄の乾燥原料に対して、２－１００重量部、４－５０重量部、または８－２５重量部、または約１０重量部の熱水（例えば、約９５℃）で、３０分－２時間抽出することにより得られる。
　得られた抽出液、または抽出液を濾過し得られた濾液、もしくは濾液を濃縮した濃縮液、濃縮液を乾燥して得られる乾燥物は、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスあるいは麻黄由来高分子縮合型タンニンの製造の原料として用いることができる。
　また、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス剤を用途としての麻黄エキス原薬や漢方薬原料エキスとして用いる場合、後述の分子量10,000～500,000の高分子縮合型タンニンを0.01％以上含むことが好ましく、0.1％以上含むことがさらに好ましい。そのような、分子量10,000～500,000の高分子縮合型タンニンを0.01％以上または0.1％以上含むことが示された麻黄エキスも本発明の範囲内である。
　エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造
本発明に用いられるエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは、麻黄エキスを原料とし、陽イオン交換クロマトグラフィーによってエフェドリンを除去し、濃縮乾燥を経て、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを得ることができる。
　エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは、麻黄エキスからエフェドリンアルカロイドを除いたエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスであり、エフェドリンアルカロイド（エフェドリンとプソイドエフェドリンの合計）を0.23％以下の量で含むものが好ましく、より好ましくはエフェドリンアルカロイドを0.023％以下の量で含むものであり、さらに好ましくは0.05ppm(検出限界)以下の量で含む。
　日本薬局方では、麻黄は生薬の乾燥物に対し，総アルカロイド（エフェドリン及びプソイドエフェドリン）を0.7％以上含むと規定されており、この量は麻黄エキスで換算した場合、約2.3％～3.5％以上含むものと計算されるので、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは麻黄エキスと明確に区別される。
　なお、上記の麻黄エキス中の総アルカロイド含量の換算は、「漢方の主張―現代科学と漢方製剤」（成川一郎、ｐ１６２－１６３、（株）健友館、1991年発行）及び参考例1から求められる。日本薬局方の麻黄から麻黄エキスを作製すると、麻黄に含まれるエフェドリンアルカロイドは、ほぼ全て麻黄エキスへ移行する。しかし、麻黄から得られる麻黄エキスの収率は20％から30％になるため、麻黄エキスに含まれる総アルカロイドは、3.3倍～5倍に濃縮される。したがって、日本薬局方で規定される麻黄の総アルカロイドである「0.7％以上」を3.3倍～5倍にした数値2.3％～3.5％以上が麻黄エキスの総アルカロイドの規定値となる。本発明に用いられるエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは、エフェドリンアルカロイド含量を、麻黄エキスの１０分の１以下とすることで、エフェドリンアルカロイドの副作用の出現の可能性が極めて少ないであろうと考えられる。
　エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造に適した陽イオン交換カラムは、エフェドリンアルカロイドの除去効率に応じ、充填剤を選択することができる。エフェドリンアルカロイド含量が0.23％以下のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造には、弱酸性陽イオン交換樹脂WK２０、強酸性陽イオン交換樹脂SK１０４、SK１１０、SK１B、UBK５３０、PK２１６、IR１２０B、FPC3500、１０６０Hの中からカラム充填剤として選択することができる。エフェドリンアルカロイド含量が0.023％以下のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス製造には、弱酸性陽イオン交換樹脂WK２０、強酸性陽イオン交換樹脂SK１０４、SK１１０、SK１B、UBK５３０、PK２１６、IR１２０B、１０６０Hの中からカラム充填剤として選択することができる。さらに、エフェドリンアルカロイド含量が0.05ppm以下のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造には、強酸性陽イオン交換樹脂PK216をカラム充填剤として選択できるほか、強酸性陽イオン交換樹脂SK１B、IR１２０Bも選択することができる。
　また、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス剤を用途としてのエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス原薬として用いる場合、後述の分子量10,000～500,000の高分子縮合型タンニンを0.01％以上含むことが好ましく、0.1％以上含むことがさらに好ましい。そのような、分子量10,000～500,000の高分子縮合型タンニンを0.01％以上または0.1％以上含むことが示されたエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスも本発明の範囲内である。
　エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造において、クロマトグラフィーの具体的な実施方法は、当業者に周知な方法のいずれかによる。乾燥方法は、減圧乾燥、凍結乾燥、スプレー乾燥などの任意の方法で行うことができる。必要な場合にはデキストリンなどの賦形剤を入れてもよい。
　麻黄由来高分子縮合型タンニンの製造
　本発明の麻黄由来高分子縮合型タンニンは、分子量10,000～500,000の高分子縮合型タンニンで、プロアントシアニジンAタイプ及びプロアントシアニジンBタイプの重合したプロアントシアニジンである。より詳細には、前記高分子縮合型タンニンは、エクステンションユニットとして、カテコールタイプ又はピロガロールタイプのフラバン 3-オールが主にプロアントシアニジンBタイプで縮合し、その一部にプロアントシアニジンAタイプの縮合型タンニンユニットを含み、さらにターミナルユニットとして、カテコールタイプ又はピロガロールタイプのフラバン 3-オールを主に含み、ピロガロールタイプとカテコールタイプを、4～5：1の比率で含む（図８）。ここで、分子量は、GPC用標準ポリスチレンを標準物質として換算した分子量である。
　本発明の麻黄由来高分子縮合型タンニンは、麻黄エキスあるいはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを原料とし、カラムクロマトグラフィーによって、水とアルコール、あるいは、水とアセトンとの混合溶媒を用いて、アルコールもしくはアセトン濃度を高くしながら順次溶出して得ることができる。分子量10,000～500,000の高分子縮合型タンニンを含む抽出分画物から溶媒を留去し、乾燥させたものを原薬として用いることができる。
　具体的には、麻黄エキス又はエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを水に溶解したものを、極性の低い有機溶媒から極性の高い有機溶媒を用いて順次分配し、得られる水エキスをカラムクロマトグラフィーによって、水とメタノール、エタノール又はアセトンから選択される有機溶媒との混合溶媒を用いて、有機溶媒濃度を高くしながら順次溶出し、得られる各分画の分子量を測定して、分子量10,000～500,000の高分子縮合型タンニンを含む抽出分画物を得る。
　極性の低い有機溶媒の例としては、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル等が挙げられ、極性の高い有機溶媒の例としては、n-ブタノール、エタノール、メタノール、水等が挙げられる。分画に用いるカラムクロマトグラフィーでは、Diaion HP-20等のスチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤、あるいは、LH-20等、その他の芳香族系合成吸着剤を用いることができる。各分画の分子量測定は、粘度法、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）、質量分析法、浸透圧法等を用いることができる。
　さらに具体的には、麻黄エキス又はエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを水で溶解したもの、あるいは、これらのエキスを、酢酸エチル、水飽和n-ブタノールで順次分配して得た水エキスを以下のクロマトグラフィーの出発材料とする。これらのエキスについて、Diaion HP-20カラムクロマトグラフィーを用いて、H2O、20％MeOH、40％MeOH、MeOHの順で順次溶出して分画し、H2O分画物、20％MeOH分画物、40％MeOH分画物、MeOH分画物の各分画物を得る。このうち、20％MeOH分画物、40％MeOH分画物、MeOH分画物として、分子量10,000～500,000の麻黄由来高分子縮合型タンニンを得ることができる。
　本発明の麻黄由来高分子縮合型タンニンは、20％MeOH分画物、40％MeOH分画物、MeOH分画物を単独で、又は任意の組合せで用いることにより調製できる。分画物中に、上述の分子量10,000～500,000の高分子縮合型タンニンを10％以上含むことが好ましく、40％以上含むことがさらに好ましい。
　別の方法として、本発明の麻黄由来高分子縮合型タンニンは、麻黄エキス又はエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを水で溶解したもの、あるいは、上述する水エキスをSephadex LH-20カラムクロマトグラフィーを用いて、50％MeOH、次いで80％MeOHで洗浄後、70％アセトン分画物として、麻黄由来高分子縮合型タンニンを得ることができる。
　麻黄由来高分子縮合型タンニンの製造において、クロマトグラフィーの具体的な実施方法は、当業者に周知な方法のいずれかによる。また、クロマトグラフィーで得られた麻黄由来高分子縮合型タンニンを含む溶液、もしくは、減圧乾燥、凍結乾燥、スプレー乾燥などの任意の方法で乾燥して得られた粉末を原薬として用いることができる。また、デキストリンなどの賦形剤を添加した後、上記の方法で乾燥させることで、粉末としての物性を改善した原薬を調製することも可能である。
　医薬品および治療方法
　本発明の一態様において、麻黄エキス、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス、あるいは、麻黄由来高分子縮合型タンニンを、抗新型コロナウイルス剤の有効成分として用いることができる。
　麻黄エキス、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス、あるいは、麻黄由来高分子縮合型タンニンを有効成分として含有する医薬品製剤を、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療のために、そのような予防又は治療を必要とする対象に投与することができる。したがって、対象は、軽症または重症の患者のみならず、感染の疑いのある人であってもよい。
　本発明の医薬品製剤の投与方法は特に限定されるものではないが、経口投与可能な剤形が好ましい。本発明の医薬用組成物は種々の剤形とすることができる。
　例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができるが、これらに限定されない。また、製剤には薬剤的に許容できる種々の担体を加えることができる。
　例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、コーティング剤、ビタミンＣ、抗酸化剤を含むことができるが、これらに限定されない。
　麻黄は漢方薬の構成生薬として幅広く用いられていることから、麻黄を含有する漢方薬、及び、麻黄を、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスに置き換えた漢方薬を抗コロナウイルス薬として提供できる。
　食品
　本発明のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスや麻黄由来高分子縮合型タンニンは、副作用成分であるエフェドリンアルカロイドを含まないため、食品としての利用が可能である。したがって、本発明のエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス、及び、麻黄由来高分子縮合型タンニンは、食品に含有させることができる。例えば、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを原材料に配合することにより、様々な食品の形態とすることができる。食品として、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料；飴、キャンディー、チュアブル、ゼリー、ガム、チョコレート等の菓子類；顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤など種々の形態の健康食品、機能性表示食品や栄養補助食品が挙げられる。
　食品としては、一般的な食品であっても、特に機能表示を伴わない健康補助食品、栄養補助食品等（いわゆるサプリメント）であっても、機能表示付きの食品（例えば、保健機能食品）であってもよい。食品は特別の用途に適する旨の表示（いわゆるヘルスクレーム）を付した食品であってもよいが、医薬として摂取されるものは含まない。ヘルスクレームの例としては、特定の疾病リスク（例えば新型コロナウイルス感染症（COVID-19）に罹患するリスク）を低減する旨の表示であることができる。
　このような食品には、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスや麻黄由来高分子縮合型タンニンの他に、カルシウム等の無機成分、種々のビタミン類、オリゴ糖、キトサン等の食物繊維、大豆抽出物等のタンパク質、レシチンなどの脂質、ショ糖、乳糖等の糖類を加えることができる。
　新型コロナウイルス感染症の予防のために、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスまたは麻黄由来高分子縮合型タンニンを含む飲食物を経口的に摂取させることも、本発明の一態様である。このような行為は、医療行為としてではなく実施されることが望ましいと思われる。
　高分子縮合型タンニンの定量
　本発明は、分子量の範囲を特定した麻黄由来高分子縮合型タンニンの含量を定量することも包含する。例えば、原料生薬である麻黄、麻黄エキス原薬、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス原薬、及び、高分子縮合型タンニン原薬について、高分子縮合型タンニンは、抗新型コロナウイルス作用の指標成分とすることができる。
　すなわち、上述の医薬品原料や原薬のみならず、食品など、組成物中の高分子縮合型タンニン含有量を定量し、含有量の規格を満たしていることを確認する試験を設定することにより、それらの組成物の抗新型コロナウイルス剤としての有効性を担保することが可能である。さらに、麻黄湯や葛根湯などの麻黄を含有する漢方薬についても、同様な規格と試験方法を設定することにより、それらの組成物の抗新型コロナウイルス剤としての有効性を担保することが可能である。
　高分子縮合型タンニンの定量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）により行う。具体的な方法は、実施例７に記載の方法で例示されるが、これに限定されない。例えば、試料溶液及び高分子縮合型タンニン標準物質溶液のピーク面積AT及びASから、試料1 mg中の高分子縮合型タンニンの量（mg）を算出することができる。
　上述したように、GPC分析は、原料生薬である麻黄の受入試験、各種原薬及び食品の有効成分の含量規格の試験方法として用いることができる。
　高分子縮合型タンニンの定量は、液体はそのまま、固体は任意の溶媒で溶液とすることで測定試料として用いることができるが、高分子縮合型タンニン含量が少ない組成物や夾雑物を多く含む組成物については、本明細書に記載した高分子縮合型タンニンの調製方法、すなわち、抽出方法やカラムクロマトグラフィー等を前処理方法として用いることで、定量が可能となり、定量の感度、精度、直線性等を改善できる場合もある。
　一態様において、麻黄エキスまたはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを調製し、得られた麻黄エキスまたはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスについて、分子量10,000～500,000の高分子縮合型タンニンを定量し、高分子縮合型タンニン含量が0.01％以上である麻黄エキスまたはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを、抗新型コロナウイルス剤の原薬として使用する。
　援用
本発明の開示には、非特許文献5（Oshima N, Yamashita T, Hyuga S, Hyuga M, Kamakura H, Yoshimura M, Maruyama T, Hakamatsuka T, Amakura Y, Hanawa T, Goda Y, Efficiently prepared ephedrine alkaloids-free Ephedra Herb extract: a putative marker and antiproliferative effects. J Nat Med. 2016; 70: 554-62）および非特許文献6（Yoshimura M, Amakura Y, Hyuga S, Hyuga M, Nakamori S, Maruyama T, Oshima N, Uchiyama N, Yang J, Oka H, Ito H, Kobayashi Y, Odaguchi H, Hakamatsuka H, Hanawa T, Goda Y, Quality Evaluation and Characterization of Fractions with Biological Activities in Ephedra Herb Extract and Ephedrine Alkaloids-Free Ephedra Herb Extract. Chem Pharm Bull. 2020; 68(2): 140-149）に記載された事項を援用する。
　これより本発明を以下の実施例で詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。
実施例１：エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの新型コロナウイルス感染阻害作用
　エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加により、新型コロナウイルス感受性細胞であるVeroE6/TMPRSS2細胞での新型コロナウイルスの増殖等に抑制効果が出現するかを検討した。
　エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加濃度は、事前にVeroE6/TMPRSS2細胞に対してエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの毒性が観察されない最高濃度を確認し、50 μg/mLとした。比較対照としてエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを添加しないコントロール群を同時に検討した。
　新型コロナウイルスの感染評価は、VeroE6TMPRSS2細胞に新型コロナウイルスを感染させ、一定時間培養した後、RNAを抽出し、PCR法によりウイルスのRNA量として定量し、標準物質の検量線からコピー数を求めた。
　VeroE6/TMPRSS2細胞を10％FBS-DMEMで5x105個/mLとなるように懸濁し、48ウエルプレート3枚に１ウエルあたり200μL播種し、CO2インキュベーターで24時間培養した。エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加群は、50μg/mL エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加無血清DMEMに交換、コントロール群は、無血清DMEMに交換し、1時間 、CO2インキュベーターで保温した。各ウエルにMOI (Multiplicity of Infection)=0.03となるように新型コロナウイルス（SARS-CoV-2，JPN/TY/WK-521株）を接種し、１時間、CO2インキュベーター内で保温した。無血清DMEMで２回洗浄し、無血清DMEMを加えた。1枚のプレートはそのまま回収し（0時間）、他の2枚のプレートは、ウイルス接種後４時間、及び２４時間、CO2インキュベーター内で保温した。各プレートについて、培地も含めて細胞を全量からRNAを抽出し、米国CDCのSARS-CoV-2-N1をプローブとしたRT-PCRを実施した。米国CDCのN遺伝子プラスミドを用いて検量線を作成し、ウイルスのコピー数を求めた（表Ａ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを添加していないコントロール群では、アッセイ開始時点（0時間）で約10,000コピーのWK-521のRNAが検出され、4時間で約400倍、24時間で約20,000倍に増加していた。一方、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加群 においては、アッセイ開始時点（0時間）で約2,000コピーのWK-521のRNAが検出され、4時間で約25倍、24時間で約130倍に増加していた（図1）。
　アッセイ開始時点のWK-521のコピー数が、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加により20％まで低下したことから、コロナウイルスの感染初期段階が抑制されていることが確認された。また、経時的なウイルス増殖率についても、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加により著しく抑制されており、24時間後のウイルスコピー数は、コントロールのコピー数に対して0.17％と、極めてわずかな量に留まっていた。これらの結果から、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは、新型コロナウイルスの感染初期や感染段階のウイルス増殖に対して抑制効果を示すことが明らかになった。
実施例２：新型コロナウイルス変異株に対する感染阻害効果
　2019年武漢での発生以降、各国で変異株が報告されている中で特にWHOが感染拡大等について懸念すべき変異株として英国、南アフリカ、ブラジルに由来するAlpha, Beta, Gamma株等を指定し監視対象としている。これら変異株は2020年以降日本国内に侵淫し、当初の流行株WK-521近縁株に置き換わっていることから、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加により、新型コロナウイルス感受性細胞であるVeroE6/TMPRSS2細胞での新型コロナウイルス変異株の増殖等に抑制効果が出現するかを検討した。表Ｂに、実施例1および2において用いた新型コロナウイルス国内分離株を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加濃度は、事前にVeroE6/TMPRSS2細胞に対してエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの毒性が観察されない最高濃度を確認し、50 μg/mLとした。比較対照としてエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを添加しないコントロール群を同時に検討した。
　新型コロナウイルスの感染評価は、VeroE6/TMPRSS2細胞に各株を感染させ、一時間培養した後、RNAを抽出し、PCR法によりウイルスのRNA量として定量し、標準物質の検量線からコピー数を求めた。24時間後の培養上清中の感染性ウイルスの力価を求めた。
　VeroE6/TMPRSS2細胞を10％FBS-DMEMで2x104個/wellとなるように懸濁し、96ウエルプレートに播種し、CO2インキュベーターで24時間培養した。エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加群は、50μg/mL エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加無血清DMEMに交換、コントロール群は、無血清DMEMに交換し、3時間 、CO2インキュベーターで保温した。各ウエルにMOI (Multiplicity of Infection)=0.03となるようにSARS-CoV-2各変異株を接種し、2時間、CO2インキュベーター内で保温した。無血清DMEMで1回洗浄し、無血清DMEMを加えた。ウイルス感染後2時間(input)および24時間の時点で培地も含めて細胞を全量からRNAを抽出し、米国CDCのSARS-CoV-2-N1をプローブとしたRT-PCRを実施した。米国CDCのN遺伝子プラスミドを用いて検量線を作成し、ウイルスのコピー数を求めた。
　24時間培養後の感染性ウイルスの力価は、培養上清25μLを採取し、10倍階段希釈列を作成したのち、96ウェルプレートに播種しておいたVeroE6/TMPRSS2細胞へ感染させ、4日間培養後に、細胞変性効果(CPE: Cytopathic effect)を顕微鏡下で確認し、CPE出現したウェル数、希釈倍数から算出した。
　その結果、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを添加していないコントロール群では、24時間培養後に、平均2.3x107copies/well、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加群 においては、平均5.8x105copies/wellとなり、コントロール群に比較して約2.5％と、RNA増殖が著しく抑制されていた（図２：各変異株の24時間後のN遺伝子コピー数）。
　24時間培養後の培養上清中の感染性ウイルスは、コントロール群では平均4.9x105　TCID50/mLとなったのに対して、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス添加群においては、平均1.8x104　 TCID50/mLとなり、コントロール群100に対して添加群では平均約3.7%と、感染性ウイルスの産生も著しく抑制されていた。これらの結果から、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスは、新型コロナウイルスの各種変異株においても、ウイルス増殖に対して抑制効果を示すことが明らかになった。
実施例３：新型コロナウイルス感染に関わるスパイクタンパク質に対するエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス成分の結合能
　新型コロナウイルスが標的細胞に結合する時、ウイルスのスパイクタンパク質が標的細胞の受容体分子に結合する。エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの成分が新型コロナウイスルのスパイクタンパク質に結合すれば、ウイルスと標的細胞の結合が阻害される。そこで、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの成分が新型コロナウイスルのスパイクタンパク質に対する結合能について、分子間相互作用解析装置を用いて検討した。
　分子間相互作用解析装置は、BIACORE(GE Healthcare)を用いた。遺伝子組換えの手法で作製された新型コロナウイルスのスパイクタンパク質のS1ドメイン（組換えS1）をセンサーチップCM5にアミンカップリング法で約500 RU固定化した。エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスをHEPESバッファー（0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ (v/v) SurfactantP20）に溶解し、200 μg/mLとなるように調整し，試料溶液とした。流速30 μL/minで試料溶液を60秒間アプライした後、120秒間 HEPESバッファーで洗浄した。組換えS1を固定化したフローセルのレスポンスから固定化していないフローセルのレスポンスを差し引いたセンサーグラムを得た結果、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの成分が組換えS1に強く結合していることが明らかとなった（図３）。
　これらの結果より、麻黄エキスやエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの成分が、新型コロナウイルスの感染に重要な役割を果たしているスパイクタンパク質のS1ドメインに強く結合することで、新型コロナウイルスの感染を抑制するものと考えられた。
実施例４：新型コロナウイルス感染に関わるスパイクタンパク質に対する麻黄由来高分子縮合型タンニンの結合
　新型コロナウイルスのスパイクタンパク質に対し、麻黄エキスあるいはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの活性成分と考えられる麻黄由来高分子縮合型タンニンが結合するか、分子間相互作用解析装置を用いて検討した。
　分子間相互作用解析は、実施例３に記載した装置及びセンサーチップを用い、同様の条件で検討した。麻黄由来高分子縮合型タンニンをHEPESバッファーに溶解し、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mLとなるように調整し，試料溶液とした。流速30 μL/minで試料溶液を60秒間アプライした後、120秒間 HEPESバッファーで洗浄した。組換えS1を固定化したフローセルのレスポンスから固定化していないフローセルのレスポンスを差し引いたセンサーグラムを得た。その結果、麻黄由来高分子縮合型タンニンが組換えS1に濃度依存的に結合していることが明らかとなった（図４）。麻黄由来高分子縮合型タンニンの平均分子量は約100,000であることから、各試料の濃度を、400 nM、200 nM、100 nMとみなし、センサーグラムに対するカーブフィッティング法を用いて麻黄由来高分子縮合型タンニンと組換えS1の結合モデルを速度論的に解析した結果、解離定数KDは30.7 nMと算出され、麻黄由来高分子縮合型タンニンは新型コロナウイルスのスパイクタンパク質に結合阻害剤として十分機能しうる結合能を有することが明らかとなった。
　これらの結果より、麻黄エキスやエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの成分である麻黄由来高分子縮合型タンニンが、新型コロナウイルスの感染に重要な役割を果たしているスパイクタンパク質のS1ドメインに強く結合することが明らかとなり、麻黄エキスやエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス と同様に、麻黄由来高分子縮合型タンニンが新型コロナウイルスの感染を抑制する抗ウイルス剤となり得ると考えられた。
実施例５： 新型コロナウイルスのスパイクタンパク質とACE2の結合阻害作用
　新型コロナウイルスのスパイクタンパク質が宿主細胞のACE2に結合することが、感染の第一段階であることが明らかとなっている。実施例4で示した、麻黄エキスあるいはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの活性成分と考えられる麻黄由来高分子縮合型タンニンが、スパイクタンパク質に結合することで、ACE2への結合を阻害するか、酵素標識したスパイクタンパク質を用いて検討した。
　96穴マイクロプレートに組換えACE2細胞外ドメイン（スパイクタンパク質との結合ドメイン）を固定化し、ビオチン化組換えスパイクタンパク質レセプター結合ドメイン（S1-RBD）を添加し、リン酸緩衝液で洗浄した後、アビジン化HRPとHRPの基質を添加反応させることで、ACE2へのスパイクタンパク質の結合量を測定するアッセイを用いて検討した。麻黄由来高分子縮合型タンニンを、最終濃度が、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mLとなるように、ビオチン化組換えS1-RBDとともに添加し、ACE2へのスパイクタンパク質の結合量を測定した。その結果、麻黄由来高分子縮合型タンニンの添加濃度依存的に、組換えS1-RBDのACE2への結合量が低下していることが明らかとなった（図５）。得られたシグモイド曲線について4パラメーターロジスティック回帰を行った結果、50％結合阻害濃度（IC50）は、3 ng/mLと算出され、麻黄由来高分子縮合型タンニンは新型コロナウイルスのスパイクタンパク質のACE2への結合を阻害することが明らかとなった。
　これらの結果より、麻黄エキスやエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの成分である麻黄由来高分子縮合型タンニンが、新型コロナウイルスの感染の第一段階を阻害することが明らかとなり、麻黄エキスやエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスと同様に、麻黄由来高分子縮合型タンニンが新型コロナウイルスの感染を抑制する抗ウイルス剤となり得ると考えられた。
実施例６： マウスコロナウイルス感染モデルに対するEFEの経口投与による効果
　ニドウイルス目コロナウイルス科に属するマウスコロナウイルス(Murine hepatitis virus: MHV）を経鼻感染させたマウスを用いて、EFEのin vivo効果について評価した。MHVはマウスに対して肺炎を発症させることが報告されている（Albuquerque, N., et al., J Virol., 80, 10382-10394, 2006）。
　マウス（BALB/c Cr Slc、雌性）にMHV（MHV-1/ATCC VR-261）を経鼻接種し、接種1時間後からEFEを6日間経口投与した。非感染群及び感染対称群は注射用水を投与した。感染群へのEFEの投与は700 mg/kg×2回/日投与[EFE 700×2（1400）]、700 mg/kg×1回/日投与（EFE 700）、350 mg/kg×2回/日投与 [EFE 350×2（700）]とした。各群10匹のマウスを用いた。接種後5日目に右肺を採取しプラークアッセイによるウイルス量測定と呼吸状態を観察した。動物実験はツムラおよび日本バイオリサーチセンターの動物実験委員会で承認され厚生労働省の所管する実施機関における動物実験等の実施に関する基本指針に従って行われた。
　MHV接種後5日目において、右肺及び肝臓のウイルスプラーク数は感染対照群と比較し全てのEFE投与群において有意な減少が認められた。右肺のウイルスプラーク数は感染対照群では1622.3±271.9 (×10<SUP>2</SUP>PFU/g)、EFE 700×2（1400）群で96.1±10.7、EFE 700群で250.1±67.9、EFE 350×2（700）群で 417.5±121.5であった（図６）。また感染対照群で観察された呼吸不整が全てのEFE投与群で改善傾向を示した（図７）。
　以上の結果から、EFEは経口投与により肺で薬効発現することが明らかになった。
実施例７：高分子縮合型タンニンの定量法
　参考例８に示したGPCを用いた高分子縮合型タンニンの定量法について、カラム長を２倍に増加させることで夾雑物との分離能を高めた定量法を確立した。この定量法を用い、麻黄エキス３ロットについて、高分子縮合型タンニン含量を算出した結果、0.03～0.69％（平均0.36％）であった。また、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス１ロットについて、高分子縮合型タンニン含量を算出した結果、0.49％であった。
　定量法
試料及び高分子縮合型タンニン標準物質を精密に量り、約10.0 mg/mL となるよう移動相に溶解し試料溶液及び高分子縮合型タンニン標準物質溶液とした。試料溶液及び高分子縮合型タンニン標準物質溶液について、次の条件でGPCを行い、データ処理ソフトウェアLabSolutions GPCを用い、試料及び高分子縮合型タンニン標準物質のピーク面積AT及びASを測定した。
　GPC条件
　　カラム：TSK-gel Super AW4000（6.0 I.D. x 150 mm x 2本）（東ソー）
　　移動相：99.5％ N,N-ジメチルホルムアミド, 0.5％ 3 Mギ酸アンモニウム水溶液
　　カラム温度：30℃
　　流速：0.3 mL/min
　　測定波長：280 nm
　　ピーク面積測定範囲：１２分～１８分
　計算式
　　試料1 mg当たりの高分子縮合型タンニン量（mg）= AT/AS x CS/CT
　　　AT：試料のピーク面積
　　　AS：標準物質のピーク面積
　　　CT：試料濃度（mg/mL）
　　　CS：高分子縮合型タンニン標準物質濃度（mg/mL）
　参考例：
既に述べたように、発明者らは、以前、エフェドリンアルカロイドに依存しない疼痛抑制作用などの薬理効果を有する、麻黄エキスからエフェドリンアルカロイドが選択的に除去されたエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造法を確立した（特許文献１、非特許文献５）。また、発明者らは、麻黄エキスまたはエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを原料として得られる新規活性成分である麻黄由来高分子縮合型タンニンの製造法を確立した（特許文献２、非特許文献６）。これらの事項を、以下の参考例により説明する。なお、詳細な試験条件や具体的なデータについては、特許文献１（WO2015/076286）および特許文献２（特開2019-131536号）の実施例の記載を援用する。
　参考例１：麻黄エキスの作製
麻黄の乾燥原料をミキサーにより粉砕し、その粉砕物５０ｇに５００ｍLの水を加え、攪拌しながら、９５℃、１時間抽出した。固液分離し、抽出液を３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った。得られた上清液を６０℃にて減圧濃縮したと、６０℃で一晩減圧乾燥を行い、麻黄エキスとして９．６ｇを得た。
　参考例２：イオン交換クロマトグラフィーの充填剤の検討
エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの製造に適したイオン交換クロマトグラフィーの充填剤を決定するために検討を行った。麻黄エキスを各種イオン交換樹脂で処理した後に、エキスに含まれるエフェドリンアルカロイドをTLC及びHPLCで解析した。検討したイオン交換樹脂は、陽イオン交換樹脂13種類、両性イオン交換樹脂1種類、陰イオン交換樹脂8種類の計22種類である。その結果、エフェドリンアルカロイド除去に適したイオン効果樹脂は、陽イオン交換樹脂であることがわかった。そこで、弱酸性陽イオン交換樹脂WK１０、WK１１、WK２０、WK４０L、FPC３５００、強酸性陽イオン交換樹脂SK１０４、SK１１０、SK１B、UBK５３０、UBK１２、PK２１６、IR１２０B、１０６０Hを用いて、麻黄エキスを処理した後のエキスに含まれるエフェドリンアルカロイド含量をHPLCにより定量した。その結果を下記の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　参考例３：イオン交換樹脂SK1BまたはIR120Bによるエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの作製
　麻黄の乾燥原料をミキサーにより粉砕し、その粉砕物５０ｇに５００ｍLの水を加え、攪拌しながら、９５℃、１時間抽出した。固液分離し、抽出液を３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、得られた上清液を２５ｍLの強酸型陽イオン交換樹脂SK１B（三菱化学製）または強酸型陽イオン交換樹脂IR120B（オルガノ社製）に通液させた。通過液を５％のNaHCO3でpH＝５．２まで調整し、６０℃にて減圧濃縮したと、６０℃で一晩減圧乾燥を行い、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスとして６．３ｇを得た。
　参考例４：高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による麻黄エキス（参考例１）およびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（参考例３）に含まれるエフェドリンの含量比較
　麻黄エキス（参考例１）およびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（参考例３）のHPLC分析から得られた結果を以下の表に示す。これらの結果から、強酸型陽イオン交換樹脂ＳＫ１Ｂ、あるいはＩＲ１２０Ｂを用いたカラムクロマトグラフィーによって、麻黄エキスからエフェドリンアルカロイド(エフェドリン及びプソイドエフェドリン)を検出限界（0.05ppm）以下まで除去できることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　参考例５：麻黄エキス（参考例１）およびエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス（参考例３）の組成成分の比較
　３次元高速液体クロマトグラフィー（３D-HPLC）により麻黄エキスとエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの組成成分を比較した結果、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスにおいてはエフェドリンアルカロイドのピークが消失したが、他の成分のパターンは麻黄エキスとほぼ同じであった（データは示さない）。
　また、LC/MSにより麻黄エキスとエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスの組成成分を比較した結果、エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスにおいては、l-ephedrine、pseudoephedrine、methylephedrine、norephedrineの各ピークが消失していることを確認した（データは示さない）。
　参考例６：麻黄由来高分子縮合型タンニン調製
　エフェドリン除去麻黄エキス（1.0354 g）について、Sephadex LH-20カラム（1.1 cm x 40 cm、Cytiva）に添加し、50％ メタノール（MeOH）、次いで80％MeOHで溶出後、70％アセトンで溶出した。70％アセトン溶出物を凍結乾燥し、高分子縮合型タンニン（125.5 mg）を得た。
　参考例７：高分子縮合型タンニン標準物質の調製
　高分子縮合型タンニン約100 mgを精密に量り、50％ジメチルホルムアミド溶液10 mLを正確に加え、完全に溶解した。この溶液について、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分析した結果、重量平均分子量は85642で、低分子量域にピークが確認されないことを確認し、高分子縮合型タンニン標準物質溶液（10.0 mg/mL）とした。
　参考例８：GPCによる高分子縮合型タンニン含量の評価
　麻黄エキス３ロットについて、下記の条件でGPC試験を実施し、高分子縮合型タンニン含量を算出した結果、2.84 mg/mLであった。
　GPC試験法
試料を精密に量り、約10.0 mg/mL となるよう50％ジメチルホルムアミド溶液に溶解し試料溶液とした。試料溶液及び高分子縮合型タンニン標準物質溶液について、次の条件でGPCを行い、データ処理ソフトウェアChromato-PRO-GPCを用い、試料溶液及び高分子縮合型タンニン標準物質溶液のピーク面積AT及びAS、並びに、重量平均分子量を算出した。
　GPC条件
　　カラム：TSK-gel Super AW4000（6.0 I.D. x 150 mm）（東ソー）
　　移動相：99.5％ N,N-ジメチルホルムアミド, 0.5％ 3Mギ酸アンモニウム水溶液
　　カラム温度：30℃
　　流速：0.3 mL/min
　　測定波長：280 nm
　　ピーク面積測定範囲：５分～１０分
　　試料溶液1 mL中の高分子縮合型タンニンの量（mg）= AT/AS x 10.00
　　　AT：試料のピーク面積
　　　AS：標準物質のピーク面積
　　　10.00：標準物質溶液1 mL中の高分子縮合型タンニンの量（mg）

Claims (11)

  1. 麻黄エキスを有効成分とし、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス剤。
  2. 麻黄エキスからエフェドリンアルカロイドを除いたエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスを有効成分とし、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス剤。
  3. 麻黄由来高分子縮合型タンニンを有効成分とし、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス剤。
  4. 医薬品製剤又は漢方製剤の形態である、請求項1～請求項3のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
  5. 食品の形態である、請求項２又は請求項3に記載の抗ウイルス剤。
  6. エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス又は麻黄由来高分子縮合型タンニンを含む飲食物を経口的に摂取させることを含む、新型コロナウイルス感染症の予防のための方法。
  7. 麻黄エキス又はエフェドリンアルカロイド除去麻黄エキス又は麻黄由来高分子縮合型タンニンを有効成分として含有する医薬品を対象に投与することを含む、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療のための方法。
  8. 高分子縮合型タンニンをゲル浸透クロマトグラフィーで定量することにより、請求項1～請求項5に記載の抗ウイルス剤の抗ウイルス作用の有効性を担保する方法。
  9. 麻黄エキスが高分子縮合型タンニンを0.01％以上含む、請求項１の抗ウイルス剤。
  10. エフェドリンアルカロイド除去麻黄エキスが高分子縮合型タンニンを0.01％以上含む、請求項２の抗ウイルス剤。
  11. 他の新型コロナウイルス感染症治療薬を対象に投与することをさらに含む、請求項６又は請求項７の方法。
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