CN110090235A - 含有由麻黄提取物或efe得到的高分子缩合型鞣质的提取分级物及其制法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含来自麻黄提取物或者来自除去麻黄碱生物碱的麻黄提取物(EFE)的重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物及其制法以及包含其的药物组合物的用途。

Description

含有由麻黄提取物或EFE得到的高分子缩合型鞣质的提取分 级物及其制法和用途
技术领域
本发明涉及包含来自麻黄提取物或者来自除去麻黄碱生物碱的麻黄提取物(ephedrine alkaloids-free Ephedra Herb extract:EFE)的重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物及其制造方法以及包含该提取分级物的药物组合物。本发明的药物组合物可用作抗癌药、抗转移药、疼痛抑制药以及抗流感病毒药。
背景技术
鞣质是从植物的茎、皮、叶、果实等提取的天然物，是指具有与蛋白质或碱性化合物等结合而使其成为难溶性的性质的多酚，在身边的食品、嗜好品、工业用品等中所使用的植物中含有。在鞣质中有在酸或酶存在时容易被水解的水解型鞣质和进行缩合的缩合型鞣质。也加上水解型鞣质为较小的低分子，因此从生药等大量的植物材料中分离，进行结构确定，查明了各种类型的水解型鞣质。另一方面，缩合型鞣质尚未被明确地鉴定。1989年Weinges将在用酸加热无色的植物提取物时生成花青素的物质命名为原花青素。而且查明了构成成分由用黄烷-3-醇或黄烷-3,4-二醇多个连结的类黄酮单元组成。目前为止，已查明了称为缩合型鞣质的大量的果实成分的实体为原花青素，进行大量与原花青素有关的研究，查明了原天竺葵定(Propelargonidin)、原花青素(Procyanidin)、原翠雀定(Prodelphinidin)、原桂金合欢定(Proguibourtinidin)、原菲瑟定(Profisetinidin)、原刺槐定(Prorobinetinidin)、原特金合欢定(Proteracacidin)、原黑木金合欢定(Promelacacidin)、原芹菜定(Proapigeninidin)、原木犀草定(Proluteolinidin)等的化学结构和药理作用。即，原花青素为在各种植物中存在的缩合或聚合的鞣质，是以黄烷-3-醇或黄烷-3,4-二醇为结构单元缩聚的化合物组。
就原花青素的化学结构而言，一般是以黄烷-3-醇或黄烷-3,4-二醇作为结构单元，采用4β位→6位、4β位→8位、4β位→8位·2β位→O→7位等结合方式聚合而成的二聚体以上的聚合物(非专利文献1、2)。由于结合方式的不同，分类为数种。其中之一为2个以上的黄烷-3-醇结构经由4β位→8位或4β位→6位结合的原花青素B型，另一个为黄烷-3-醇结构的4β位→8位和2β位→O→7位或4β位→6位和2β位→O→7位的结合存在至少1处的原花青素A型(参照图1)。
缩合型鞣质与水解型鞣质相比，分子量的宽度宽，分子量大者达到约20,000(非专利文献3)。
已知原花青素显示出多样的生理活性，报道了抗肿瘤、抗炎症、抗老化、抗氧化、抗过敏、抗菌、育毛等的活性(非专利文献4、5)，关于这些生理活性与原花青素的聚合度数的结构活性相关关系，并非已完全明确(专利文献1)。在专利文献2中，示出了原花青素A型和原花青素B型(只是儿茶酚型)的单体单元的结合在C-4、C-8位产生的结构式。在专利文献3中，示出了原花青素A型的聚合物以及原花青素B型(焦棓酸型、儿茶酚型、单体单元的结合在C-4、C-8位产生)的缩合体·聚合物的肝纤维化抑制效果。在专利文献4中报道了原花青素B(焦棓酸型、儿茶酚型)单体单元的结合在C-4、C-6、C-8位产生，形成原花青素，其具有尿素酶抑制作用。
在包含原花青素的植物中，例如已知苹果、蓝莓、接骨木莓、葡萄、草莓、红醋栗、越橘、鹅莓、蔓越莓、美莓、欧洲越橘、黑加仑、樱桃、黑果木、黑莓、李子、ホワートルベリー、博伊森莓、桑葚、木莓、红醋栗、大杨莓、柿子、松树、橡树、山桃、麦子、小麦、大豆、黑大豆、可可豆、小豆、七叶树、花生、银杏叶、绿茶、大黄、麻黄、杨梅皮等(专利文献5,6)。
麻黄为麻黄科植物草麻黄(Ephedra sinica Stapf)、中麻黄(Ephedraintermedia Schrenk et C.A.Meyer)或木贼麻黄(Ephedra equisetina Bunge(Ephedraceae))的地上茎。麻黄是自古以来所使用的最重要的生药。麻黄被日本药典规定为含有0.7％以上的总生物碱(麻黄碱和假麻黄碱)，认为麻黄的药理作用几乎全部来自麻黄碱生物碱(非专利文献6)。另一方面，麻黄的副作用即心悸、血压上升、失眠、排尿障碍等由麻黄碱生物碱的中枢神经和交感神经刺激作用产生，认为将麻黄的主作用和副作用分离是困难的，目前为止尚未想出为了除去麻黄碱生物碱的副作用、从麻黄中除去麻黄碱。
本发明人由目前为止的研究查明：麻黄的非生物碱级分具有经由肝细胞增殖因子(HGF)受体c-Met激酶抑制作用的抗癌抗转移作用，进而从麻黄的非生物碱级分中分离草棉黄素配糖体，查明了非糖部分的草棉黄素具有包括c-Met激酶抑制作用的多激酶抑制作用。其中，也发现了草棉黄素的TrkA(NGF受体)抑制作用强，具有经由NGF-TrkA信号阻断的疼痛抑制作用(专利文献7、8)。由这些结果暗示：麻黄的药理作用的一部分不依赖于麻黄碱生物碱，因此能够从麻黄中将副作用成分除去。因此查明了从麻黄提取物中制备将麻黄碱生物碱除去了的EFE(非专利文献7)(专利文献9)，具有包含疼痛抑制作用、抗流感病毒作用的几个药理作用(专利文献9)(非专利文献8)，失眠、心悸、兴奋等副作用消失(非专利文献9)。但是，麻黄提取物自不必说，EFE含有各种成分，因此通常可服用的体积成为限制主要因素，因此不能进行进一步期待有效性的高效价的给药。
另一方面，已报道了来自麻黄的低分子的原花青素A型或原花青素B型(焦棓酸型、儿茶酚型)的聚合的原花青素(非专利文献10、11、12)。进而，最近从麻黄的70％丙酮提取液分离出原花青素A型和原花青素B型两者聚合的低聚物(非专利文献13)。
已知原花青素的制造法，其特征在于，用分级分子量为5000以下的超滤膜和/或食盐排除率为30％以下的反渗透膜对来自麻黄的原花青素含有液处理后，分取分级分子量为500～5000的级分(专利文献6)。
但是，目前为止，尚无有关重均分子量超过20,000的高分子鞣质的报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：原花青素低聚物的精制方法日本专利第4582917号
专利文献2：蔓越莓提取物及其制造方法日本专利第5459699号
专利文献3：肝纤维化抑制剂日本专利第4822291号
专利文献4：尿素酶抑制剂和含有其的药物和食品组合物以及尿素酶活性测定方法日本特开2000-159669
专利文献5：胶囊剂日本特开2016-69335
专利文献6：原花青素的制造法日本特公平6-31208
专利文献7：以麻黄为成分的MET抑制剂日本专利第5786164号
专利文献8：多激酶抑制剂、抗癌剂、抗转移剂、药剂耐性抑制剂、疼痛抑制剂和止痒药日本特开2014-129341
专利文献9：除去麻黄碱生物碱的麻黄提取物及其制法和用途PCT/JP2014/080605(WO2015/076286)
非专利文献
非专利文献1：《スタインエッガー·ヘンゼル生药学[上]化学·药理学へ的アプローチ》(糸川秀治他译、(株)广川书店发行)第204～208页(1977年)
非专利文献2：Porter L.J.，Flavans and proanthocyanidins，In：HarborneJ.B.(ed.)，“The Flavonoids，Advances in Research Science 1986”，Chapman&Hall，1994，第23-55页)
非专利文献3：大原诚资、《热带树林的成分和利用(2)鞣质》、热带林业、39,56-60、1997
非专利文献4：バート·シュビッタース/ジャック·マスケリエ著、《21世纪的生物体防御物质OPC》(佐佐木瞭译、フレグレンスジャーナル公司发行、1997年)第50-135页
非专利文献5：Tomoya Takahashi等，Journal of Investigative Dermatology，112，310-316，1999
非专利文献6：原田正敏,麻黄的药理学，现代东洋医学,1(2),34-39,1980
非专利文献7：Oshima,N.等,J Nat Med,70,554-562,2016
非专利文献8：Hyuga,S.等,J Nat Med,70,571-583,2016
非专利文献9：竹元裕明等、第33次和汉医药学会学术大会要旨集、海报P4-5,第87页,2016
非专利文献10：Molecules.2013年5月6日；18(5):5172-89.A-typeproanthocyanidins from the stems of Ephedra sinica(Ephedraceae)and theirantimicrobial activities.Zang X1,Shang M,Xu F,Liang J,Wang X,Mikage M,Cai S.
非专利文献11：Molecules.2013年5月10日；18(5):5326-34.Characterizationof phenolic constituents from ephedra herb extract.Amakura Y1,Yoshimura M,Yamakami S,Yoshida T,Wakana D,Hyuga M,Hyuga S,Hanawa T,Goda Y.
非专利文献12：有关鞣质的最近的研究药学杂质103(2),125-142,1983
非专利文献13：Molecules.2017年8月6日；22(8):1308Characterization ofproanthocyanidin oligomers of Ephedra sinica.Orejola J,Matsuo Y,Saito Y,Tanaka T.
非专利文献14：Kennedy,J.A.等，J.Chromatogr.A 995,99-107,2003
发明内容
发明要解决的课题
确立了从麻黄提取物中将麻黄碱生物碱除去的EFE的制造方法，使得能够提供医药品，其具有经由c-Met激酶抑制作用的抗癌作用·抗转移作用、疼痛抑制作用和抗流感病毒作用，排除了麻黄碱生物碱产生的副作用。但是，麻黄提取物自不必说，EFE含有各种成分，因此通常可服用的体积成为限制主要因素，因此不能进行进一步期待有效性的高效价的给药。对麻黄提取物或EFE中的具有经由c-Met激酶抑制作用的抗癌作用·抗转移作用、疼痛抑制作用和抗流感病毒作用的活性成分进行了详查，结果发现了作为麻黄的有效性成分之一的草棉黄素配糖体，但由于其药效不高，因此作为医药品并非最适合。
本发明的目的包括，从麻黄提取物或EFE中查明具有经由c-Met激酶抑制作用的抗癌作用·抗转移作用、疼痛抑制作用和抗流感病毒作用的新活性成分，通过确立该成分的制造方法，从而提供可进行高效价的给药并且排除了活性成分以外的成分产生的副作用显现风险的医药品。进而，在与本发明有关的研究过程中，发现了活性成分的新效力效果(c-Met表达量的降低作用以及经由上皮生长因子受体(EGFR)磷酸化抑制作用和EGFR表达量的降低作用的抗癌作用)，因此以提供作为本活性成分的用途为目的之一。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题认真研究，结果发现：对于将麻黄提取物或EFE用水/正丁醇提取的水可溶部分，使用芳香族系合成吸附剂Diaion HP-20柱，用水、20％～100％甲醇(MeOH)洗脱进行分级，对于20％甲醇以上的洗脱部分进行分析，结果发现其化学结构为在原花青素A型和原花青素B型(焦棓酸型和儿茶酚型)的C-4、C-6、C-8位聚合的重均分子量45000以上的高分子。
进而，查明得到的成分组的结构，发现在包含重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物中存在经由c-Met激酶抑制作用、c-Met磷酸化抑制作用、c-Met表达量的降低作用的抗癌·抗转移作用、疼痛抑制作用、经由EGFR的磷酸化抑制作用和EGFR表达量的降低作用的抗癌作用以及抗流感病毒作用，完成了本申请发明。
即，本申请发明提供以下的内容。
[权利要求1]
提取分级物，是包含来自麻黄提取物或者来自除去麻黄碱生物碱的麻黄提取物(EFE)的重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物，包含30％以上的所述重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质。
[权利要求2]
根据权利要求1所述的提取分级物，其中，高分子缩合型鞣质作为扩链单元，儿茶酚型或焦棓酸型的黄烷-3-醇主要以原花青素B型缩合，在其一部分中含有原花青素A型的缩合型鞣质单元，以及，作为末端单元，主要包含儿茶酚型或焦棓酸型的黄烷-3-醇，以约5:1包含焦棓酸型和儿茶酚型。
[权利要求3]
根据权利要求1所述的提取分级物的制造方法，其包括：采用柱色谱法、使用水与选自甲醇或乙醇中的醇的混合溶剂，边使醇浓度升高边将来自麻黄提取物或者除去麻黄碱生物碱的麻黄提取物(EFE)的水溶性级分依次洗脱，测定得到的各级分的分子量，得到包含重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物。
[权利要求4]
药物组合物，其包含根据权利要求1或2所述的提取分级物。
[权利要求5]
根据权利要求4所述的药物组合物，其为疼痛抑制药。
[权利要求6]
根据权利要求4所述的药物组合物，其为对于表达c-Met的癌症的抗癌·抗转移药。
[权利要求7]
根据权利要求4所述的药物组合物，其为对于表达EGFR的癌症的抗癌药。
[权利要求8]
根据权利要求4所述的药物组合物，其为抗流感病毒药。
[权利要求9]
含有高分子缩合型鞣质作为活性成分的药物组合物的含量测定法，其使用根据权利要求1所述的提取分级物。
发明的效果
根据本发明，可提供包含含有来自麻黄提取物或来自EFE的重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物作为有效成分的药物组合物，能够提供具有疼痛抑制作用、表达c-Met的癌症的抗癌·抗转移药、表达EGFR的癌症的抗癌药和抗流感病毒作用的可高效价地给药的医药品。本发明的提取分级物为高分子级分(重均分子量45000以上)的原花青素A型和原花青素B型的聚合的原花青素(缩合型鞣质、高分子多酚)。
根据本发明，可提供可进行高效价的给药并且排除了活性成分以外的成分产生的副作用显现风险的医药品。
附图说明
图1是表示原花青素A型和原花青素B型的结构及其结构单元的结构的图。
图2是表示将来自麻黄提取物的水提取物的H2O分级物、10％MeOH分级物、20％MeOH分级物、30％MeOH分级物、40％MeOH分级物、50％MeOH分级物和MeOH分级物用HPLC柱分析的HPLC色谱的图。
图3为表示来自麻黄提取物的水提取物的H2O分级物、10％MeOH分级物、20％MeOH分级物、30％MeOH分级物、40％MeOH分级物、50％MeOH分级物和MeOH分级物的采用13C-NMR的结构解析的图。
图4为表示将来自EFE的水提取物的H2O分级物、20％MeOH分级物、40％MeOH分级物和MeOH分级物用HPLC柱分析的HPLC色谱的图。
图5为表示来自EFE的水提取物的H2O分级物、20％MeOH分级物、40％MeOH分级物和MeOH分级物的采用13C-NMR的结构解析的图。
图6为表示来自麻黄提取物的水提取物-30％MeOH分级物和40％MeOH分级物的高分子级分的采用13C-NMR的结构解析的图。
图7为表示水提取物的20％MeOH、40％MeOH和MeOH分级物的GPC分析的结果的图。
图8为表示作为对于水提取物的40％MeOH分级物进行间苯三酚分解而得到的分解生成物，即，儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、没食子儿茶素(gallocatechin)、表儿茶素-(4→2)-间苯三酚(epicatechin-(4→2)-phloroglucinol)、没食子儿茶素-(4→2)-间苯三酚(gallocatechin-(4→2)-phloroglucinol)、原翠雀定A-型-(4′→2)-间苯三酚(prodelphinidin A-type-(4′→2)-phloroglucinol)的结构的图。
图9为表示对于由用水将麻黄提取物溶解而得的物质得到的正己烷提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物的c-Met激酶抑制作用，通过使用c-Met的激酶结构域的重组蛋白质和合成基质肽的体外测定考察的结果的图。
图10为表示对于由用水将麻黄提取物溶解而得的物质得到的正己烷提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物的癌细胞的运动能力抑制作用进行试验的结果的图。
图11为表示对于将水提取物添加到Diaion HP-20柱中得到的、H2O分级物、10％MeOH分级物、20％MeOH分级物、30％MeOH分级物、40％MeOH分级物、50％MeOH分级物和MeOH分级物，进行c-Met激酶抑制作用试验的结果的图。
图12为表示对于将来自麻黄提取物的水提取物添加到Diaion HP-20柱中得到的、H2O分级物、10％MeOH分级物、20％MeOH分级物、30％MeOH分级物、40％MeOH分级物、50％MeOH分级物和MeOH分级物，进行癌细胞的运动能力抑制作用试验的结果的图。
图13为表示对于将EFE和来自EFE的水提取物添加到Diaion HP-20柱中得到的、gH2O分级物、20％MeOH分级物、40％MeOH分级物和MeOH分级物，进行使用小鼠的对于福尔马林诱发疼痛的抑制作用试验的结果的图。
图14为表示对于将EFE和来自EFE的水提取物添加到Diaion HP-20柱中得到的、H2O分级物、20％MeOH分级物、40％MeOH分级物和MeOH分级物，进行对于c-Met的表达和酪氨酸磷酸化、EGFR的表达和酪氨酸磷酸化的抑制作用试验的结果的图。
图15为表示将来自EFE的水提取物添加到Diaion HP-20柱中得到的、H2O分级物、40％MeOH分级物的、对于关节炎模型小鼠的疼痛抑制作用的图。
图16为表示高分子缩合型鞣质标准物质溶液的GPC分析的结果的图。
具体实施方式
作为本发明的一个方案，提供包含来自麻黄提取物或者来自除去麻黄碱生物碱的麻黄提取物(EFE)的重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物。
作为用于得到本发明的提取分级物的原料使用的麻黄提取物为日本药典的麻黄的热水提取物，或者是从麻黄提取物中将麻黄碱生物碱除去的EFE(专利文献9)。EFE能够通过由麻黄提取物采用阳离子交换色谱法将麻黄碱除去、经过浓缩干燥而得到。如后述的实施例中所示那样，使用麻黄提取物作为原料的情况下、使用EFE作为原料的情况下都能够同样地得到本发明的提取分级物。
本发明的提取分级物的特征在于，包含重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质。重均分子量是以GPC用标准聚苯乙烯作为标准物质换算得到的重均分子量。本发明的提取分级物为重均分子量45000以上的、原花青素A型和原花青素B型的聚合的原花青素(缩合型鞣质、高分子多酚)。
本发明的提取分级物包含30％以上、更优选40％以上的重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质。
就本发明的提取分级物中所含的高分子缩合型鞣质而言，作为扩链单元，儿茶酚型或焦棓酸型的黄烷-3-醇主要以原花青素B型缩合，在其一部分中包含原花青素A型的缩合型鞣质单元，进而作为末端单元，主要包含儿茶酚型或焦棓酸型的黄烷-3-醇，以约5:1包含焦棓酸型和儿茶酚型(参照图1)。
作为本发明的另一方案，提供本发明的提取分级物的制造方法，其包括：采用柱色谱法，使用水与选自甲醇或乙醇中的醇的混合溶剂，边提高醇浓度边将来自麻黄提取物或者除去麻黄碱生物碱的麻黄提取物(EFE)的水溶性级分依次洗脱，测定得到的各级分的分子量，得到包含重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物。
具体地，将来自麻黄提取物或者除去麻黄碱生物碱的麻黄提取物(EFE)溶解于水中，将溶解而得的物质使用极性低的有机溶剂至极性高的有机溶剂依次分配，采用柱色谱法、使用水与选自甲醇或乙醇中的醇的混合溶剂，边提高醇浓度边将得到的水提取物依次洗脱，测定得到的各级分的分子量，得到包含重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物。
作为极性低的有机溶剂的例子，可列举出己烷、二乙醚、醋酸乙酯等，作为极性高的有机溶剂的例子，可列举出正丁醇、乙醇、甲醇、水等。在用于分级的柱色谱法中，能够使用Diaion HP-20等苯乙烯-二乙烯基苯系合成吸附剂或者其他的芳香族系合成吸附剂。各级分的分子量测定能够采用粘度法、凝胶渗透色谱法(GPC)、质量分析法、渗透压法等。在本申请实施例中，采用以GPC用标准聚苯乙烯作为标准物质的GPC求出重均分子量。
具体地，将麻黄提取物或EFE用水溶解，将溶解而得的物质用醋酸乙酯、水饱和正丁醇依次分配，得到醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物的各分配提取物。在得到的各分配提取物中，在水提取物中确认了活性，因此对于确认了活性的水提取物，进一步使用Diaion HP-20柱色谱法(5.5x40cm、三菱化学)，按H2O→20％MeOH→40％MeOH→MeOH的顺序依次洗脱，进行分级，得到H2O分级物、20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物的各分级物。测定了各分级物的活性，结果可知20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物具有c-Met激酶抑制作用、磷酸化抑制作用、表达量的降低作用、癌细胞的运动能力抑制作用、EGFR的磷酸化抑制作用、表达量的降低作用、疼痛抑制作用、抗流感病毒作用。另外，20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物为重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质。
因此，查明本申请发明的提取分级物能够通过将20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物单独地使用或者以任意的组合使用来制备。由这些结果，作为效率高的制备方法，也可通过将上述的水提取物用100％MeOH提取，将100％MeOH分级物进一步给予Sephadex LH-20柱等，得到高分子级分来制备。
作为本发明的另一方案，提供药物组合物，其包含含有上述高分子缩合型鞣质的提取分级物。本发明的药物组合物如后述的实施例中所示那样，可用作疼痛抑制药、抗癌·抗转移药和抗流感病毒药。另外，本发明的药物组合物在使用麻黄提取物作为原料的情形和使用EFE作为原料的情形下都同样地显示出有效的药理作用。
本发明涉及的疼痛抑制药、抗癌·抗转移药、抗流感病毒药例如可制成片剂、颗粒剂、细粒剂、胶囊剂等经口给药的制剂、适于经口给药的各种液体制剂、或者注射剂这样的非经口给药用制剂。优选经口给药。
在经口给药的制剂的情况下，将包含重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物与制剂载体一起以片剂、颗粒剂、细粒剂、胶囊剂等形态制剂化而得到。
作为制剂载体，能够使用赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂和增塑剂等。作为赋形剂，能够使用例如白糖、氯化钠、甘露醇、乳糖、葡萄糖、淀粉、碳酸钙等。作为结合剂，能够使用例如水、乙醇、丙醇、葡萄糖液、淀粉液、明胶液等。作为崩解剂，能够使用例如羧甲基纤维素钙、干燥淀粉、碳酸氢钠等。作为润滑剂，能够使用例如精制滑石、硬脂酸盐、硼酸粉末、聚乙二醇等。作为增塑剂，能够使用例如甘油脂肪酸酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、蓖麻油等。
在上述的经口给药的制剂化的情况下，也可使用水溶性高分子和表面活性剂等分散剂。作为水溶性高分子，能够使用例如羟丙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮等。作为表面活性剂，能够使用例如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁等。
制备片剂时，使用上述制剂载体，采用常规方法，将包含重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物制成片剂。颗粒剂或细粒剂能够通过在包含重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物中添加上述制剂载体，采用流动层造粒、高速搅拌造粒、搅拌流动层造粒、离心流动造粒、挤出造粒等进行颗粒化而制备。胶囊剂与非活性的医药填充剂或稀释剂一起混合来制备，填塞于硬明胶胶囊或软胶囊中。
经口液体制剂通过将包含重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物、和甜味剂(例如蔗糖)、保存剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、着色剂、香料等混合而制备。
注射用制剂例如以液剂、乳浊液或悬浮液的形态制备，使其对于血液为等渗压。液体、乳浊液或悬浮液的形态的制剂例如使用水性介质、乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇等来制备。
在注射用制剂中，能够酌情使用本技术领域中通常所使用的添加剂，能够使用例如等渗压剂、稳定化剂、缓冲剂、保存剂、螯合剂、抗氧化剂等。作为等渗压剂，例如可列举出葡萄糖、山梨醇、甘露醇等。作为稳定化剂，例如可列举出亚硫酸钠等。作为缓冲剂，例如可列举出硼酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂等。作为保存剂，例如可列举出对羟基苯甲酸酯、苄醇等。作为螯合剂，例如可列举出依地酸钠、柠檬酸钠等。作为抗氧化剂，例如可列举出亚硫酸钠、亚硫酸氢钠等。
作为本发明的疼痛抑制药、抗癌·抗转移药、抗流感病毒药的给药量，例如，对于包含重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物一次给药，能够在每1kg体重0.5mg至500mg、优选10mg至200mg的范围选择给药量。但是，本发明的药物组合物并不受这些给药量限制。
进而，作为本发明的另一方案，作为使用本发明的提取分级物的、以高分子缩合型鞣质作为活性成分的药物组合物的管理方法之一，提供含量测定法。具体地，使用本发明中所示的高分子缩合型鞣质的分子量的解析中使用的GPC分析，对于含量未知的试样和高分子缩合型鞣质标准物质，分别求出高分子缩合型鞣质的峰面积，由峰面积的相对值能够算出试样中的高分子缩合型鞣质含量。另外，该含量测定法也可测定麻黄提取物或EFE中的高分子缩合型鞣质含量，能够作为以高分子缩合型鞣质为活性成分的药效、即、作为疼痛抑制药、抗癌·抗转移药和抗流感病毒药制造时的管理方法之一使用。
实施例
通过实施例对本发明更详细地说明，但本发明并不限定于此。各种的改变、变形对于本领域技术人员而言是可以的，这些改变、变形也包含在本发明中。
(实施例1)麻黄提取物或EFE的分级、分析
将麻黄提取物(300g)用水(5L)溶解，将溶解而得的物质用正己烷(4L)、醋酸乙酯(12L)、水饱和正丁醇(12L)依次分配，得到了正己烷提取物(92.3mg)、醋酸乙酯提取物(13.2g)、正丁醇提取物(65.7g)、水提取物(161.1g)。对于来自麻黄提取物的得到的各分配提取物，求出c-Met激酶抑制活性、癌细胞的运动抑制活性。其结果在正丁醇和水提取物中确认了活性。
对于收率多、确认了活性的水提取物(90g)，进一步使用Diaion HP-20柱色谱法(5.5x40cm、三菱化学)，按H2O→10％MeOH→20％MeOH→30％MeOH→40％MeOH→50％MeOH→MeOH的顺序依次洗脱，进行分级，得到了H2O分级物(47.9g)、10％MeOH分级物(2.5g)、20％MeOH分级物(2.6g)、30％MeOH分级物(7.0g)、40％MeOH分级物(11.5g)、50％MeOH分级物(5.1g)、MeOH分级物(2.6g)的各分级物。对于得到的各分级物，进行c-Met激酶抑制活性、癌细胞的运动抑制活性试验，结果特别是在30％MeOH分级物、40％MeOH分级物、其次是50％MeOH分级物中确认了强的活性。
因此，为了对于水提取物的各分级物的含有成分进行比较，进行HPLC分析。HPLC条件如下所述。
柱：L-柱ODS(2.1I.D.x 150mm)(化学物质评价研究机构)、
柱温度：40℃、
流速：0.3mL/分钟、
测定波长：200-400nm、
流动相：(A)0.1％甲酸-蒸馏水和(B)0.1％甲酸-乙腈[浓度梯度条件(B在A中)：0→30分钟(0→50％)、30→35分钟(50→85％)、35→40分钟(85％)、40→50分钟(85→90％)、50→55分钟(90→100％)、55→60分钟(100％)]。
其结果，在H2O分级物和10％MeOH分级物以外的级分中观察到对于缩合型鞣质低聚物特征的宽峰(图2)。
另外，对于各分级物进行采用13C-NMR的结构解析。就NMR的条件而言，使用MeOH-d4:D2O(1:1)作为测定溶剂，装置使用Brucker AVANCE500(Bruker BioSpin)。其结果在H2O分级物和10％MeOH分级物以外的级分中共同地观察到与黄烷-3-醇骨架对应的信号，确认了有助于活性的级分为缩合型鞣质(原花青素)低聚物级分。就显示出强活性的30％MeOH分级物、40％MeOH分级物、50％MeOH分级物而言，确认了特别强的信号。另外，所有的分级物基于波谱解析都具有包含原花青素A型的结构，进而儿茶酚型的信号强度小，由此暗示焦棓酸型多(图3)。
同样地，将EFE(400g)用水(5L)溶解，将溶解而得的物质用醋酸乙酯(10L)、水饱和正丁醇(10L)依次分配，得到了醋酸乙酯提取物(7.3g)、正丁醇提取物(85.0g)、水提取物(311.0g)。对于来自EFE的得到的各分配提取物进行疼痛试验。其结果在水提取物中确认了活性。对于确认了活性的水提取物(290g)，进一步使用Diaion HP-20柱色谱法(5.5x40cm、三菱化学)，按H2O→20％MeOH→40％MeOH→MeOH的顺序依次洗脱，进行分级，得到了H2O分级物(190.6g)、20％MeOH分级物(35.9g)、40％MeOH分级物(41.7g)、MeOH分级物(13.9g)的各分级物。对于得到的各分级物进行疼痛试验，结果在20％MeOH分级物、40％MeOH分级物，MeOH分级物中确认了活性。
因此，为了对于水提取物的各分级物的含有成分进行比较，同样地进行HPLC分析。其结果在确认了活性的20％MeOH分级物、40％MeOH分级物，MeOH分级物中观察到对于缩合型鞣质低聚物特征的宽峰(图4)。
另外，对于各分级物进行采用13C-NMR的结构解析，结果在确认了活性的20％MeOH分级物、40％MeOH分级物，MeOH分级物中共同地观察到与黄烷-3-醇骨架对应的信号，确认为与来自麻黄提取物的活性级分同样的缩合型鞣质(原花青素)低聚物级分(图5)。
再有，本实施例中的c-Met激酶抑制活性按照实施例5和7中记载的方法进行，癌细胞的运动抑制活性按照实施例6和8中记载的方法进行，疼痛试验按照实施例9中记载的方法进行。
(实施例2)活性级分的分子量分析
为了确认有助于活性的级分为缩合型鞣质(原花青素)低聚物级分，进一步采用超滤对活性级分进行根据分子量的分级。对于来自麻黄提取物的水提取物-40％MeOH分级物的20％MeOH不溶部分，使用Vivaspin 500(GE Healthcare:3、5、10、30、50、100KDa)进行11400x g、10分钟离心分离，得到了7个级分[<3KDa(收率约10％)、3～5KDa(约4％)、5～10KDa(约5％)、10～30KDa(约6％)、30～50KDa(约2％)、50～100KDa(约3％)、>100KDa(约70％)]。对于各级分，进行c-Met激酶抑制作用的试验，结果在>100KDa的高分子级分(麻黄提取物高分子级分)中确认了活性。对于该高分子级分进行采用13C-NMR的结构解析，结果确认为同样的缩合型鞣质(原花青素)低聚物级分。再有，对于水提取物-30％MeOH分级物的>100KDa的高分子级分也进行采用13C-NMR(作为测定溶剂，为丙酮-d6:D2O(1:1))的结构解析，结果观察到同样的波谱(图6)。
对于活性级分(麻黄提取物高分子级分、来自EFE的水提取物-20％MeOH、40％MeOH、MeOH分级物)进行GPC分析。将GPC用标准聚苯乙烯作为标准物质，采用以下的条件进行分析。
柱：TSK-gel Super AW4000(6.0I.D.x150mm)(东曹)、
柱温度：30℃、
流速：0.3mL/分钟、
测定波长：280nm、
流动相：N,N-二甲基甲酰胺+3M甲酸铵(0.5％)
分析的结果：在所有的分级物中都观察到在保留时间7.5～8.5分钟显示出峰顶的高分子区域的峰(图7)。使用Chromato-PRO-GPC进行数据处理，算出了各分级物的重均分子量，结果是麻黄提取物高分子级分：94372，20％MeOH分级物：113279，40％MeOH分级物：59042，MeOH分级物：45004(用以GPC用标准聚苯乙烯作为标准物质换算的重均分子量计，均为3次测定的值的平均值)。
(实施例3)部分结构的解析
对于作为活性级分之一的来自麻黄提取物的水提取物-40％MeOH分级物，进行间苯三酚分解。其结果确认了儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素-(4→2)-间苯三酚、没食子儿茶素-(4→2)-间苯三酚、原翠雀定A-型-(4′→2)-间苯三酚作为分解生成物(图8)。
因此，查明作为扩链单元，儿茶酚型或焦棓酸型的黄烷-3-醇主要以B型缩合，在其一部分中包含A型的缩合型鞣质单元，进而作为末端单元，主要包含儿茶酚型或焦棓酸型的黄烷-3-醇。另外，通过HPLC分析对硫醇分解的单元算出了焦棓酸型与儿茶酚型的大致存在比，结果大致为5:1。(参照图1)
(实施例4)来自EFE的提取分级物中的高分子缩合型鞣质的含量
对于缩合型鞣质低聚物级分而言，有采用Sephadex LH-20柱色谱法通过含水丙酮(丙酮-水(7:3))洗脱进行分级的报道(非专利文献14)。按照本方法，将70％丙酮(丙酮-水(7:3))洗脱部分作为高分子缩合型鞣质级分，估算了活性级分(来自EFE的水提取物-20％MeOH、40％MeOH、MeOH分级物)中的高分子缩合型鞣质量。其结果在20％MeOH分级物中为约32％，在40％MeOH分级物中为约45％，在MeOH分级物中为约43％。
(实施例5)麻黄提取物分配提取物的c-Met激酶抑制作用
将麻黄提取物用水溶解，将溶解而得的物质用正己烷、醋酸乙酯、水饱和正丁醇依次分配，采用使用c-Met的激酶结构域的重组蛋白质和合成基质肽的体外测定考察了得到的各分级物(正己烷提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物)的c-Met激酶抑制作用。
测定条件如下所述。制备在40mM Tris-HCl pH7.5、2mM DTT、7mM MgCl2、10μM ATP中使4nM重组c-Met激酶结构域、0.2μg/mL Poly(Glu4,Tyr1)和各分级成为5μg/mL的溶液，在室温下培育1小时。反应停止后，使用ADP-Glo试剂，用照度计(PerkinElmer Co.,Ltd.，EnSpire)测定依赖于ADP量的鲁米诺发光强度，算出了c-Met激酶活性。其结果查明正丁醇提取物和水提取物具有激酶抑制作用(图9)。
(实施例6)麻黄提取物的分配提取物的癌细胞的运动能力抑制作用
使麻黄提取物溶解于水中，将溶解而得的物质用正己烷、醋酸乙酯、水饱和正丁醇依次分配，采用使用Transwell的试验对得到的各分级物(正己烷提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物)的癌细胞的运动能力抑制作用进行评价。在测定中，使用表达c-Met、采用HGF诱导运动能力的高转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞。
测定条件如下所述。使MDA-MB-231细胞(5x104细胞/孔)悬浮于载体(2.5％EtOH-DMEM)或者溶解有25μg/mL的各分配提取物的2.5％EtOH-DMEM中，添加到上部孔中。下部孔使用胶原涂覆的24孔板。向下部孔中添加了600μL的50ng/mL HGF-DMEM。24小时培养后，在显微镜下测定移动到下部孔中的细胞数，作为运动能力的指标。其结果查明正丁醇提取物、水提取物具有癌细胞的运动能力抑制作用(图10)。
(实施例7)水提取物的Diaion HP-20柱分级物的c-Met激酶抑制作用
由实施例9的疼痛试验的结果可知，通过经口给药显示药理作用的分配提取物为水提取物，正丁醇提取物的经口给药没有显示出药理作用。因此，将麻黄提取物的分配中得到的水提取物添加到Diaion HP-20柱中，得到了用H2O、10％MeOH、20％MeOH、30％MeOH、40％MeOH、50％MeOH、MeOH依次洗脱而成的分级物。对于各分级物，通过使用c-Met的激酶结构域的重组蛋白质和合成基质肽的体外测定来考察。
测定条件如下所述。制备在40mM Tris-HCl pH7.5、2mM DTT、7mM MgCl2、10μM ATP中使4nM重组c-Met激酶结构域、0.2μg/mL Poly(Glu4,Tyr1)和各级分成为5μg/mL的溶液，在室温下培养1小时。反应停止后，使用ADP-Glo试剂，采用照度计(PerkinElmer Co.,Ltd.，EnSpire)测定依赖于ADP量的鲁米诺发光强度，算出了c-Met激酶活性。其结果查明DiaionHP-20柱的20％MeOH分级物、30％MeOH分级物、40％MeOH分级物、50％MeOH分级物和MeOH分级物具有c-Met激酶抑制作用(图11)。
(实施例8)水提取物的Diaion HP-20柱分级物的癌细胞的运动能力抑制作用
由实施例9的疼痛试验的结果可知，通过经口给药显示药理作用的分配提取物为水提取物，正丁醇提取物的经口给药没有显示出药理作用。因此，将麻黄提取物的分配中得到的水提取物添加到Diaion HP-20柱中，得到了用H2O、10％MeOH、20％MeOH、30％MeOH、40％MeOH、50％MeOH、MeOH依次洗脱的级分。对于各级分，解析了采用HGF诱导的癌细胞的运动能力的抑制作用。
测定条件如下所述。使MDA-MB-231细胞(5x104细胞/孔)悬浮于载体(DMEM)或者溶解有10μg/mL的各级分的DMEM中，添加到上部孔中。下部孔使用胶原涂覆的24孔板。向下部孔中添加了600μL的50ng/mL HGF-DMEM。24小时培养后，在显微镜下测定移动到下部孔中的细胞数，作为运动能力的指标。其结果查明30％MeOH分级物、40％MeOH分级物和50％MeOH分级物强烈地抑制采用HGF诱导的运动能力(图12)。
(实施例9)使用小鼠的对于福尔马林诱发疼痛的抑制作用(福尔马林试验)
对于EFE的各分配提取物和水提取物的Diaion HP-20柱分级物，考察了对于福尔马林诱发疼痛的抑制作用。
将4周龄的雄性ddY小鼠搬入后驯化1周以上，使用1组4～8只。在实验开始日进行体重测定，以各组中变得大致相同的方式分成对照组、EFE给药组、各级分给药组(7组)。将EFE和各级分加入10％DMSO(DMSO:盐水＝1:9)，用超声波溶解。对照组采用10％DMSO经口给药。EFE组采用700mg/kgEFE经口给药。各级分组采用由相对于EFE700mg/kg的各级分的重量收率算出的量经口给药。在各试样给药6小时后，将2.5％福尔马林溶液10μL向左后足底部皮内给药。给药后迅速地将小鼠放入圆柱亚克力(丙烯酸)笼(高20cm x直径10cm)中，进行45分钟视频摄影。疼痛关联行动是将从给药后即刻到5分钟后产生的第1相和从10分钟后到45分钟后产生的第2相作为对象，计量舔所处置的足的行动时间。统计学的解析是采用Dunnett试验进行对照组和被验物质给药组的疼痛行动时间，显著水平设为5％。
将结果示于图13中。对于第1相，试样给药组对疼痛关联行动没有产生影响，由此认为不具有对于侵害受容性疼痛的疼痛抑制作用。另一方面，关于第2相，可知在EFE组、水提取物组、20％MeOH分级物组、40％MeOH分级物组、MeOH分级物组中，与对照组相比疼痛关联行动减少，具有对于炎症性疼痛的抑制作用。水提取物组用比EFE组少的给药量就显示出强的疼痛抑制作用，由此查明疼痛抑制作用集中于水提取物中，即，比活性明显提高。另一方面，在体外的活性评价中有药效的正丁醇提取物如果在体内，则没有显示药效。
接下来，将该水提取物用DiaionHP-20柱分级。由实施例7和8查明：20％MeOH分级物、30％MeOH分级物、40％MeOH分级物、50％MeOH分级物和MeOH分级物具有c-Met激酶抑制作用和运动能力抑制作用。因此，为了提高各级分的回收量以用于动物试验，将水提取物采用DiaionHP-20分离为H2O分级物、20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物。其结果查明H2O分级物不具有疼痛抑制作用，20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物具有活性。由以上可知，20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物具有对于炎症性疼痛的镇痛作用。
(实施例10)对于c-Met的表达和c-Met酪氨酸磷酸化以及EGFR的表达和EGFR酪氨酸磷酸化的作用
对于来自EFE的水提取物的Diaion HP-20柱分级物，使用过表达c-Met和EGFR的来自人非小细胞肺癌的H1993细胞，解析了对于c-Met和EGFR的作用。
各分级物用10％DMSO-RPMI1640培养基溶解，制成2～4mg/mL的浓度的储备溶液后，用RPMI培养基稀释并使用。培养基中所含的DMSO的最终的浓度为0.125％。在H1993细胞中添加100μg/mL EFE、50μg/mL H2O分级物、25μg/mL 20％MeOH分级物、25μg/mL 40％MeOH分级物或者25μg/mL MeOH分级物，培养4小时后，将细胞溶解，使用离心分离的上清液，进行蛋白质印迹试验(Western-blotting)。将结果示于图14中。
需要说明的是，H1993细胞由于过表达c-Met和EGFR，因此即使无HGF或EGF的刺激，也通过自磷酸化而将受体磷酸化。
(1)对于c-Met的作用：
H2O分级物对c-Met的表达量和磷酸化没有产生影响。20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物使c-Met表达量降低，阻断了磷酸化。就它们的作用而言，40％MeOH分级物最高，显示出与EFE大致同程度的作用。因此，对于c-Met的作用，查明在H2O分级物中不存在，在20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物中存在。这与(实施例9)的疼痛试验的结果大体上一致。
(2)对于EGFR的作用：
H2O分级物对EGFR的表达量和磷酸化没有产生影响。20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物阻断了EGFR的磷酸化。另一方面，EGFR的表达量由于EFE和40％MeOH分级物而降低。但是，20％MeOH分级物和MeOH分级物为使EGFR的表达量略微降低的程度。
由这些结果查明，EGFR的磷酸化抑制作用在H2O分级物中不存在，在20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物中存在，与实施例9的疼痛试验的结果和上述(1)的对于c-Met的作用大体上一致。另一方面，可知使EGFR的表达量降低的作用存在于40％MeOH分级物。
在日本的癌症死亡原因第1位的肺癌中，对于分子靶标的治疗药的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)效果显著的类型而言，生存期延长，但用数年获得耐药性而复发成为了问题，对于耐药性获得的原因之一，报道了c-Met过表达(矢野圣二、实验医学、29,203-208,2011)。在c-Met过表达为原因的EGFR-TKI耐性的情况下，认为c-Met抑制剂和EGFR-TKI的并用是有效的，但c-Met抑制剂的医药品化的目标尚未建立。
由于20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物将肺癌细胞过表达的c-Met和EGFR的磷酸化阻断，因此可用于c-Met过表达为原因的EGFR-TKI耐性肺癌患者的治疗。进而，40％MeOH分级物不仅具有过表达的c-Met和EGFR的磷酸化抑制作用，而且使其表达量降低，因此可成为有效性更高的分子靶标的治疗药。
(实施例11)对于关节炎模型小鼠的疼痛抑制作用
由实施例10查明40％MeOH分级物的药效最高，由实施例9-10查明H2O分级物不具有药效。因此，在体内对这些分级物的对于关节炎模型小鼠的镇痛效果进行比较研究。将结果示于图15中。
实验动物使用雌性Balb/c的9周龄。将小鼠搬入，驯化1周左右后，在右后足足跖接种10μL的完全佛氏佐剂(Complete Freud’sAdjuvant)(CFA)5mg/mL，使饲养7天的小鼠成为了关节炎模型小鼠。这是因为，CFA接种第7天的小鼠的足关节显著地肿胀，对于机械刺激的感受性变得最高。将溶解于10％DMSO溶液的390mg/kg H2O分级物、或者、190mg/kg 40％MeOH分级物对关节炎模型小鼠经口给药。对照组是将载体(10％DMSO溶液)向正常小鼠给药，载体组是将载体向关节炎模型小鼠给药。试验药给药的6小时后，进行右足的von Frey试验，使用up-down法算出了50％反应阈值(50％缩足阈值：50％PWT)(S.R.Chapman等,Journal of Neuroscience Method 53(1994)55-63)。在一元配置分散分析之后采用Tukey的多重比较鉴别法进行统计解析。解析软件使用Prism 7(GraphPad Software Inc.,SanDiego,CA,USA)，将统计上显著水平p<0.05判断为具有显著性差异。
通过40％MeOH分级物的经口给药，与载体组比较，50％PWT显著地增加，对于机械刺激的感受性降低。另一方面，对于H2O分级物的经口给药而言，50％PWT与载体组大致相同，对于机械刺激的感受性仍高。由这些结果查明：40％MeOH分级物对于关节炎模型小鼠显示疼痛抑制作用，但H2O分级物不具有疼痛抑制作用。
(实施例12)抗流感病毒作用
由实施例9的福尔马林试验的结果可知，将EFE的水提取物用Diaion HP-20分级的、20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物具有疼痛抑制作用，测定了这些级分的抗流感病毒作用。该测定方法利用通过流感病毒的感染而使MDCK细胞溶解，用50％的细胞生存的试样浓度评价抗流感病毒作用。另外，为了确认没有细胞毒性测定了抗流感病毒作用，也同时测定了细胞生存率为50％的浓度。
对于各试样，分别用10％FBS-MEM制备成25μg/mL的溶液，进而制作10个等级的2倍稀释系列，制成试样溶液。将包含流感病毒(A/WSN/33(H1N1)株)的液体用10％FBS-MEM稀释到1000TCID50/mL，制成流感病毒液。将MDCK细胞用10％FBS-MEM悬浮，在96孔培养板的各孔，用3x104个/100μL播种。培养了24小时后，将培养上清液除去，将试样溶液100μL添加到各孔中，进而，添加100μL的流感病毒液或10％FBS-MEM。72小时培养后，用结晶紫染色，用酶标仪(Microplate Reader)测定了各孔的560nm处的吸光度。对于添加的试样浓度与细胞生存率的曲线进行4参数逻辑回归解析，由流感病毒添加组求出了50％阻断浓度(IC50值)，由非流感病毒添加组求出了50％细胞病变浓度(CC50值)(表1)。
【表1】
表1抗流感病毒作用
各试样的IC50值是比CC50值低的浓度，由此确认能够测定抗流感病毒作用。另外，20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物的IC50值与EFE的IC50值为相同程度，因此查明显示EFE的抗流感病毒作用的活性成分存在于20％MeOH分级物、40％MeOH分级物、MeOH分级物中。
(实施例13)高分子缩合型鞣质标准物质的制备
对于实施例1中得到的水提取物-40％MeOH分级物，进一步使用Sephadex LH-20柱色谱法(GE Heal thcare)进行精制。将柱用50％MeOH清洗后，用70％丙酮洗脱，得到了高分子缩合型鞣质。将洗脱液浓缩、冻结干燥后，精密地称量约100mg(100.0mg)，正确地加入50％二甲基甲酰胺溶液10mL中，完全地溶解。对于该溶液，进行实施例2中所示的GPC分析，结果重均分子量为85642，未确认在低分子量区域中有峰(图16)。将该溶液约1mL分注到小药瓶中，制成了高分子缩合型鞣质标准物质溶液(10.0mg/mL)。
(实施例14)使用GPC的高分子缩合型鞣质含量的测定
使用实施例2中所示的采用GPC的分子量分析法和实施例13中所示的高分子缩合型鞣质标准物质，测定麻黄提取物的高分子缩合型鞣质含量。
对于麻黄提取物3个批次，分别以成为10.00mg/mL的方式溶解于50％二甲基甲酰胺溶液中，制成试样溶液。对于各试样溶液和高分子缩合型鞣质标准物质溶液(10.0mg/mL)，在实施例2中所示的条件下进行GPC分析。对于试样导入后5～10分钟的高分子缩合型鞣质的峰面积，采用下式求出试样1mL中的高分子缩合型鞣质含量(表2)。
试样溶液1mL中的高分子缩合型鞣质的量(mg)＝AT/AS x 10.00
AT：试样的峰面积
AS：标准物质的峰面积
10.00：标准物质溶液1mL中的高分子缩合型鞣质的量(mg)
【表2】
表2 GPC分析的峰面积和定量值

Claims (9)

1.提取分级物，是包含来自麻黄提取物或者来自除去麻黄碱生物碱的麻黄提取物(EFE)的重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物，包含30％以上的所述重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质。
2.根据权利要求1所述的提取分级物，其中，就高分子缩合型鞣质而言，作为扩链单元，儿茶酚型或焦棓酸型的黄烷-3-醇主要以原花青素B型缩合，在其一部分中含有原花青素A型的缩合型鞣质单元，以及，作为末端单元，主要包含儿茶酚型或焦棓酸型的黄烷-3-醇，以约5:1包含焦棓酸型和儿茶酚型。
3.根据权利要求1所述的提取分级物的制造方法，其包括：采用柱色谱法、使用水与选自甲醇或乙醇中的醇的混合溶剂，边使醇浓度升高边将来自麻黄提取物或者除去麻黄碱生物碱的麻黄提取物(EFE)的水溶性级分依次洗脱，测定得到的各级分的分子量，得到包含重均分子量45,000以上的高分子缩合型鞣质的提取分级物。
4.药物组合物，其包含根据权利要求1或2所述的提取分级物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其为疼痛抑制药。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其为对于表达c-Met的癌症的抗癌·抗转移药。
7.根据权利要求4所述的药物组合物，其为对于表达EGFR的癌症的抗癌药。
8.根据权利要求4所述的药物组合物，其为抗流感病毒药。
9.含有高分子缩合型鞣质作为活性成分的药物组合物的含量测定法，其使用根据权利要求1所述的提取分级物。
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