KR101866478B1 - 유기용매를 이용한 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 추출물의 제조방법 - Google Patents

유기용매를 이용한 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 추출물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유기용매를 이용한 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에탄올, 증류수, 클로로포름을 포함하는 유기용매를 이용하여 꽃송이버섯 추출물을 제조하고, 항암 활성, 항혈관신생 및 뇌신경세포보호 효과를 갖는 꽃송이버섯 추출물을 함유하는 암 치료용 약학적 조성물 및 암 개선용 식품에 관한 것이다.
본 발명에 따른 꽃송이버섯 추출물은 위암, 피부암, 자궁경부암, 유방암, 간암, 뇌암과 같은 암세포의 전이능력 및 증식능력을 억제시키고, 혈관내피세포의 침윤성 및 관 형성과 같은 혈관내피세포의 분화능력을 억제할 수 있으며, 신경독소인 글루타메이트에 의해 유도된 신경아교세포 사멸에 대한 보호효과가 있으므로 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물 및 암 개선용 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유기용매를 이용한 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 추출물의 제조방법{Method of Manufacturing Sparassis crispa Extract using Organic Solvent}
본 발명은 유기용매를 이용한 꽃송이버섯(Sparassis crispa) 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에탄올, 증류수, 클로로포름을 포함하는 유기용매를 이용하여 꽃송이버섯 추출물을 제조하고, 항암 활성, 항혈관신생 및 뇌신경세포보호 효과를 갖는 꽃송이버섯 추출물을 함유하는 암 치료용 약학적 조성물 및 암 개선용 식품에 관한 것이다.
버섯은 필수 아미노산, 지방산, 비타민 등의 풍부한 영양소와 독특한 맛과 향을 함유하고 있어 주로 식용으로 애용되어 왔으며 그 중 일부만이 약용으로 이용되어 왔다. 하지만 과학기술의 발전과 함께 체계적인 연구로 버섯의 약리 성분들이 규명되고 다양한 질병 예방과 치료에 이용하려는 시도가 이루어지면서 식용뿐만 아니라 약용으로서의 버섯에 대한 관심이 급증하고 있다.
꽃송이버섯(Sparassis crispa)은 민주름버섯목(Aphyllophorales), 꽃송이버섯과(Sparassidaceae), 꽃송이버섯속(Sparassis)에 속하는 버섯으로, 한국, 일본, 중국, 유럽, 북미에 분포하며, 침엽수의 그루터기 혹은 그 주위에 발생하여 뿌리에 기생하는 것으로 알려져 있다.
최근 꽃송이버섯이 우리의 관심을 모으게 된 이유는 면역증강에 효과가 있는 베타글루칸(β-1,3-D-glucan) 함량이 다른 버섯류에 비해 3~4배 많은 약 45% 정도를 함유하고 있다는 일본의 연구보고가 있었기 때문이다. 특히 꽃송이버섯의 베타글루칸에 대한 각종 약리활성 실험 결과, 종양증식 억제작용(Ohno et al., 2000), 알러지 증상 개선작용(Yiu and Ushio, 1989), 사람NK세포 활성화 작용(Harada T. et al., 2002), 혈당치 상승 억제작용, 콜레스테롤 상승 억제작용, 혈압상승 억제작용(Morigiwa et al., 1986) 등의 다양한 기능을 가지고 있음이 밝혀졌다. 이외에도 꽃송이버섯에는 천연 토코페롤 성분 등 기능성 비타민이 다량 함유된 것으로 확인되었고, 또한 무기물이 풍부하고 아미노산 함량이 다른 버섯에 비해 높아 식용버섯으로서 가치가 높다는 평가를 받고 있다.
현재 일본에서는 과립, 캡슐 등의 제형으로 가공한 제품이 개발되어 있고 최근에는 꽃송이버섯의 항산화 활성, 콜라겐생성 촉진작용, 미백작용 기능이 확인되어 미용을 위한 건강식품으로서도 상품화되고 있다.
이와 함께 1985년 중국에서는 꽃송이버섯의 인공재배가 이루어졌고, 1997년 일본에서도 톱밥재배가 성공한 것이 계기가 되어 더욱 널리 알려지기 시작하였다. 우리나라는 1990년대부터 꽃송이버섯에 대한 배양특성 정도가 연구되기 시작하였으며, 2000년대에 들어와서야 재배 및 생리활성에 관한 연구들이 활발하게 이루어지고 있다. 우리나라에서도 꽃송이버섯의 최적의 재배방법과 관련한 특허가 여러 건 등록되었으나, 아직 재배법이 널리 보급되지 않은 상황이다.
최근 식물성 유산균 및 효모를 이용한 꽃송이버섯 재배용 영양첨가제, 그의 제조방법 및 그를 이용한 꽃송이버섯 재배방법이 개발되어 폐사율이 없고 출하일령이 단축되며 핵심 기능성 성분인 베타글루칸이 45~50% 함유되어 있는 고품질 꽃송이버섯을 대량 생산할 수 있는 기술이 확보되어 품질은 높이고 가격은 낮춘 식약용 꽃송이버섯 제품 개발의 기반을 마련하게 되었다(한국등록특허 제1480396호).
이러한 꽃송이버섯을 생버섯으로 그대로 섭취할 경우 유효성분의 인체 흡수량이 적기 때문에 유효성분을 추출하여 장기간 복용할 수 있는 방법들이 연구되고 있다. 그러나 열수 추출 방법을 사용할 경우 꽃송이버섯의 유효성분들을 변성시킬 수 있고 유용활성을 나타내는 비극성의 저분자 화합물들이 충분히 추출되기 어렵다. 열수 추출법의 단점을 보완하기 위한 또 다른 주요 추출 방법으로 알코올과 같은 유기용매를 이용한 추출법이 꽃송이버섯 추출물의 제조에 이용되고 있으나, 특정 효능을 나타내는 성분들이 존재하는 분획물 만을 농축하여 얻는 공정 기술에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 열수 추출법의 단점을 보완하고 특정 효능을 나타내는 성분들이 존재하는 분획물을 획득하기 위하여 예의 노력한 결과, 유기용매를 이용하여 제조된 꽃송이버섯 추출물이 위암, 피부암, 자궁경부암, 유방암, 간암, 뇌암과 같은 암세포의 전이능력 및 증식능력을 억제시키고, 혈관내피세포의 침윤성 및 관 형성과 같은 혈관내피세포의 분화능력을 억제할 수 있으며, 신경독소인 글루타메이트에 의해 유도된 신경아교세포 사멸에 대한 보호효과가 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 유기용매를 이용한 꽃송이버섯 추출물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 개선용 식품을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 꽃송이버섯 분말을 에탄올로 추출한 다음, 에탄올 추출물을 분리하는 단계; (b) 상기 에탄올 추출물을 에탄올과 헥산의 혼합용매로 추출한 다음, 헥산 층을 제거하는 단계; (c) 상기 헥산 층을 제거하고 남은 잔여물을 증류수와 클로로포름의 혼합용매로 추출한 다음, 증류수 층을 제거하는 단계; 및 (d) 상기 증류수 층을 제거하고 남은 잔여물에 1% 염화나트륨을 첨가하여 추출한 다음, 클로로포름 층을 분리하여 꽃송이버섯 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 꽃송이버섯 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 개선용 식품을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 꽃송이버섯 분말을 에탄올로 추출한 다음, 에탄올 추출물을 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 에탄올 추출물을 90% 에탄올과 헥산의 혼합용매로 추출한 다음, 헥산 층을 제거하는 단계; (c) 상기 헥산 층을 제거하고 남은 잔여물을 증류수와 클로로포름의 혼합용매로 추출한 다음, 증류수 층을 제거하는 단계; (d) 상기 증류수 층을 제거하고 남은 잔여물에 1% 염화나트륨을 첨가하여 추출한 다음, 클로로포름 층을 분리하여 꽃송이버섯 추출물을 수득하는 단계; 및 (e) 상기 수득된 꽃송이버섯 추출물을 분취 HPLC를 이용하여 유효성분을 함유하는 분획물을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 (b) 단계의 혼합용매는 90% 에탄올과 헥산이 부피비로 2:3이고, 상기 (c) 단계의 혼합용매는 증류수와 클로로포름이 부피비로 2:3인 것을 특징으로 하는 꽃송이버섯 추출물의 제조방법으로 제조된 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물로, 상기 퇴행성 뇌신경 질환은 알츠하이머성 치매 또는 혈관성 치매인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 꽃송이버섯 추출물은 위암, 피부암, 자궁경부암, 유방암, 간암, 뇌암과 같은 암세포의 전이능력 및 증식능력을 억제시키고, 혈관내피세포의 침윤성 및 관 형성과 같은 혈관내피세포의 분화능력을 억제할 수 있으며, 신경독소인 글루타메이트에 의해 유도된 신경아교세포 사멸에 대한 보호효과가 있으므로 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물 및 암 개선용 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 꽃송이버섯 추출물의 제조방법을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 꽃송이버섯 추출물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 꽃송이버섯 추출물의 분취-HPLC 분석 결과 및 각 분획물의 습득량을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 꽃송이버섯 추출물을 농도별로 처리한 다음, 암세포의 증식저해 활성을 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 꽃송이버섯 추출물을 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 다음, 위암세포주(AGS)에서 암세포의 이동능력 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 꽃송이버섯 추출물을 25 ㎍/㎖ 농도로 처리한 다음, 혈관내피세포(HUVEC)의 침윤성 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 꽃송이버섯 추출물을 25 ㎍/㎖ 농도로 처리한 다음, 혈관내피세포(HUVEC)의 관 형성능 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 꽃송이버섯 추출물을 농도별로 처리한 다음, 과량의 glutamate 처리에 의해 유도된 뇌신경세포(C6 glial cell) 사멸에 대한 보호 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체적인 예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 개별 구성에 관한 세부 사항은 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 유기용매를 이용하여 꽃송이버섯 추출물을 제조하였으며, 상기 꽃송이버섯 추출물은 위암, 피부암, 자궁경부암, 유방암, 간암, 뇌암과 같은 암세포의 전이능력 및 증식능력을 억제시키고, 혈관내피세포의 침윤성 및 관 형성과 같은 혈관내피세포의 분화능력을 억제할 수 있으며, 신경독소인 글루타메이트에 의해 유도된 신경아교세포 사멸에 대한 보호효과가 있으므로 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물 및 암 개선용 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 일 관점에서 (a) 꽃송이버섯 분말을 에탄올로 추출한 다음, 에탄올 추출물을 분리하는 단계; (b) 상기 에탄올 추출물을 에탄올과 헥산의 혼합용매로 추출한 다음, 헥산 층을 제거하는 단계; (c) 상기 헥산 층을 제거하고 남은 잔여물을 증류수와 클로로포름의 혼합용매로 추출한 다음, 증류수 층을 제거하는 단계; 및 (d) 상기 증류수 층을 제거하고 남은 잔여물에 1% 염화나트륨을 첨가하여 추출한 다음, 클로로포름 층을 분리하여 꽃송이버섯 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 꽃송이버섯 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 (a) 꽃송이버섯 분말을 에탄올로 추출한 다음, 에탄올 추출물을 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 에탄올 추출물을 90% 에탄올과 헥산의 혼합용매로 추출한 다음, 헥산 층을 제거하는 단계; (c) 상기 헥산 층을 제거하고 남은 잔여물을 증류수와 클로로포름의 혼합용매로 추출한 다음, 증류수 층을 제거하는 단계; (d) 상기 증류수 층을 제거하고 남은 잔여물에 1% 염화나트륨을 첨가하여 추출한 다음, 클로로포름 층을 분리하여 꽃송이버섯 추출물을 수득하는 단계; 및 (e) 상기 수득된 꽃송이버섯 추출물을 분취 HPLC를 이용하여 유효성분을 함유하는 분획물을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 (b) 단계의 혼합용매는 90% 에탄올과 헥산이 부피비로 2:3이고, 상기 (c) 단계의 혼합용매는 증류수와 클로로포름이 부피비로 2:3인 것을 특징으로 하는 꽃송이버섯 추출물의 제조방법으로 제조된 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물로, 상기 퇴행성 뇌신경 질환은 알츠하이머성 치매 또는 혈관성 치매인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, (e) 상기 수득된 꽃송이버섯 추출물은 분취 HPLC를 이용하여 유효성분을 함유하는 분획물을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 혼합용매는 에탄올과 헥산이 부피비로 1:0.1 내지 1:5인 것이 바람직하고, 에탄올:헥산=2:3인 것이 가장 바람직하다.
상기 혼합용매에 사용된 에탄올을 90% 에탄올을 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 혼합용매는 증류수와 클로로포름이 부피비로 1:0.1 내지 1:5인 것이 바람직하고, 증류수:클로로포름=2:3인 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 위암, 피부암, 자궁경부암, 유방암, 간암 또는 뇌암인 것이 바람직하다.
상기 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화 될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 건강상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질병의 정도, 약물형태, 투여시간, 투여경로 및 투여기간에 따라 그 범위가 다양하지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 하지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 꽃송이버섯 추출물은 1일 유효성분을 기준으로 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 더욱 바람직하게는 0.5 mg/kg(체중) 내지 100 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 암 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 개선용 식품에 관한 것이다.
본 발명에 따른 식품에 의해 증상이 개선될 수 있는 암은 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 건강기능 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 꽃송이버섯 추출물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 꽃송이버섯 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 건강 기능식품 또한, 식품조성물로서 기능성 식품, 영양보조제, 건강 식품, 식품 첨가제 등의 다양한 형태를 포함하는 것이며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태, 예컨대, 앞서 언급한 꽃송이버섯 추출물을 차, 쥬스, 드링크의 형태로 제조하거나, 과립화, 캡슐화, 분말화하거나, 이러한 화합물 또는 추출물을 음료, 과실 및 가공식품, 어류, 육류 및 그 가공식품, 빵류, 면류, 조미료 등 각종 식품에 첨가하여 제조함으로써 제공될 수 있다.
본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
[ 실시예 ]
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 꽃송이버섯 추출물의 제조
본 실시예에서는 꽃송이버섯 분말과 유기용매를 이용하여 꽃송이버섯 추출물을 제조하였다(도 1 참조).
건조된 꽃송이버섯 분말 10 g을 에탄올(ethanol, CH3CH2OH) 1 L에 넣은 다음, 상온에서 24시간 교반하여 추출한 후 유리솜 필터를 통과시켜 꽃송이버섯 분말을 제거하였다. 꽃송이버섯 분말이 제거된 에탄올 추출물을 증발기에 의해 증발시켜 수득된 샘플을 90% 에탄올 200 mL에 녹이고, 녹인 샘플을 헥산(hexane, C6H14) 300 mL을 넣고 3시간 교반한 다음, 헥산 층을 분리하였다. 헥산층이 제거된 샘플에 증류수 200 mL과 클로로포름(chloroform, CHCl3) 300 mL을 넣고 3시간 교반한 다음, 증류수 층을 분리하였다. 증류수 층이 제거된 샘플에 1% 염화나트륨(sodium chloride, NaCl) 200 mL를 첨가한 다음, 0.5시간 혼합한 후 클로로포름 층을 분리하였으며, 분리된 클로로포름 층에 함유되어 있는 꽃송이버섯 추출물을 수득하였다.
실시예 2: 꽃송이버섯 추출물의 분석 및 분리
실시예 1에서 수득한 클로로포름 층에 함유되어 있는 생리활성 물질을 분석하기 위하여 분취형 고성능 액체크로마토그래피를 이용하여 꽃송이버섯 추출물을 분석 및 분리하였다.
실시예 2-1: 꽃송이버섯 추출물의 분석
실시예 1에서 수득한 꽃송이버섯 추출물에 포함되어 있는 생리활성 물질을 분석하기 위하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분석을 수행하였다. 시료 분석은 Shimadzu LC-2030C 3D를 사용하였으며, 0.45 ㎛ 박막여과지로 여과하여 10 ㎕를 주입하였고, 컬럼은 Shim-peck GIS(5 μm ODS, 250 x 4.6 mm id 10-70101-05)을, 유속은 1 ml/min로 용매는 A 용액(0.05% trifluoroacetic acid를 포함한 물), B 용액(아세토나이트릴)으로 gradient 프로그램을 이용하여 60분간 분석하였다. UV 검출기를 이용하여 샘플을 분석하였고, 분석 파장은 200, 230, 250, 270, 290, 300 nm에서 추출된 샘플을 각각 확인하였다(도 2 참조).
실시예 2-2: 꽃송이버섯 추출물의 분획물 분리
실시예 1에서 수득한 꽃송이버섯 추출물에 포함되어 있는 생리활성 물질을 분석하기 위하여 분취(preparative) HPLC(Thermo Ultimate3000prep)를 이용하여 7개의 구역으로 분리하였다. 분취 HPLC의 분리 조건으로 컬럼은 YMC-Pack ODS-AQ-HG, (250 x 20 mm l.D. S-10μm, 12nm, AQG12S11-2520WT, No.2025002045)을, 유속은 10 ml/min로 용매는 A 용액(0.05% trifluoroacetic acid를 포함한 물), B 용액(아세토나이트릴)으로 gradient 프로그램을 이용하여 총 120분 동안 분석하였다. UV 검출기를 이용하여 샘플을 분석하였고, 분석 파장은 200, 230, 250, 270, 290, 300nm을 이용하였다.
상기 조건을 이용하여 각 구역의 습득량을 확인한 결과 1구역에서는 13.5 mg(분획물 1), 2구역에서는 2 mg(분획물 2), 3구역에서는 1.3 mg(분획물 3), 4구역에서는 6.1 mg(분획물 4), 5구역에서는 9.6 mg(분획물 5), 6구역에서는 17.4 mg(분획물 6), 7구역에서는 3.5 mg(분획물 7)의 습득량을 나타내었다(도 3 참조).
실시예 3: 꽃송이버섯 추출물의 항암 활성
본 실시예에서는 실시예 2-2에서 수득한 꽃송이버섯 추출물(분획물 1~7)의 항암 활성을 확인하였다. 항암 세포배양은 악성 흑색종 세포주인 B16F10, 위암세포주인 AGS, 간암세포주인 HepG2, 자궁경부암세포주인 HeLa, 유방암세포주인 MCF-7, 뇌종양세포주인 U87MG를 한국세포주은행으로부터 분양받아 사용하였다. B16F10, HepG2, HeLa, MCF-7 은 10%(v/v) FBS와 1X의 Pen/Strep/Amph B가 포함된 DMEM 배지를 사용하였고, U87MG는 MEM 배지를 사용하였으며, AGS는 RPMI 배지를 사용하여 이산화탄소 세포배양기에서 37℃, 5% CO2 분위기에서 배양하였다.
실시예 3-1: 꽃송이버섯 추출물의 암세포 증식능력 억제 활성
꽃송이버섯 추출물의 암세포 증식 억제 활성은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 암세포(2×10³ cells/well)를 96-well plate의 각 well에 분주하여 24시간 배양한 다음, 각 세포에 꽃송이버섯 추출물(분획물 1~7)을 가장 높은 농도인 100 ㎍/㎖부터 serial dilution하여 처리하였다. 이를 3일간 배양한 다음, MTT 용액(2 mg/ml) 50 ㎕을 첨가하고 3시간 동안 반응시켰다. 조심스럽게 배지를 제거한 다음, dimethylsulfoxide(DMSO) 100 ㎕를 가하여 MTT 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 다음, microplate reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, 추출물의 농도별(100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 6.25 ㎍/㎖, 3.125 ㎍/㎖) 성장억제 정도를 조사하였다.
도 4는 각 암세포에 꽃송이버섯 추출물(분획물 1~7)을 농도별로 처리한 다음, 암세포의 증식저해 활성을 측정한 결과를 것으로, 6개의 모든 암종에서 분획물 4에서 가장 높은 암세포 증식 저해 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3-2: 꽃송이버섯 추출물의 암세포 전이능력 억제 활성
꽃송이버섯 추출물의 암세포 전이능력 억제 효능은 wound healing assay를 이용하여 관찰하였다. 24-well plate에 AGS 위암 세포가 90% 이상 confluent하도록 접종하였다(3×105/well). 세포의 부착 후, pipette tip를 이용하여 plate 바닥을 긁어 wound를 만들었다. PBS로 헹궈 떨어져 나간 세포들을 제거하고, 추출물을 처리한 배지를 넣었다. 24 시간 배양한 다음, wound 부위를 현미경으로 촬영하여 암세포의 이동능력에 대한 저해효능을 관찰하였다.
도 5는 꽃송이버섯 추출물(분획물 1~7)을 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 다음, 암세포의 이동능력 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 분획물 4 및 5에서 가장 높은 암세포 전이능력 저해 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 꽃송이버섯 추출물의 항혈관신생 활성
본 실시예에서는 실시예 2-2에서 수득한 꽃송이버섯 추출물(분획물 1~7)의 항혈관신생 활성을 확인하기 위하여, 혈관내피세포(HUVEC) 침윤성 및 관 형성능 억제 활성을 확인하였다.
실시예 4-1: 꽃송이버섯 추출물의 혈관내피세포 침윤성 억제
꽃송이버섯 추출물 처리에 의한 혈관내피세포 침투 억제는 invasion assay를 이용하여 관찰하였다. 배양 중인 HUVECs의 EBM-2 배지를 제거하고 serum free EBM-2 배지를 처리한 후 24시간 배양하였다. Invasion transwell의 membrane(8 μm pore) 바닥을 gelatin(1 ㎎/㎖) 10 ㎕으로 coating하고 건조시킨 후 well의 안을 Matrigel(3 ㎎/㎖) 10 ㎕로 coating하여 건조시켰다. Well에 serum free EBM-2 배지 600 ㎕와 꽃송이버섯 추출물 25 ㎍/㎖을 각각 처리하고 혈관신생유도인자인 VEGF(30 ng/㎖)를 처리하였다. 각 transwell에 HUVECs(7×10⁴cells)을 분주하고 18시간 동안 배양하였다. Invasion된 세포를 고정시키기 위해 70% methanol을 사용하였다. 세포를 고정시킨 transwell membrane을 hematoxylin과 eosin을 사용하여 핵과 세포질을 염색시킨 후 에탄올을 사용하여 탈수시켰다. 각 well의 안쪽을 면봉으로 조심스럽게 닦아내고 현미경을 이용하여 세포의 침투 억제 활성 정도를 관찰하였다.
도 6은 꽃송이버섯 추출물(분획물 1~7)을 25㎍/㎖ 농도로 처리한 다음, 혈관내피세포(HUVEC)의 침윤성 억제 활성을 측정한 결과 나타낸 것으로, 분획물 4에서 가장 높은 혈관내피세포 침윤성 억제 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4-2: 꽃송이버섯 추출물의 혈관내피세포 관 형성능 억제
꽃송이버섯 추출물 처리에 의한 혈관내피세포 관 형성능 억제 활성은 tube formation assay를 이용하여 관찰하였다. 배양 중인 HUVECs의 EBM-2 배지를 제거하고 serum free EBM-2 배지를 처리한 후 24시간 배양하였다. 48-well plate의 각 well을 Matrigel(10 ㎍/㎕)로 코팅한 후, 꽃송이버섯 추출물 25 ㎍/㎖과 혈관신생유도인자인 VEGF(30 ng/㎖)를 포함한 serum free EBM-2 배지 400 ㎕를 분주한 다음, HUVECs(7×10⁴cells)을 분주하고 3시간 동안 배양하였다. 현미경을 이용하여 튜브 형성 억제 활성 정도를 관찰하였다.
도 7은 꽃송이버섯 추출물(분획물 1~7)을 25㎍/㎖ 농도로 처리한 다음, 혈관내피세포(HUVEC)의 관 형성능 억제 활성을 측정한 결과 나타낸 것으로, 분획물 4에서 가장 높은 혈관내피세포 관 형성 억제 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 꽃송이버섯 추출물의 뇌신경세포보호 활성
본 실시예에서는 꽃송이버섯 추출물의 뇌신경세포보호 효능을 측정하기 위해, 과량의 glutamate에 의해 유도된 신경아교세포인 C6 glial 세포의 손상에 대한 보호 효과를 MTT assay를 이용하여 분석하였다. C6 세포는 10% FBS와 1%의 Pen/Strep/Amph B를 첨가한 DMEM 배지로 배양하였다. 배양기는 37℃ 온도를 유지했고, 5% CO2가 계속 공급되어 세포배양의 적절한 조건을 갖추었다. 배양된 C6 세포는 96-well 플레이트에 5×103 cells/well 농도로 분주하여 1일 동안 배양한 다음, 꽃송이버섯 추출물을 농도별(50 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 6.25 ㎍/㎖, 3.125 ㎍/㎖)로 1시간 동안 전처리하고 23 mM L-glutamate를 첨가하여 세포독성을 유발시킨 뒤 24시간 더 배양하였다. MTT 용액을 첨가하여 3시간 동안 37℃에서 반응시키고, DMSO로 형성된 formazan이 완전히 용해되게 한 후 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. Cell viability는 control의 생존율에 대한 백분율로 나타내었다.
도 8은 꽃송이버섯 추출물(분획물 1~7)을 농도별로 처리한 다음, 과량의 glutamate 처리에 의해 유도된 뇌신경세포(C6 glial cell) 사멸에 대한 보호 활성을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 분획물 4, 5, 7에서 우수한 뇌신경세포사멸에 대한 보호 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (1)

  1. (a) 꽃송이버섯 분말을 에탄올로 추출한 다음, 에탄올 추출물을 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 에탄올 추출물을 90% 에탄올과 헥산의 혼합용매로 추출한 다음, 헥산 층을 제거하는 단계;
    (c) 상기 헥산 층을 제거하고 남은 잔여물을 증류수와 클로로포름의 혼합용매로 추출한 다음, 증류수 층을 제거하는 단계;
    (d) 상기 증류수 층을 제거하고 남은 잔여물에 1% 염화나트륨을 첨가하여 추출한 다음, 클로로포름 층을 분리하여 꽃송이버섯 추출물을 수득하는 단계; 및
    (e) 상기 수득된 꽃송이버섯 추출물을 분취 HPLC를 이용하여 유효성분을 함유하는 분획물을 분리하는 단계를 포함하고,
    상기 (b) 단계의 혼합용매는 90% 에탄올과 헥산이 부피비로 2:3이고,
    상기 (c) 단계의 혼합용매는 증류수와 클로로포름이 부피비로 2:3인 것을 특징으로 하는
    꽃송이버섯 추출물의 제조방법으로 제조된 꽃송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물로,
    상기 퇴행성 뇌신경 질환은 알츠하이머성 치매 또는 혈관성 치매인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물.
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