KR101938396B1 - 퉁퉁마디 추출물을 포함하는 치매 예방 또는 치료 및 인지기능 개선용 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물을 유효성분으로 포함하는 치매의 예방, 치료 또는 인지능 개선용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 탈염 퉁퉁마디 추출물과 추출물로부터 분리된 acetylcholine esterase 저해성 유효성분인 acanthoside B가 뇌신경염증 억제를 통한 뇌신경세포 보호활성이 탁월하며, 스코폴라민(scopolamine)에 의해 유도된 기억력 감퇴 동물모델의 수동회피실험(passive avoidance test) 및 Y 미로실험(Y-maze test)에서 기억력개선 및 공간인지능력을 현저히 향상시키는 것을 확인하였다. 본 발명의 아칸토사이드 B 또는 퉁퉁마디 추출물은 치매의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 인지능 개선 약제학적 조성물 또는 기억력 및 인지능 개선용 건강기능식품 또는 사료 등에 적용될 수 있다.

Description

퉁퉁마디 추출물을 포함하는 치매 예방 또는 치료 및 인지기능 개선용 약제학적 조성물{A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of dementia and improvement of cognitive function comprising extract of Salicornia europaea}
본 발명은 퉁퉁마디 추출물을 포함하는 치매 예방 또는 치료 및 인지기능 개선용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아칸토사이드 B (Acanthoside B) 화합물을 유효성분으로 하는 퉁퉁마디 추출물을 포함하는 치매 예방 또는 치료 및 인지기능 개선용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
치매(dementia)는 일상생활에 손상을 주는 기억력과 인지능력 악화로 정의되며, 알츠하이머병(Alzheimer’s disease, AD)은 임상병리학적으로 기억력 및 인지력 상실, 정신 및 행동장애를 동반하는 신경퇴행성 질병이다. 이 질환은 노인성 치매의 가장 주된 원인이며 AD 발생의 20-50%가 85세 이상의 노인인구에서 발병된다. AD는 장기적 치료가 요구되고 질병의 특성상 환자 가족 및 간병인에 대한 사회적 지원도 요구되기 때문에 치료에 소요되는 금액이 2010년 발표 기준으로 세계적으로 6천 4십억 달러에 이르고 있다 [Wimo A, Prince, M. (2010) World Alzheimer Report 2010: The Global Economic Impact of Dementia (London: Alzheimer's Disease International). 이미 많은 선진국에서는 치매가 환자, 가족 및 사회에 심각한 경제적 부담을 주는 질병으로 여겨지고 있다. 현재까지도 이 질병의 정확한 기전이 밝혀지지 않았고 질병의 특성상 매우 복잡한 발병 기작을 가지고 있기 때문에 치료법 개발에 어려움이 많다.
치매증상의 하나인 기억력 감퇴 현상은 뇌신경전달물질인 acetylcholine 함량과 관계가 있다는 증거가 다양하게 제시되고 있다. 치매 환자의 뇌에서 아세틸콜린 분비 및 콜린성 신경세포의 수가 감소한다는 사실이 증명된 이후 “Cholinergic deficient hypothesis” 즉, 치매의 증상이 신경세포 presynapse의 아세틸콜린 감소에 기인한다는 가설을 바탕으로 하면 아세틸콜린을 분해하는 효소를 억제하여 아세틸콜린을 증가시킴으로써 치매증상을 치료할 수 있을 것으로 받아들여져 왔다[Francis PT, Palmer AM, Snape M, Wilcock GK (1999) The cholinergic hypothesis of Alzheimer's disease: a review of progress. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry 66: 137-147]. 또한, 뇌혈관내에 acetylcholine esterase (AChE)의 농도가 증가될수록 신경세포의 콜린성 신경전달물질이 결핍되어 기억 및 인지능력 장애를 유발할 수 있다고 보고되고 있다. 현재 FDA 승인 치료제 4종은 모두 acetylcholine esterase (AChE) 저해 화합물들로서 Tacrine (Cognex), Donepezil (Aricept), Rivastigmine (Exelon), Galantamine (Reminyl) 이 알려져 있다. FDA에서 승인된 위의 네 약물 이외에도 현재 많은 치료물질 들이 임상 시험 중에 있다. 그러나, Tacrine의 경우 강한 acetylcholine esterase 저해활성을 나타내는 약물이나 간독성 등의 부작용으로, 현재 거의 사용이 되지 않고 있으며, Rivastigmine 은 구토 및 현기증을 유발할 수 있고 치료에 효과적인 고농도로 투여하기가 어렵다는 단점이 알려지고 있다 (Naik RS, Hartmann J, Kiewert C, Duysen EG, Lockridge O, Klein J (2009) Effects of rivastigmine and donepezil on brain acetylcholine levels in acetylcholinesterase-deficient mice. Journal of pharmacy & pharmaceutical sciences: a publication of the Canadian Society for Pharmaceutical Sciences, Societe canadienne des sciences pharmaceutics 12: 79-85). 따라서, 화학합성 의약품을 대체할 부작용과 독성이 없는 천연물 소재의 AChE 억제제의 개발이 절실하여, 천연물 유래 새로운 AChE 저해 화합물을 이용한 치매 예방과 치료 약물 개발에 관한 연구도 활발한 편이며, 근래에는 피부나 정맥주입 등이 가능하도록 하는 차세대 AChE 억제제 개발도 진행되고 있다 [Hong-Qi Y, Zhi-Kun S, Sheng-Di C (2012) Current advances in the treatment of Alzheimer's disease: focused on considerations targeting Abeta and tau. Translational neurodegeneration 1: 21].
한편, 뇌신경염증반응 (neuroinflammation)이 알츠하이머형 치매, 노인성 치매, 파킨슨씨병, multiple sclerosis, AIDS dementia 등과 같은 신경질환의 병리기전에 관여한다는 것이 알려 있으며, microglia 및 astrocytes의 과민화에 의한 염증반응이 대표적 신경변성질환 중 하나인 파킨슨병의 주된 원인 및 결과로 주목 받고 있다. 신경교세포는 중추신경계 (central nervous system)를 구성하는 중요한 세포 가운데 하나로, 적절히 활성화된 신경교세포와 잘 조절된 염증반응은 신경세포 및 조직 보호 작용이 있으나, 이들 세포가 과도한 염증반응을 수반하여 적절히 조절되지 못할 경우 이들이 생산해 내는 염증매개 물질들은 신경세포 독성을 나타낼 수 있으며 신경조직의 퇴행성 변이를 초래할 수 있다.
뇌신경계의 퇴행성질환은 뇌와 척수의 특정한 신경세포군이 그 기능을 잃고 신경세포의 수가 감소하는 질환을 총칭하는 질환으로 대표적으로 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease; AD), 파킨슨병 (Parkinson’s disease; PD), 헌팅턴병(Huntington’s disease; HD) 등이 있다. 현재까지 지난 30년에 걸쳐 축적되어 온 분자생물학 및 면역조직화학염색 연구 등을 통하여 퇴행성 뇌신경변성질환은 뇌신경계의 정보전달에 가장 중요한 신경세포의 사멸과 뇌신경세포 상호간의 정보를 전달하는 시냅스의 형성이나 기능상의 문제, 뇌신경의 전기적 활동성의 이상적 증가나 감소로 인하여 발병되는 것으로 알려져 있으며 이러한 현상은 연령이 높아지면 더욱 증가한다. 현재 인구의 고령화는 신흥경제국 및 서구를 중심으로 전 세계에서 급격하게 진행되고 있으며 한국도 2015년 65세 이상 고령인구가 800만명을 넘어서 전체인구의 15.7%을 차지하고 있으며, 2060년에는 40.1%에 달할 것으로 예측되고 있다.
한편, AD의 뇌병변에서 보이는 큰 특징 중에는 미세아교세포증(microgliosis)증 뇌신경염증이 있으며, 다수의 역학조사에 따르면 NSAIDs계의 항소염제를 장기 복용하였을 시 AD 유병률이 낮아지는 경향을 보였다. 캐나다에서 실행된 10년간의 장기 프로젝트에서 역시 경도의 인지능력 장애 환자군에 NSAIDs 치료를 하였을 때 AD 유병률이 낮아지는 것을 보여주었다. 따라서, 경도 및 중도의 인지능력 장애의 경우에는 뇌신경세포의 염증 억제제가 효과적인 예방과 치료제로 사용할 수 있을 것으로 예상되고 있다. 그러나, 염증 치료제인 노바티스(Novartis)의 COX-2 저해제인 ‘프렉시지’(Prexige, lumiracoxib)가 캐나다와 호주에서 부작용으로 퇴출된 사례를 보더라도, 최근 기존 화학합성 의약품이 아닌 천연물로부터 부작용이 적은 뇌신경세포 염증억제 또는 보호 약물을 이용한 AD의 예방 및 치료제의 개발이 주목을 받고 있다.
퉁퉁마디(Salicornia spp.)는 명아주과에 속하는 1년생 초본 식물로서 염생식물 중 염저항성이 강하여 NaCl 200mM을 첨가한 사경재배에서도 성장감소 없이 생육이 가능하며 생육을 위하여 염류를 절대적으로 필요로 하는 절대염생식물(Obligatory halophyte or True halophyte)이다. 절대염생식물에서 삼투조절에 기여하는 용질들은 삼투저항 유기물질로 알려지고 있는데 세포 내 축적되는 대표적인 삼투저항 물질들로는 아미노산 proline, glycin betaine과 같은 onium화합물, 당알코올류들인 mannitol, sorbitol, inositol 등과 단당류 trehalose 등이 있다 [Validation of suitable reference genes for gene expression analysis in the halophyte Salicornia europaea by real-time quantitative PCR. 2015. Front Plant Sci. 21(5):788]. 퉁퉁마디는 바닷물을 먹고 자라기 때문에 ‘비료’를 줄 필요 없고, 체내 염도가 높아 병충해가 없어 ‘농약’이 필요 없는 친환경/ 지속가능한 작물로서 한국을 비롯하여 미국, 유럽 등 세계 도처에서 자생 또는 재배되고 있으며 특히 아열대 및 열대지역에서는 ‘3모작’이 가능하여, 지구온난화에 따른 물부족과 식량부족시대에 적합한 ‘해수농업(Seawater Agriculture)’의 최적 모델식물이라고 하겠다.
또한, 퉁퉁마디는 체내 다량의 식물성 염분 (NaCl, KCl 등)과 칼슘, 마그네슘, 칼륨 등을 함유하여 ‘미네랄의 보고’라고 알려져 있다. 다량의 식이섬유, 필수아미노산 등의 영양소와 클로로필, 폴리페놀, 플라보노이드의 식물 생리활성 물질도 풍부하여 예로부터 몸 안에 쌓인 독소와 숙변을 없애고, 암, 고혈압, 당뇨병, 간염, 피부병, 관절염 등을 치료하기 위한 민간요법으로 활용되어 왔으며, 지난 10여년간 국내 자생식물의 생리활성 물질 연구가 활성화 되면서 우리나라 서해안에 자생하여 왔던 염생식물인 퉁퉁마디의 기능성 연구가 국내 연구자 중심으로 활성화 되었고, 결과로 100여편 이상의 국내외 학술논문과 수많은 특허들이 도출되었다. 특히, 퉁퉁마디의 콜린은 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)과 뇌에서의 신경세포 구성물질인 스핑고미엘린(sphingomyelin), 체내 구성세포의 구성물질인 레시틴(lecithin)의 중요한 전구체로 알려져 있으며 베타인은 간에서 해독작용에 주요한 역할을 하는 물질로, 체내 독성을 없애 줌으로써 혈중 독성농도를 줄여주는데 결정적인 기여를 하는 물질로 알려져 있다. [함초와 칠면초의 이화학적 특성 조사연구, 한국식품위생안전성학회지. 2010. 25(2):170-179]
퉁퉁마디라는 원료 자체가 다량의 염분(35% 이상)을 함유함에 따라 현재 시중에 시판되는 퉁퉁마디 관련 제품 (분말, 추출액, 환 등)에 짠맛을 그대로 유지하여 소금대체재로 활용하거나 다른 원료와의 혼합을 통한 저염화 제품으로 개발되고 있다. 그리고, 퉁퉁마디의 다양한 기능성 연구에도 불구하고 퉁퉁마디의 추출물이나 분말에 고농도의 나트륨 함유로 인하여 100% 퉁퉁마디 분말이나 100% 퉁퉁마디 추출물의 기능성 소재화에는 제약이 있었다. 본 발명자들은 탈염을 통한 기능성강화 퉁퉁마디 탈염소재와 그 제조방법에 관한 원천기술을 보유하고 있다.
본 발명에서는 탈염한 퉁퉁마디의 추출물에서 아세틸콜린 에스테라아제(acetylcholine esterase) 저해활성이 우수함을 확인하고, 그 추출물로부터 유효성분인 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물을 단리하였으며, 퉁퉁마디 추출물과 아칸토사이드 B 화합물의 뇌신경염증 억제를 통한 세포 보호활성과 건망증 동물모델에서 기억력 및 인지능력 개선 효과를 확인하였다. 이에, 탈염한 퉁퉁마디 추출물 또는 아칸토사이드 B 화합물을 유효성분으로 함유하는 치매의 예방과 치료 및 인지능 개선을 위한 약학조성물과 기능성식품으로 제안한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 부작용이 적은 뇌신경세포 염증억제 약물로서 치매 예방 또는 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 퉁퉁마디(Salicornia europaea) 추출물에서 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물을 분리하였으며, 상기 화합물이 뇌신경염증 억제를 통한 세포 보호활성과 건망증 동물모델에서 기억력 및 인지능력 개선 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 치매 예방, 치료 또는 인지능 개선용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 인지능 및 기억력 개선용 기능성식품 또는 사료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물의 분리방법을 제공하는데 있다
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아칸토사이드 B (acanthoside B) 또는 이의 악제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 치매의 예방, 치료 또는 인지능 개선용 약제학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017045828010-pat00001
본 발명자들은 부작용이 적은 뇌신경세포 염증억제 약물로서 치매 예방 또는 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 퉁퉁마디(Salicornia europaea) 추출물에서 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물을 분리하였으며, 상기 화합물이 뇌신경염증 억제를 통한 세포 보호활성과 건망증 동물모델에서 기억력 및 인지능력 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명자들은 퉁퉁마디를 동결 건조한 후 파쇄하여 분말화한 다음 냉수를 이용하여 탈염하고, 상기 탈염된 분말을 열수추출 또는 효소분해 추출한 후, 클로로포름을 이용하여 유기용매 분획을 한 뒤, 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 이후 HPLC에 의한 단일물질을 분리한 후 구조분석을 실시한 결과, 아칸토사이드 B (acanthoside B) 임을 확인하였고, 이의 세포 보호활성을 확인하였다.
본 발명에서는 퉁퉁마디를 수세한 후 동결건조, 열풍건조 또는 음건하여 파쇄하고, 수득된 건조분말을 3-9°C의 냉수를 이용하여 탈염시킴으로써 퉁퉁마디 탈염물(예컨대, 탈염분말)을 수득할 수 있다.
본 발명에서 정의되는 퉁퉁마디 추출물은 탈염된 퉁퉁마디를 원재료로 사용하고, 추출은 물 또는 C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하고, 더 바람직하게는 추출 전에 탈염 퉁퉁마디를 효소가수분해 후 물 또는 에탄올 혼합용매로 추출한 추출물을 포함한다.
본 발명의 대상질환인 “치매”는 알츠하이머형 치매증, 뇌혈관성 치매증, 뇌신경염증성 치매, 및 퇴행성 뇌질환[예컨대, 루이소체치매(Dementia with Lewy Bodies, DLB), 다발성 경색치매(Multi-Infarct Dementia, MID), 전두측두엽변성증(frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 픽병(Pick's disease), 피질기조퇴행 (Corticobasal degeneration, CBD), 퇴행성 핵상마비 (progressive supranuclear palsy, PSP), 파킨슨병 및 헌팅턴병] 등을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 인지능 개선용 약제학적 조성물은 기억력 장애 개선 또는 기억력 증진용 조성물과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유효성분으로 포함하는"이란 하기의 아칸토사이드 B 의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함된 아칸토사이드 B 는 천연식물재료인 퉁퉁마디로부터 분리한 화합물로서 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명에서 유효성분으로 사용되는 아칸토사이드 B 는 그 자체 또는 염의 형태, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탄산 및 아스파르트산 등을 포함하며 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산 및 인산 등을 포함하며 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아칸토사이드 B (acanthoside B) 또는 이의 악제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 인지능 및 기억력 개선용 기능성식품 또는 사료용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
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본 발명의 인지능 및 기억력 개선용 기능성식품 또는 사료용 조성물은 상술한 본 발명의 치매의 예방, 치료 또는 인지능 개선용 약제학적 조성물과 동일한 유효성분인 아칸토사이드 B (acanthoside B) 를 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물인 경우에는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등의 형태로 제조될 수 있다. 예컨대 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 아칸토사이드 B 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 아칸토사이드 B 화합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
한편, 퉁퉁마디는 오랫동안 식용 및 민간약으로 사용되어 왔던 것이므로 이로부터 추출된 성분 또는 퉁퉁마디 추출물 자체는 독성 및 부작용 등의 문제가 없을 것으로 예상할 수 있다. 이러한 이유로 퉁퉁마디 추출물 또는 이의 분획성분은 동일한 목적으로 동물의약품 및 기능성 사료로도 개발이 가능하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 퉁퉁마디(Salicornia spp.) 추출물을 포함하는 치매 예방 또는 치료 및 인지능 개선용 약제학적 조성물을 제공하며, 또는 퉁퉁마디(Salicornia spp.) 추출물을 포함하는 인지능 및 기억력 개선용 기능성식품 또는 사료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 퉁퉁마디 추출물은 탈염된 퉁퉁마디를 물 또는 50 내지 100 (v/v, %) 농도의 탄소수 1 내지 4의 저가알코올로 추출하여 수득할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 퉁퉁마디 추출물은 탈염된 퉁퉁마디의 효소가수분해물을 물 또는 50 내지 100 (v/v, %) 농도의 탄소수 1 내지 4의 저가알코올로 추출하여 수득할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물의 분리방법을 제공한다:
(a) 퉁퉁마디(Salicornia spp.)로부터 (i) 극성 용매 추출물 또는 (ii) 효소가수분해 추출물을 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 산성 용액을 첨가하여 교반 및 정치한 후 침전물을 제거하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 결과물에 염기성 용액을 첨가한 후, 비극성 유기용매를 첨가하여 알칼로이드 분획물을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 알칼로이드 분획물을 정제하여 단일물질인 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물을 수득하는 단계.
이하, 본 발명의 아칸토사이드 B 분리방법에 대하여 상세히 설명한다.
단계 (a): 퉁퉁마디 추출물을 수득하는 단계
우선, 퉁퉁마디(Salicornia spp.)에 적절한 용매를 가하여, (i) 극성 용매 추출물 또는 (ii) 효소가수분해 추출물을 수득한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 퉁퉁마디는 줄기, 잎 또는 줄기/잎 부위이다.
본 발명에서는 퉁퉁마디 또는 퉁퉁마디 탈염물에 용매를 처리하여 추출물을 수득한다. 예컨대 퉁퉁마디를 수세한 후 동결건조 또는 열풍건조 또는 음건하여 파쇄하고, 수득된 건조분말을 3-9°C의 냉수를 이용하여 탈염시킴으로써 퉁퉁마디 탈염물(예컨대, 탈염분말)을 수득할 수 있다.
본 발명의 분리방법에서 사용되는 극성 용매는, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 극성 용매는 물 또는 50 내지 100 (v/v, %) 농도의 탄소수 1 내지 4의 저가알코올이다.
상기 효소는 셀룰라아제(celluase), 헤미셀룰라아제(hemicelluase), 펙티나아제(pectinase) 및 β-글루카나아제(β-glucanase) 또는 이의 조합을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다.
단계 (b): 산성 용액을 첨가하여 교반 및 정치한 후 침전물을 제거하는 단계
이어, 상기 단계 (a)의 결과물에 산성 용액을 첨가하여 교반 및 정치한 후 침전물을 제거한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 수득된 퉁퉁마디 추출물에 염산을 가하여 교반한 후, 4℃에서 12시간 정치하였다. 이 과정에서 생성되는 침전물은 원심분리 및 감압여과로 제거한다.
본 발명에서 산성 용액은 염산, 초산, 황산 등을 사용할 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다..
단계 (c): 알칼로이드 분획물을 수득하는 단계
다음으로, 상기 단계 (b)의 결과물에 염기성 용액을 첨가하고 반응시킨 후, 순차적으로 비극성 유기용매를 첨가하여 알칼로이드 분획물을 수득한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)의 결과물에 6N의 암모니아수를 가하여 pH를 10이상으로 조정한 후, 클로로포름을 첨가하여 분배분획을 실시하였다. 클로로포름 분획물 중의 클로로포름을 진공휘발농축기로 제거한후, 동결건조함으로써 탈염 퉁퉁마디의 알칼로이드 분획물 (PM-AL)을 수득할 수 있다.
본 발명에서 염기성 용액은 암모니아수 또는 가성소다(NaOH)를 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 분리방법에서 사용되는 비극성 유기용매는, 클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 아세톤, 아세토나이트릴, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 디클비로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 또는 THF를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비극성 용매는 클로로포름이다.
단계 (d): 아칸토사이드 B (acanthoside B) 를 분리하는 단계
마지막으로 상기 단계 (c)의 알칼로이드 분획물을 정제하여 단일물질인 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물을 수득한다.
상기 단계 (d)는 상기 단계 (c)의 알칼로이드 분획물을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 분리할 수 있다.
본 발명자들은 상기방법에 의하여 순수분리한 화합물의 분자구조를 동정한 결과 아칸토사이드 B (화학식 1)임을 확인하였다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물을 유효성분으로 포함하는 치매의 예방, 치료 또는 인지능 개선용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
(b) 본 발명에서는 탈염 퉁퉁마디 추출물과 추출물로부터 분리된 acetylcholine esterase 저해성 유효성분인 acanthoside B가 뇌신경염증 억제를 통한 뇌신경세포 보호활성이 탁월하며, 스코폴라민(scopolamine)에 의해 유도된 기억력 감퇴 동물모델의 수동회피실험(passive avoidance test) 및 Y 미로실험(Y-maze test)에서 기억력개선 및 공간인지능력을 현저히 향상시키는 것을 확인하였다.
(c) 본 발명의 아칸토사이드 B 또는 퉁퉁마디 추출물은 치매의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 인지능 개선 약제학적 조성물 또는 기억력 및 인지능 개선용 건강기능식품 또는 사료 등에 적용될 수 있다.
도 1. 탈염 퉁퉁마디 추출물(PM-EE)로부터 acetylcholine esterase 저해 유효 화합물의 정제과정 중의 주요 획분들과 단리된 S7-L3-3(acanthoside B) 화합물의 HPLC 크로마토그램 비교 및 S7-L3-3(acanthoside B)의 UV 스펙트럼과 화학구조
도 2. 탈염 퉁퉁마디 추출물(PM-EE)로부터 AChE 저해 유효 화합물의 분리 정제 과정의 도식도
도 3. 탈염 퉁퉁마디 추출물(PM-EE)로부터 AChE 저해 유효 화합물의 정제과정 중의 주요 획분들과 단리된 S7-L3-3(acanthoside B) 화합물의 AChE 저해활성 비교
도 4. 단리화합물 S7-L3-3의 ESI-MS 스펙트럼; (A) positive mode, (B) negative mode
도 5a-5b. 단리화합물 S7-L3-3의 NMR 분석결과; (5a) 1H-NMR 스펙트럼, (5b) 13C-NMR 스펙트럼
도 6a-6b. 단리화합물 S7-L3-3의 HMBC-NMR(6a)과 1H-1H COSY(6b) 스펙트럼
도 7. 1H 및 13C-NMR과 2D-NMR 분석을 통한 S7-L3-3의 입체구조(A) 및 분자내 탄소 및 수소 위치 결정을 통한 S7-L3-3의 동정 및 화학구조 결정(B)
도 8a-8b. 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE)의 뇌신경교세포 염증 억제 효과; (8a) PM-EE의 LPS 유도 일산화질소(NO) 생성 억제 효과, (8b) PM-EE의 뇌신경염증 인자 단백질들(iNOS, COX-2)의 발현 저해 효과
도 9. RT-PCR을 통한 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE)의 뇌신경염증 유전자 발현 억제효과 확인
도 10a-10c. 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE)에서 분리한 acanthoside B의 뇌신경교세포 염증억제 효과; (10a) MTT assay를 통한 acanthoside B 세포독성 검사 (10b) acanthoside B의 LPS 유도 일산화질소(NO) 생성 억제 효과, (10c) acanthoside B의 뇌신경염증 인자 단백질들(iNOS, COX-2)의 발현 저해 효과
도 11. RT-PCR을 통한 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE)에서 분리한 acanthoside B의 뇌신경염증 유전자 발현 억제효과 확인
도 12a-12b. Scopolamine을 이용한 건망증 동물모델에서 탈염 퉁퉁마디 추출물(PM-EE)과 acanthoside B의 수동 회피(passive avoidance) 실험; (12a)PM-EE의 처리 효과, (12b) acanthoside B의 처리 효과
도 13a-13b. Scopolamine을 이용한 건망증 동물모델에서 탈염 퉁퉁마디 추출물(PM-EE)과 acanthoside B의 Y 미로 (Y-maze) 실험; (13a)PM-EE의 처리 효과, (13b) acanthoside B의 처리 효과
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 탈염 퉁퉁마디 건조 분말로부터 다양한 추출물의 제조
전남 신안군에서 재배되는 퉁퉁마디를 7월부터 8월에 씨가 맺히기 전에 잎과 줄기부분을 수확하여 세척하고 건조한 후 저온냉수탈염법을 통하여 제조된 퉁퉁마디 탈염분말 10 g에 대하여 다양한 추출물을 다음과 같이 제조하였다. 열수추출물은 퉁퉁마디 탈염분말 10g에 100mL의 증류수를 가하고, 15분간 2회의 초음파처리 후 100±1℃에서 3시간 동안 환류냉각 추출을 실시하였다. 이 후 방냉하고 원심분리(10,000rpm, 25분)하여 수득된 상등액을 진공농축하고 동결건조하여 열수 추출분말을 제조하였다. 메탄올과 에탄올 추출은 퉁퉁마디 탈염분말 10g에 100mL의 메탄올과 에탄올을 각각 가하고 15분간 2회의 초음파처리 후 각 용매의 끓는 점 근처의 온도에서 3시간 동안 환류 냉각 추출을 실시하였다. 이 후 방냉하고 감압여과 및 원심분리(10,000rpm, 25min)하여 수득된 상등액을 감압건조 농축을 통하여 각 알코올을 제거한 후 증류수에 현탁시킨후, 동결건조하여 메탄올 및 에탄올 추출분말을 제조하였다. 또한 가수된 알코올 추출물은 물, 메탄올 또는 물, 에탄올과 1:1 또는 3:7의 (v/v) 비율로 혼합하여 50%, 70% 메탄올 및 50%, 70% 에탄올을 각각 조제하여 10g의 퉁퉁마디 탈염분말에 100mL씩 각각 가하고, 15분간 2회의 초음파처리 후, 끓는 점 근처의 온도에서 3시간동안 환류냉각 추출을 각각 실시하였다. 이 후 방냉하여 감압여과 및 원심분리하여 수득된 상등액을 검압건조 농축을 통하여 알코올을 제거한 후 동결건조하여 50% 또는 70% 메탄올 및 에탄올 추출 분말을 제조하였다.
실시예 2. 탈염 퉁퉁마디 효소가수분해물로부터 다양한 추출물의 제조
7월부터 8월에 수확된 퉁퉁마디의 잎과 줄기부분을 세척하고 건조한 후 저온냉수탈염법을 통하여 제조된 퉁퉁마디 탈염분말 10g에 60mL의 증류수를 가하여 15분간 2회의 초음파처리 후, celluase, hemicelluase, pectinase, β-glucanase (Sigma Co, USA)를 각각 0.1%(v/v) 첨가하고 50℃에서 18시간 동안 효소가수분해를 실시하여 탈염 퉁퉁마디의 효소가수분해물을 수득하였다. 효소가수분해 열수추출물의 경우, 탈염 퉁퉁마디의 효소가수분해물에 40mL의 증류수를 가하여 실시예 1과 같은 방법으로 환류냉각추출을 실시하여 효소가수분해 열수추출물을 제조하였다. 탈염 퉁퉁마디 효소가수분해물의 메탄올 및 에탄올 추출물은 탈염 퉁퉁마디의 효소가수분해물을 동결건조한 후 수득되는 건조분말에 100mL의 메탄올과 에탄올을 각각 가하고 15분간 2회의 초음파처리 후 각 용매의 끓는 점 근처의 온도에서 3시간 동안 환류 냉각 추출을 실시하였다. 이 후 방냉하고 감압여과 및 원심분리(10,000rpm, 25min)하여 수득된 상등액을 감압건조 농축을 통하여 각 알코올을 제거한 후 증류수에 현탁시킨후, 동결건조하여 탈염 퉁퉁마디 효소가수분해물의 메탄올 및 에탄올 추출분말을 제조하였다. 탈염 퉁퉁마디 효소가수분해물의 50% 메탄올 및 50% 에탄올 추출물은 효소가수분해 후 동량(60mL, v/v=1:1)의 메탄올 또는 에탄올을 가하고 실시예 1과 같이 동일한 방법으로 추출하여 제조하였다. 탈염 퉁퉁마디 효소가수분해물의 70% 메탄올 및 70% 에탄올 추출물은 효소가수분해 후 각각 140mL 메탄올 또는 에탄올을 가하고 실시예 1과 같이 동일한 방법으로 추출하여 제조하였다.
실시예 3. Acetylcholine esterase ( AChE ) 저해활성 측정
뇌혈관 내에 acetylcholine esterase (AChE)의 농도가 증가할수록 신경세포의 콜린성 신경전달물질이 결핍되어 기억 및 인지기능장애를 유발할 수 있다고 보고되고 있으므로 AChE 저해활성 측정은 치매 예방 및 치료 또는 인지능 향상을 위한 약물 또는 건강기능성 원료의 개발의 도구로 사용될 수 있다. 본 발명에서도 탈염 퉁퉁마디 추출물 또는 탈염 퉁퉁마디 효소가수분해 추출물, 또는 탈염 퉁퉁마디 추출물로부터 수득되는 정제획분들의 AChE 저해활성을 측정하였으며, 측정 방법은 Ellman’s coupled enzyme assay를 일부 수정하여 실시하였다. 즉 96-well microplate에 100mM Phosphate buffer (pH8) 170μl, 2mM DTNB(dithiobisnitrobenzoic acid) 20μl, 추출시료 20μl를 가하고 20μl의 AChE 0.25U/mL in the Buffer를 분주하고 37°C에서 10분간 pre-incubation 한 후, 3.75mM acetylcholine Iodide의 기질용액을 가하였다. 효소 반응액을 37°C에서 10분간 incubation한 후 410nm의 UV-VIS microreader에서 흡광도를 측정하였으며, 기질과 시료가 포함되지 않는 대조군의 흡광도(Ac)와 시험군의 흡광도(As)를 비교하여 AChE 저해활성을 다음과 같이 계산하였다.
AChE 저해활성(%) = [1-(As/Ac)] X 100
Ac: 대조군의 흡광도, As: 시료군의 흡광도
실험예 1. 탈염 퉁퉁마디 분말 추출물의 수율 및 AChE 저해활성)
실시예 1에서 제조된 탈염된 퉁퉁마디의 다양한 추출물들에 대하여 동일한 농도 (100μg/mL)에서 AChE 저해활성을 측정한 결과와 각 추출물들의 수율을 표 1에 나타내었다.
탈염 퉁퉁마디 분말 추출물의 수율 및 AChE 저해활성
- 열수 메탄올 에탄올 50% 메탄올 50% 에탄올 70% 메탄올 70% 에탄올
수율 (%) 15.6 8.7 7.8 11.6 10.9 9.8 9.2
AChE 저해활성 (%) 52.6 58.9 61.2 62.5 65.2 60.5 62.8
* 시료농도: 100 μg/mL
상기 표 1에서 나타난 바와 같이 탈염된 퉁퉁마디의 열수추출물과 메탄올 및 에탄올 또는 가수된 메탄올 및 에탄올 추출물들 및 가수된 알코올 추출물들은 100μg/mL의 농도에서 모두 52.6% 이상의 높은 AChE 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있었으며, 특히 50% 에탄올 추출물에서 가장 높은 AChE 저해활성(65.2%)과 열수추출물에서 가장 높은 수율(15.6%)을 보임을 알 수 있었다.
실험예 2. 탈염 퉁퉁마디 효소가수분해물의 수율 및 AChE 저해활성
실시예 2에서 제조된 탈염된 퉁퉁마디 효소가수분해물의 다양한 추출물들에 대하여 동일한 농도 (100 μg/mL)에서 AChE 저해활성을 측정한 결과와 각 추출물들의 수율을 표 2에 나타내었다.
탈염 퉁퉁마디 효소가수분해물의 수율 및 AChE 저해활성
- 열수 메탄올 에탄올 50% 메탄올 50% 에탄올 70% 메탄올 70% 에탄올
수율 (%) 32.6 19.1 17.4 28.7 29.3 21.5 21.1
AChE 저해활성 (%) 54.0 60.9 65.2 62.7 66.4 61.8 63.6
* 시료농도: 100 μg/mL
상기 표 2에서 나타난 바와 같이 탈염된 퉁퉁마디 효소가수분해물의 열수추출물과 메탄올 및 에탄올 또는 가수된 메탄올 및 에탄올 추출물들 및 가수된 알코올 추출물들은 100μg/mL의 농도에서 효소 가수분해 전의 추출물들보다 증가된 AChE 저해활성을 나타내었을 확인할 수 있었을 뿐만 아니라, 특히 수율이 현저하게 높아짐을 알 수 있었다. 이는 퉁퉁마디 내 고분자 식이섬유들이 celluase, hemicelluase, pectinase, β-glucanase 와 같은 효소의 작용을 통하여 가수분해 되면서 물과 알코올에 대한 가용성 성분이 증가되는 것으로 보였다. 특히 50% 에탄올 추출물에서 가장 높은 AChE 저해활성(67.2%)과 상당한 수율(29.3%)을 보여 탈염 퉁퉁마디 추출물 내 AChE 저해활성을 나타내는 유효성분 분리를 위한 대량 추출 조건으로 탈염 퉁퉁마디 효소가수분해물의 50% 에탄올 추출을 실시하였다.
실시예 4. 탈염 퉁퉁마디로부터 AChE 저해활성 물질의 분리 및 정제
4-1. 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE) 및 알칼로이드 분획물 (PM-AL)의 제조
실험예 1, 2의 결과를 토대로 탈염 퉁퉁마디 추출물로부터 AChE 저해활성을 나타내는 유효성분을 분리하고자 7월부터 8월에 수확된 퉁퉁마디의 잎과 줄기부분을 세척하고 동결건조한 후 냉수탈염을 통하여 수득된 500g의 퉁퉁마디 탈염분말에 3L의 증류수를 가하여 충분히 혼합한 후, celluase, hemicelluase, pectinase, β-glucanase가 포함된 복합효소 (Optivin Mash, Connell Bros Company, Australia)를 각각 0.3%(v/v) 첨가하고 50℃에서 18시간 동안 효소가수분해를 실시하였다. 생성된 효소가수분해물에 동량의 에탄올을 가하여 85±1℃에서 3시간 동안 환류냉각추출한 후 방냉하고 4℃, 10,000rpm에서 25분간 원심분리하였다. 수득된 원심분리 상등액을 45℃에서 감압건조를 통하여 에탄올을 완전히 제거하고 동결건조하여 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE)을 수득하였다. 수득된 추출물 PM-EE (100g)을 2L의 증류수에 용해시킨 후 6N의 염산을 가하여 pH를 2.0으로 조정하여 30분간 교반하고 4℃에서 12시간 정치하였다. 이 과정에서 생성되는 침전물은 원심분리 및 감압여과로 제거한 후, 6N 암모니아수를 가하여 pH를 10이상으로 조정하고 분액여두로 옮겨 동량의 클로로포름으로 분배분획을 실시하였다. 수층에 다시 동량의 클로로포름을 가하여 분액여두에서 두 번째 분배 분획을 실시한 후, 1, 2차 클로로포름 분획물 중의 클로로포름을 진공휘발농축기로 제거한후, 증류수에 현탁하고 동결건조함으로써 탈염 퉁퉁마디의 알칼로이드 분획물 (PM-AL)을 수득하였다.
4-2: 컬럼크로마토그래피 정제
실시예 4-1에서 수득된 PM-AL 획분 (8g)을 극성 실리카겔 (Silicagel 60G, Merck, Germany)이 충진된 컬럼 (3.3 × 40 ㎝)에 로딩한 후 클로로포름과 메탄올의 혼합비율을 달리한 이동상 용매를 이용하여 유속 0.3 ml/분의 속도로 용출시켜 100 ml씩 8개의 분획물들 (PM-1, PM-2, PM-3, PM-4, PM-5, PM-6, PM-7, PM-8)을 획득하였다. 그 중 AChE 저해활성이 우수한 획분(PM-S7, 187㎎)을 감압건조 후 3 ml의 메탄올에 용해하고, 저분자용 겔여과 세파덱스 (Sephadex) LH-20이 충진된 세 번째 컬럼 (2.5 × 33 cm)에 도입한 다음 100% 메탄올(유속 0.2 ml/분)을 이동상 용매로 사용하여 흘려 보내면서 50 ml씩 총 7개의 분획물(PM-7-L1, ~L2, ~L3, ~L4, ~L5, ~L6, ~L7)을 수득하였다. 최종적으로 상기 7개의 분획물 중 AChE 저해활성이 가장 우수한 PM-S7-L3 획분을 감압농축, 동결건조하여 90 mg 을 수득하였다.
4-3. 고속액체크로마토그래피(HPLC)에 의한 순수분리
실시예 4-2에서 수득된 PM-S7-L3 분획물(90㎎)을 2㎖의 HPLC 용 메탄올에 용해한 후 0.22㎛ 필터로 여과한 다음 분석 및 분취용 고속액체크로마토그라피를 이용하여 AChE 저해활성이 강한 단일물질 (S7-L3-3)을 분리하였다. 분석용 HPLC는 졸박스 이클립스 C18 분석 컬럼 (Zorbax Eclips, 5㎛, 4.5 × 250㎜, Agilent)이 장착된 모델(1260 Infinity, Agilent, USA)을 사용하였고, 고속분취 액체크로마토그라피는 일본 YMC사의 프렙용 컬럼(Triart C18, 20㎜ × 150㎜, 5㎛, YMC, Japan)이 장착한 모델(Multiple Preparative HPLC(LC-forte/R, YMC, Japan)을 사용하였다. 이동상 용매 조건은 아세토니트릴과 0.04% trifluoroacetic acid (TFA)가 함유된 3차 증류수를 이용한 그래디언트 조건에서 1㎖/분의 유속으로 흐르게 하여 분석하였으며, Agilent, 1200 DAD 검출기(detector) 또는 YMC-YUV-3400 UV 검출기를 사용하였으며, 두 파장영역 (254 및 210 nm)의 흡수도를 이용하여 화합물들을 순수분획한 결과 머무름시간 26.5 분에서 화합물 S7-L3-3 1(38.5mg)을 수득할 수 있었다. 도 1에서 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE), 알칼로이드분획물 (PM-AL), 컬럼 정제 분획물인 PM-S7과 PM-S7-L3, 및 분취용 HPLC로 최종 단리된 화합물 S7-L3-3의 분석용 HPLC 크로마토그램 프로파일들을 비교하였으며, 정제가 진행될수록 유효성분인 S7-L3-3의 머무름시간인 26.5분대의 피크의 크기가 커지고 전체 크로마토그램이 단순하여 짐을 확인할 수 있으며, 순수정제된 S7-L3-3의 구조분석으로 밝혀진 acanthoside B의 UV 스펙트럼과 화학구조를 나타내었다. 또한 도 2에서는 AChE 저해활성 유효성분의 전체 분리 정제과정을 도식도로 나타내었다.
4-4. 탈염 퉁퉁마디 추출 및 정제 분획물들의 AChE 저해 활성 확인과 IC50값
상기 실시예 4-1~4-3으로부터 AChE 저해활성 화합물 S7-L3-3의 정제 과정에서 수득된 탈염 퉁퉁마디 추출물(PM-EE), 알칼로이드 분획물(PM-AL), 및 컬럼 크로마토그래피 정제획분들 (PM-S7과 PM-S7-L3) 및 최종 단리 화합물인 S7-L3-3의 AChE 저해활성을 비교측정하였으며, 각 시료의 농도는 각각 100, 50 및 10μg/mL 농도로 3회 이상 반복 실험한 평균값으로 도 3에 나타내었다. 100μg/mL 농도에서 탈염 퉁퉁마디 추출물(PM-EE)의 AChE 저해활성은 65.2%로 최근 공개된 대한민국 특허공보 10-2016-0088622에서 개시된 발효 아로니아 추출물보다 상당히 우수한 편이었으며, 정제가 진행될수록 각 분획물의 AChE 저해활성은 점차 증가함을 확인할 수 있었다. 특히 최종 정제된 화합물 S7-L3-3의 AChE 저해활성은 10μg/mL 의 농도에 PM-EE (25.8%) 보다 현저히 증가하였음(93.2%)을 확인할 수 있었다. 또한 각 단계별 추출물 및 정제 분획물들의 AChE 저해활성을 50% 시키는 농도 즉 IC50값을 양성대조군으로서 치매 치료제로 처방되는 AChE 저해 합성 의약품인 galantamine과 천연물에서 분리된 AChE 저해성분인 berberine과 비교하였으며 (표 3), 또한 최종 정제 화합물 S7-L3-3가 하기 실시예 5의 구조분석을 통하여 acanthoside B로 획인되었으므로, 유사구조를 가진 페닐프로파노이드 글리코사이드 계통의 elutheroside E와 같이 비교측정하여 표 3에 나타내었다.
탈염 퉁퉁마디 추출물, 정제분획물들, 및 정제화합물(S7-L3-3)의 AChE 저해 IC50값 측정
시료명 IC50 (μg/mL)
PM-EE 78.9±3.90
PM-AL 20.7±1.23
PM-S7 10.5±0.8
PM-S7-L3 4.4±0.5
S7-L3-3 (acanthoside B) 2.8±0.21
Tacrine 0.036±0.01
Galantamine 3.6±0.41
Berberine 10.7±0.59
Elutheroside E 8.2±0.37
각 시료들의 AChE 저해활성 IC50값을 측정결과, 상기 표 3에서 나타난 바와 같이 탈염 퉁퉁마디 추출물(PM-EE)의 IC50값은 78.9±3.9로 나타났으며, 정제가 진행될수록 이 값은 점점 작아짐을 확인할 수 있었고, 최종 정제된 S7-L3-3(acanthoside B)의 IC50값은 2.8±0.21로 나타나, 정제에 따른 AChE 저해활성이 약 28배 증가하였음을 의미한다. S7-L3-3(acanthoside B)의 AChE 저해활성은 초기 FDA 승인 항치매 치료제로 처방되었으나 현재는 간독성 등으로 임상처방이 금지된 약물인Tacrine (IC50값: 0.038±0.01) 보다는 낮았으나, AChE 저해제로서 합성의약품인 galantamine (IC50값: 3.6±0.41) 보다 동등이상의 활성과 천연물 유래 AChE 저해 화합물인 berberine (IC50값: 5.6±0.19)보다는 약 3.8배 우수하였다. 한편, acanthoside B와 같이 페닐프로파노이드 글리코사이드 계통의 유사구조로서 acanthoside B보다 글루코스 한분자를 더 가지고 있는 elutheroside E의 IC50값은 8.2±0.37로 측정되었는데, 이는 퉁퉁마디 추출물 내 정제시료인 S7-L3-3 (acanthoside B)가 elutheroside E 보다 AChE 저해활성이 약 3배 정도 강함을 의미한다. 이와 같이 elutheroside E와 acanthoside B 화합물 간의 AChE 저해활성 크기의 차이는 페닐프로파노이드 분자내 글루코스의 치환정도가 AChE 저해활성에 중요한 요소로 작용함을 알 수 있었다. 퉁퉁마디 추출물(PM-EE, IC50: 78.9±3.90) 역시 선행 보고된 AChE 저해활성을 나타내는 쑥부쟁이추출물이 [Kor. J. Herbology 2009；24(4)：121-126]과 아로니아 발효 추출물[대한민국 공개특허 10-2016-0088622] 보다 높은 수준을 보여 acanthoside B 화합물과 퉁퉁마디 추출물(PM-EE) 모두 부작용과 독성이 없는 AChE 저해활성 천연소재로서 치매 예방과 치료 및 인지능 개선을 위한 의약품과 기능성 식품의 용도로 개발될 수 있음을 시사하였다.
실시예 5. AChE 저해활성을 나타내는 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM- EE ) 로부터 분리된 화합물 (S7-L3-3)의 구조분석
5-1. S7-L3-3의 분자량과 UV λmax 결정
실시예 4-3 에서 분리된 화합물 S7-L3-3의 분자량 결정을 위하여 1 mg 의 화합물 A를 전자포말이온화 (ESI) 질량분석기 (LC-ESI mass spectrometer, AGILENT 1100, USA Micromass Quattro II)로 포지티브 및 네거티브 스캔을 실시하고, 하이 레조루션(High resolution) MS를 측정하였다 (도 4A 및 4B). 분리된 화합물 S7-L3-3의 자외선 최대 흡수대는 시료를 메탄올에 1 mg/ml의 농도로 용해시킨 후 자외선 분광기(Genesys 10S UV-VIS spectrophotometer, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 190-400 nm 영역 내에서 측정하였다.
5-2. 핵자기공명(NMR)분석
화합물 S7-L3-3(5 ㎎)을 완전 건조하여 CDCl3 (0.5 ml)에 용해한 후 5 mm NMR 튜브에 주입하고 제올 모델 기종 (JNM-ECA 600, Jeol, Japan)으로 분석 하였으며, 1H-NMR(도 5a)은 600MHz로, 13C-NMR(도 5b)은 150 MHz로 각각 측정하였다. 그리고, HMBC-NMR (도 6a) 과 1H-1H COSY-NMR (도 6b) 측정을 통하여 화합물 S7-L3-3내 수소와 탄소의 위치와 입체구조를 결정하였다 (도 7).
상기와 같이 측정한 결과, 화합물 S7-L3-3는 퉁퉁마디에서는 현재까지 보고된 바 없는 분자량 580의 아칸토사이드 B (acanthoside B, (2S,3R,4S,5S,6R)-2-[4- [(3S,3aR,6S,6aR)-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrofuro[3,4-c]furan-6-yl]-2,6-dimethoxyphenoxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol)로 동정되었고 물리· 화학적 성질은 다음과 같다.
(1) 분자식 : C28H36O13
(2) 분자량 : 580, ESI-MS: m/z 579.0 [M-H]+, m/z 602.9 [M+Na]+ (도 4)
(3) UV λmax : 210nm, 238sh, 272nm
(4) 성상 : 흰색 분말 (white powder)
(5) 용해성 : 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름, 피리딘에 용해
(6) 1H 및 13C-NMR : 1H-NMR (CDCl3, 600 MHz): d 6.47 (2H, s, H-2 and H-6), 4.62 (1H, d, J 4.6 Hz, H-7), 3.00 (1H, m, H-8), 3.81 (1 H, m, H-9a), 4.19 (1H, m, H-9b), 6.51 (2H, 1H, H-2' and H-6'), 4.65 (1H, H-7'), 4.50 (1H. H-1"), 3.49 (1H, H-2"), 3.37 (1H, H-3"), 3.41 (1H, H-4"), 3.16 (1H. H-5"), 3.71 (1H, H-6"a), 3.64 (1H, H-6"b), 3.77 (6H, s, 2-OCH3), 3.78 (6H, s, 2-OCH3) (도 5A); 13C-NMR (CDCl3, 150 MHz): d131.2 (C-1), 102.3 (C-2), 147.3 (C-3), 134.4 (C-4), 147.3 (C-5), 102.7 (C-6), 86.0 (C-7), 53.9 (C-8), 71.6 (C-9), 56.1 (2 X-OCH3), 56.2 (2 Y-OCH3), 138.2 (C-1'), 102.9 (C-2'), 152.6 (C-3'), 134.4 (C-4'), 152.6 (C-5'), 102.9 (C-6'), 85.6 (C-7'), 54.2 (C-8'), 71.7 (C-9'), 105.4 (C-1"), 73.9 (C-2"), 75.9 (C-3"), 69.5 (C-4"), 76.2 (C-5"), 61.5 (C-6") (도 5B)
(7) 화학구조식
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실시예 6. 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE)의 뇌신경교세포 보호 효과
실험예 1. PM-EE의 뇌신경염증 인자 단백질 발현 억제효과 확인
LPS로 자극된 뇌신경교세포인 BV2 microglia에서 뇌신경염증 유도 물질인 LPS(200ng/ml) 및 시험시료인 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE, 0-100μg/mL)이 뇌신경교세포에 미치는 영향을 확인하고자, MTT assay를 통하여 세포독성검사를 수행한 결과, LPS 및 PM-EE 단독으로 또는 같이 처리한 모든 시험물질의 농도군에서 대조군에 비하여 세포 생존율이 유의적으로 변하지 않음을 확인하였다. 따라서, 세포독성이 없는 농도내에서 PM-EE (20, 50, 100μg/mL)의 뇌신경염증 억제효능을 분석하기 위하여 뇌신경염증 유발 인자인 LPS(200ng/㎖)로 자극된 mouse BV2 microglia세포에서 생산되는 아질산염(NO)이 PM-EE처리에 의하여 저해되는지, Griess 시약을 이용한 NO assay를 통하여 세포내 LPS-유도 아질산염(NO) 함량을 측정하였다. 도 8a의 결과에서, LPS-유도로 증폭된 세포내 아질산염(NO) 함량은 대조군보다 약 9배로 증가하였으나, PM-EE를 농도별 (20, 50, 100μg/mL)로 처리를 한 결과 아질산염(NO)의 양이 농도의존적으로 현저히 감소함을 확인할 수 있었다 (도 8a). 또한 LPS로 유도되는 아질산염(NO)의 합성 유도 효소인 iNOS(inducible nitric oxide synthetase) 단백질과 뇌신경세포내 염증 인자로 알려진 COX-2(cyclooxygenase type 2) 단백질의 발현을 SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용한 웨스틴 블랏팅으로 확인한 결과 PM-EE가 단백질 단계에서의 iNOS 및 COX-2의 발현을 농도의존적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다(도 8b).
실험예 2. PM-EE의 뇌신경염증 유전자 발현 억제효과 확인
뇌신경교세포인 BV2 microglia에서 LPS 및 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE)을, 농도별(0-100μg/mL)로 처리하고 1시간 뒤 LPS로 세포를 자극하였으며, 3시간 뒤 RNA extraction buffer로 RNA 시료를 분리하였다. 이후, RNA정제과정을 거쳐, RNA를 주형으로 하는 cDNA를 합성하고 PCR로 증폭하는 즉 RT-PCR를 이용하여 분석하였다. 아래 표4 에는 본 실험의 RT-PCR에 사용된 primer들을 나타내었으며, BV2 microglia세포에서 분리한 RNA에 표 4의 primer들을 이용하여 95℃ 30분 변성, 95℃ 5초 및 60℃ 20초 조건으로 45회 연속 반응 후 0.2℃/15초 조건으로 95℃까지 가온 후 반응을 종결하였으며, 마지막으로, agarose gel electrophoresis를 통하여 bp 크기별로 분리를 하고, UV light에서 band를 확인, 카메라로 형광을 이미지화하였다. 도 9의 결과에서 와 같이 LPS를 처리하지 않은 대조군에서는 뇌세포 염증관련 유전자들 (IL-1β, iNOS, COX-2, TNF-α) 발현이 없거나 미미하였으나, LPS를 처리한 실험군에서는 이들 유전자들의 mRNA 발현량이 현저히 증가함을 확인할 수 있으며, 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE)의 처리시 농도 의존적으로 감소하는 발현변화 양상을 확인 할 수 있었다. 특히 고농도(100μg/mL에서는 LPS 유도에 의하여 증폭된 뇌세포 염증관련 유전자들 (IL-1β, iNOS, COX-2, TNF-α)유전자들이 LPS 유도전인 대조군과 거의 같은 수준으로 회복됨을 확인함으로써 탈염 퉁퉁마디 추출물 (PM-EE)이 뇌신경교세포인 BV2 microglia에서 뇌신경염증을 염증인자 단백질 발현뿐만 아니라 mRNA 유전자 단계에서부터 강력히 억제할 수 있음을 시사하는 것이다. 이는 PM-EE가 뇌신경염증을 억제하여 뇌손상을 예방함으로써 뇌인지기능을 개선시킬 수 있음을 확인한 결과라고 하겠다.
RT-PCR에 사용한 프라이머 서열
Gene Sequence (5'->3')
iNOS Forward TGAAGAAAACCCCTTGTGCT
iNOS Reverse TTCTGTGCTGTCCCAGTGAG
COX2 Forward CAAGACAGATCATAAGCGAGGA
COX2 Reverse GGCGCAGTTTATGTTGTCTGT
TNF-α Forward CCACCACGCTCTTCTGTCTAC
TNF-α Reverse AGGGTCTGGGCCATAGAACT
IL-1 β Forward TGTGAAATGCCACCTTTTGA
IL-1 β Reverse GGTCAAAGGTTTGGAAGCAG
IL-6 Forward TGATGCACTTGCAGAAAACA
IL-6 Reverse ACCAGAGGAAATTTTCAATAGGC
GAPDH Forward AAGGGCTCATGACCACAGTC
GAPDH Reverse TTCAGCTCTGGGATGACCTT
실시예 7. PM-EE로부터 분리한 유효성분 acanthoside B의 뇌신경교세포 보호 효과
실험예 1. Acanthoside B의 뇌신경염증 인자 단백질 발현 억제효과 확인
LPS로 자극된 뇌신경교세포인 BV2 microglia에서 뇌신경염증 유도물질인 LPS(200ng/ml) 및 PM-EE의 유효성분인 acanthoside B가 뇌신경교세포에 미치는 영향을 확인하고자 실험 농도별 (1, 5, 10μg/mL)로 세포에 처리하고, MTT assay를 통한 세포독성검사를 수행한 결과 (도 10a), LPS 및 acanthoside B 단독으로 또는 같이 처리한 모든 시험물질의 농도군에서 대조군에 비하여 세포 생존율이 유의적으로 변하지 않음을 확인하였다. 따라서, 세포독성이 없는 농도내(1, 5, 10μg/mL)에서 acanthoside B의 뇌신경염증 억제효능을 분석하기 위하여 뇌신경염증 유발 인자인 LPS(200ng/㎖)로 자극된 mouse BV2 microglia세포에서 생산되는 아질산염(NO)이 acanthoside B처리에 의하여 저해되는지, Griess 시약을 이용한 NO assay를 통하여 세포내 LPS-유도 아질산염(NO) 함량을 측정하였다. 도 10b의 결과에서, LPS-유도로 증폭된 세포내 아질산염(NO)이 acanthoside B 처리농도에 의존적으로 현저히 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 LPS로 유도되는 아질산염(NO)의 합성 유도 효소인 iNOS와 뇌신경세포내 염증인자인 COX-2의 단백질의 발현을 현저히 감소시킴을 웨스틴 블랏팅을 통하여 확인함으로써 (도 10c) acanthoside B는 PM-EE의 뇌신경세포 염증억제 유효성분으로서 PM-EE보다 현저히 낮은 농도에서도 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현을 저해하는 것으로 확인되었다.
실험예 2. Acanthoside B의 뇌신경염증인자 유전자 발현 억제효과 확인
Acanthoside B가 뇌신경염증인자의 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하고자 뇌신경교세포인 BV2 microglia에서 LPS 및 acanthoside B를, 농도별(1, 5, 10μg/mL)로 처리하고 1시간 뒤 LPS로 세포를 자극하였으며, 3시간 뒤 RNA extraction buffer로 RNA 시료를 분리하여 cDNA를 합성하고, 상기 표4의 프라이머들을 사용하여 실시예 6과 동일한 방법으로 RT-PCR을 실시하였다. 도 11의 결과에서 와 같이 LPS를 처리하지 않은 대조군에서는 뇌세포 염증관련 유전자들 (IL-1β, iNOS, COX-2, TNF-α)유전자들의 발현이 없거나 미미하나, LPS를 처리한 실험군에서는 이들 유전자들의 mRNA 발현량이 현저히 증가함을 확인할 수 있으며, acanthoside B의 처리시 농도 의존적으로 감소하는 발현변화 양상을 확인 할 수 있었다. 특히 고농도(10μg/mL에서는 LPS 유도에 의하여 증폭된 뇌세포 염증관련 유전자들 (IL-1β, iNOS, COX-2, TNF-α)유전자들이 LPS 유도전인 대조군과 거의 같은 수준으로 회복됨을 확인함으로써 PM-EE에서 AChE 저해 유효성분으로 분리된 acanthoside B가 뇌신경염증을 염증인자 단백질 발현뿐만 아니라 mRNA 유전자 단계에 까지 작용함으로써 뇌신경염증을 억제하여 뇌 손상을 예방함으로써 뇌인지기능을 개선시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 인지기능 손상 동물모델에서 탈염 퉁퉁마디 추출물(PM- EE ) 및 그 유효성분(acanthoside B)의 기억력 및 인지능력 개선 효과 확인
실험예 1. in vivo 인지기능 손상모델에서 PM- EE 및 acanthoside B의 인지능 및 기억력 개선 효능 분석
상기 실시예 4-1에서 수득된 퉁퉁마디 추출물(PM-EE)과 PM-EE로부터 실시예 4-2 및 4-3에서 분리한 AChE 저해 및 신경세포염증 억제 물질인 acanthoside B의 인지능 및 기억력 개선 효능을 확인하고자 Scopolamine을 이용한 건망증 동물모델에서 수동 회피 (Passive avoidance) 실험을 통한 학습 능력 효과 측정하고자 하였다. 마우스에 조명을 비춘 밝은 쪽 구획에 놓고 20초의 탐색시간 후 길로틴문(guillotine door)이 열려 어두운 구획으로 들어갈 수 있게 하였다. 이때 길로틴문이 열린 후 60초 이내에 어두운 쪽으로 들어가지 않는 마우스는 실험에서 제외시켰다. 길로틴문이 열린 후 마우스가 어두운 쪽으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였다. 일단 마우스가 어두운 쪽으로 들어가면 길로틴문이 닫히고 0.25 mA의 전기 충격이 3초 동안 격자 바닥을 통해 흐르게 되고 마우스는 이러한 전기 작용을 기억하게 된다. 학습 시험이 끝나고 24시간 후에 본 실험을 시행하였다. 실험은 각 그룹당 10마리의 SD 랫트 (240-260g)에 PM-EE와 acanthoside B를 농도별로 처리하고, 시험시료의 마지막 투여 30분 후에 증류수에 녹인 스코폴라민(Sigma-Aldrich, Co. USA)을 1 mg/kg의 용량으로 복강 투여하고, 스코폴라민 투여 30분 후 마우스가 10초의 탐색시간 후 길로틴문이 열리고 어두운 쪽으로 네 발이 다 들어가는데 걸리는 시간(Transfer Latency Time, TLT: 머무름 시간)을 150초까지 측정하였다. 이 때 걸리는 시간이 길수록 수동회피의 인지능과 기억이 좋음을 나타낸다. 또한, 탈염 퉁퉁마디 추출시료인 PM-EE와 acanthoside B와 별도로 양성대조군으로 치매치료제인 갈란타민(galantamine, Sigma-Aldrich, Co. USA) 10mg/kg을 투여하였다. TLT (Transfer latency time)을 컴퓨터를 통해 기록한 결과, 모든 실험에서 스코폴라민 (scopolamine)만을 투여한 그룹의 머무름시간이 유의성있게 감소한 것으로 보아 기억력 및 인지능 감퇴 모델이 제작되었음을 확인하였고, 인지능 및 기억력이 손상된 마우스 모델에서 PM-EE(도 12a)와 acanthoside B(도 12b).의 처리로 손상된 인지능이 개선되어 TLT가 유의성있게 길어지는 것을 확인할 수 있었으며, 이 효과는 모두 농도의존적임을 볼 수 있으며, 특히 고농도의 PM-EE와 acanthoside B 투여시에는 치매치료제인 galantamine 보다 우수한 인지능력 및 기억력 개선효과를 나타내었다 (도 12a-12b).
실험예 2. Y 미로실험 (Y-maize test)에 의한 인지능 및 기억력 개선 효능 분석
상기 실시예 4-1에서 수득된 퉁퉁마디 추출물(PM-EE)과 PM-EE로부터 실시예 4-2 및 4-3에서 분리한 AChE 저해 및 신경세포염증 억제 물질인 acanthoside B의 인지능 및 기억력 개선 효능을 확인하고자 Scopolamine을 이용한 건망증 동물 모델에서 Y 미로실험 (Y-maize test)을 수행하였다. 본 실험은 PM-EE와 acanthoside B을 10% tween 80에 녹인 후 농도별 (PM-EE: acanthoside B)로 경구투여하였다. 또한, 양성대조군으로 치매치료제인 갈란타민(galantamine, Sigma-Aldrich, Co. USA) 10mg/kg을 투여하였다. Y-미로실험은 검정색의 폴리비닐 플라스틱으로 만든 3개의 가지 (A, B, C)로 구성되어 있으며, 각가지(arm)의 길이는 50cm, 넓이는 10cm, 높이는 20cm이고 세 팔이 접히는 각도가 120도인 실험장치에 실험동물을 조심스럽게 놓고 8분동안 자유롭게 움직이게 한 다음 들어가 가지를 기록하였다. 세 개의 다른 가지에 차례로 들어간 경우 1점 (실제 변경, actual altenation)씩 부여하고, 변경 행동력(alternation behavior)은 하기 계산식에 의해 계산하였다.
변경행동력(alternation behavior) = 실제변경(actual alternation)/최고변경(maximum alternation) X 100 (최고변경: 총 입장횟수 - 2)
실험결과, 정상동물 즉 대조군의 행동력이 67점이었으나, 스코폴라민의 투여로 45.5점으로 감소되어 인지능 및 기억력이 감퇴되었음을 볼 수 있었으며, PM-EE와 acanthoside B의 투여로 농도의존적으로 변경행동력 즉 공간인지능이 다시 획복됨을 확인할 수 있었다. 따라서 본 실험에 사용된 농도범위내에서 PM-EE(도 13a)와 acanthoside B(도 13b)는 치매치료제인 galantamine 보다 우수한 인지능 및 기억력 개선효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 9. 단회투여독성시험
마우스를 사용하여 탈염 퉁퉁마디 추출물(PM-EE)의 단회투여독성시험을 실시하였다. 단회 투여독성 시험결과, PM-EE는 ICH에서 정하고 있는 투여가능 용량인 2g/kg에서 2주간 투여하였을 때, 사망예를 전혀 관찰 할 수 없었으며, 체중증가, 사료 섭취량 등에서 전혀 유의한 이상을 발견할 수 없었다. 따라서, 본 발명의 acanthoside B를 함유하는 탈염 퉁퉁마디 추출물(PM-EE)은 안전한 치매예방 및 치료용 약물과 건강기능성 식품 원료 및 사료로 개발 될 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물을 유효성분으로 포함하는 치매 예방, 치료 또는 인지능 개선용 약제학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112017045828010-pat00004

  2. 제1항에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머형 치매증, 뇌혈관성 치매증, 뇌신경염증성 치매, 루이소체치매(Dementia with Lewy Bodies, DLB), 다발성 경색치매(Multi-Infarct Dementia, MID), 전두측두엽변성증(frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 픽병(Pick's disease), 피질기조퇴행 (Corticobasal degeneration, CBD), 퇴행성 핵상마비 (progressive supranuclear palsy, PSP), 파킨슨병 또는 헌팅턴병인 것인, 약제학적 조성물.
  3. 하기 화학식 1로 표시되는 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물을 포함하는 인지능 및 기억력 개선용 기능성식품 또는 사료용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112017045828010-pat00005

  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 다음 단계를 포함하는 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물의 분리방법:
    (a) 퉁퉁마디(Salicornia spp .)로부터 (i) 극성 용매 추출물 또는 (ii) 효소가수분해 추출물을 수득하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 산성 용액을 첨가하여 교반 및 정치한 후 침전물을 제거하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 결과물에 염기성 용액을 첨가한 후, 비극성 유기용매를 첨가하여 알칼로이드 분획물을 수득하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)의 알칼로이드 분획물을 정제하여 단일물질인 아칸토사이드 B (acanthoside B) 화합물을 수득하는 단계.
  9. 제 8 항 있어서, 상기 단계 (c)의 비극성 유기용매는 클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 디클비로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 또는 THF인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항 있어서, 상기 단계 (d)는 상기 단계 (c)의 알칼로이드 분획물을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
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