KR20060029714A

KR20060029714A - 포도나무 수피 추출물을 함유하는 아세틸콜린에스터라제저해제

Info

Publication number: KR20060029714A
Application number: KR1020040069762A
Authority: KR
Inventors: 조태형; 우성식; 김동선; 도선길; 성선영; 류종하; 오미선
Original assignee: 주식회사 유니젠
Priority date: 2004-09-02
Filing date: 2004-09-02
Publication date: 2006-04-07
Also published as: WO2006025708A3; WO2006025708A2

Abstract

본 발명은 포도나무 (Vitis vinifera) 수피 추출물 중 폴리페놀성분인 비티신 A (vitisin A)와 감마비니페린(γ-viniferin)을 유효성분으로 함유하는 아세틸콜린에스테라제 저해제에 관한 것이다. 본 발명에 따르는 포도나무 수피의 추출물 및 이로부터 추출, 정제한 유효성분인 비티신 A (vitisin A)와 감마비니페린(γ-viniferin)은 아세틸콜린에스테라제의 작용을 저해함으로써 인체 뇌 내의 신경전달물질인 아세틸콜린의 분해를 억제하므로 노인성 치매의 예방 및 치료를 위한 약학조성물, 의약품 및 건강기능식품으로서 사용될 수 있다.

포도나무, gamma-viniferin, vitisin A, 아세틸콜린에스테라제 저해, 치매, 인지능

Description

포도나무 수피 추출물을 함유하는 아세틸콜린에스터라제 저해제 {Acetylcholinesterase inhibitor contains extract of stem bark of Vitis vinifera}

본 발명은 포도나무(Vitis vinifera)로부터 일정조건 하에서 추출 및 정제하여 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 활성저해 및 감퇴된 기억력 증진에 유용한 효과가 있는 유효성분을 효율적으로 추출·정제하는 방법과 이러한 포도나무 추출물을 함유한 치매치료용 조성물에 관한 것이다.

우리나라는 물론 전세계적으로 노인인구가 증가하게 되면서 노인인구에 많은 각종 퇴행성 노인질환들이 사회적, 경제적인 손실을 야기시키고 있다. 특히 치매질환은 심각한 사회적, 경제적 문제로 대두되고 있으므로 치료되어야 할 심각한 난치성 질환이다.

치매질환은 다양한 원인으로 발병할 수 있으나, 주 발병원인으로 알츠하이머병(65%)이 알려져 있다. 이 질환의 특징으로는 아밀로이드 베타 단백질이 주성분인 노인반이 뇌세포 밖에 침착되어 있다는 것과, 학습과 기억력이 현저하게 감퇴되는 증상을 보이게 된다는 것이다.

최근에 치매질환의 원인을 밝히기 위하여 분자유전학적인 연구는 물론이고 여러 가지 다양한 분야에서 노력을 하고 있으나, 이 질환의 원인이 정확하게 밝혀지지 않아서 치료제 개발에도 상당히 어려움이 많은 상태이지만 일차적으로 나타나는 주 증상인 기억력 감퇴 증상을 억제하려는 노력이 최근까지 활발하게 진행되고 있다. 1970년대 후반에는 치매질환이 콜린성 신경계의 기능저하와 인지기능의 손상과 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀졌으며 알츠하이머씨병 치료 방법의 일환으로, 뇌에서의 아세틸콜린 농도를 높게 유지시키면 환자의 기억력이 크게 회복된다는 연구 결과가 발표되었다. 아세틸콜린에스터라제(AChE)는 체내 부교감 신경의 활성을 매개하는 신경 전달 물질들중의 하나인 아세틸콜린(acetylcholine)을 콜린과 아세테이트로 가수분해하는 효소로서, 소포체막에서 형성되어 세포막으로 이동하여 그 기능을 수행하며, 콜린 신경과 그 주위, 특히 근신경 접합부에 가장 많이 분포되어 있고, 혈장, 간 및 다른 조직에서도 발견되고 있는 중요한 효소이다. 뇌에서 아세틸콜린의 분해효소인 아세틸콜린에스터라제(AchE)의 활성을 억제하여 아세틸콜린의 농도를 유지하여 인지기능을 증진시킬 수 있는 치료제 개발을 위한 노력의 결과로 4가지 치료제, 타크린(tacrine), 도네피질(donepezil), 리바스티그민(rivastigmine), 갈란타민(galantamine)이 개발되어 치매치료제로 사용되고 있다.

항콜린에스터라제 이외에 아세틸콜린 합성증가제 및 수용체 효현제 등이 연구되고 있으나 효능면에서 미미한 상태이다. 1998년에 아밀로이드 베타 단백질의 침착을 막아서 이 단백질의 독성작용으로 인한 뇌세포 손상을 억제할 수 있는 치료제의 개발 가능성을 보여주는 결과가 보고된 바 있었으나 아직까지 주목할 만한 후속 결과 들이 없는 상태이다.

비록 원인적인 치료방법은 아니더라도 전술한 바와 같이 기억력과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려진 감퇴된 콜린성 신경계를 보충해주고 개선해 주어 저하된 인지기능을 개선해 줄 수 있는 약물의 개발이 계속되고 있다. 국내외에서 현재 사용되고 있는 치매치료제들은 증상개선을 위한 항콜린약물, 대사를 비특이적으로 항진시키는 대사항진약물, 혈액순환을 좋게 해주는 뇌기능개선제 또는 치매예방 및 치료제 등이 있으나 이들 약물들의 효과는 일시적이고 미약하다. 또한, 이러한 약물들을 사용한다고 해서 노인성 치매환자의 뇌병변이 개선되었다는 보고는 없다. 이들 약물은 부교감신경자극을 통해 오심, 구토, 기관지수축 등의 부작용을 나타내고, 우울증, 불면증, 고혈압, 변비 등을 야기하기도 한다. 따라서, 부작용이 적으며, 효능이 좋고, 원인적치료(뇌병변의 개선)까지 가능한 새로운 치매치료제의도출이 필요하다.

본 발명은 포도나무 (Vitis vinifera) 수피 추출물 또는 이로부터 분리된 비티신 A (vitisin A)와 감마비니페린(γ-viniferin)을 유효성분으로 함유하는 노인성 치매의 예방 및 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명은 아세틸콜린에스터라제 저해 효과가 있는 포도나무(Vitis vinifera) 수피 추출물의 제조와 유효성분의 분리, 정제방법을 특징으로 한다.

아세틸콜린에스터라제의 저해 효과 측정은 합성기질인 아세틸티오콜린이 아세틸 콜린에스터라제에 의해 분해되었을 때 생성되는 티오콜린과 5,5'-디티오-비스(2-니트로벤조산)의 반응 결과 생성되는 황색형광을 측정하여 아세틸콜린에스터라제의 활성을 평가하는 Ellman의 방법을 응용하였다.

본 발명에서 원료물질로 사용되는 포도나무는 학명으로는 Vitis vinifera이며 전 세계 과일 생산량의 1/3을 차지하고 과일 가운데 생산량 1위인 중요 작물로 그 뿌리와 수피는 각각 포도근, 포도등이라는 약재명으로 구토의 억제에 효험이 있음이 전통 의약서인 동의수세보원(東醫壽世保元)에 밝혀져 있다.

구조식 1. gamma-viniferin 구조식 2. vitisin A

본 발명의 상기 구조식 (I)의 비티신 A 및 감마비니페린 화합물들은 당업계에서 잘 알려져 있는 공지의 합성 방법 또는 포도나무(Vitis vinifera), 새머루(Vitis flexuosa), 왕머루(Vitis amurensis), 머루(Vitis coignetiae ), 까마귀머루(Vitis thunbergii), 사막포도(Vitis riparia), 산머루(Vitis kaempferi) 등의 Vitis 속 으로부터 분리될 수 있으며, 바람직하게는 포도나무( Vitis vinifera), 새머루( Vitis vinifera)로부터 분리될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기의 비티신 A 화합물 및 감마비니페린 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 비티신 A 화합물 및 감마비니페린 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 비티신 A, 감마비니페린 화합물 및 이들 화합물들을 포도나무 추출물 또는 포도나무추출물로부터 분리된은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 포도나무 또는 뿌리, 바람직하게는 수피를 적절히 세절하고 세척하여 건조하여 건조중량의 약 2 내지 100배, 바람직하게는 약 10 내지 30배 부피의 물, 메탄올, 에탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10, 더욱 바람직하게는 1:0.2 내지 1:3의 혼합비를 갖는 혼합용매 또는 물, 50%, 70%, 95%의 에탄올에서 20 내지 100?, 바람직하게는 50 내지 70?의 추출 온도에서 약 0.5시간 내지 2일, 바람직하게는 1시간 내지 1일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바 람직하게는 2회 내지 3회 반복하여 수득한 후, 감압여과하고 여과한 추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100?, 바람직하게는 50 내지 70?에서 감압농축한 다음, 추출된 잔사를 진공동결건조기로 건조하여 물, 에탄올, 메탄올과 같은 저급알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 포도나무 조추출물을 얻을 수 있다.

상기의 포도나무 조추출물은 물에 현탁한 후, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트 및 부탄올등의 비극성용매를 이용하여 본 발명의 포도나무의 각 용매별 분획물을 수득할 수 있는데, 바람직하게는 포도나무 조추출물에 동량의 에틸아세테이드와 물의 혼합용매를 사용하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.

더욱 구체적으로는 상기 공정으로 수득된 포도나무 비극성 가용 추출물, 바람직하게는 에틸아세테이트 가용성 분획물을 디클로로메탄:메탄올 혼합용매(100:1 ~ 5:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피(Silica gel column chromatography)를 수행하여 5내지 8개의 분획으로 분리한 후, 하부 분획 4으로부터Preparative HPLC를 사용하여 본 발명의 비티신 A또는 감마비니페린을 수득할 수 있다.

본 발명의 비티신 A화합물 및 감마-비니페린 화합물은 통상의 치환기들의 합성 및 분획 방법을 통하여도 합성할 수 있다(Herbert O. House: Modern Synthetic Reactions, 2 nd Ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., 1972).

본 발명은 발명의 비티신 A화합물 및 감마-비니페린 화합물 화합물을 함유하는 포도나무 추출물, 바람직하게는 에탄올 추출물, 더욱 바람직하게는 에틸아세테이트 가용성 분획물을 유효성분으로 함유하는 치매예방 및 치매치료용 약학조성물을 제 공한다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 포도나무 추출물 또는 이로부터 분리된 비티신 A 화합물 및 감마비니페린 화합물의 뇌기능보호 및 뇌기능 개선 또는 노인성치매 질환의 예방 및 치료제로서의 효능을 알아보기 위하여, 뇌내의 신경전달물질인 아세틸콜린을 감소시키는 효소인 아세틸콜린에스테라제에 포도나무 추출물, 바람직하게는 비극성 용매 추출물, 더욱 바람직하게는 비티신 A 화합물 및 감마비니페린 화합물을 처리하여 이들이 아세틸콜린에스테라제에 활성을 강하게 억제함을 확인하였다.

본 발명의 뇌기능보호 및 뇌기능 개선 또는 노인성치매 질환의 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물 또는 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 또는 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물들의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물 또는 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 뇌기능보호 및 뇌기능 개선 또는 노인성치매 질환의 예방 및 치료 효과를 나타내는 상기 추출물 또는 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 추출물 또는 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 뇌기능보호 및 뇌기능 개선 또는 노인성치매 질환의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 또는 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료 와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 또는 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 또는 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1.

아세틸콜린에스터라제 저해 활성의 측정

96 micro well plate에 식물시료 실험구와 각각 2개의 positive control, blank 실험구를 두고 bioassay를 실시하였음. 각 well별로 식물 시료 실험구의 경우 식물 시료 추출물 50㎎/㎖ DMSO solution을 0.1M phosphate buffer로 10배 희석하여 10㎕, positive control구의 경우 Tacrine DMSO 용액(2㎎/㎖)을 0.1M phosphate buff로 10배 희석하여 10㎕, blank구의 경우 10% DMOS를 포함한 0.1M phosphate buffer 10㎕를 가한 후 5㎕ DTNB phosphate buffer solution(50mM), 2.5㎕ 아세틸콜린에스터라제 0.1M phosphate buffer solution(50unit/㎖, electric eel 유래), 132.5㎕ phosphate buffer를 가하여 혼합한 후 25℃에서 5분간 incubation 시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정함. 흡광도 측정 후 50㎕Acetylthiocholine iodide distilled water solution(0.01mM) 용액을 각 실험구에 가하고 25℃에서 3분간 incubation 시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정함. 측정된 흡광도는 아래 식을 통해 blank 실험구와 positive control 실험구에 대비한 저해 정도를 계산하였음

저해율 (%) = 100 - A/(CTRL- BLNK ) X 100

A : 식물 시료 실험구 AchI 반응전 흡광도 - AchI 반응후 흡광도

CTRL : positive control Tacrine AchI 반응전 흡광도 - AchI 반응후 흡광도

BLNK : 0.1% DMSO AchI 반응전 흡광도 - AchI 반응후 흡광도

* CTRL과 BLNK 실험구는 각각 2개 반복구의 평균값을 계산에 적용하였음

실시예 2.

포도나무중의 아세틸콜린에스터라제저해 활성성분 정제

포도나무중의 활성물질 규명을 위해 포도나무 수피 (800g)에 건조중량의 25배에 해당하는 70% 주정 수용액을 가하여 80˚C로 가열추출한 후 여과, 농축, 동결건조의 방법으로 얻은 건조분말(48g)로 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 노르말 부탄올, 증류수 등의 용매를 이용한 분획화를 실시하였다. 아세틸콜린에스터라제에 대하여 가장 큰 저해활성이 관찰된 에틸아세테이트 분획(33.6g)을 순상 실리카겔 컬럼에 걸고 디클로로메탄과 메탄올, 초산의 혼합용매로 메탄올의 비율을 증가시켜 가면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 활성물질을 추적하였다. 각 용출액에 대해 효소저해 비활성을 측정한 후 억제활성이 제일 강한 분획에 대하여 ODS 컬럼(9.4×250㎜)이 장착된 prep HPLC에서 30% 아세토니트릴을 사용하여 활성물질의 정제를 실시한 다음 활성분획을 농축시켜 2종의 활성물질을 분리하였다.

실시예 3.

Vitisin A의 구조 규명

실시예 2에서 분리하여 수득된 화합물은 ¹H-NMR 또는 ¹³C-NMR 그리고 MS 등의 측정치를 문헌치와 비교하여 오히즈미 등[Journal of Organic Chemistry, 58, 850-853, 1993]에 의해 Vitis coignetiae에서 분리, 보고된 바 있는 vitisin A인 것으로 밝혀졌다. 이 화합물의 물리화학적 특성 및 기기분석 데이타는 다음과 같다.

TLC : 15% 메탄올 수용액, 순상 실리카겔에서 Rf 치 0.5

10% 황산용액과 반응시킨 후 가열하면 암갈색으로 발색

② 질량스펙트럼 m/z : 907 [MH+]

¹H 자기공명스펙트럼(600㎒, acetone-D₆) : 7.06(2H, d, J=8.5), 6.68(2H, d, J=8.5), 5.41(1H, d, J=3.0), 5.50(1H, d, J=3.0), 6.11(1H, d, J=2.0), 7.22(2H, d, J=8.5), 6.86(2H, d, J=8.5), 5.91(1H, d, J=10.5), 4.26(1H, d, J=10.5), 6.41(1H, brs), 7.17(2H, d, J=8.5), 6.80(2H, d, J=8.5), 6.19(2H, d, J=8.5)

¹³C 자기공명스펙트럼(600㎒, acetone-D₆) : 135.7(C-1), 129.2(C-2,6), 115.8(C-3,5), 41.0(C-7), 120.5(C-10), 159.1(C-13), 128.3(C-2',6'), 116.5(C-3',5'), 142.6(C-9'), 156.2(C-13'), 129.2(C-1"), 115.8(C-5"), 131.4(C-7"), 123.0(C-8"), 101.3(C-12"), 130.4(C-2"',6"'), 116.4(C-3"', 5"'), 107.2(C-10"', 14"'), 160.6(C-11"', 13"')

실시예 4.

Gamma-viniferin의 구조 규명

실시예 2에서 분리하여 수득된 화합물은 ¹H-NMR 또는 ¹³C-NMR 그리고 MS 등의 측정 치를 문헌치와 비교하여 Mattivi 등[Bulletin de Liaison Groupe Polyphenols, 16, 116-119, 1992]에 의해 Vitis속 식물에서 분리, 보고된 바 있는 gamma-viniferin인 것으로 밝혀졌다. 이 화합물의 물리화학적 특성 및 기기분석 데이타는 다음과 같다.

TLC : 20% 메탄올 수용액, 순상 실리카겔에서 Rf 치 0.5

10% 황산용액과 반응시킨 후 가열하면 암갈색으로 발색

② 질량스펙트럼 m/z : 907 [MH+]

¹H 자기공명스펙트럼(600㎒, acetone-D₆) : 4.35(1H, d, J=5.1), 5.58(1H, d, J=5.1), 4.48(1H, d, J=5.4), 5.45(1H, d, J=5.4), 4.55(1H, d, J=4.7), 5.44(1H, d, J=4.7), 6.85(2H, d, J=8.7), 7.22(2H, d, J=8.7), 6.94(2H, d, J=8.7), 7.28(2H, d, J=8.7), 6.61(2H, d, J=8.7), 6.69(2H, d, J=8.7), 6.24(3H, brs), 6.14(2H, d, J=2.2), 6.24(1H, brs), 6.36(1H, d, J=2.1), 6.68(1H, d, J=2.1), 6.23(1H, d, J=2.1), 6.78(1H, d, J=8.4), 6.85(1H, d, J=1.9), 7.17(1H, dd, J=8.4, 1.9), 6.66(1H, d, J=16.3), 6.79(1H, d, J=16.3)

¹³C 자기공명스펙트럼(600㎒, acetone-D₆) : 134.0(C-1), 127.8(C-2,6), 116.1(C-3,5), 93.8(C-7), 107.0(C-10,14), 159.7(C-11,13), 125.5(C-2'), 110.5(C-5'), 126.5(C-6'), 123.9(C-7'), 130.2(C-8'), 159.4(C-13'), 132.5(C-1'), 115.9(C-3',5'), 93.9(C-7"'), 52.0(C-8'), 96.5(C-12'), 127.8(C-2"',6"'), 116.3(C- 3"',5"'), 106.9(C-10"',14"'), 158.9(C-11"',13"')

실시예 5

포도나무 추출물 및 vitisin A, gamma-viniferin의 아세틸콜린에스터라제 저해 활성은 아래 표1과 같다

검 체	IC₅₀ (㎍/㎖)
포도나무 추출물	80
vitisin A	95
gamma-viniferin	96

실시예 5.

대나무의 종 및 부위별 r-viniferin 및 vitisin 함량분석

경조정, 뉴나이, 이탈리아, 적령, 리자마트, 매니큐어핑거, 레드네헤스콜, 루비시드레스, 블랙올림피아, 마리오, 하니쥬스, 메스켓베일리A의 각 줄기수피 및 잔가지 추출물 10g에 대하여 부위별 gamma-viniferin과 vitisin A의 함량을 분석하였다. 기기는 Hitachi 社의 L-7000 series를, 정지상은 Zorbax XDB-C18, (4.6X150mm)를 사용하였고 이동상은 B 용액은 100% ACN, C 용액은 ACN: Water=1:9 , D 용액은 ACN: Water=9:1을 사용하였으며 조건은 아래 표2와 같다

Time(min)	B	C	D
0	0	100	0
5	0	75	25
30	0	75	25
40	100	0	0
50	100	0	0
55	0	100	0

정지상의 온도는 40?, 검출기의 파장은 UV 205nm로 하였으며 시료는 2000ppm으로 10ul를 주입하였으며 분석 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

대나무종	줄기수피		잔가지
대나무종	r-viniferin 함량% /추출효율%	Vitisin A 함량% /추출효율%	r-viniferin 함량% /추출효율%	Vitisin A 함량% /추출효율%
뉴나이	2.2/3.7	0.8/3.7	No detection	No detection
마리오	6.3/4.2	1.3/4.2	No detection	No detection
적령	2.5/2.8	0.5/2.8	No detection	No detection
루비세드레스	2.9/5.3	0.7/5.3	No detection	No detection
레드네헤스콜	5.7/3.5	1.6/3.5	No detection	No detection
리자마트	2.3/2.7	0.7/2.7	No detection	No detection
머스켓 베일리 A	6.2/1.7	1.2/1.7	No detection	No detection
허니쥬스	4.8/3.2	0.8/3.2	No detection	No detection
경조정	6.2/4.8	1.0/4.8	No detection	No detection
매니큐어 핑거	2.4/2	0.5/2	No detection	No detection
블래올림피아	4.1/2.3	1.0/2.3	No detection	No detection

본 발명에서 사용되는 감마-비니페린, 비티신 또는 이들을 함유하는 포도나무의 저급알코올추출물, 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물 등의 활성성분은 환자의 나이, 치매의 정도, 체중에 따라서 달라질 수 있으나, 일일 0.1 내지 500 mg의 량을 일일 1 내지 수회 투여할 수 있다. 이 양은 질병의 정도, 성별, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.

다음에 제제실시예를 예시한다.

제제실시예 1

정제의 제조:

포도나무의 에틸아세테이트 분획물 500.0mg

유당 500.0mg

탈크 5.0mg

마그네슘 스테아레이트 1.0mg

상기의 성분을 통상의 정제의 제조방법으로 제제화한다.

제제실시예 2

정제의 제조:

포도나무의 부탄올분획물 100.0mg

유당 100.0mg

탈크 1.0mg

마그네슘 스테아레이트 적량

상기의 성분을 통상의 정제의 제조방법으로 제제화한다.

제제실시예 3

정제의 제조:

비티신 A 2.0mg

유당 10.0mg

탈크 적량

마그네슘 스테아레이트 적량

상기의 성분을 통상의 정제의 제조방법으로 제제화한다.

제제실시예 4

캅셀제의 제조:

감마-비니페린 500.0mg

유당 500.0mg

탈크 5.0mg

스테아린산 마그네슘 5.0mg

상기의 성분을 통상의 캅셀제의 제조방법으로 제제화한다.

제제실시예 5

캅셀제의 제조:

비티신 A 2.0mg

유당 30.0mg

탈크 1.0mg

스테아린산 마그네슘 1.0mg

상기의 성분을 통상의 캅셀제의 제조방법으로 제제화한다.

제제실시예 6

액제의 제조:

포도나무 에탄올추출물 500mg

이성화당 20.0g

산화방제제 적량

메틸 파라옥시벤조에이트 적량

정제수 적량 가하여 전체 100.0ml

상기의 성분을 통상의 액제의 제제방법으로 제제화하고 갈색병에 충전하여 액제를 제조한다.

제제실시예 7

액제의 제조:

비티신 A 50.0mg

감마-비니페린 50.0mg

이성화당 50.0mg

산화방지제 적량

메틸 파라옥시벤조에에트 적량

정제수 적량 가하여 전체 100.0ml

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법으로 제제화하고 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.

제제실시예 8

산제의 제조:

포도나무의 폴리페놀 분획물 50.0mg

유당 100.0mg

탈크 5.0mg

상기의 성분을 통상의 산제의 제조방법으로 혼합하고 봉지에 넣고 밀봉하여 산 제를 제조한다.

제제실시예 9

주사제의 제조:

비니페린 1.0mg

산화방지제 적량

트윈 80 적량

주사용증류수 적량 가하여 전체 2.0ml

상기의 성분을 통상의 주사제의 제조방법으로 2.0ml의 용량의 앰플에 충전하고 멸균시켜서 주사제를 제조한다.

제제실시예 10

주사제의 제조:

포도나무의 에틸아세테이트 분획 10.0mg

산화방제제 적량

트윈 80 적량

주사용증류수 적량 가하여 전체 2.0ml

본 발명에 따른 감마-비니페린 및 비티신 A 화합물은 아세틸콜린에스터라제의 활성을 억제할 수 있는 효과적인 아세틸콜린 분해 효소 저해제로서, 이를 유효 성분으로 포함하는 약학적 제제의 형태로 하여, 알츠하이머씨병을 비롯한 노인성 치매 및 아세틸콜린의 농도 감소에 따라 발생하는 각종 증상을 치료 및 예방하는데 효과적으로 사용할 수 있다.

Claims

하기 일반식 (I)으로 표시되는 감마비니페린 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 치매예방 또는 치료용 약제학적 조성물

(I)
하기 일반식 (II)로 표시되는 비티신 A 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 치매예방 및 치료용 약제학적 조성물

(II)
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 감마비니페린 화합물 또는 비티신 A 화합물은 포도나무(Vitis vinifera), 새머루(Vitis flexuosa), 왕머루(Vitis amurensis), 머루(Vitis coignetiae), 까마귀머루(Vitis thunbergii), 사막포도(Vitis riparia), 산머루(Vitis kaempferi)로부터 분리됨을 특징으로 하는 약학조성물.
뇌기능보호 및 개선 효과를 나타내는 제 1항 또는 제 2항의 감마비니페린 화합물 또는 비티신 A 화합물 및 식품학적으로 허용되는 식품 보조 첨가제를 함유하는 건강기능식품.
제 4항에 있어서, 건강음료인 건강기능식품