KR101778839B1

KR101778839B1 - 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101778839B1
Application number: KR1020150007921A
Authority: KR
Inventors: 현 용 이; 최운용; 김남영
Original assignee: 서원대학교산학협력단
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2017-09-14
Also published as: KR20160088622A

Abstract

본 발명은 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 조성물 및 다양한 공정을 거쳐 아로니아에 들어있는 생리활성물질을 극대화할 수 있는 아로니아 발효 추출물 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법을 이용 시 열수 추출이나 에탄올 추출물에 비해 항산화 활성이 증가되고, 아세틸콜린에스테라제 활성이 저해될 뿐 아니라 뇌신경 세포 보호 활성도 뛰어나 이를 치매 및 인지능 개선의 용도로 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating dementia comprising an fermented extract of aronia}

본 발명은 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 인지능 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

최근 의학과 생명과학의 발달로 인구의 노령화가 증가함에 따라 퇴행성 질환에 대한 관심이 집중되고 있다. 대표적인 퇴행성 질환으로 기억력 장애를 일으키는 것을 치매라고 한다. 치매의 유형 중에 알츠하이머 병이 가장 일반적인 치매의 유형이며 큰 사회적인 문제로 대두되고 있다. 이러한 알츠하이머 병은 인지능력 저하 및 언어장애를 통해 일상 생활에 장애를 일으키는 특징을 가지고 있다. 하지만 알츠하이머병이라고 일컬어지고 있는 대부분의 노인성치매는 그 발병원인에 대해서는 자세히 밝혀진 바 없으나 많은 동물실험 및 임상연구의결과를 토대로 발병 기전은 산화적 스트레스에 의한 뇌신경세포의 사멸, 신경세포의 amyloid beta protein로 구성된 senile plaque과 hyperphosphorylatedtau protein로 구성된 neurofibrillary tangle의 축적 그리고 acetylcholinesterase(AchE)에 의한 신경 전달 물질인 acetylcholine(Ach)의 감소 등이 있다. 이에 따라, 현재 비타민E와 셀레질린(Selegiline) 같은 항산화제나 AchE 억제제인타크린(Tacrine)과 아리셉트(Aricept) 등이 치매 치료제로 사용되고 있다. 이들 치료제는 완벽하게 치매를 치료하는 것이 아니라 치매를 늦추거나 예방하는 정도의 효과를 나타낸다. 또한 일시적인 간독성, 위장관 장애 그리고 심장 서맥 유발 등의 부작용을 일으키기 때문에 새로운 치료제들을 개발하고 요구되고 있다. 천연물의 경우, 경험적으로 안전성과 유효성이 입증되었기 때문에 부작용이 적고 개발 기간과 비용을 절감할 수 있다.

한편, 아로니아(Aronia melanocarpa)은 장미과에 속하는 베리류로서, 동북 아메리카 및 동유럽에서 자생하고 있다. 검붉은색을 띠는 아로니아는 근래에는 전 세계에 널리 재배되고 있으며, 또한 원예종에서 2품종간에 교배육종으로 재배되고 있다. 아로니아는 특히, 안토시아닌이 자연계 식물들 중에서 가장 높은 군에 속한다고 알려져있다. 안토시아닌 중에서도 Cyanidin-3-galactoside, Cyanidin-3-glucoside, Cyanidin-3-arabinoside, Delphinidin-3-glucoside 등 많은 종류의 안토시아닌이 함유 되어있으며, 그 밖에도 다량의 페놀이 함량되어 있다고 알려져 있다. 이러한 아로니아는 연구를 통해 뛰어난 항산화 효과와 항염증과 면역의 증강에 효능을 보일 뿐만 아니라, 당뇨 및 각종 심혈관계 질환과 향장 관련 효능에 대해서도 많은 연구가 이루어졌다.

그러나 아로니아는 유용 성분인 안토시아닌의 안정성이 온도, pH, 빛, 저장기간에 큰 영향을 받기 때문에 추출 간에 안토시아닌의 파괴가 발생하여 본래의 높은 성분함량에 비하여 상응하는 활성을 나타내지 못해 활용도가 기대치에 미치지 못하는 문제점이 존재하는 실정이다.

한국등록특허 제1095034호

이에 본 발명자들은 다양한 생리활성물질을 가지고 있는 아로니아를 연구하던 중 물리적인 전처리 공정 및 발효를 활용 시 인지능 개선 활성물질을 증진시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 (a) 초음파, 초고압, 고압펄스, 고압균질 또는 냉동 및 해동 추출 공정 중 선택된 어느 하나의 공정을 통해 아로니아를 전처리 하는 단계; (b) 전처리된 아로니아를 유산균 발효하는 단계; (c) 발효 후 얻어지는 아로니아를 추출하는 단계; 및 (d) 상기 (b)단계에서 얻어진 아로니아 발효액과 (c)단계에서 얻어진 아로니아 추출물을 혼합하여 농축한 후 동결건조하여 분말의 형태로 제조하는 단계;를 포함하는 아로니아 발효 추출물 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 인지능 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 초음파, 초고압, 고압펄스, 고압균질 또는 냉동 및 해동 추출 공정 중 선택된 어느 하나의 공정을 통해 아로니아를 전처리 하는 단계; (b) 전처리된 아로니아를 유산균 발효하는 단계; (c) 발효 후 얻어지는 아로니아를 추출하는 단계; 및 (d) 상기 (b)단계에서 얻어진 아로니아 발효액과 (c)단계에서 얻어진 아로니아 추출물을 혼합하여 농축한 후 동결건조하여 분말의 형태로 제조하는 단계;를 포함하는 아로니아 발효 추출물 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b)단계의 유산균 발효는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 사카로미세스 엑시구스(Saccharomyces exiguus), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브릭키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 플랜타넘(Lactobacillus plantarum), 락토코커스 디아세틸락티스(Lactococcus diacetylactis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 스트렙토코커스 썰모필러스(Streptococcus thermophilus), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 사카로미세스 프라길리스(Saccharomyces fragilis), 아스퍼질러스 니가(Aspergilus niger), 바실러스 스페아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 및 아세토박터 자일리늄(Acetobacter xylinum)로부터 선택된 1종 이상의 균주를 이용하여 발효할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c)단계의 아로니아를 추출하는 단계는 물, 에탄올 또는 메탄올에 황산, 염산, 아세트산, 인산 또는 붕산 중 어느 하나 이상을 처리하여 추출하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 초음파 추출 공정은 (a) 아로니아와 물 또는 70% 에탄올을 1:10 (W/W)의 부피비로 혼합하여 30 ~ 120 kHz에서 30분 ~ 60분동안 초음파 추출하는 단계; (b) 초음파 추출된 아로니아를 50 ~ 70℃의 온도에서 6 ~ 12시간 동안 가열 추출 하는 단계; (c) 상기 (b)단계 후 얻어진 아로니아를 여과한 후, 감압농축 하는 단계; 및 (d) 농축된 아로니아 추출물을 동결건조하여 분말의 형태로 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 초고압 추출 공정은 (a) 아로니아 및 물을 1:10 (W/W)의 부피비로 혼합하여 200 ~ 500MPa의 압력에서 10분 ~ 30분 동안 초고압 추출하는 단계; (b) 초고압 처리된 아로니아를 70 ~ 90℃의 온도에서 6 ~ 12시간 동안 가열 추출 하는 단계; (c) 상기 (b)단계 후 얻어진 아로니아를 여과한 후, 감압농축 하는 단계; 및(d) 농축된 아로니아 추출물을 동결건조하여 분말의 형태로 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고압펄스 추출 공정은 (a) 아로니아 건조 분말을 고속 분쇄 공정을 거쳐 1~10㎛ 크기의 입자로 분쇄하는 단계; (b) 분쇄된 아로니아 분말을 물에 첨가하여 연속적으로 교반을 시켜 주는 단계; (c) 교반을 시켜 주면서 펄스형 레이저(Nd-YAG)를 이용하여 300~500nm의 가시광선파장을 광학용 유리로 만들어진 투과창을 이용하여 펄스폭은 5 ~ 15ns(FWHM), 펄스 반복률은 5 ~ 15Hz로 하고 펄스에너지는 100, 200, 300mJ로 각각 5~7분씩 3단계로 나누어 순차적으로 용액 중에 담겨 있는 입자 표면에 조사하는 단계; (d) 고압 펄스 처리된 아로니아를 70 ~ 90℃의 온도에서 6 ~ 12시간 동안 가열 추출 하는 단계; (e) 상기 (d)단계 후 얻어진 아로니아를 여과한 후, 감압농축 하는 단계; 및 (f) 농축된 아로니아 추출물을 동결건조하여 분말의 형태로 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고압균질 추출 공정은 (a) 건조 분말 형태의 아로니아를 1L 증류수에 증류수 총 중량부 대비 5 ~ 15%의 양으로 첨가한 후 고속 분쇄기에 10,000 ~ 30,000rpm으로 10 ~ 30분 동안 파쇄하는 단계; (b) 고압 균질기에 50 ~ 90㎛ 크기의 관을 통과시켜 10000 ~ 30000psi의 압력을 가하는 단계; (c) 고압 균질 처리된 아로니아를 70 ~ 90℃의 온도에서 6 ~ 12시간 동안 가열 추출 하는 단계; (d) 상기 (c)단계 후 얻어진 아로니아를 여과한 후, 감압농축 하는 단계; 및 (e) 농축된 아로니아 추출물을 동결건조하여 분말의 형태로 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 냉동 및 해동 추출 공정은 (a) 아로니아를 70 ~ 90℃의 온도에서 6 ~ 12시간 동안 가열 추출 하는 단계; (b) 가열 추출된 아로니아를 용기에 넣어 -80℃ ~ -60℃의 온도에서 급속 냉동하는 단계; 및 (c) 냉동상태의 아로니아를 2300 ~ 2600 MHz 세기의 마이크로파를 이용하여 급속 해동하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머형 치매증, 뇌혈관성 치매증, 픽병, 크루츠펠트-야곱병, 두부손상에 의한 치매 및 파킨슨병을 포함할 수 있다.

나아가 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 인지능 개선용 식품 조성물을 제공한다.

도 1은 아로니아 발효 추출물의 세포독성 측정 결과이다.
도 2는 아로니아 발효 추출물을 처리한 PC12세포의 뉴라이트 길이를 측정한 결과이다.
도 3은 아로니아 발효 추출물의 수중 미로 실험 결과이다.
도 4는 아로니아 발효 추출물의 수동 회피 실험 결과이다.
도 5는 아로니아 발효 추출물의 RT-PCR 측정 결과이다.

본 발명은 (a) 초음파, 초고압, 고압펄스, 고압균질 또는 냉동 및 해동 추출 공정 중 선택된 어느 하나의 공정을 통해 아로니아를 전처리 하는 단계; (b) 전처리된 아로니아를 유산균 발효하는 단계; (c) 발효 후 얻어지는 아로니아를 추출하는 단계; 및 (d) 상기 (b)단계에서 얻어진 아로니아 발효액과 (c)단계에서 얻어진 아로니아 추출물을 혼합하여 농축한 후 동결건조하여 분말의 형태로 제조하는 단계;를 포함하는 아로니아 발효 추출물 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 (b)단계의 유산균 발효는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 사카로미세스 엑시구스(Saccharomyces exiguus), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브릭키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 플랜타넘(Lactobacillus plantarum), 락토코커스 디아세틸락티스(Lactococcus diacetylactis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 스트렙토코커스 썰모필러스(Streptococcus thermophilus), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 사카로미세스 프라길리스(Saccharomyces fragilis), 아스퍼질러스 니가(Aspergilus niger), 바실러스 스페아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 및 아세토박터 자일리늄(Acetobacter xylinum)로부터 선택된 1종 이상의 균주를 이용하여 발효할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 가장 바람직하게는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)의 복합균을 이용하여 발효한 것일 수 있다.

또한, 상기 (c)단계의 아로니아를 추출하는 단계는 물, 에탄올 또는 메탄올에 황산, 염산, 아세트산, 인산 또는 붕산 중 어느 하나 이상을 처리하여 추출할 수 있다.

본 발명은 상기의 방법으로 제조된 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 아로니아는 블랙초크베리, 레드초크베리, 아로니아 멜라노카파 아론, 아로니아 멜라노카파 네로, 아로니아 멜라노카파 바이킹 및 아로니아 멜라노카파 메킨지 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 치매는 알츠하이머형 치매증, 뇌혈관성 치매증, 픽병, 크루츠펠트-야곱병, 두부손상에 의한 치매 및 파킨슨병을 포함할 수 있다.

본 발명의 아로니아 발효 추출물은 상기의 방법과 같이 초음파, 초고압, 고압펄스, 고압균질 또는 냉동 및 해동 추출 공정을 거칠 수 있는데 이렇게 제조된 아로니아 추출물은 열수 추출이나 에탄올 추출물에 비해 항산화 활성이 증가되고, 아세틸콜린에스테라제 활성이 저해될 뿐 아니라 뇌신경 세포 보호 활성도 뛰어나므로 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 아로니아 발효 추출물을 0.1 내지 90 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상심 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 1일 0.0001 내지 1 g/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 200 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 인지능 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 방법으로 추출된 아로니아 발효 추출물은 열수 추출이나 에탄올 추출물에 비해 항산화 활성이 증가되고, 아세틸콜린에스테라제 활성이 저해될 뿐 아니라 뇌신경 세포 보호 활성도 뛰어나므로 치매 예방 또는 인지능 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 아로니아 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 아로니아 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

아로니아의 초음파, 초고압, 고압펄스, 고압균질 및 냉동·해동 추출물 제조 방법

본 발명의 아로니아 초음파 전처리는 건조된 아로니아 100g에 1L의 물 또는 70% 에탄올을 1:10 (W/W)의 비율로 혼합해 30~120 kHz의 초음파의 조건에서 30분 내지 60분 동안 전처리하여 제조하였다. 또한, 초고압 전처리는 건조된 아로니아와 물을 1:10 (W/W)의 비율로 혼합해 200~500MPa의 압력에서 10분 내지 30분 동안 전처리하여 제조하였다.

고압펄스 전처리는 아로니아 건조 분말 100g을 고속 분쇄 공정을 거쳐 입자크기 1~10㎛ 크기의 입자로 분쇄하였다. 분쇄된 아로니아를 1L의 증류수에 첨가하여 연속적으로 교반을 시켜주면서 펄스형 레이저(Nd-YAG)를 이용하여 파장 300~500nm의 가시광선을 광학용 유리로 만들어진 투과창을 이용하여 펄스폭은 10ns(FWHM), 펄스 반복률은 10Hz로 하고 펄스에너지 100, 200, 300mJ로 5~7분씩 3단계로 나누어 순차적으로 용액 중에 담겨 있는 입자 표면에 조사하여 제조하였다. 또한, 고압균질 전처리는 건조 분말 형태의 아로니아 100g을 1L 증류수에 10% 첨가한 후 고속 분쇄기에 20,000rpm으로 15분 동안 파쇄하였다. 파쇄된 아로니아를 고압 균질기에 70㎛ 크기의 관을 통과시켜 10000~30000psi 이상의 압력을 가하여 제조하였다.

또한, 냉동·해동 전처리는 아로니아 100g을 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열 추출을 한 후, 추출된 아로니아를 별도의 용기에 넣어 -70℃의 온도에서 급속 냉동시켰다. 이후, 냉동상태의 아로니아를 2450 MHz 세기의 마이크로파를 이용하여 급속 해동하여 제조하였다.

< 실시예 2>

아로니아의 발효 방법

본 발명의 아로니아 발효 추출물을 제조하기 위해, 실시예 1의 방법으로 다양하게 전처리된 아로니아를 MRS broth 배지에 1:10 (w/v)의 비율로 첨가한 후, 37℃에서 배양된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)와 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 복합균을 접종하였다. 접종이 끝난 후에, 37℃의 온도에서 120rpm의 속도로 7일간 발효시켜 아로니아 발효물을 획득하였다.

상기에서 얻어진 아로니아 발효물을 발효액과, 아로니아 잔여물로 분리한 후에 아로니아 잔여물을 물, 에탄올 또는 메탄올과 1:10 (w/v)비율로 하여 혼합하여 열수 추출은 100℃, 에탄올 추출은 80℃ 및 메탄올 추출은 60℃에서 각각 24시간 추출한 후, 감압 여과장치를 통해 추출물을 여과하였다. 이후, 여과된 열수, 에탄올 및 메탄올 추출물을 감압농축한 후에 동결건조하여 분말의 형태로 제조하였다.

< 실험예 1>

아로니아 발효 추출물의 항산화 활성 측정

본 발명 아로니아 발효 추출물의 항산화 활성을 측정하였다. 항산화 활성 실험은 각각 DPPH 소거 활성 측정, 환원력 측정, 총 페놀 함량 측정 실험을 하였다.

아로니아 추출물의 항산화 활성 측정

공정	열수	에탄올	발효	발효 초음파	발효 초고압	발효 고압펄스	발효 고압균질	발효 냉동 해동
DPPH free radical scavenging ratio (%)	57.56	58.63	60.04	68.14	67.11	67.62	66.07	65.56
Reducing power (O.D.)	0.442	0.445	0.450	0.466	0.454	0.463	0.467	0.498
Total phenol contents (㎎/㎖)	49.5	84.5	88.9	117.6	109.5	113.1	111.3	103.78

아로니아 추출물의 항산화 활성 측정 결과, 상기 표 1에서 나타난 바와 같이 열수 추출물과 에탄올 추출물에 비해 아로니아에 발효 공정을 거친 군에서 항산화 활성이 더 높아짐을 알 수 있었다. 또한, 발효공정 단독 처리군에 비해 발효 공정과 물리적인 공정(초음파 처리, 초고압 처리, 고압펄스 처리, 고압균질 처리, 냉동 및 해동 처리)을 함께 적용하였을 경우 더 높은 항산화 활성을 보임을 알 수 있었다.

< 실험예 2>

아로니아 발효 추출물의 세포독성 측정

본 발명 아로니아 발효 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여 MTT 시약을 사용하였으며, 사용된 세포로는 CCD-986sk 세포를 사용하였다.

세포독성 측정 방법은 세포를 3.0×10⁵농도로 96-웰 플레이트(well plate)에 24시간동안 배양한 후 각 샘플을 농도별로 처리하여 다시 24시간동안 배양하였다. 200 μg/mL 농도의 MTT 시약을 50 μL씩 암실에서 주입하여 3시간동안 배양한 후, PBS buffer로 두 번 세척하고 DMSO를 각 웰에 200 μL 주입하여 20분 뒤에 570 nm에서 흡광도로 측정하였다. 세포 생존율을 계산한 방법은 시료첨가군의 O.D값/시료 무첨가군의 O.D값×100% 하여 %로 계산하였다.

측정 결과, 모든 아로니아 추출물에서 농도 의존적으로 세포 독성이 높아지는 것을 알 수 있었으나, 가장 농도가 높은 아로니아 초음파 추출물 1.0 mg/mL의 농도에서 5.0%의 세포 독성이 나타남을 고려하였을 때 전체적으로 아로니아 추출물은 낮은 세포 독성을 보임을 알 수 있었다(도 1 참조).

< 실험예 3>

아로니아 발효 추출물의 PC12 세포 증식 효과 측정

본 발명자들은 아로니아 발효 추출물의 뇌신경 보호효과를 확인하기 위해, pheochromocytoma(PC12) 신경 세포주를 이용하여 신경분화 활성측정을 하였다. PC12 세포는 RPMI 1640의 배지에서 배양된 세포를 0.25% tyrosin-EDTA로 떼어낸 후 7.5×10²viable cells / well의 농도로 24 웰 플레이트에 900 μL를 접종하였다. 접종 24시간 후에 아로니아 추출물을 각각 100 ug/mL의 양으로 첨가하여 36.5℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 매일 현미경 (×100)사진 촬영을 실시하여 신경돌기의 길이를 측정하였다.

그 결과, 스코폴라민(scopolamine)을 처리한 군에서 가장 짧은 길이의 뉴라이트를 보임을 알 수 있었으며, 초음파 처리된 발효 아로니아를 첨가한 군의 경우가 약 250 um의 길이로 가장 증식이 잘됨을 알 수 있었다(도 2 참조).

< 실험예 4>

아로니아 발효 추출물의 HT22 세포 배양 및 뇌신경 세포 보호 활성 측정

본 발명자들은 아로니아 발효 추출물의 뇌신경세포 보호 활성을 측정하였다. 마우스 해마 유래 세포주인 HT22 세포를 사용하였으며, HT22 세포는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에 5% CO2와 37℃ 조건 배양기 내에서 배양하였다.

뇌신경세포 보호 활성을 측정하기 위해 배양된 HT22 세포를 6.7×10⁴cells/300μl씩 48-웰 플레이트에 분주하여 배양하였다. 24시간 후, 안토시아닌 sample(100과 500 μg/ml), 50 μM Trolox(positive control)와 2 mM 글루타메이트(glutamate)를 첨가한 후, 5% CO2와 37℃조건 배양기 내에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)를 처리한 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 뇌세포 보호 활성은 relative protection(%)로 나타냈다.

HT22 세포 보호 활성 측정 결과

Groups		Relative Production (%)
Control		100
Trolox		89.74
초음파 발효 아로니아 추출물	500 ug/mL	35.08
	1000 ug/mL	43.11

마우스 해마 유래 세포주인 HT22 세포에서 발효 아로니아 추출물의 세포 보호 활성을 측정하였다. 항산화 효과가 가장 좋은 초음파 아로니아 추출물을 이용하여 확인하였으며, 그 결과 아로니아 추출물의 농도 의존적으로 효과가 증진됨을 확인할 수 있었다(표 2 참조).

< 실험예 5>

아로니아 발효 추출물의 AChE 의 활성 측정

본 발명자들은 아로니아 발효 추출물의 AChE 활성을 측정하기 위하여 아세틸티오콜린(acetylthiocholine) 기질을 사용하였으며, AChE에 의해 생성되는 티오콜린(thiocholine)을 DTNB와 반응시켜 그 결과 생성되는 5-thio-2-nitrobenzoate를 405nm에서 흡광도 변화를 측정하여 수행하였다.

96 웰 마이크로플레이트(well microplate)에 100μL의 AChE assay buffer(0.1 M Tris-HCl, pH 8.2), 10 μL의 0.5 U/ml AChE(dissolved in assay buffer containing 10% glycerol) 및 10 μL의 적당하게 희석된 시료를 가한 후 흔들면서 상온에서 10분 동안 인큐베이션(incubation)한 후, 10 μL의 10 mM DTNB와 5μL의 100 mM 아세티콜린을 가한 후 2분 동안 반응시킨 후 흡광기(microplate reader)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이 때 효소 대신 동량의 분석 버퍼(assay buffer)를 가한 것을 대조군(control)으로 하였으며, AChE inhibitor에 의한 억제 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.

억제율(%) = 100-(As/Ac)×100 (Ac: 대조군의 흡광도, As: 시료군의 흡광도)

그 결과, 아로니아 발효 추출물의 농도가 증가함에 따라 AChE에 대한 저해 활성이 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였으며, 가장 높은 농도인 1000 ug/mL에서 약 41.53%의 높은 저해 활성을 보임을 알 수 있었다(표 3 참조).

Acetylcholinestrase(AChE) 활성 측정

Groups		Inhibitory effect against AChE (%)
Tacrine		51.55
발효 아로니아 추출물	125 ug/mL	7.78
	250 ug/mL	19.27
	500 ug/mL	31.09
	1000 ug/mL	41.53

< 실험예 6>

아로니아 발효 추출물의 수중 미로 실험 측정

본 실험에 사용한 흰쥐는 4주령 SPF계 수컷 ICR 마우스를 사용하였다. 입수 후 일주일간 사육환경에서의 적응기간을 거쳤다. 적응기간 중 동물의 체중을 측정하고, 선택한 동물들은 각 군의 평균체중에 맞도록 최대한 균일하게 분포시켜 지정된 수가 되도록 하여 온도 22± 2℃, 상대습도 50± 5%, 환기횟수 10~15 회/hr, 조명시간 12시간(오전 7.5 시 점등~오후 7.5 시 소등) 및 조도 150~300 Lux의 환경조건을 설정하였다.

아로니아 발효 추출물의 수중미로시험은 동물인지능력측정기(EthoVision Maze test system, Noldus Information Technology, Wageningen, Netherlands)를 사용하여 실시하였다. 실험동물이 수조주변의 표지물을 기억하여 수조 내 일정한 장소에 위치한 도피대를 찾아가 10초 이상 머무는 경우 도피대를 찾아갈 때까지 소요되는 시간을 탈출잠복기(escape latency)로 하였으며, 이를 하루 2번 실시하여 나온 평균값을 평균 탈출잠복기(mean escape latency)로 하였다. 실험은 1일 2회씩 4일간 연속적으로 실시하였고, 실험동물이 도피대를 120초 이내에 찾지 못하면 동물을 도피대에 10초간 두었다가 실험을 끝내고 탈출잠복기를 120초로 하였다.

상기의 결과를 도3에 나타내었으며, 모든 실험 군에서 스코폴라민(scopolamine)에 의해 유도된 기억력 손상에 대한 개선 활성을 수중 미로 실험을 확인 결과, 아로니아 발효 초음파 추출물 처리 군에서 높은 효과를 보였으며, 실험 기간 4일 동안 점차 escape latency(수중에서 target을 찾아가는 시간)을 유의성 있게 줄여갔음을 알 수 있었다.

< 실험예 7>

아로니아 발효 추출물의 수동 회피 실험 측정

아로니아 발효 추출물의 섭취가 학습 및 기억력에 미치는 영향을 평가하기 위해 수동회피상자(GEMINITM Avoidance System, San Diego Instrument, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수동 회피시험을 실시하였다. 어두운 방과 밝은 방으로 나누어진 수동회피상자의 밝은 방에 실험동물을 넣으면 어두운 방으로 넘어가고 그때 2초간 전기충격을 가하였다. 전기충격 24시간 후에 실험동물을 밝은 방에 다시 놓았을 때 어두운 방의 전기충격을 기억하여 어두운 방으로 가고 싶은 본성을 억제하게 되는데, 이때 밝은 방에서 체류하는 시간(step throughlatency)을 측정하여 기억력을 평가하였다.

모든 실험군의 아로니아 추출물의 스코폴라민(scopolamine)에 의해 유도된 기억력 손상에 대한 개선 활성을 수동 회피 실험을 통해 확인한 결과, 가장 높은 활성을 보인 것은 상기의 수중미로 실험 결과와 같이 초음파+70% 에탄올 추출물과 70% 에탄올 추출물에서 가장 높은 활성을 나타냄을 알 수 있었다(도 4 참조).

< 실험예 8>

RT - PCR 분석 결과

RT-PCR은 아세틸콜린 가수분해 효소(acetylcholinesterase: AChE), 아세틸콜린 합성효소(choline acetyltransferase : ChAT), 무스카린성 아세틸콜린 수용체 (muscarinic acetylcholine receptor : mAchR)의 mRNA 발현을 측정하기 위하여 시행하였다. mRNA는 TRI reagent (Molecular Research Center, OH, 미국)로 실험동물의 뇌 해마부위로부터 추출하였다. 분리한 mRNA는 M-MLV 역전사 효소(Promega, WI, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 42℃의 온도에서 1시간 동안 역전사 시켰다. cDNA의 증폭은 하기와 같은 합성 프라이머(primer)를 사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 시행하였다. PCR에 의해 증폭된 DNA들은 에티디움브로마이드(ethydiumbromide)로 염색된 1.5 % 아가로즈 젤(agarose gel)에서 전기영동 한 뒤 UV를 조사하여 젤다큐멘테이션 시스템(gel documentation system)으로 관찰하였다. glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 동일한 실험 조건 확인을 위한 대조 지표로 사용하였다.

PCR 프라이머 시퀀스

Gene	PCR primer sequences
M1 AchR	Forward	5′-CAG AAG TGG AGA TGC C-3′
M1 AchR	Reverse	5′-GAG CTT TTG GGA GGC TGC TT-3′
M2 AchR	Forward	5′-TGC TGT GGC CTC CAA TAT GA-3′
M2 AchR	Reverse	5′-TGA CCC GAC GAC CCA ACT-3′
AChE	Forward	5′-AGA AAA TAT TGC AGC CTT TG-3′
AChE	Reverse	5′-CTG CAG GTC TTG AAA ATC TC-3′
ChAT	Forward	5′-AGG GTG ATC TGT TCA CTC AG-3′
ChAT	Reverse	5′-TCT TGT TGC CTG TCA TCA TA-3′
GAPDH	Forward	5′-AGT GTA GCC CAG GAT GCC CTT-3′
GAPDH	Reverse	5′-AGT GTA GCC CAG GAT GCC CTT-3′

본 발명 아로니아 추출물의 RT-PCR을 분석한 결과, 아로니아 초음파 발효 추출물의 유전자 발현 양상이 대조군(control)에 비해 2배가량 대폭 증가하는 것을 확인 할 수 있었다(도 5 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

(a) 고압펄스공정을 통해 아로니아를 전처리 하는 단계;
(b) 전처리된 아로니아를 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 와 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 의 복합균을 이용하여 유산균 발효하는 단계;
(c) 발효 후 얻어지는 아로니아를 추출하는 단계; 및
(d) 상기 (b)단계에서 얻어진 아로니아 발효액과 (c)단계에서 얻어진 아로니아 추출물을 혼합하여 농축한 후 동결건조하여 분말의 형태로 제조하는 단계;를 포함하며,
상기 (a) 단계의 고압펄스 추출 공정은, (i) 아로니아 건조 분말을 고속 분쇄 공정을 거쳐 1~10 ㎛ 크기의 입자로 분쇄하는 단계; (ii) 분쇄된 아로니아 분말을 물에 첨가하여 연속적으로 교반을 시켜 주는 단계; (iii) 교반을 시켜 주면서 펄스형 레이저(Nd-YAG)를 이용하여 300~500nm 의 가시광선파장을 광학용 유리로 만들어진 투과창을 이용하여 펄스폭은 5 ~ 15ns(FWHM), 펄스 반복률은 5 ~ 15Hz 로 하고 펄스에너지는 100, 200, 300mJ 로 각각 5~7 분씩 3 단계로 나누어 순차적으로 용액 중에 담겨 있는 입자표면에 조사하는 단계; (iv) 고압 펄스 처리된 아로니아를 70 ~ 90℃의 온도에서 6 ~ 12 시간 동안 가열 추출 하는 단계; (v) 상기 (iv)단계 후 얻어진 아로니아를 여과한 후, 감압농축 하는 단계; 및 (vi)농축된 아로니아 추출물을 동결건조하여 분말의 형태로 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 아로니아 발효 추출물 제조방법.
(a) 냉동 및 해동 추출 공정을 통해 아로니아를 전처리 하는 단계;
(b) 전처리된 아로니아를 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 와 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 의 복합균을 이용하여 유산균 발효하는 단계;
(c) 발효 후 얻어지는 아로니아를 추출하는 단계; 및
(d) 상기 (b)단계에서 얻어진 아로니아 발효액과 (c)단계에서 얻어진 아로니아 추출물을 혼합하여 농축한 후 동결건조하여 분말의 형태로 제조하는 단계;를 포함하며,
상기 (a) 단계의 냉동 및 해동 추출 공정은, (i) 아로니아를 70 ~ 90℃의 온도에서 6 ~ 12 시간 동안 가열 추출 하는 단계; (ii) 가열 추출된 아로니아를 용기에 넣어 -80℃ ~ -60℃의 온도에서 급속 냉동하는 단계; 및 (iii) 냉동상태의 아로니아를 2300 ~ 2600 MHz 세기의 마이크로파를 이용하여 급속 해동하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 아로니아 발효 추출물 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 (c)단계의 아로니아를 추출하는 단계는 물, 에탄올 또는 메탄올에 황산, 염산, 아세트산, 인산 또는 붕산 중 어느 하나 이상을 처리하여 추출하는 것을 특징으로 하는 아로니아 발효 추출물 제조방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항 또는 제2항의 방법으로 제조된 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 치매는 알츠하이머형 치매증, 뇌혈관성 치매증, 픽병, 크루츠펠트-야곱병, 두부손상에 의한 치매 및 파킨슨병을 포함하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항의 방법으로 제조된 아로니아 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 인지능 개선용 식품 조성물.