KR102147638B1 - 박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 본 발명은 박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 박하 추출물 제조를 위하여 박하분말 30 g에 물 600 mL을 첨가한 후 100℃에서 9시간 동안 교반 추출하고,
이와 같은 방법으로 2회 반복 추출한 추출물을 여과지(ADVANTEC No. 2, Adventec Toyo Kaisha, Tokyo, Japan)를 사용하여 여과하고,
여과한 추출액은 rotary evaporator(EYELA, N-N series, Toyko, Japan) 감압 농축 후 동결건조하고,
박하 발효물 제조를 위하여 박하 추출물을 10 °로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하였으며, L3, L54, L120 혼합균주 3종(1:1:1, 1.06CFU/ml)을 5% 접종하고 37℃에서 48시간 동안 발효하고,
발효 후 원심분리(VS-5000N, VISION SCIENCE Co., STD., Korea)(10,000 rpm, 5 min, 4℃)를 통해 상층액을 회수하였으며, 다시 121℃에서 15분간 멸균하여 동결건조한 후 냉동 보관하여 사용하는 박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물 및 이의 제조방법이다.
본 발명은 박하 추출물 제조를 위하여 박하분말 30 g에 물 600 mL을 첨가한 후 100℃에서 9시간 동안 교반 추출하고,
이와 같은 방법으로 2회 반복 추출한 추출물을 여과지(ADVANTEC No. 2, Adventec Toyo Kaisha, Tokyo, Japan)를 사용하여 여과하고,
여과한 추출액은 rotary evaporator(EYELA, N-N series, Toyko, Japan) 감압 농축 후 동결건조하고,
박하 발효물 제조를 위하여 박하 추출물을 10 °로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하였으며, L3, L54, L120 혼합균주 3종(1:1:1, 1.06CFU/ml)을 5% 접종하고 37℃에서 48시간 동안 발효하고,
발효 후 원심분리(VS-5000N, VISION SCIENCE Co., STD., Korea)(10,000 rpm, 5 min, 4℃)를 통해 상층액을 회수하였으며, 다시 121℃에서 15분간 멸균하여 동결건조한 후 냉동 보관하여 사용하는 박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물 및 이의 제조방법이다.
Description
본 발명은 박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 산업화와 환경의 변화 속에서 현대인들은 다양한 원인에 의한 스트레스증가, 운동부족 등으로 인해 비만, 혈액 내 콜레스테놀 함량 증가, 고혈압, 당뇨병, 혈액순환 저하 등의 성인병이 증가하고 있으며, 면역력 저하에 따른 몸이 점점 약해져 가고 있다. 또한 장 운동 부족으로 인한 변비가 증가하고 있다.
이에 따라 현대인들은 운동 계획을 세우거나 식단을 조절하는 계획을 가지고 있으나 규칙적으로 실행하기 어렵고 또한 매일 매일의 식단 준비를 위한 시간 부족 또는/및 경제적인 부담으로 인해 번번이 실패를 하고 있다.
스트레스는 예로부터 만병의 근원으로 일컬어지고 있으며, 특히 현대사회에서는 학업, 업무, 결혼, 육아 등의 사회적 요인, 날씨, 교통 등의 주변 환경적 요인 등 다양한 원인으로 인하여 남녀노소를 불문하고 과도하게 발생하고 있기 때문에 매우 중요한 사회적 문제로 인식되고 있다. 또한 스트레스가 만성적으로 지속되면 각종 신경증, 위궤양 등이 나타나며, 신체의 생리활성, 면역활성 등이 저하하고, 뇌세포 손상 및 재생을 억제하여 불면증, 무기력증, 기억력 감퇴 및 대표적 정신 질환인 우울증의 유발을 유도하게 된다.
내외적 환경 자극에 의해 신체적 및 심리적 스트레스를 받게 되면 인체는 적응하기 위해 뇌에서 노르에피네프린(NE: locus ceruleus norepinephrine)과 부신 피질 자극 호르몬 유리 호르몬 (CRH: corticotropin releasing hormone)을 분비하게 된다.
NE는 교감 신경계를 활성화 시키고 부교감 신경계의 작용을 억제하여 혈암, 심박동, 호흡을 증가시키며 기관지를 확장시키는 등의 작용을 조절한다.
CRH는 시상 하부에서 분비되며 뇌하수체 전엽으로부터 부신피질자극 호르몬 (ACTH: Adrenocorticotropic hormone)의 분비를 촉진시킨다. 분비된 ACTH는 혈액으로 이동되어 부신피질에 있는 ACTH-receptor와 결합하게 되고 이는 cAMP의 활성화 ,PKA(protein kinase A, 단백질인산화효소)의 활성화를 유도하여 최종적으로 스트레스 호르몬인 코르티졸(coctisol), 코르티코스테론(corticosterone), 코르티손(cortisone)등이 생성되게 된다.
따라서 스트레스로 인한 다양한 정신적 질병의 증상을 효과적으로 억제하기 위해서는 스트레스 발생으로 인한 독성 물질에 대한 보호 효과 및 예방효과가 있는 소재의 개발이 필요하였다.
박하(Mentha arvensis)는 우리나라 각처의 물기가 많은 곳에서 자라는 다년생 초본이다. 생육환경은 개울가와 낮은 지대의 습한 곳에서 자란다. 키는 약 30㎝가량이고 잎은 마주나며 긴 타원형으로 길이는 2~5㎝가량이다. 잎 밑이 날카로우며 끝도 날카롭고, 가장자리에 날카로운 톱니가 있다. 꽃은 연한 자주색이고 꽃자루가 있으며, 잎 사이에 모여 공 모양을 이루며 피어 있다. 이 식물은 전체에 짧은 털이 있고, 향기가 좋다. 열매는 10~11월에 달리고 미세하다. 관상용으로 쓰이며, 잎과 줄기는 약용으로 쓰인다.
박하의 주성분은 멘톨, 멘톤, 이소멘톤, 캄펜, 리모넨 등을 함유하고 있으며, 두통완화, 소화기능 촉진, 폐의 기능 강화, 과민성 대장 증후군 완화, 기억력 개선, 구강위생 향상, 멀미 치료, 암 예방 등의 효능을 가지고 있다.
참고로 관련된 선행기술 문헌은 다음과 같다.
한국등록특허번호 : 10-1450813, 한국공개특허번호 : 1020080045860, 한국등록특허번호 : 10-0972116
참고로 관련된 선행기술 문헌은 다음과 같다.
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본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로서, 박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 박하 유산균 발효물을 이용하여 스트레스 완화에 효과가 있는 조성물 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명 일 실시 예의 박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물 및 이의 제조방법은,
박하 추출물 제조를 위하여 박하분말 30 g에 물 600 mL을 첨가한 후 100℃에서 9시간 동안 교반 추출하고,
이와 같은 방법으로 2회 반복 추출한 추출물을 여과지(ADVANTEC No. 2, Adventec Toyo Kaisha, Tokyo, Japan)를 사용하여 여과하고,
여과한 추출액은 rotary evaporator(EYELA, N-N series, Toyko, Japan) 감압 농축 후 동결건조하고,
도 1과 같이, 박하 발효물 제조를 위하여 박하 추출물을 10 °Brix로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하였으며, L3, L54, L120 혼합균주 3종(1:1:1, 1.06CFU/ml)을 5% 접종하고 37℃에서 48시간 동안 발효하고,
발효 후 원심분리(VS-5000N, VISION SCIENCE Co., STD., Korea)(10,000 rpm, 5 min, 4℃)를 통해 상층액을 회수하였으며, 다시 121℃에서 15분간 멸균하여 동결건조한 후 냉동 보관하면서 사용하였다.
이하, 본 발명의 박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물 및 이의 제조방법에 관하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 여기서 사용되는 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.
본 발명은 박하 추출물 그 자체의 효과도 강조하며, 더욱 박하 추출물에 유산균이 추가된 박하 발효물에 의한 효과와 기능이 권리의 요점이다.
도 1은 박하 추출물 및 발효물 제조방법을 나타내는 흐름도이다.
먼저, 실험재료는 다음과 같다.
본 실험에 사용한 박하(Mentha arvensis var, MA)는 하나의 예로써 옴니허브(주)(Daegu, Korea)에서 구입한 후 동결건조기(FDA5508, ilShinbiobase. Co., LTD, Korea)를 이용하여 건조 및 분쇄한 것을 사용하였다. 또한 발효균주는 장수노인 분변에서 분리한 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus rhamnosus L3 KCTC18485P, Enterococcus faecium(과학적 성질 및 분류학상에 의거 표시수정됨 Lactobacillus plantarum) L54 KCTC18486P, Lactobacillus acidophilus(과학적 성질 및 분류학상에 의거 표시수정됨 Pediococcus pentosaceus) L120 KCTC18487P 3종을 이용하였다.
- 미생물 기탁일 및 기탁 번호 : 2016년 08월 3일 / KCTC18485P for L3
- 미생물 기탁일 및 기탁 번호 : 2016년 08월 3일 / KCTC18486P for L54
- 미생물 기탁일 및 기탁 번호 : 2016년 08월 3일 / KCTC18487P for L120
박하 추출물 제조를 위하여 박하분말 30 g에 물 600 mL을 첨가한 후 100℃에서 9시간 동안 교반 추출하였다. 이와 같은 방법으로 2회 반복 추출한 추출물을 여과지(ADVANTEC No. 2, Adventec Toyo Kaisha, Tokyo, Japan)를 사용하여 여과하였다. 여과한 추출액은 rotary evaporator(EYELA, N-N series, Toyko, Japan) 감압 농축 후 동결건조하여 실험에 사용하였다.
특히 박하 발효물 제조를 위하여 박하 추출물을 10 °Brix로로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하였으며, L3, L54, L120 혼합균주 3종(1:1:1, 1.06CFU/ml)을 5% 접종하고 37℃에서 48시간 동안 발효하였다.
발효 후 원심분리(VS-5000N, VISION SCIENCE Co., STD., Korea)(10,000 rpm, 5 min, 4℃)를 통해 상층액을 회수하였으며, 다시 121℃에서 15분간 멸균하여 동결건조한 후 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다.
이하 유산균(L3,L54,L120)이 포함되지 않은 박하추출물과, 상기 본 발명의 제조방법(도 1)과 상기 유산균(L3,L54,L120 이 포함된 박하 발효물에 의한 효과를 설명하겠다. 이를 통해 상기 본 발명의 도 1의 각 조건들에 대한 임계의미도 나타내고자 한다.(도 2 - 도 6)
도 2는 PC12 신경세포에서 박하 추출물 및 발효물의 세포독성 평가를 보여주는 그래프이다. (왼쪽 A는 그냥 박하 추출물이고, 오른쪽 B는 본 발명의 박하 발효물로써 효능에서 차이가 나는 것을 그래프를 통해 알 수 있으며, 상기 도 1의 각 조건에 대한 임계의미를 명확히 보여주고 있다)
PC12 뇌신경세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 구입하였으며, 배지는 10% horse serum(HS, Invitrogen, USA), 5% fetal bovine serum(FBS, Invitrogen, USA)가 첨가된 RPMI 1640(Invitrogen, USA) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 4~5일마다 1×105~106 cells/mL로 계대배양 후 실험에 사용하였다. 또한 박하 추출물 및 발효물에 대한 세포독성 측정은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. PC12 신경세포를 96 well plate에 14 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시킨 후 각각의 시료를 농도별(0, 0.25, 0.5, 1, 5mg/mL)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
이후 PBS에 2 mg/mL의 농도로 녹인 MTT 용액을 세포에 처리하고, 37°에서 4시간 동안 더 배양하여 MTT를 환원시켜 formazan 생성을 확인하였다. 세포가 떨어지지 않도록 배지를 조심스럽게 제거한 후 DMSO를 100 μL씩 분주하여 10분 동안 혼합한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였으며 각 시료에 대한 세포의 생존율은 대조구의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다. 그 결과 박하 추출물과 박하 추출물을 항스트레스 효과가 우수한 유산균 3종으로 발효시킨 발효물에 대한 세포독성은 나타나지 않았으므로 소재에 대한 안전성을 확인할 수 있었다.
도 3은 스트레스에 대한 박하 추출물 및 발효물의 신경세포 보호효과를 보여주는 그래프이다.(그래프 A는 신경세포 보호효과를 보여주는 것이고, 그래프 B는 세포막의 손상여부를 보여주는 것으로써, 상기 도 1의 각 조건에 대한 임계의미를 명확히 보여주고 있다)
스트레스호르몬 corticosterone(CORT) 처리에 의한 박하 추출물과 박하 추출물을 항스트레스 효과가 우수한 유산균 3종으로 발효시킨 발효물에 대한 신경세포 보호효과를 확인하고자 MTT assay와 LDH(lactate dehydrogenase) assay를 수행하였다. 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 1, 5mg/mL)의 박하 열수 추출물 및 발효물을 PC12 세포에 24시간 전처리한 후 250uM의 CORT를 24시간 동안 처리한 다음, MTT를 이용하여 세포의 생존율을 확인한 결과 박하 추출물 보다 박하 발효물에서 세포 생존율이 높게 나타났다. 또한, 세포막 손상에 미치는 효과를 확인하기 위하여 세포 배지에 방출된 LDH의 함량을 측정한 결과 박하추출물 및 발효물에서 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 스트레스에 대한 박하 추출물 및 발효물의 뇌신경세포 보호효과를 확인할 수 있었으며, 전반적으로 추출물 보다는 발효물에서 신경세포 보호효과가 우수하였다.
도 4는 박하 추출물 및 발효물의 ERK1/2 인산화 억제 효과를 보여주는 도면이다.
PC12 신경세포에 스트레스 CORT를 처리하면 세포성장과 분열에 관계하는 신호전달경로(MAPK pathway)를 작동시켜 신호전달분자 ERK1/2 인산화가 유도됨에 따라 인산화된 ERK1/2 단백질의 양이 증가한다. 그러나 박하 추출물 및 발효물은 CORT 처리에 의한 정신적 스트레스 유도시 각각 20%, 41% 인산화된 ERK1/2 단백질의 양이 감소하였다. 따라서 박하추출물 및 발효물은 PC12 신경세포에서 스트레스 유도시 ERK1/2 인산화를 억제하여 MAPK(ERK1/2) 활성조절을 통해 신경세포 보호작용을 나타내는 것으로 사료된다.
도 5는 박하 추출물 및 발효물의 DNA 손상 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
스트레스에 의한 DNA 손상은 세포사멸을 유도하게 되는데 PC12 신경세포에 스트레스 CORT 처리후 DNA 손상 정도를 확인한 결과 박하 추출물은 스트레스에 대한 DNA 손상율을 20% 감소시켰으며, 박하 발효물은 DNA 손상율을 46% 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 PC12 신경세포에서 박하 추출물 및 발효물은 스트레스에 의해 유도된 DNA 손상을 억제시켜 세포의 생존을 연장시키는 것으로 사료된다.
도 6은 박하 추출물 및 발효물의 카테콜아민 생합성 효소 유전자발현 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
스트레스를 받으면 신경전달물질인 카테콜아민 분비가 촉진되어 카테콜아민을 합성하는데 관여하는 Tyrosine hydroxylase (TH), Dopamine β hydroxylase (DBH) 유전자의 발현이 촉진된다. TH는 카테콜아민 합성에 관여하는 첫 번째 효소로서 tyrosine을 Dopamine (DA)의 전구체인 L-DOPA로 전환하는데 관여하는 효소이며, TH와 함께 카테콜아민 합성에서 주요하게 관여하는 유전물질의 하나인 DBH는 도파민을 노르에피네프린으로 전환하는데 관여하는 효소이다. 따라서 PC12 신경세포에 스트레스 CORT 처리후 카테콜아민 생합성 효소 TH와 DBH의 유전자 발현 수준을 확인한 결과 박하추출물 및 발효물에 의해 TH, DBH 유전자 발현이 감소됨에 따라 박하 추출물 및 발효물이 스트레스 완화에 효과가 있는 것으로 사료된다.
본 발명은 박하 추출물과 박하 추출물을 항스트레스 효과가 우수한 유산균 3종으로 발효시킨 발효물에 대한 세포독성은 나타나지 않았으므로 소재에 대한 안전성을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명은 스트레스에 대한 신경세포 보호효과가 있었다.
또한 본 발명은 스트레스에 의해 유도된 ERK1/2 인산화 억제 효과가 있었다.
또한 본 발명은 스트레스에 의해 유도된 DNA 손상 억제 효과가 있었다.
또한 본 발명은 스트레스에 의해 유도된 카테콜아민 생합성 효소의 유전자 발현 억제 효과가 있었다.
도 1은 박하 추출물 및 발효물 제조방법을 나타내는 흐름도
도 2는 PC12 신경세포에서 박하 추출물 및 발효물의 세포독성 평가를 보여주는 그래프
도 3은 스트레스에 대한 박하 추출물 및 발효물의 신경세포 보호효과를 보여주는 그래프
도 4는 스트레스에 대한 박하 추출물 및 발효물의 신경세포 보호효과를 보여주는 도면
도 5는 박하 추출물 및 발효물의 DNA 손상 억제 효과를 보여주는 그래프
도 6은 박하 추출물 및 발효물의 카테콜아민 생합성 효소 유전자발현 억제 효과를 보여주는 그래프
도 2는 PC12 신경세포에서 박하 추출물 및 발효물의 세포독성 평가를 보여주는 그래프
도 3은 스트레스에 대한 박하 추출물 및 발효물의 신경세포 보호효과를 보여주는 그래프
도 4는 스트레스에 대한 박하 추출물 및 발효물의 신경세포 보호효과를 보여주는 도면
도 5는 박하 추출물 및 발효물의 DNA 손상 억제 효과를 보여주는 그래프
도 6은 박하 추출물 및 발효물의 카테콜아민 생합성 효소 유전자발현 억제 효과를 보여주는 그래프
이하, 본 발명의 박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물 및 이의 제조방법을 실시 예를 들어 상기와 같이 상세하게 설명하였고, 물론 본 발명의 권리범위는 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 기술 분야의 통상적인 지식을 가진자에 의하여 다양하게 변형 실시될 수 있다.
Claims (2)
- 박하 추출물 제조를 위하여 박하분말 30 g에 물 600 mL을 첨가한 후 100℃에서 9시간 동안 교반 추출하는 단계;
상기와 같은 방법으로 2회 반복 추출한 추출물을 여과지를 사용하여 여과하는 단계;
여과한 추출액은 rotary evaporator 감압 농축 후 동결건조하는 단계;
박하 발효물 제조를 위하여 박하 추출물을 10°Brix로 로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여, Lactobacillus rhamnosus L3 기탁번호 KCTC18485P, Lactobacillus plantarum L54 기탁번호 KCTC18486P, Pediococcus pentosaceus L120 기탁번호 KCTC18487P 혼합균주 3종(1:1:1)을 5% 접종하고 37℃에서 48시간 동안 발효하는 단계; 및
발효 후 원심분리기(10,000 rpm, 5 min, 4℃)를 통해 상층액을 회수하고, 다시 121℃에서 15분간 멸균하여 동결건조한 후 냉동 보관하는 단계; 를 포함하는 박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물의 제조방법.
- 박하 추출물 제조를 위하여 박하분말을 첨가한 후 교반 추출하는 단계;
상기와 같은 방법으로 추출한 추출물을 여과지를 사용하여 여과하는 단계;
여과한 추출액을 감압 농축 후 동결건조하는 단계;
박하 발효물 제조를 위하여 박하 추출물을 10°Brix로 로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여, Lactobacillus rhamnosus L3 기탁번호 KCTC18485P, Lactobacillus plantarum L54 기탁번호 KCTC18486P, Pediococcus pentosaceus L120 기탁번호 KCTC18487P 혼합균주 3종(1:1:1)을 5% 접종하고 37℃에서 48시간 동안 발효하는 단계; 및
발효 후 원심분리기를 통해 상층액을 회수하고, 다시 121℃에서 15분간 멸균하여 동결건조한 후 냉동 보관하는 단계; 를 포함하는 박하 유산균 발효물을 함유하는 스트레스 완화용 조성물의 제조방법.
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-
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Non-Patent Citations (1)
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| 뇌신경 건강식품 화순박하진액 첫 후기 (online 2017. 3. 27.)[2019. 9. 23. 검색], 인터넷: <URL: http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=hydroin303&logNo=220968674259&parentCategoryNo=&categoryNo=41&viewDate=&isShowPopularP* |
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