CN108660174B - 一种抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽 - Google Patents

一种抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽，有效解决抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽的制备问题，（1）芝麻去油，得到富集芝麻蛋白的芝麻粉，加水，搅拌均匀，加热，得芝麻粉水溶液；（2）芝麻粉水溶液中加入胃蛋白酶，进行第一次酶解；（3）第一次酶解后的溶液中，加入胰蛋白酶进行第二次酶解；（4）第二次酶解后的溶液中，加入碱性蛋白酶进行第三次酶解；（5）对芝麻生物活性肽粗品溶液脱盐、浓缩、干燥，得芝麻生物活性肽。本发明有助于提高酶解反应效率，对消化能力弱的特殊人群具有更好的适用性，具有抗疲劳、增强体力的作用，具有促进肠道益生菌增殖的作用，将从根本上预防亚健康状态的出现。

Description

一种抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽
技术领域
本发明涉及一种抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽。
背景技术
随着生活节奏加快、工作强度加大及精神压力增加，处于亚健康状态的人群越来越多。慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome,CFS)——以机体通过休息得不到缓解、全身性疲劳为主要临床特点的一种亚健康状态，发病率亦不断攀升。慢性疲劳综合征是现代医学面临的难题之一，因其无病理改变，西医尚无循证医学证明有效的治疗方法。故而，充分发挥中医药治未病、对慢性疾病具有良好疗效的优势，利用中医药预防和治疗慢性疲劳综合征，具有重大现实意义。
CFS属中医“懈怠”、“懈惰”、“乏力”、“神疲”、“四肢劳倦”、“四肢不举”等范畴，虽无病理改变，但已有气血失调，是机体失于气血的充养所致。CFS虽然是一种多脏器、多系统功能失调的疾病，但主要涉及肝、肾、脾三脏，其基本病机为肝、肾、脾三脏的本虚症。《素问》云：肝虚、肾虚、脾虚，皆令人体重烦冤。脾主运化，脾胃虚弱，运化失职，则气血化生不足，肌肉、清窍失养，见四肢酸痛、头昏乏力等症；肾主骨、生髓，肝主筋，七情及劳逸过度，伤及肝肾，则筋骨酸软无力、易于困倦或失眠烦躁。治疗上应扣其“肝虚、肾虚、脾虚”病机实质，予以养肝补肾健脾。
作为药食两用中药黑芝麻，2015版中国药典记载其能补肝肾，益精血，用于精血亏虚，头晕眼花，耳鸣耳聋等。《神农本草经》载黑芝麻“主治伤中虚羸，补五内，益气力，长肌肉，填髓脑”。《名医别录》说它具有“坚筋骨、明耳目、耐饥渴、延年”的功效。《本草纲目》言黑芝麻“服至百日，能除一切痼疾；一年面光泽不饥，二年白发返黑，三年齿落更生”。而且，现代研究证明，芝麻中蛋白含量较高(脱油脂后蛋白高达42.7％～50％)，其蛋白质的氨基酸组成又与FAO/WHO推荐的人类蛋白质标准具有很好的一致性，而且含有8种人体不能合成、必须从食物摄取的必需氨基酸，其必需氨基酸含量可占芝麻蛋白氨基酸总量的30％，是良好的食用蛋白质资源。这非常契合CFS需要补肝肾健脾的治则，因此，黑芝麻是一个非常有希望防治CFS的药物。
随着生物活性肽多种活性的发现，从生物活性肽的角度去研究蛋白质，将为有效利用蛋白质及阐明各种蛋白质的不同作用开辟新途径。
目前，芝麻生物活性肽的抗氧化、抗衰老、降血压、抑菌、溶解血栓及金属螯合作用，已有报道【隋晓,等.芝麻活性肽研究进展.食品与机械,2016,32(02):193-7；Wang,Z.,et al.,Peptides from sesame cake extend healthspan of Caenorhabditis elegansvia upregulation of skn-1 and inhibition of intracellular ROS levels.ExpGerontol,2016,82:139-49】，而芝麻肽的其他生物活性，目前研究尚未涉及。
通常情况下，蛋白质主要是通过发酵、酶解的方法获得生物活性肽【刘铭,等.制备、纯化和鉴定生物活性肽的研究进展及应用.食品与发酵工业,2016,42(04):244-51】；而在芝麻蛋白酶解制备芝麻生物活性肽的报道中，大部分采用的是单一酶酶解，如碱性蛋白酶、Protex 6L碱性蛋白酶、Protex-7L中性内切蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶及胃蛋白酶等【隋晓,等.芝麻活性肽研究进展.食品与机械,2016,32(02):193-7；陶然,芝麻蛋白及多肽的研制[D].武汉轻工大学,2014；中国发明专利CN103103016A“一种水酶法从芝麻中提取油和短肽的方法”；中国发明专利CN102559367A“芝麻油的提取方法”】；尚有一部分采用复合酶酶解，如复合纤维素酶酶解【中国发明专利CN101224022A“水酶法同时制备芝麻油和蛋白质工艺方法”】，复合植物蛋白酶酶解【李佳,芝麻油加工副产物提取蛋白质及制备蛋白肽的研究[D].山东农业大学,2016】，木瓜蛋白酶和风味蛋白酶双酶分步水解【陈义勇,等.芝麻蛋白水解工艺的研究[J].食品研究与开发,2006,27(9):17-20】，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶双酶酶解【高明侠,等.固定化双酶水解芝麻粕蛋白制备氨基酸研究[J].扬州大学学报：农业和生命科学版,2008,29(4):95-8】，木瓜蛋白酶和Alcalase酶的双酶同步酶解【中国发明专利CN103250863A“一种芝麻多肽的制备方法”】，加酶顺序为碱性蛋白酶—中性蛋白酶—木瓜蛋白酶的酶解【唐章晖,等.酶解芝麻粕制备芝麻多肽工艺研究[J].粮油科技与经济,2013,38(2):48-51；中国发明专利CN105936928A“一种酶解芝麻粕制备芝麻多肽工艺”】，加酶顺序为Alcalase 2.4L—Protex7L—风味蛋白酶的酶解【中国发明专利CN107474941A“水酶法同步提取芝麻油和芝麻多肽粉的方法”】，中性蛋白酶酶解芝麻饼粕5h后，加入芝麻饼粕质量1‰-3‰的木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶N中的一种或多种的混合酶的再酶解【中国发明专利CN104397662B“一种利用芝麻饼粕制备肉味香精的方法”】等。另外，中国发明专利CN107474941A“水酶法同步提取芝麻油和芝麻多肽粉的方法”，涉及中性蛋白酶酶解5h后加入自制复合酶的酶解(其中自制复合酶为米曲霉发酵芝麻粕:麸皮:水4:1:5的溶液制备自制酶，并选择木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶N中的一种或多种按照1:2的比例加入自制酶中而制得)；中国发明专利CN103387870A“一种固态发酵水酶法制取芝麻油脂的方法”，公开了一种微生物(枯草芽孢杆菌)固态发酵后，又加入蛋白酶(Alcalase碱性内切蛋白酶)进行酶解的方法。
虽然上述专利或文献公开了一种、两种或多种蛋白酶酶解芝麻蛋白的新方法，但如何制备出抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽至今未见有报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽，可有效解决抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽的制备问题。
本发明的技术方案是：具体步骤如下：
(1)芝麻去油，得到富集芝麻蛋白的芝麻粉，加入芝麻粉重量5-200倍的水，搅拌均匀，加热至沸腾，继续加热10min，得芝麻粉水溶液；
(2)在芝麻粉水溶液中加入胃蛋白酶，进行第一次酶解；
(3)在第一次酶解后的溶液中，再加入胰蛋白酶进行第二次酶解；
(4)在第二次酶解后的溶液中，再加入碱性蛋白酶进行第三次酶解，得芝麻生物活性肽粗品溶液；
(5)对芝麻生物活性肽粗品溶液依次进行脱盐、浓缩至60℃下相对密度为1.05～1.25、干燥，即得芝麻生物活性肽。
所述的芝麻去油：芝麻用压榨法或水代法去除部分油脂后得到芝麻粕，晒干，在晒干后的芝麻粕中加入芝麻粕重量6-8倍体积的6号抽提溶剂油或有机溶剂，回流提取2次，每次40-60分钟，即可去除剩余油脂，得去除油脂后的芝麻粕，晾干，得富集芝麻蛋白的芝麻粉；
所述的第一次酶解为，先调芝麻粉水溶液pH至1.5～1.8，在30～50℃下，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加胃蛋白酶为1.6～10U/g，酶解1～2h后，升温至95～100℃，保持2～5分钟，停止酶反应；
所述的第二次酶解为，将第一次酶解后的溶液冷却至30～50℃，调pH至7.8～8.5，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加胰蛋白酶为3-20U/g，酶解1～2h，升温至95～100℃，保持2～5分钟，停止酶反应；
所述的第三次酶解为，将第二次酶解后的溶液冷却至30～50℃，调pH至8.5～10.5，加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加碱性蛋白酶为100～200U/g，酶解1～3h，升温至95～100℃，保持2～5分钟，停止酶反应；
所述的脱盐为，将芝麻生物活性肽粗品溶液，调pH值至6.5～7.5，以1～2BV/h的流速，通过装有磺酸型阳离子交换树脂的层析柱，除去Na+阳离子，收集脱去阳离子的流出液，再以1～2BV/h的流速经过装有季铵盐型阴离子交换树脂的层析柱，交换除去Cl-阴离子，收集脱去阴离子的流出液。
本发明的另一目的在于，提供上述芝麻生物活性肽在制备抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的药物、特殊食品或食品中的应用。
所述芝麻生物活性肽在改善身体及精神疲劳、增强体力的前提下，有效促进肠道益生菌生长，无副作用，治标又治本，从而实现对亚健康状态慢性疲劳状态的纠正。
一种抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的药物组合物，该药物组合物包含上述的芝麻生物活性肽以及药学上可接受的载体；所述的药物组合物为口服制剂或注射剂；所述口服制剂的剂型为胶囊、散剂、片剂、滴丸剂、微丸剂、口服液或颗粒剂。
一种抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的特殊食品或食品组合物，该特殊食品或食品组合物包含上述的芝麻生物活性肽以及食品上可接受的载体配制成饮料、面条、饼干、撒剂、调味品、糖果、特殊食品(特殊食品主要包括保健食品和特殊膳食用食品)。
本发明的有益效果：
(1)本发明将芝麻去油后提取芝麻蛋白，不仅相对富集了芝麻蛋白，而且在去油的同时，芝麻被粉碎，大幅度增加了蛋白质底物颗粒的表面积，有助于提高酶解反应效率。
(2)本发明仿照胃、胰和小肠的消化条件，使用胃、胰和碱性蛋白酶，相比于单一酶解的产品具有更接近人体实际消化情况的特点，对消化能力弱的特殊人群，如：幼儿、老人、体弱及术后病人，具有更好的适用性。
(3)本发明制备的芝麻生物活性肽，具有抗疲劳、增强体力的作用。
(4)本发明制备的芝麻生物活性肽，具有促进肠道益生菌增殖的作用，将从根本上预防亚健康状态的出现。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施情况作详细说明。
实施例1
黑芝麻放入榨油机中，用压榨法去除部分油脂后得到黑芝麻粕，晒干，在晒干后的黑芝麻粕中加入黑芝麻粕重量8倍体积的石油醚，回流提取60分钟，得第一次脱脂黑芝麻粕，在第一次脱脂黑芝麻粕中加入黑芝麻粕重量6倍体积的石油醚，回流提取40分钟，即可去除剩余油脂，得第二次脱脂黑芝麻粕，第二次脱脂黑芝麻粕即为去除油脂后的黑芝麻粕，晾干，得富集芝麻蛋白的芝麻粉；芝麻粉中加入芝麻粉重量200倍的水，搅拌均匀，加热至沸腾，继续加热10min，得芝麻粉水溶液；调芝麻粉水溶液pH至1.5，在37℃下，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加胃蛋白酶为1.6U/g，酶解2h后，升温至95℃，保持5分钟，停止酶反应，得胃蛋白酶酶解液(即为第一次酶解后的溶液，以下同)；将胃蛋白酶酶解液冷却至37℃，调pH至8.0，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加胰蛋白酶为3U/g，酶解2h，升温至95℃，保持5分钟，停止酶反应，得胰蛋白酶酶解液(即为第二次酶解后的溶液，以下同)；将胰蛋白酶酶解液冷却至37℃，调pH至10，加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加碱性蛋白酶为100U/g，酶解3h，升温至95℃，保持5分钟，停止酶反应，得芝麻生物活性肽粗品溶液；将芝麻生物活性肽粗品溶液调pH值至7.0，以1.5BV/h的流速经装有732阳离子交换树脂的层析柱，收集流出液为脱除Na+阳离子的芝麻生物活性肽溶液；再将脱除Na+阳离子的芝麻生物活性肽溶液以1.5BV/h的流速经过装有D201阴离子交换树脂的层析柱吸附其中的Cl-阴离子，收集流出液，得脱盐的精制芝麻生物活性肽；脱盐的精制芝麻生物活性肽浓缩60℃下相对密度为1.05，干燥，即得固体状的芝麻生物活性肽。
实施例2
白芝麻放入榨油机中，用压榨法去除部分油脂后得到白芝麻粕，晒干，在晒干后的白芝麻粕中加入白芝麻粕重量6倍体积的6号抽提溶剂油，回流提取40分钟，得第一次脱脂白芝麻粕，在第一次脱脂白芝麻粕中加入白芝麻粕重量6倍体积的6号抽提溶剂油，回流提取40分钟，即可去除剩余油脂，得第二次脱脂白芝麻粕，第二次脱脂白芝麻粕即为去除油脂后的白芝麻粕，晾干，得富集芝麻蛋白的芝麻粉；芝麻粉中加入芝麻粉重量5倍的水，搅拌均匀，加热至沸腾，继续加热10min，得芝麻粉水溶液；调芝麻粉水溶液pH至1.8，在37℃下，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加胃蛋白酶为2U/g，酶解1h后，升温至100℃，保持5分钟，停止酶反应，得胃蛋白酶酶解液；将胃蛋白酶酶解液冷却至37℃，调pH至7.8，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加胰蛋白酶为5U/g，酶解1h，升温至100℃，保持2分钟，停止酶反应，得胰蛋白酶酶解液；将胰蛋白酶酶解液冷却至45℃，调pH至9.5，加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加碱性蛋白酶为150U/g，酶解1h，升温至100℃，保持2分钟，停止酶反应，得芝麻生物活性肽粗品溶液；将芝麻生物活性肽粗品溶液调pH值至6.8，以1BV/h的流速经装有732阳离子交换树脂的层析柱，收集流出液为脱除Na+阳离子的芝麻生物活性肽溶液；再将脱除Na+阳离子的芝麻生物活性肽溶液以1BV/h的流速经过装有D201阴离子交换树脂的层析柱吸附其中的Cl-阴离子，收集流出液，得脱盐的精制芝麻生物活性肽；脱盐的精制芝麻生物活性肽浓缩至60℃下相对密度为1.25，干燥，即得固体状的芝麻生物活性肽。
实施例3
黑芝麻用传统的石磨水代法去除部分油脂后得到黑芝麻粕，晒干，在晒干后的黑芝麻粕中加入黑芝麻粕重量7倍体积的质量浓度为95％的乙醇，回流提取50分钟，得第一次脱脂黑芝麻粕，在第一次脱脂黑芝麻粕中加入黑芝麻粕重量6倍体积的质量浓度为95％的乙醇，回流提取50分钟，即可去除剩余油脂，得第二次脱脂黑芝麻粕，第二次脱脂黑芝麻粕即为去除油脂后的黑芝麻粕，晾干，得富集芝麻蛋白的芝麻粉；芝麻粉中加入芝麻粉98倍重量的水，搅拌均匀，加热至沸腾，继续加热10min，得芝麻粉水溶液；调芝麻粉水溶液pH至1.7，在30℃下，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加胃蛋白酶为10U/g，酶解1h后，升温至98℃，保持2分钟，停止酶反应，得胃蛋白酶酶解液；将胃蛋白酶酶解液冷却至50℃，调pH至8.5，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加胰蛋白酶为20U/g，酶解2h，升温至98℃，保持4分钟，停止酶反应，得胰蛋白酶酶解液；将胰蛋白酶酶解液冷却至30℃，调pH至8.5，加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加碱性蛋白酶为200U/g，酶解2h，升温至98℃，保持3分钟，停止酶反应，得芝麻生物活性肽粗品溶液；将芝麻生物活性肽粗品溶液调pH值至7.5，以2BV/h的流速经装有732阳离子交换树脂的层析柱，收集流出液为脱除Na+阳离子的芝麻生物活性肽溶液；再将脱除Na+阳离子的芝麻生物活性肽溶液以2BV/h的流速经过装有D201阴离子交换树脂的层析柱吸附其中的Cl-阴离子，收集流出液，得脱盐的精制芝麻生物活性肽；脱盐的精制芝麻生物活性肽浓缩至60℃下相对密度为1.15，干燥，即得固体状的芝麻生物活性肽。
实验资料：
取上述得到的固体状的芝麻生物活性肽进行体内实验，以评价其抗慢性疲劳及肠道益生菌增殖的作用，以下为试验例：
30只昆明小鼠，随机分为5组，每组6只，分别为空白组、模型对照组、芝麻生物活性肽低(0.1g/kg·d)、中(0.25g/kg·d)、高(0.5g/kg·d)剂量组。灌胃给药，每天1次，每次灌胃体积为0.1mL/10g，连续12天，空白组和模型对照组灌胃等体积蒸馏水。芝麻生物活性肽低(0.1g/kg·d)、中(0.25g/kg·d)、高(0.5g/kg·d)剂量组所用芝麻生物活性肽均为本发明制备方法得到的芝麻生物活性肽。给药同时除空白组外，其余各组进行小鼠慢性疲劳造模，上午悬吊，下午进行力竭游泳(力竭标准：游泳动作明显失调，即将沉入水中)，连续12d。游泳训练前3天适应性游泳30min，以后为力竭性训练。悬吊每3d循序加量1次，时间分别为1，1.5，2，2.5h。实验结束第二天收集各组小鼠粪便进行小鼠肠道菌群影响的研究，摘眼球取血，4500r/min离心10min，留取上部血清，按试剂盒说明书方法测定乳酸脱氢酶；解剖取肝，按试剂盒说明书方法测定肝糖元；解剖取脑，测定5-HT含量。
CFS的症状包括体力或心理负荷过重，引起不易解除的疲劳和焦虑等。长时间的力竭游泳能够造成躯体疲劳，使机体消瘦，营养代谢紊乱。悬尾使小鼠的躯体活动受限，使小鼠产生挣扎、急躁、愤怒等心理变化，从而造成精神疲劳。造模过程中，可观察到造模后小鼠精神萎靡不振，嗜睡，四肢蜷卧，站立不稳，大便稀，皮肤松弛，体毛干枯无光泽，逃避反应能力下降，这些表现在造模组小鼠中表现尤为严重。显示这种造模方法较好地复制了人类CFS的模型。
1、经过长时间运动后，小鼠机体在物质代谢和酶水平方面将发生相应的变化。血乳酸是肌肉进行无氧代谢的产物，浓度越高，反映体内越疲劳，而乳酸脱氢酶(LDH)是代谢乳酸的关键酶，故乳酸脱氢酶活性越高，机体消耗乳酸越快，反映药物抗疲劳的作用越强；肝糖原(又称肝糖元)是重要的储能物质，机体运动时需要肝糖元分解为其提供能量，故肝糖原储备量越多，就会为机体提供更多的能量，机体的运动耐力(即体力)就越强，抗疲劳能力就越强，反之，肝糖原耗尽是运动性疲劳的一个重要因素。本发明芝麻生物活性肽对乳酸脱氢酶、肝糖元的影响见表1。
表1芝麻生物活性肽对乳酸脱氢酶、肝糖元含量的影响
分组 乳酸脱氢酶活性(U/L) 肝糖元含量(mg/g组织)
空白组 6852.08±515.47<sup>#</sup> 24.35±3.47
模型组 6202.08±439.41<sup>#</sup> 15.57±4.66<sup>##</sup>
低剂量组 6302.08±303.25 19.08±5.22
中剂量组 6454.17±553.83 20.05±4.90
高剂量组 7187.5±197.01<sup>**</sup> 24.54±4.82<sup>**</sup>
注：与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01
由表1可见，与空白组比较，模型组的乳酸脱氢酶活性降低(P<0.05)，有统计学差异，肝糖元含量显著性降低(P<0.01)，说明力竭游泳和悬尾试验够使机体疲劳，造模成功。与模型组比较，芝麻生物活性肽能提高小鼠体内乳酸脱氢酶活性，提高肝糖原的储备量，特别是高剂量组与模型组比较，有非常显著性差异(P<0.01)。以上实验结果表明，本发明芝麻生物活性肽能显著提高慢性疲劳者体内乳酸脱氢酶，以消除身体疲劳感觉，可显著提高肝糖原含量，以增强机体的运动耐力，缓解体力疲劳而抗疲劳。
2、当机体处于长期疲劳的状态下，容易产生应激性损伤，脑组织中5-HT水平下降。5-羟色胺(5-HT)与人们的精神活动行为、睡眠、痛域等有非常密切的关系，当下丘脑内5-HT含量下降时，就会出现精神状态不佳、反应迟钝、注意力下降、懒言少动、睡眠质量下降、易紧张、易惊恐、易愤怒、丧失以往的兴趣和爱好等慢性疲劳的精神症状。本发明芝麻生物活性肽对脑组织中5-HT的影响见表2。
表2各组小鼠脑组织5-HT含量
分组 脑组织5-HT含量pg/mg
空白组 581.77±129.08
模型组 418.09±18.42<sup>#</sup>
低剂量组 450.28±71.22
中剂量组 507.71±102.03
高剂量组 516.40±84.52<sup>*</sup>
注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05
由表2可知，与空白组相比，模型组脑组织的5-HT含量明显降低，二者有显著性差异(P<0.05)，说明模型小鼠因力竭游泳和悬尾，脑部5-HT神经递质分泌异常，导致小鼠行为发生变化，从而产生疲劳状态，即造模成功。给药组与模型组相比，5-HT含量有增加的趋势，特别是高剂量组与模型组相比有显著差异(P<0.05)，表明本发明芝麻生物活性肽可通过调节5-HT神经递质而发挥改善精神疲劳的作用。
3、肠道菌群的正常组合遭到破坏，就会出现胃肠不适等病理表现，随着时间的延长，就出现中医脾虚证的证候，进而导致慢性疲劳的发生；同样，由慢性疲劳造成的脾虚也可能引起肠道菌群失调，加重慢性疲劳。而乳酸杆菌是人体有益的生理菌，有人体肠道的“健康卫士”之称，它在胃肠道含量的变化可直接影响胃肠道菌群的平衡。而MRS选择琼脂培养基可培养罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧乳杆菌和植物乳杆菌等肠道益生菌，常用于乳酸菌的分离、计数和培养。
为确定芝麻生物活性肽对慢性疲劳肠道菌群的影响，我们使用MRS选择琼脂培养基考察其对益生菌乳酸菌总数的作用。具体实验步骤为：实验结束第二天收集的小鼠粪便0.1g，置于含0.9ml生理盐水和玻璃珠的无菌小瓶中，摇床120r/min振摇30min分散，并用此母液稀释出10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度菌悬液，取10-3、10-4、10-5、10-6稀释度菌悬液100μl分别接种于MRS乳酸杆菌选择琼脂培养基，置于37℃培养箱48h后，计数菌落个数，平均值为X。公式：CFU/g样品＝(X/0.1)×(稀释倍数/样品重量)。实验结果见表3。
表3各组小鼠肠道菌群含量
Figure BDA0001679991610000081
注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05
由表3可见，与空白组相比，模型组小鼠粪便中的乳酸菌含量降低，二者有显著差异(P<0.05)，说明疲劳模型能显著降低肠道益生菌总量，而高剂量给药组小鼠粪便中的乳酸菌含量比模型组高，且差异有显著性(P<0.05)，表明，本发明获得的芝麻生物活性肽具有改善肠道菌群，促进益生菌生长有的作用。
结论
本发明利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶三种酶酶解制备的芝麻生物活性肽能显著提高慢性疲劳模型体内的LDH、肝糖原含量，提高其5-HT含量以及肠道乳酸菌含量，而具有抗疲劳、增强机体的运动耐力及促进肠道益生菌增殖的用途。
本发明制备的芝麻活性肽可作为食品原料和药品原辅料，与一种或多种食品和药学上可接受的载体配制成颗粒、散剂、片剂、胶囊、饮料或面条、饼干、撒剂、调味品、糖果等，作为药品、特殊医学用途配方食品或高品质的保健食品、食品。
本发明以芝麻蛋白为原料，按照人体消化吸收的特点，使用胃蛋白酶解物、胰蛋白酶解物和碱性蛋白酶解物三种酶酶解芝麻蛋白，以仿照胃、胰和小肠的消化条件，而制备获得。本发明制备出的芝麻生物活性肽既可克服CFS时脾虚不能运化之不足，又可充分利用芝麻含有高达30％的8种人体不能合成、必须从食物摄取的必需氨基酸的特性，能显著提高慢性疲劳者体内乳酸脱氢酶，以消除身体疲劳感觉，提高肝糖原含量，以供能迅速增强体力而抗疲劳，并能提高其5-羟色胺含量，以减轻精神疲劳症状，还能显著提高肠道益生杆菌的菌含量，以纠正慢性疲劳病理状态，从而具有抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的作用。

Claims (10)

1.一种抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽，其特征在于，具体步骤如下：
（1）芝麻去油，得到富集芝麻蛋白的芝麻粉，加入芝麻粉重量5-200倍的水，搅拌均匀，加热至沸腾，继续加热10min，得芝麻粉水溶液；
（2）在芝麻粉水溶液中加入胃蛋白酶，进行第一次酶解；所述的第一次酶解为，先调芝麻粉水溶液pH至1.5～1.8，在30～50℃下，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加胃蛋白酶为1.6~10U/g，酶解1～2h后，升温至95～100℃，保持2～5分钟，停止酶反应；
（3）在第一次酶解后的溶液中，再加入胰蛋白酶进行第二次酶解；所述的第二次酶解为，将第一次酶解后的溶液冷却至30～50℃，调pH至7.8～8.5，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加胰蛋白酶为3-20 U/g，酶解1～2h，升温至95～100℃，保持2～5分钟，停止酶反应；
（4）在第二次酶解后的溶液中，再加入碱性蛋白酶进行第三次酶解，得芝麻生物活性肽粗品溶液；所述的第三次酶解为，将第二次酶解后的溶液冷却至30～50℃，调pH至8.5～10.5，加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为以芝麻粉重量计，添加碱性蛋白酶为100～200U/g，酶解1～3h，升温至95～100℃，保持2～5分钟，停止酶反应；
（5）对芝麻生物活性肽粗品溶液依次进行脱盐、浓缩至60°C下相对密度为1.05～1.25、干燥，即得芝麻生物活性肽。
2.根据权利要求1所述的抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽，其特征在于，所述的芝麻去油：芝麻用压榨法或水代法去除部分油脂后得到芝麻粕，晒干，在晒干后的芝麻粕中加入芝麻粕重量6-8倍体积的6号抽提溶剂油或有机溶剂，回流提取2次，每次40-60分钟，即可去除剩余油脂，得去除油脂后的芝麻粕，晾干，得富集芝麻蛋白的芝麻粉。
3.根据权利要求1所述的抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的芝麻生物活性肽，其特征在于，所述的脱盐为，将芝麻生物活性肽粗品溶液，调pH值至6.5～7.5，以1～2BV/h的流速，通过装有磺酸型阳离子交换树脂的层析柱，收集脱去阳离子的流出液，再以1～2BV/h的流速经过装有季铵盐型阴离子交换树脂的层析柱，收集脱去阴离子的流出液。
4.权利要求1至3中任一项所述的芝麻生物活性肽在制备抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的药物或食品中的应用。
5.根据权利要求4所述的芝麻生物活性肽在制备抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的药物或食品中的应用，其特征在于，所述芝麻生物活性肽在改善身体及精神疲劳、增强体力的前提下，有效促进肠道益生菌生长，从而实现对亚健康状态慢性疲劳状态的纠正。
6.权利要求1至3中任一项所述的芝麻生物活性肽在制备抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的特殊食品中的应用。
7.根据权利要求6所述的芝麻生物活性肽在制备抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的特殊食品中的应用，其特征在于，所述芝麻生物活性肽在改善身体及精神疲劳、增强体力的前提下，有效促进肠道益生菌生长，从而实现对亚健康状态慢性疲劳状态的纠正。
8.一种抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含权利要求1-3中任一项的芝麻生物活性肽以及药学上可接受的载体；所述的药物组合物为口服制剂或注射剂。
9.一种抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的特殊食品，其特征在于，该特殊食品包含权利要求1-3中任一项的芝麻生物活性肽以及食品上可接受的载体。
10.一种抗疲劳、促进肠道益生菌增殖的食品组合物，其特征在于，该食品组合物包含权利要求1-3中任一项的芝麻生物活性肽以及食品上可接受的载体。
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