KR20150068803A

KR20150068803A - 함초 추출물을 유효 성분으로 하는 염증성 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150068803A
Application number: KR1020130154898A
Authority: KR
Inventors: 박태규; 강소희; 최면
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2015-06-22

Abstract

본 발명은 함초 추출물을 유효 성분으로 하는 염증성 신경 퇴행성 질환 및 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

함초 추출물을 유효 성분으로 하는 염증성 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 조성물{A Composition for preventing and treating neuro-inflammatory disease and inflammation disease comprising Salicornia bigelovii extract}

함초(鹹草)는 해안에서 자생하면서 바닷물을 흡수하고 자라는 1년생 초본이다. salicorinia 속으로, 짙은 녹색의 줄기와 가지가 가을에 적색으로 변한다. 줄기는 마디가 많고 두드러지며, 가지는 2~3번 갈라져서 마주난다. 가지는 다육질로 비대하고 진한 녹색이며 잎과 가지의 구분이 거의 없다. 키는 10~40cm 자라고 꽃은 7~8월, 가지 사이에 흰녹색으로 보일 듯 말 듯 핀다. 열매는 9월말에서 10월 중순경에 둥글고 납작하게 익으며, 봄부터 여름까지는 줄기와 가지가 진한 녹색이다가 가을이 되면 빨강색으로 물든다.함초는 그 이름대로 맛이 몹시 짜며 거의 지구상에서 유일하게 소금을 흡수하면서 자라는 식물이다. 의서 『신농본초경』에는 함초라고 기록되어 있으며 일본 가이바라의 『대화본초』에는 함초 이외에도 염초, 신초(神草), 복초(福草)라고 기록되어 있다.

함초의 특징은 육초(陸草)이면서도 해수속의 모든 성분을 간직하고 있다는 것으로, 즉 바닷물 속의 쓴맛을 제외한 각종 미네랄과 효소 등을 잎과 줄기에 농축된 상태로 지니고 있는 것이다. 함초는 해안 염습지대에 자생하면서 만조때 바닷물을 한껏 흡수하고 간조때엔 햇볕을 받으면서 광합성을 통해 잎과 줄기에서 수분은 증발되고 해수 속에 들어있는 각종 유효성분만이 남아있게 되는 생리를 지니고 있다. 그 성분 중에는 바다의 각종 미네랄과 효소가 풍부하다.

일반적으로 신경 염증은 뇌 허혈, 알쯔하이머 질환, 파킨슨병, 헌팅톤 질환 및 근위축성 측색 경화증 등의 다양한 신경학적 및 신경퇴행성 질환의 발병에 수반되어 있다 (Allan SM, Rothwell NJ. Cytokines and acute neurodegeneration. Nat Rev Neurosci 2001;2:734-744). 뇌에 고유한 면역 세포인 미세아교 세포(microglia)는 전염증성 사이토카인, 산화 질소(NO) 및 기타 신경독 인자의 생산을 통하여 뇌염증에 있어서 특히 중요한 역할을 수행한다. 활성화된 미세아교세포로부터 종양 괴사 인자 (TNF-α) 와 인터류킨 IL-6 등의 사이토카인 분비 자극에 의해 신경 뉴우런을 직접적으로 손상시킬 수 있다(Liu B, Wang K, Gao HM, Mandavilli B, Wang JY, Hong JS. Molecular consequences of activated microglia in the brain: overactivation induces apoptosis. J Neurochem 2001;77:182-189.).

따라서, 미세아교세포의 세포신호전달 억제는 신경염증성 질환의 개선을 초래할 수 있다.

리포폴리사카라이드(LPS)는 생체 및 시험관내 연구에 있어서 적극적인 모델 면역자극제로서 널리 사용되어 왔다. 이전의 연구에 의하면, LPS는 미세아교세포를 자극하여 유도성 질소 산화물 합성(iNOS), NO 및 인터류킨(IL)-1, IL-6 및 종양 괴사 인자 (TNF-α) 등의 사이토카인류를 생산하는 것이 제안되었다(Gayle DA, Ling Z, Tong C, Landers T, Lipton JW, Carvey PM. Lipopolysaccharide (LPS)-induced dopamine cell loss in culture: roles of tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and nitricoxide. Brain Res Dev Brain Res 2002;133:27-35.).

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020120011981호는 항염증 효과를 갖는 잠분 추출물 및 이를 포함하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 잠분 추출물은 헴 옥시게나제- 1과 시르투인1의 발현을 증대시켜 항염증 효과를 갖는다는 것이 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항염증성 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 염증성 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 함초 추출물을 유효 성분으로 하는 염증성 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 유도성 질소 산화물 합성(iNOS) 및 NO 생산을 약화시키는 것이 바람직하고,

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 미세아교세포에서 미세아교세포 활성을 억제하는 것이 바람직하고,

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 Cox-2 활성을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 함초 추출물을 유효 성분으로 하는 염증성 신경 퇴행성 질환 완화용 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 함초 추출물을 유효 성분으로 하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 함초 추출물을 유효 성분으로 하는 항염증용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 함초 추출물을 유효 성분으로 하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 함초 추출물을 유효 성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해,유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당,옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 함초추출물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

본 발명은 상기 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 또한 결핵 예방 및 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 상기 함초추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기 함초추출물을 유효 성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 결핵 예방 및 치료와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 함초추출물을 투여하는 것을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명에 있어서의 약제조성물 중 유효성분인 함초 추출물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라, 체중 kg 당 6 내지 30㎎을 일일 1회 내지 3회 분복할 수 있다. 특이 증상을 나타내는 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수도 있다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 함초추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내,동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 LPS (lipopolysaccharide)-자극된 BV-2미세아교세포에서 함초 추출물(Salicornia bigelovii extract; 이하, 'SBE'라 함)의 항-산화 및 항-신경염증 활성을 조사하였다.

본 발명은 항산화 활성을 1, 1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radical 소거 에세이를 사용하여 측정하였다. 세포 생존률을 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5- diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 에세이를 사용하여 평가하였다. Western 블럿 분석에 의하여 결정된 염증 매개체의 생산 및 단백질 발현을 분석하기 위하여 LPS로 BV-2 미세아교세포를 자극하였다.

본 발명의 SBE는 DPPH-생성된 자유기를 40 ㎍/mL (p < 0.001)에서 최대 저해를 보이며 현저하게 저해하였다. SBE 단독으로는 BV-2 세포에 대해서 200 ㎍/mL 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다. nitric oxide의 생성에서 LPS-유도된 증가는 농도 의존적으로 SBE에 의하여 농도의존적으로 억제되었다 (각각 10 ㎍/ml에 대해 p < 0.05, 20 ㎍/mL에서 p < 0.01 및 40 ㎍/mL에서 p < 0.001). SBE는 또 iNOS (inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2 (cyclooxygenase-2) 발현에서 LPS-유도된 증가를 저해하였다. 또한, BV-2 세포에서 LPS-자극에 의한 TNF-알파 및 인터루킨-6와 같은 전염증성 사이토카인의 생성을 SBE 전처리에 의하여 억제되었다. 기작 연구는 SBE는 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에서 NFkB 신호전달 경로의 조절에 의하여 작동한다는 것을 나타내었다.

이하 본 발명을 설명한다.

DPPH radical 소거 활성에 대한 SBE 추출물의 효과

도 1A에 나타낸 것과 같이, SBE는 40 ㎍/ml의 농도에서 최대효과를 나타내는 농도 의존적인 형태에서 현저한 DPPH 자유기 소거 활성을 나타낸다(p < 0.001). ESR 분광 데이터를 도 1B에 나타낸다.

BV -2 미세아교세포 생존률에 대한 SBE 의 효과

도 2에 나타낸 것과 같이, 0.1 ㎍/ml에서 200 ㎍/ml 범위의 여러 농도에서 24시간 동안 SBE 처리는 BV-2 미세아교세포에 대한 유의적인 독성을 나타내지 않았다.

BV - 2미세아교세포세포에서 LPS -유도된 NO 생성에 대한 SBE 효과

도 3에 나타낸 것과 같이, LPS 단독으로 처리된 세포는 NO 레벨을 현저하게 증가시켰다(p < 0.001). SBE (10, 20, 40 및 80 ㎍/ml) 전처리는 LPS 단독 처리된 세포에 비교하여 용량 의존적인 형태로 LPS-자극된 증가된 NO 분비를 BV-2 세포에서 현저하게 억제하였다. 최대 효과는 100 ㎍/ml의 농도에서 관찰되었다(p < 0.001).

BV - 2미세아교세포에서 iNOS 및 COX 레벨의 LPS -유도된 발현에 대한 SBE 효과

SBE는 전-염증성 매개체의 발현에 대한 넓은 스펙트럼의 저해 교과를 나타내고 농도 의존적으로 iNOS 및 inducible COX-2과 같은 단백질 발현의 LPS-유도된 증가를 감소시켰다. 그러나 constitutive COX-1 단백질 발현 수준은 방해되지 않았다(도 4).

BV - 2미세아교세포에서 TNF -알파 및 IL -6 생성에 대한 SBE 효과

도 5에 나타낸 것과 같이, TNF-알파 레벨은 비처리된 세포와 비교하여 LPS 처리 후 현저하게 증가하였다(p<0.001). 그러나, SBE는 농도 의존적으로 TNF-알파생성을 현저하게 저해하였다(각각 10 및 20 ㎍/ml에서 p < 0.01, 40 ㎍/ml에서 p < 0.001). LPS 자극은 IL-6 발현을 BV-세포에서 증가시켰다. 그러나, 여러 농도에서 SBE로 전처리는 현저하게 그리고 농도 의존적으로 LPS-유도된 IL-6 레벨을 BV-2 세포에서 감소시켰다(10 ㎍/ml에서 p < 0.05, 20 ㎍/ml에서 p < 0.01 그리고 40 ㎍/ml에서 p < 0.001) (도 6).

LPS - 자극된 BV -2 세포에서 NF - kB 에 대한 SBE 효과

SBE는 IkB-알파 LPS-유도된 인산화 및 분해와 p65 NF-kB의 핵 이동을 농도의존적인 형태로 저해하였다(도 7).

본 발명은 SBE가 NF-kB 신호경로를 통하여 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에서 신경-염증 반응을 저해한다는 것을 처음 밝혔다. 따라서 본 발명은 SBE가 항산화 활성을 가지고, 항-신경염증 효과를 가진다는 것을 처음으로 확인하였고 따라서 미세아교세포-매개된 신경염증을 완화하는 치료제로 개발될 수 있다.

도 1은 DPPH radical 소거 활성에 대한 SBE 추출물의 효과. 여러 농도의 SBE에 의한 DPPH 자유 래디컬 소거 능력 (A) 및 ESR 스펙트럼(B)을 측정. BV-2 세포를 여러 농도(10, 20, 40 및 80 ㎍/ml)에서 SBE를 처리하거나 무처리하였다. DPPH 래디컬에 대한 각 샘플의 소거 활성을 JES-FA ESR 분광계를 사용하여 측정하였다. spin adduct를 정확하게 2분 후에 ESR 분광기로 측정하였다. 데이터는 평균 ±SEM (n = 3)로 나타냄; **p < 0.01 및 ***p < 0.001, 원-웨이 분산 분석에 의하여 대조군과 비교되고 Dunnett 멀티플 레인지 테스트를 수반함. SBE = 함초 추출물
도 2는 BV-2 microglial cell 생존률에 대한 SBE의 효과
SBE 처리된 세포에서 생존률을 MTT 에세이를 사용하여 결정하였다. 그 결과들을 대조군 샘플의 퍼센트로 나타냄. 데이터는 평균 ±SEM (n = 3)로 나타냄. SBE = 함초 추출물
도 3은 BV-2미세아교세포세포에서 LPS-유도된 NO 생성에 대한 SBE 효과. BV-2 세포를 SBE로 기재된 농도(10, 20 및 40 ㎍/ml)로 4시간 동안 LPS (1 ㎍/ml)와 함께 또는 없이 처리하였다. 배양 상등액에서 nitrite는 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. 데이터는 평균 ±SEM (n = 3)로 나타냄.; ^# p < 0.001, 대조군과 비교할 때. *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001, 원-웨이 분산 분석에 의하고 Dunnett 멀티플 레인지 테스트를 수반하여 LPS 단독 처리된 군과 비교할 때. SBE = 함초 추출물
도 4는 LPS-자극된 BV-2미세아교세포에서 iNOS 및 COX-1 및 -2 단백질 발현레벨에 대한 SBE 효과. 여러 농도(10, 20 및 40 ㎍/ml)의 SBE에 의한 LPS-자극된 BV-2미세아교세포에서 iNOS 및 COX-1 및 -2 단백질 발현레벨을 iNOS, COX-1 및 COX-2에 대한 특정 항체로 면역블럿 분석에 의하여 모니터하였다. 베타-액틴을 내부 대조군으로 사용하였다. SBE = 함초 추출물.
도 5는 LPS- 자극된 BV-2 세포에서 전염증성 사이토카인 TNF-알파 발현에 대한 SBE 효과. BV-2 세포를 SBE로 기재된 농도(10, 20 및 40 ㎍/ml)로 4시간 동안 LPS (1 ㎍/ml)와 함께 또는 없이 처리하였다. 배양 상등액에서 TNF-알파 레벨을 제조업자의 지시에 따라서 특정 ELISA 키트를 사용하여 평가하였다. 데이터는 평균 ±SEM (n = 3)로 나타냄.; ^# p < 0.001, 대조군과 비교할 때. *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001, 원-웨이 분산 분석에 의하고 Dunnett 멀티플 레인지 테스트를 수반하여 LPS 단독 처리된 군과 비교할 때. SBE = 함초 추출물
도 6은 LPS- 자극된 BV-2 세포에서 전염증성 사이토카인 IL-6 발현에 대한 SBE 효과. BV-2 세포를 SBE로 기재된 농도(10, 20 및 40 ㎍/ml)로 4시간 동안 LPS (1 ㎍/ml)와 함께 또는 없이 처리하였다. 배양 상등액에서 IL-6를 제조업자의 지시에 따라서 특정 ELISA 키트를 사용하여 평가하였다. 데이터는 평균 ±SEM (n = 3)로 나타냄.; ^# p < 0.001, 대조군과 비교할 때. *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001, 원-웨이 분산 분석에 의하고 Dunnett 멀티플 레인지 테스트를 수반하여 LPS 단독 처리된 군과 비교할 때. SBE = 함초 추출물.
도 7은 LPS- 자극된 BV-2 세포에서 NF-kB 활성에 대한 SBE 효과. LPS- 자극된 BV-2 세포에서 기재된 농도(10, 20 및 40 ㎍/ml)의 SBE에 의한 IkB-알파 발현레벨 및 p65 NF-kB의 핵 이동을 특정항체로 면역블럿 분석에 의하여 모니터하였다.내부 대조군으로 베타-액틴을 사용하였다. 데이터는 평균 ±SEM (n = 3)로 나타냄. SBE = 함초 추출물.
도 8은 함초 추출물 용매분획의 항산화활성 상대비교 도면

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하에 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 함초 추출물의 조제

건조된 함초 전체(5 kg)를 대한민국 전통시장으로부터 2012년 5월 동안 모아서, 전문가인 건국대학교 김종보 교수로부터 확인받았다. 바우처 견본(HC-KU2012)을 추후 레퍼런스를 위하여 본 발명자들의 식물 표본실에 보관하였다. 함초 추출물을 얻기 위하여, 건조된 식물 재료를 믹서로 갈고 3 부피의 에탄올로 3회 탈지하였다. 잔류물을 히팅 맨틀에서 2시간 동안 에탄올로 1:10 비율(w/v)로 70~80℃에서 추출하였다. 그 상등액을 여과하고 50℃에서 로터리 증류기로 농축하였다. 추가 분획화를 위하여, 그 추출물(1Kg)을 헥산, 클로로포름 및 에틸 아세테이트(EA) 분획으로 각각 220 mg, 50 mg 및 456 mg으로 분획화하였다. 함초 추출물의 활성 에틸 아세테이트 분획 (SBE, 45.6%)을 동결건조하고 추가 실험에 사용 때까지 -20℃에서 냉장하였다. SBE 추출물을 증류수에 재용해하여 항산화 및 항-신경염증 활성을 측정하기 위하여 0.22 um 필터로 여과하였다. 본 발명에서 사용한 다른 시약들은 통상적으로 구할 수 있는 최고 등급이었다.

실시예 2: DPPH radical 소거 활성

SBE의 항-산화 활성을 안정한 radical DPPH (2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 결정하였다. radical 소거 능력을 SBE 추출물의 알리쿼트 및 DPPH 메탄올 용액으로 구성된 반응 혼합물을 채택하여 평가하였다 [Sanches-Moreno C, Plaza L, Ancos B, Cano MP. Food Chem 2006; 98: 749-756]. 요약하면, 60 ㎕의 각 OFP-EA 추출물의 샘플 용액을 60 ㎕ DPPH (60 μM) 메탄올 용액에 첨가하였다. 10 초간 힘차게 혼합한 후, 그 혼합물을 100 ? Teflon 모세관 튜브에 옮긴 후 DPPH radical에 대한 각 샘플의 소거 활성을 JES-FA ESR 분광계(Jeol Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. spin adduct를 2분 후 ESR 분광계 상에서 측정하였다. 실험 조건은 다음과 같았다: 중앙 장, 3,475 G; 변조 주파수(modulation frequency), 100 kHz; 변조 진폭, 2 G; 초음파 파워, 5 mW; gain, 6.3 x 10⁵, 및 온도, 298K.

실시예 3:세포 배양 및 생존률

BV-2 microglia 세포를 37 ?, 5 % CO2 조건하에서 5 % FBS(fetal bovine serum ;FBS, Hyclone, Logan, UT, USA) 및 50 ㎍/ml penicillin-streptomycin (Invitrogen)가 보충된 DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. 모든 실험에서, 세포를 혈청 없는 DMEM에서 LPS (1 ㎍/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 첨가 전에 1시간 동안 기재된 농도의 SBE로 전처리하였다. 동일 부피의 멸균 수를 모든 대조군 처리에 첨가하였다. 세포 생존률을 MTT[3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]에세이로 결정하였다[13]. 세포를 4시간 동안 MTT로 처리한 후 24시간 동안 여러 농도(0.1, 1.0, 10, 40, 60, 80, 100 및 200 ㎍/ml)의 SBE로 배양한 후 100 ㎕의 이소프로판올(0.04N 염산 내)을 formazan 결정을 용해하기 위하여 첨가하였다. 그 흡광도를 570 nm에서 Anthos 2010 분광계(Salzburg, Austria)를 사용하여 읽었다. 세포 생존률을 대조군과 비교한 상대적인 흡광도로 계산하였다.

실시예 4: Nitric oxide 에세이

활성화된 microglia에 의한 NO 생성의 최종 산물로 안정한 nitrite의 양은 비색법으로 결정하였다[Green LC, Wagner DA, Glogowski J, Skipper PL, Wishnok JS, Tannenbaum SR. Anal Biochem 1982; 126: 131-138]. 요약하면, BV-2 세포(2 x 10⁵cells/ml)를 500 ㎕ 완전 배양 배지에서 6-웰 플레이트에 시딩하고 2시간 동안 LPS (1 ㎍/ml)로 자극 전에 1시간 동안 기재된 농도(10, 20 및 40 ㎍/ml)에서 SBE 추출물로 처리하였다. 50 ㎕의 배양 상등액을 동일 부피의 Griess 시약으로 혼합하고 상온에서 10분간 배양하였다. 540 nm에서 흡광도를 PowerWavex Microplate Scanning 분광계(Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA)를 사용하여 읽었다. Nitrite 농도를 sodium nitrite 표준 곡선으로부터 외삽법에 의하여 결정하였다.

실시예 5:핵 단백질 추출 및 웨스턴 블럿 분석

세포를 냉장 PBS로 3회 세척하고 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 % (v/v) Tergitol- type NP -40 (NP-40), 0.25 % sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Sodium orthovanadate (Na3VO4) 및 프레테이즈 저해제 칵테일(Complete MiniTM, Roche, Mannheim, Germany)을 포함한 버퍼에서 4℃에서 파쇄하였다. 그 파쇄액을 비수용성 성분들을 제거하기 위하여 10,000 g, 20 분, 4℃ 조건에서 원심분리하여 청징하였다. 세포 파쇄액을 BCA (bicinchoninic acid) 시약(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 단백질 양을 표준화하였다. 동일 양의 단백질을 10 % PAGE(poly acryl amide gel electrophoresis) 상에 로딩하고 표준 SDS (sodium dodecyl sulphate)-PAGE 방법에 의하여 분리하였다. 단백질들을 NC 막(S&S, Dassel, Germany)으로 옮기고 5% 탈지 분유 TBS 용액으로 불록킹하였다. 단백질 발현을 검출하기 위하여, 그 블럿들을 내부 대조군으로 베타-액틴을 사용하여 iNOS (1:1000), COX-1 (1:1000), COX-2 (1:1000), NF-kB, IkB-알파(1:1000), anti-p-IkB-알파 및 베타-actin (1:2000)에 대한 특정 항체들로 프로브하고 1시간 동안 horseradish peroxidase-부착된 2차 항체(1:1000-2000)(Bio-Rad, Herculus, CA, USA)로 배양하였다. 막 상에 면역반응 단백질들을 X-선 필름 상에서 West-Save 기질 (Lab-Frontier, Seoul, Korea)을 사용한 화학발광에 의하여 검출하였다. Inos(inducible nitric oxide synthase), COX(cyclooxygenase ) -1, COX-2, NF(nuclear factor;NF-kB), I kappa B-alpha (IkB-알파 및 베타-actin에 대한 항체들은 Cell Signaling Technology Inc (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다.

실시예 6: IL -6 에세이

BV-2 microglia 세포(1 x 10⁵ 세포/웰)을 96-웰 플레이트에 배양하고 LPS (1㎍/ml)를 첨가 또는 첨가하지 아니하고 기재된 농도에서 SBE로 처리하였다. LPS 처리 4시간 후, 그 세포를 모으고 그 상등액을 제조업자의 지시에 따라 IL-6 양을 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)로부터 구입한 murine IL-6 ELISA 키트를 사용하여 수행하였다.

실시예 7: TNF -알파 에세이

BV-2 미세아교세포(1 x 10⁵ 세포/웰)를 96-웰 플레이트 상에서 배양하고 기재된 농도의 SBE로 1시간 동안 처리하고 LPS (1 ㎍/ml)로 자극하였다. LPS 처리 4시간 후, 그 세포들을 모아서 그 상등액을 제조업자의 지시에 따라 양을 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)로부터 구입한 murine IL-6 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.

실험예

본 실험에서 전자 공여능(electron donating ability, EDA)은 Blois 등의 방법을 사용하여 측정하였다. 즉 각 시료 0.2ml (6.0mg/ml)에 4x10^-4M DPPH 용액(1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)을 첨가하고 10분 후 분광광도계를 사용하여 525nm에서 흡광도를 측정하였다.

시료인 함초 추출물 용매 분획의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과, 폴리페놀의 함량과 마찬가지로 chloroform 과 ethyl acetate 분획에서의 항산화 활성이 다른 분획과 비교하여 많은 차이를 보였으며 ethyl acetate 분획이 가장 높은 활성을 나타내었다. 항산화 물질인 vitamin C와 비교한 항산화력을 도 8에 나타내었다.

본 발명의 모든 데이터는 적어도 3회 독자적인 시험의 평균 ±SEM로 나타내었다. 통계분석을 Dunnett 멀티플 레인지 테스트를 수반하는 원-웨이 분산분석을 사용하여 SAS 통계 소프트웨어(SAS Institute, Cray, NC, USA)를 사용하여 수행하였다. P < 0.05를 통계적으로 유의적인 것으로 간주되었다.

Claims

함초 추출물을 유효 성분으로 하는 염증성 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 유도성 질소 산화물 합성(iNOS) 및 NO 생산을 약화시키는 것을 특징으로 하는 염증성 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 미세아교세포에서 미세아교세포 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 Cox-2 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
함초 추출물을 유효 성분으로 하는 염증성 신경 퇴행성 질환 완화용 식품 조성물.
함초 추출물을 유효 성분으로 하는 항염증용 약학 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 조성물은 유도성 질소 산화물 합성(iNOS) 및 NO 생산을 약화시키는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 조성물은 Cox-2 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학 조성물.
함초 추출물을 유효 성분으로 하는 항염증용 기능성 식품 조성물.
함초 추출물을 유효 성분으로 하는 항산화용 조성물.