KR20230084189A - 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 항바이러스제 - Google Patents
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Abstract
신종 코로나 바이러스 감염증 (COVID-19) 의 예방 또는 치료를 위한, 마황 엑기스, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스, 또는 마황 엑기스 유래의 고분자 축합형 타닌을 유효 성분으로서 포함하는 의약품 제제, 한방 제제, 식품 그 밖의 조성물의 사용. 바람직하게는, 이들 조성물은 경구 섭취 가능한 형태로 제공된다.
Description
본 발명은, 마황 엑기스, 마황 엑기스로부터 에페드린알칼로이드를 제거한 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 (Ephedrine alkaloids-free Ephedra Herb extract : EFE), 및/또는, 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 유효 성분으로 하고, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항바이러스제에 관한 것이다.
신종 코로나 바이러스 감염증 (COVID-19) 은, 세계적인 감염 확대가 발생하고 있으며, 그 예방법 및 치료법의 확립이 중요한 과제가 되고 있다. 이와 같은 배경에서, 다양한 기존의 의약품으로부터 COVID-19 의 치료에 유효한 것을 시급하게 찾아내는 연구가 진행되고 있다. 그러나, 코로나 바이러스 이외의 바이러스에 대하여 유효성이 확인되어 있는 약제여도, 신종 코로나 바이러스 (SARS-CoV-2) 에 대하여 유효한지는, 용이하게 예상할 수 없어, 감염 기구에 기초한 분자 레벨이나 세포 레벨에서의 평가 실험에 의해 유효성을 검증할 필요가 있다.
현재까지, 일본 내에서 승인되고 있는 치료약을 이하의 표에 나타낸다 (비특허문헌 1 : 신종 코로나 바이러스 감염증 진료의 지침서 제 5.3 판, 2021년 8월 29일/일간 약업 2021년 9월 27일). 항체 의약품의 로나프레브와 제부디 이외에는, 중등증 (中等症) 이상의 환자에 대한 치료약이다. 로나프레브와 제부디는, 점적 정맥 주사이기 때문에, 치료할 수 있는 의료 기관에 제한이 있고, 약값도 10 만엔 이상 하는 것으로 일컬어지고 있으며, 항체 때문에 증산도 어렵다. 이 때문에, 자택 요양 중인 경증자에게 안전하고 또한 저렴하게 투여할 수 있는 경구 치료약이 요구되고 있다.
한방약은, 복수의 생약을 조합한 한방 처방의 엑기스이며, 전통적으로 다양한 질병의 치료에 사용되어 왔다. 한방약의 적용은, 현대 의학과는 상이한 한방 의학적 개념에 기초하여 처방되고 있다. 따라서, COVID-19 에 대한 한방 치료가 기대되고 있다. 이와 같은 배경에서, 한방 의학적 개념에 추가하여, 지금까지의 지견을 근거로 하여, 몇 가지의 한방약이 후보약으로서 제안되어 있다 (비특허문헌 2, 비특허문헌 3). 그러나, 구체적인 에비던스는 없어, 가능성의 제시에 그치고 있다. 또, 중국에서 전통적으로 사용되고 있는 복수의 생약의 엑기스인 중의약, 청폐 배독탕에 대해, 후보약이 되는 것이 제안되어 있다 (비특허문헌 2, 비특허문헌 4). 그러나, 청폐 배독탕은 항바이러스제로서의 작용 기전은 불분명하고, 모든 생약, 혹은, 특정한 복수의 생약의 조합으로 효과를 나타내는지, 특정한 생약 엑기스 단독으로도 유효한지에 대해서는 보고되어 있지 않다.
상기 서술한 바와 같이, 생약은 한방약 등의 전통약으로서 사용되고 있다. 생약은, 노지에서의 재배, 혹은, 자생하고 있는 것을 수확하고, 건조시켜 사용하고 있다. 따라서, 동일한 종이라도, 채취 계절이나 기후 등의 불확정 인자의 영향을 받아, 성분 함량이 변동되는 경우가 있다. 항바이러스 작용을 갖는 생약이나 한방약 등을 경험적으로 사용하는 것은 가능하지만, 채취된 로트의 역가는 불확정이기 때문에, 효능 효과를 표방한 의약품으로서 제공하기 위해서는, 적절한 시험을 실시하여, 적절한 규격에 적합한 것을 확인해야 한다.
마황은, 일본 약국방에 수재되어 있는 의약품으로서, 그 약효는, 거의 전부 에페드린알칼로이드에서 기인하는 것으로 믿어져 왔다. 그러나, 발명자들은, 마황에, 에페드린알칼로이드에 의존하지 않는 유용한 약효를 알아내고, 부작용의 원인 물질인 에페드린알칼로이드를 선택적으로 제거함으로써, 안전성이 높은 의약품으로서 마황 엑기스를 제공할 수 있다는 발상에 이르러, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 항암·항전이약, 동통 억제약, 항인플루엔자 바이러스약으로서의 용도를 나타내 왔다 (특허문헌 1, 비특허문헌 5). 또한, 발명자는, 중량 평균 분자량 45,000 이상의 마황 유래 고분자 축합형 타닌이 이것들의 약효에 관여하고 있는 것을 밝히고 있다 (특허문헌 2, 비특허문헌 6).
이와 같이, 마황 엑기스, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스, 및 마황 유래 고분자 축합형 타닌은, 몇 가지의 약효를 갖는 것이 나타나 있지만, 신종 코로나 바이러스에 대한 항바이러스 작용은 보고가 없다. 또, 지금까지의 지견으로부터 항신종 코로나 바이러스 작용을 나타내는지, 당업자라 하더라도 불분명하였다.
그러나, 마황 엑기스, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스, 및 마황 유래 고분자 축합형 타닌이, 항코로나 바이러스 작용을 갖고 있는 것이 밝혀지면, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항코로나 바이러스제로서 제공할 수 있다. 또, 주된 약효 성분을 정량하는 방법을 개발함으로써, 마황 엑기스나 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 뿐만 아니라, 경험적으로 신종 코로나 바이러스 감염증의 치료에 사용되고 있는 마황을 함유하는 한방약에 대해서도, 구성 생약으로서 사용하고 있는 마황의 항바이러스 작용을 담보한 의약품으로서 제공할 수 있다.
신종 코로나 바이러스 감염증 진료의 지침서 제 5.3 판, 2021년 8월 29일
와타나베 켄지, Jin Chengjun, 시바야마 치카노, Liu Jianping, Jia Liqun, Jin, Yan Hongrong, [긴급 기고] 신종 코로나 바이러스 감염증 (COVID-19) 에 대한 한방의 역할, 주간 일본 의사 (醫事) 신보 5008 호, p44 (2020년 04월 18일 발행)
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Oshima N, Yamashita T, Hyuga S, Hyuga M, Kamakura H, Yoshimura M, Maruyama T, Hakamatsuka T, Amakura Y, Hanawa T, Goda Y, Efficiently prepared ephedrine alkaloids-free Ephedra Herb extract : a putative marker and antiproliferative effects. J Nat Med. 2016 ; 70 : 554-62.
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본 발명의 과제는, 신종 코로나 바이러스 감염증 (COVID-19) 의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항바이러스제를 제공하는 것에 있다.
본 발명에는, 기존약이나 의약품 후보 조성물의 항코로나 바이러스 작용에 대해, 코로나 바이러스의 감염 기구에 기초한 분자 레벨이나 세포 레벨에서의 평가 실험에 의한 검증이 필요하다.
본 발명자들은, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 유용한 조성물로서, 마황 엑기스, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스, 및 마황 유래 고분자 축합형 타닌에 대해, 신종 코로나 바이러스의 감염 기구에 기초한 분자 레벨이나 세포 레벨에서의 평가 실험을 실시한 결과, 항신종 코로나 바이러스 작용을 갖는 것을 알아내고, 또한, 항신종 코로나 바이러스 작용의 주성분인 고분자 축합형 타닌을 겔 침투 크로마토그래피로 분리하는 기술로 유효성을 담보하는 방법을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 대표적인 양태로서, 이하의 (1) ∼ (11) 을 제공하는 것이다.
(1) 마황 엑기스를 유효 성분으로 하고, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
(2) 마황 엑기스로부터 에페드린알칼로이드를 제거한 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 유효 성분으로 하고, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
(3) 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 유효 성분으로 하고, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
(4) 의약품 제제 또는 한방 제제의 형태인, 상기 항바이러스제.
(5) 식품의 형태인, (2) 또는 (3) 에 기재된 항바이러스제.
(6) 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 또는 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 포함하는 음식물을 경구적으로 섭취시키는 것을 포함하는, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방을 위한 방법 (바람직하게는, 의료 행위를 제외한다).
(7) 마황 엑기스 또는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 또는 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 유효 성분으로서 함유하는 의약품을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 방법.
(8) 고분자 축합형 타닌을 겔 침투 크로마토그래피로 정량함으로써, 상기 (1) ∼ (5) 에 기재된 조성물의 항바이러스제로서의 유효성을 담보하는 방법.
(9) 마황 엑기스가 고분자 축합형 타닌을 0.01 ％ 이상 포함하는, (1) 의 항바이러스제.
(10) 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스가 고분자 축합형 타닌을 0.01 ％ 이상 포함하는, (2) 의 항바이러스제.
(11) 다른 COVID-19 치료약을 대상에 투여하는 것을 추가로 포함하는, (6) 또는 (7) 의 방법.
본원발명에 의해, 마황 엑기스, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 (EFE), 및 고분자 축합형 타닌을 항신종 코로나 바이러스제로서 제공할 수 있는 것이 밝혀졌다. 또, 항신종 코로나 바이러스 작용의 주성분이 분자량 10,000 ∼ 500,000 의 고분자 축합형 타닌인 것이 밝혀지고, 항바이러스제로서의 유효성을 담보하는 겔 침투 크로마토그래피에 의한 정량법을 확립할 수 있었다.
이미 서술한 바와 같이, COVID-19 의 환자에게 안전하고 또한 저렴하게 투여할 수 있는 경구 치료약이 요구되고 있다. 2021년 9월 현재, 세계에서 개발 중인 경구 치료약을 이하의 표에 나타낸다.
EFE 이외의 치료약은 RNA 폴리메라아제 저해제와 메인 프로테아제 저해제이며, EFE 와 동일한 작용 기전의 경구 치료약은 없다. EFE 는 로나프레브 및 제부디와 동일한 작용 기구로, SARS-CoV2 의 스파이크 단백질에 결합하여, 숙주 세포에 대한 결합을 저지한다. 상기 표의 경구 치료약이 EFE 보다 먼저 의약품화되어도, 작용 기전이 상이하기 때문에, EFE 와의 병용도 가능하다. 또, 경구 치료약은 환자가 자택에서 복용하기 때문에, 안전성이 가장 중요한데, EFE 는 부작용 성분을 제거하고 있기 때문에 안전성이 높다. 또한 로나프레브나 제부디보다 저렴하게 공급할 수 있고, EFE 의 작용 기전으로부터, 의료 종사자, 밀접 접촉자나, 백신 접종을 할 수 없는 자에 대한 예방적 투여가 가능할 것으로 생각된다. 최근, EFE 가 SARS-CoV-2 의 변이주에 대해서도 유효한 것이 밝혀졌다. 실시예에서 나타내는 바와 같이, EFE 는 SARS-CoV-2 의 다양한 변이주의 감염을 저해한다. 따라서, 새롭게 출현하는 변이로의 위협에도 대응이 가능하다.
EFE 의 유효 성분은 고분자 축합형 타닌의 혼합물 (마황 유래 고분자 축합형 타닌) 인 것으로 생각되며, 다양한 구조와 다양한 분자량을 갖고 있다. 발명자들은, 이론에 구속될 의도는 없지만, 이와 같이 다양한 구조와 다양한 분자량을 갖는 것이, 마황 엑기스 또는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 (EFE) 또는 마황 유래 고분자 축합형 타닌의 다양한 약효 (항암·항전이약, 동통 억제약, 항인플루엔자 바이러스약으로서의 용도) 의 이유일 것으로 생각하고 있다. 본 발명자들은, EFE 및 마황 유래 고분자 축합형 타닌이 인플루엔자 바이러스의 감염 저해 작용을 발휘하는 것을 확인하고 있다. 인플루엔자 바이러스와 신종 코로나 바이러스의 구조의 차이의 쪽이, 신종 코로나 바이러스의 변이보다 크지만, 어느 쪽의 바이러스도 저해할 수 있는 것을 생각하면, EFE 나 마황 유래 고분자 축합형 타닌은, 장래적으로 출현하는 신종 코로나 바이러스 (SARS-CoV-2) 의 변이에 대해서도 폭넓게 대응 가능할 것으로 기대된다.
이상의 점에서, 마황 엑기스, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스, 및/또는, 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 유효 성분으로 하는 의료용 또는 일반용 의약품인 항신종 코로나 바이러스제를 신종 코로나 바이러스 감염증의 치료에 사용함으로써, 입원 관리를 필요로 하지 않고, 자택이나 숙박 시설 요양 중인 감염 초기의 경증 환자의 중증화를 억제하는 것이 가능하다.
또, 항신종 코로나 바이러스제를 일반용 의약품으로서 제공할 수 있기 때문에, 의료 종사자나 밀접 접촉자가 셀프메디케이션에 의한 조기의 예방적 치료가 가능해진다. 또한, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스나 마황 유래 고분자 축합형 타닌은, 부작용 성분인 에페드린알칼로이드를 포함하지 않기 때문에, 식약 구분상, 식품으로서의 이용이 가능하기 때문에, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방을 기대한 보건 기능 식품으로서 제공할 수도 있다.
또한, 마황을 함유하는 한방약을 비롯하여, 마황 엑기스, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스, 및 고분자 축합형 타닌에 대해, 항신종 코로나 바이러스제로서의 유효성을 담보하는 방법을 제공할 수 있다.
도 1 은, 신종 코로나 바이러스 감염 세포에 대한 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가에 의한 바이러스 카피수의 영향을 나타내는 그래프이다. VeroE6/TMPRSS2 세포에 있어서의 신종 코로나 바이러스의 N1 RNA 카피수에 대해, 컨트롤 조건 (흑색 동그라미) 및 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가 조건 (삼각) 의 거동을 나타낸다. x 축 : 바이러스 접종 후의 경과 시간 y 축 : SARS-CoV-2 RNA 카피수.
도 2 는, 신종 코로나 바이러스 변이주에 대한 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 감염 저해 효과를 나타낸다.
도 3 은, 신종 코로나 바이러스의 감염에 관련된 스파이크 단백질의 S1 도메인에 대한 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 성분의 결합을 나타내는 센서그램이다. 실측값 (실선) 에 피팅되는 결합 모델에 의한 예측값 (파선) 을 나타냈다.
도 4 는, 신종 코로나 바이러스 감염에 관련된 스파이크 단백질에 대한 마황 유래 고분자 축합형 타닌의 결합을 나타내는 센서그램이다. 400 nM, 200 nM, 및 100 nM 고분자 축합형 타닌에 대해, 각 실측값 (실선) 에 피팅되는 결합 모델에 의한 예측값 (각 파선) 을 나타냈다.
도 5 는, 마황 유래 고분자 축합형 타닌 (EMCT) 에 의한 신종 코로나 바이러스의 스파이크 단백질과 ACE2 의 결합 저해 작용을 나타내는 그래프이다. 50 ％ 결합 저해 농도 (IC50) 는, 4 파라미터 로지스틱 회귀의 결과 (실선), 3 ng/mL 로 산출되었다.
도 6 은, MHV 감염 5 일째의 우측폐의 바이러스량을 나타낸다.
도 7 은, MHV 감염 5 일째의 호흡 상태를 나타낸다.
도 8 은, 프로안토시아니딘 A 타입 및 프로안토시아니딘 B 타입의 구조 및 그 구성 유닛의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2 는, 신종 코로나 바이러스 변이주에 대한 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 감염 저해 효과를 나타낸다.
도 3 은, 신종 코로나 바이러스의 감염에 관련된 스파이크 단백질의 S1 도메인에 대한 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 성분의 결합을 나타내는 센서그램이다. 실측값 (실선) 에 피팅되는 결합 모델에 의한 예측값 (파선) 을 나타냈다.
도 4 는, 신종 코로나 바이러스 감염에 관련된 스파이크 단백질에 대한 마황 유래 고분자 축합형 타닌의 결합을 나타내는 센서그램이다. 400 nM, 200 nM, 및 100 nM 고분자 축합형 타닌에 대해, 각 실측값 (실선) 에 피팅되는 결합 모델에 의한 예측값 (각 파선) 을 나타냈다.
도 5 는, 마황 유래 고분자 축합형 타닌 (EMCT) 에 의한 신종 코로나 바이러스의 스파이크 단백질과 ACE2 의 결합 저해 작용을 나타내는 그래프이다. 50 ％ 결합 저해 농도 (IC50) 는, 4 파라미터 로지스틱 회귀의 결과 (실선), 3 ng/mL 로 산출되었다.
도 6 은, MHV 감염 5 일째의 우측폐의 바이러스량을 나타낸다.
도 7 은, MHV 감염 5 일째의 호흡 상태를 나타낸다.
도 8 은, 프로안토시아니딘 A 타입 및 프로안토시아니딘 B 타입의 구조 및 그 구성 유닛의 구조를 나타내는 도면이다.
본 발명은, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용의 항바이러스제로서, 마황 엑기스, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스, 및 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 사용하는 것, 및 이것들을 유효 성분으로서 포함하는 의약품이나 식품 등의 조성물을 제공한다.
마황 엑기스의 제조
본 발명에 사용되는 마황 엑기스는, 마황과 식물 Ephedra sinica Stapf, Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer 또는 Ephedra equisetina Bunge (Ephedraceae) 의 지상경을 사용한다. 생, 건조 혹은 지상경을 가공한 것을 이용할 수 있다. 마황 엑기스의 추출 공정은, 주지의 방법 중 어느 것에 기초하여 실시할 수 있다. 추출 용매로는, 물 또는 온수, 열수, 알코올계 용매, 및 아세톤 등 그 밖의 유기 용매를 사용할 수 있다. 알코올계 용매로는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올 등을 예시할 수 있다. 이들 용매는 단독으로 사용해도 되고, 조합하여 사용해도 된다.
추출 용매의 양은 마황의 건조 중량에 대하여, 2 ∼ 100 중량부, 4 ∼ 50 중량부, 또는 8 ∼ 25 중량부인 것이 바람직하다. 추출 온도는 4 ∼ 98 ℃ 가 바람직하다. 추출 시간은 30 분 ∼ 2 시간이 바람직하다. 추출 방법은 교반 추출, 침지 추출, 향류 추출, 초음파 추출, 초임계 추출 등의 임의의 방법으로 실시할 수 있다. 일 양태에 있어서, 추출 용매는 물이고, 그리고, 마황 엑기스는, 마황의 열수 추출액 및/또는 열수 추출물일 수 있다. 마황의 열수 추출액 및/또는 열수 추출물은, 마황의 건조 원료에 대하여, 2 ∼ 100 중량부, 4 ∼ 50 중량부, 또는 8 ∼ 25 중량부, 또는 약 10 중량부의 열수 (예를 들어, 약 95 ℃) 로, 30 분 ∼ 2 시간 추출함으로써 얻어진다.
얻어진 추출액, 또는 추출액을 여과시켜 얻어진 여과액, 혹은 여과액을 농축시킨 농축액, 농축액을 건조시켜 얻어지는 건조물은, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 혹은 마황 유래 고분자 축합형 타닌의 제조의 원료로서 사용할 수 있다.
또, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항바이러스제를 용도로서의 마황 엑기스 원약이나 한방약 원료 엑기스로서 사용하는 경우, 후술하는 분자량 10,000 ∼ 500,000 의 고분자 축합형 타닌을 0.01 ％ 이상 포함하는 것이 바람직하고, 0.1 ％ 이상 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 그러한, 분자량 10,000 ∼ 500,000 의 고분자 축합형 타닌을 0.01 ％ 이상 또는 0.1 ％ 이상 포함하는 것을 나타낸 마황 엑기스도 본 발명의 범위 내이다.
에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조
본 발명에 사용되는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스는, 마황 엑기스를 원료로 하고, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 에페드린을 제거하고, 농축 건조를 거쳐, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 얻을 수 있다.
에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스는, 마황 엑기스로부터 에페드린알칼로이드를 제거한 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스이며, 에페드린알칼로이드 (에페드린과 슈도에페드린의 합계) 를 0.23 ％ 이하의 양으로 포함하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 에페드린알칼로이드를 0.023 ％ 이하의 양으로 포함하는 것이고, 더욱 바람직하게는 0.05 ppm (검출 한계) 이하의 양으로 포함한다.
일본 약국방에서는, 마황은 생약의 건조물에 대하여, 총 알칼로이드 (에페드린 및 슈도에페드린) 를 0.7 ％ 이상 포함한다고 규정되어 있으며, 이 양은 마황 엑기스로 환산한 경우, 약 2.3 ％ ∼ 3.5 ％ 이상 포함하는 것으로 계산되므로, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스는 마황 엑기스와 명확하게 구별된다.
또한, 상기 마황 엑기스 중의 총 알칼로이드 함량의 환산은,「한방의 주장-현대 과학과 한방 제제」(나리카와 이치로, p162-163, (주) 켄유칸, 1991년 발행) 및 참고예 1 로부터 구해진다. 일본 약국방의 마황으로 마황 엑기스를 제조하면, 마황에 포함되는 에페드린알칼로이드는, 거의 전부 마황 엑기스로 이행된다. 그러나, 마황으로부터 얻어지는 마황 엑기스의 수율은 20 ％ 내지 30 ％ 가 되기 때문에, 마황 엑기스에 포함되는 총 알칼로이드는, 3.3 배 ∼ 5 배로 농축된다. 따라서, 일본 약국방에서 규정되는 마황의 총 알칼로이드인「0.7 ％ 이상」을 3.3 배 ∼ 5 배로 한 수치 2.3 ％ ∼ 3.5 ％ 이상이 마황 엑기스의 총 알칼로이드의 규정값이 된다. 본 발명에 사용되는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스는, 에페드린알칼로이드 함량을, 마황 엑기스의 10 분의 1 이하로 함으로써, 에페드린알칼로이드의 부작용의 출현 가능성이 매우 적을 것으로 생각된다.
에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조에 적합한 양이온 교환 칼럼은, 에페드린알칼로이드의 제거 효율에 따라, 충전제를 선택할 수 있다. 에페드린알칼로이드 함량이 0.23 ％ 이하인 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조에는, 약산성 양이온 교환 수지 WK20, 강산성 양이온 교환 수지 SK104, SK110, SK1B, UBK530, PK216, IR120B, FPC3500, 1060H 중에서 칼럼 충전제로서 선택할 수 있다. 에페드린알칼로이드 함량이 0.023 ％ 이하인 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 제조에는, 약산성 양이온 교환 수지 WK20, 강산성 양이온 교환 수지 SK104, SK110, SK1B, UBK530, PK216, IR120B, 1060H 중에서 칼럼 충전제로서 선택할 수 있다. 또한, 에페드린알칼로이드 함량이 0.05 ppm 이하인 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조에는, 강산성 양이온 교환 수지 PK216 을 칼럼 충전제로서 선택할 수 있는 것 외에, 강산성 양이온 교환 수지 SK1B, IR120B 도 선택할 수 있다.
또, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항바이러스제를 용도로서의 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 원약으로서 사용하는 경우, 후술하는 분자량 10,000 ∼ 500,000 의 고분자 축합형 타닌을 0.01 ％ 이상 포함하는 것이 바람직하고, 0.1 ％ 이상 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 그러한, 분자량 10,000 ∼ 500,000 의 고분자 축합형 타닌을 0.01 ％ 이상 또는 0.1 ％ 이상 포함하는 것을 나타낸 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스도 본 발명의 범위 내이다.
에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조에 있어서, 크로마토그래피의 구체적인 실시 방법은, 당업자에게 주지된 방법 중 어느 것에 의한 것이다. 건조 방법은, 감압 건조, 동결 건조, 스프레이 건조 등의 임의의 방법으로 실시할 수 있다. 필요한 경우에는 덱스트린 등의 부형제를 넣어도 된다.
마황 유래 고분자 축합형 타닌의 제조
본 발명의 마황 유래 고분자 축합형 타닌은, 분자량 10,000 ∼ 500,000 의 고분자 축합형 타닌이며, 프로안토시아니딘 A 타입 및 프로안토시아니딘 B 타입이 중합된 프로안토시아니딘이다. 보다 상세하게는, 상기 고분자 축합형 타닌은, 익스텐션 유닛으로서, 카테콜 타입 또는 피로갈롤 타입의 플라반 3-올이 주로 프로안토시아니딘 B 타입으로 축합되고, 그 일부에 프로안토시아니딘 A 타입의 축합형 타닌 유닛을 포함하고, 또한 터미널 유닛으로서, 카테콜 타입 또는 피로갈롤 타입의 플라반 3-올을 주로 포함하고, 피로갈롤 타입과 카테콜 타입을 4 ∼ 5 : 1 의 비율로 포함한다 (도 8). 여기서, 분자량은, GPC 용 표준 폴리스티렌을 표준 물질로 하여 환산한 분자량이다.
본 발명의 마황 유래 고분자 축합형 타닌은, 마황 엑기스 혹은 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 원료로 하고, 칼럼 크로마토그래피에 의해, 물과 알코올, 혹은, 물과 아세톤의 혼합 용매를 사용하여, 알코올 혹은 아세톤 농도를 높이면서 순차적으로 용출시켜 얻을 수 있다. 분자량 10,000 ∼ 500,000 의 고분자 축합형 타닌을 포함하는 추출 분획물로부터 용매를 증류 제거하고, 건조시킨 것을 원약으로서 사용할 수 있다.
구체적으로는, 마황 엑기스 또는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 물에 용해시킨 것을, 극성이 낮은 유기 용매에서부터 극성이 높은 유기 용매를 사용하여 순차적으로 분배하고, 얻어지는 수 (水) 엑기스를 칼럼 크로마토그래피에 의해, 물과 메탄올, 에탄올 또는 아세톤에서 선택되는 유기 용매의 혼합 용매를 사용하여, 유기 용매 농도를 높이면서 순차적으로 용출시키고, 얻어지는 각 분획의 분자량을 측정하여, 분자량 10,000 ∼ 500,000 의 고분자 축합형 타닌을 포함하는 추출 분획물을 얻는다.
극성이 낮은 유기 용매의 예로는, 헥산, 디에틸에테르, 아세트산에틸 등을 들 수 있고, 극성이 높은 유기 용매의 예로는, n-부탄올, 에탄올, 메탄올, 물 등을 들 수 있다. 분획에 사용하는 칼럼 크로마토그래피에서는, Diaion HP-20 등의 스티렌-디비닐벤젠계 합성 흡착제, 혹은, LH-20 등, 그 밖의 방향족계 합성 흡착제를 사용할 수 있다. 각 분획의 분자량 측정은, 점도법, 겔 침투 크로마토그래피 (GPC), 질량 분석법, 삼투압법 등을 사용할 수 있다.
더욱 구체적으로는, 마황 엑기스 또는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 물로 용해시킨 것, 혹은, 이들 엑기스를, 아세트산에틸, 수 포화 n-부탄올로 순차적으로 분배하여 얻은 수 엑기스를 이하의 크로마토그래피의 출발 재료로 한다. 이들 엑기스에 대해, Diaion HP-20 칼럼 크로마토그래피를 사용하여, H2O, 20 ％ MeOH, 40 ％ MeOH, MeOH 의 순서로 순차적으로 용출시키고 분획하여, H2O 분획물, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물의 각 분획물을 얻는다. 이 중, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물로서, 분자량 10,000 ∼ 500,000 의 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 얻을 수 있다.
본 발명의 마황 유래 고분자 축합형 타닌은, 20 ％ MeOH 분획물, 40 ％ MeOH 분획물, MeOH 분획물을 단독으로, 또는 임의의 조합으로 사용함으로써 조제할 수 있다. 분획물 중에, 상기 서술한 분자량 10,000 ∼ 500,000 의 고분자 축합형 타닌을 10 ％ 이상 포함하는 것이 바람직하고, 40 ％ 이상 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
다른 방법으로서, 본 발명의 마황 유래 고분자 축합형 타닌은, 마황 엑기스 또는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 물로 용해시킨 것, 혹은, 상기 서술한 수 엑기스를 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피를 사용하여, 50 ％ MeOH, 이어서 80 ％ MeOH 로 세정 후, 70 ％ 아세톤 분획물로서, 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 얻을 수 있다.
마황 유래 고분자 축합형 타닌의 제조에 있어서, 크로마토그래피의 구체적인 실시 방법은, 당업자에게 주지된 방법 중 어느 것에 의한 것이다. 또, 크로마토그래피로 얻어진 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 포함하는 용액, 혹은, 감압 건조, 동결 건조, 스프레이 건조 등의 임의의 방법으로 건조시켜 얻어진 분말을 원약으로서 사용할 수 있다. 또, 덱스트린 등의 부형제를 첨가한 후, 상기 방법으로 건조시킴으로써, 분말로서의 물성을 개선한 원약을 조제하는 것도 가능하다.
의약품 및 치료 방법
본 발명의 일 양태에 있어서, 마황 엑기스, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스, 혹은, 마황 유래 고분자 축합형 타닌을, 항신종 코로나 바이러스제의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.
마황 엑기스, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스, 혹은, 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 유효 성분으로서 함유하는 의약품 제제를, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위해, 그러한 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에 투여할 수 있다. 따라서, 대상은, 경증 또는 중증의 환자 뿐만 아니라, 감염 의심이 있는 사람이어도 된다.
본 발명의 의약품 제제의 투여 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 경구 투여 가능한 제형이 바람직하다. 본 발명의 의약용 조성물은 다양한 제형으로 할 수 있다.
예를 들어, 경구 투여를 위해서는, 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 환제, 액제, 유제, 현탁제, 용액제, 주정제, 시럽제, 엑기스제, 엘릭시르제로 할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 또, 제제에는 약제적으로 허용할 수 있는 다양한 담체를 첨가할 수 있다.
예를 들어, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 착향제, 착색제, 감미제, 교미제, 용해 보조제, 현탁화제, 유화제, 코팅제, 비타민 C, 항산화제를 포함할 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
마황은 한방약의 구성 생약으로서 폭넓게 사용되고 있는 점에서, 마황을 함유하는 한방약, 및 마황을, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스로 대치시킨 한방약을 항코로나 바이러스약으로서 제공할 수 있다.
식품
본 발명의 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스나 마황 유래 고분자 축합형 타닌은, 부작용 성분인 에페드린알칼로이드를 포함하지 않기 때문에, 식품으로서의 이용이 가능하다. 따라서, 본 발명의 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스, 및 마황 유래 고분자 축합형 타닌은, 식품에 함유시킬 수 있다. 예를 들어, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 원재료에 배합함으로써, 다양한 식품의 형태로 할 수 있다. 식품으로서, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선정할 수 있지만, 예를 들어, 청량 음료, 탄산 음료, 영양 음료, 과실 음료, 락트산 음료 등의 음료 ; 사탕, 캔디, 츄어블, 젤리, 껌, 초콜릿 등의 과자류 ; 과립제, 정제, 캡슐제, 드링크제 등 다양한 형태의 건강 식품, 기능성 표시 식품이나 영양 보조 식품을 들 수 있다.
식품으로는, 일반적인 식품이어도 되고, 특히 기능 표시를 수반하지 않는 건강 보조 식품, 영양 보조 식품 등 (이른바 서플리먼트) 이어도 되고, 기능 표시가 부여된 식품 (예를 들어, 보건 기능 식품) 이어도 된다. 식품은 특별한 용도에 적합하다는 취지의 표시 (이른바 헬스 클레임) 를 부여한 식품이어도 되지만, 의약으로서 섭취되는 것은 포함하지 않는다. 헬스 클레임의 예로는, 특정한 질병 리스크 (예를 들어 신종 코로나 바이러스 감염증 (COVID-19) 에 걸릴 리스크) 를 저감시킨다는 취지의 표시일 수 있다.
이와 같은 식품에는, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스나 마황 유래 고분자 축합형 타닌 외에, 칼슘 등의 무기 성분, 다양한 비타민류, 올리고당, 키토산 등의 식이 섬유, 대두 추출물 등의 단백질, 레시틴 등의 지질, 자당, 젖당 등의 당류를 첨가할 수 있다.
신종 코로나 바이러스 감염증의 예방을 위해, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 또는 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 포함하는 음식물을 경구적으로 섭취시키는 것도, 본 발명의 일 양태이다. 이와 같은 행위는, 의료 행위로서는 아니며 실시되는 것이 바람직한 것으로 생각된다.
고분자 축합형 타닌의 정량
본 발명은, 분자량의 범위를 특정한 마황 유래 고분자 축합형 타닌의 함량을 정량하는 것도 포함한다. 예를 들어, 원료 생약인 마황, 마황 엑기스 원약, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 원약, 및 고분자 축합형 타닌 원약에 대해, 고분자 축합형 타닌은, 항신종 코로나 바이러스 작용의 지표 성분으로 할 수 있다.
즉, 상기 서술한 의약품 원료나 원약 뿐만 아니라, 식품 등, 조성물 중의 고분자 축합형 타닌 함유량을 정량하고, 함유량의 규격을 만족하고 있는 것을 확인하는 시험을 설정함으로써, 그들 조성물의 항신종 코로나 바이러스제로서의 유효성을 담보하는 것이 가능하다. 또한, 마황탕이나 갈근탕 등의 마황을 함유하는 한방약에 대해서도, 동일한 규격과 시험 방법을 설정함으로써, 그들 조성물의 항신종 코로나 바이러스제로서의 유효성을 담보하는 것이 가능하다.
고분자 축합형 타닌의 정량은, 겔 침투 크로마토그래피 (GPC) 에 의해 실시한다. 구체적인 방법은, 실시예 7 에 기재된 방법으로 예시되지만, 이것에 한정되지 않는다. 예를 들어, 시료 용액 및 고분자 축합형 타닌 표준 물질 용액의 피크 면적 AT 및 AS 로부터, 시료 1 ㎎ 중의 고분자 축합형 타닌의 양 (㎎) 을 산출할 수 있다.
상기 서술한 바와 같이, GPC 분석은, 원료 생약인 마황의 인수 시험, 각종 원약 및 식품의 유효 성분의 함량 규격의 시험 방법으로서 사용할 수 있다.
고분자 축합형 타닌의 정량은, 액체는 그대로, 고체는 임의의 용매로 용액으로 함으로써 측정 시료로서 사용할 수 있지만, 고분자 축합형 타닌 함량이 적은 조성물이나 협잡물을 많이 포함하는 조성물에 대해서는, 본 명세서에 기재한 고분자 축합형 타닌의 조제 방법, 즉, 추출 방법이나 칼럼 크로마토그래피 등을 전처리 방법으로서 사용함으로써, 정량이 가능해지고, 정량의 감도, 정밀도, 직선성 등을 개선할 수 있는 경우도 있다.
일 양태에 있어서, 마황 엑기스 또는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 조제하고, 얻어진 마황 엑기스 또는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스에 대해, 분자량 10,000 ∼ 500,000 의 고분자 축합형 타닌을 정량하고, 고분자 축합형 타닌 함량이 0.01 ％ 이상인 마황 엑기스 또는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를, 항신종 코로나 바이러스제의 원약으로서 사용한다.
원용
본 발명의 개시에는, 비특허문헌 5 (Oshima N, Yamashita T, Hyuga S, Hyuga M, Kamakura H, Yoshimura M, Maruyama T, Hakamatsuka T, Amakura Y, Hanawa T, Goda Y, Efficiently prepared ephedrine alkaloids-free Ephedra Herb extract : a putative marker and antiproliferative effects. J Nat Med. 2016 ; 70 : 554-62) 및 비특허문헌 6 (Yoshimura M, Amakura Y, Hyuga S, Hyuga M, Nakamori S, Maruyama T, Oshima N, Uchiyama N, Yang J, Oka H, Ito H, Kobayashi Y, Odaguchi H, Hakamatsuka H, Hanawa T, Goda Y, Quality Evaluation and Characterization of Fractions with Biological Activities in Ephedra Herb Extract and Ephedrine Alkaloids-Free Ephedra Herb Extract. Chem Pharm Bull. 2020 ; 68 (2) : 140-149) 에 기재된 사항을 원용한다.
이제부터 본 발명을 이하의 실시예로 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않는다.
실시예 1
실시예 1 : 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 신종 코로나 바이러스 감염 저해 작용
에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가에 의해, 신종 코로나 바이러스 감수성 세포인 VeroE6/TMPRSS2 세포에서의 신종 코로나 바이러스의 증식 등에 억제 효과가 출현하는지를 검토하였다.
에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가 농도는, 사전에 VeroE6/TMPRSS2 세포에 대하여 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 독성이 관찰되지 않는 최고 농도를 확인하고, 50 μg/mL 로 하였다. 비교 대조로서 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 첨가하지 않은 컨트롤군을 동시에 검토하였다.
신종 코로나 바이러스의 감염 평가는, VeroE6/TMPRSS2 세포에 신종 코로나 바이러스를 감염시켜, 일정 시간 배양한 후, RNA 를 추출하고, PCR 법에 의해 바이러스의 RNA 량으로서 정량하고, 표준 물질의 검량선으로부터 카피수를 구하였다.
VeroE6/TMPRSS2 세포를 10 ％ FBS-DMEM 으로 5 × 105 개/mL 가 되도록 현탁시키고, 48 웰 플레이트 3 장에 1 웰당 200 μL 파종하고, CO2 인큐베이터에서 24 시간 배양하였다. 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가군은, 50 μg/mL 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가 무혈청 DMEM 으로 교환, 컨트롤군은, 무혈청 DMEM 으로 교환하고, 1 시간, CO2 인큐베이터에서 보온하였다. 각 웰에 MOI (Multiplicity of Infection) ＝ 0.03 이 되도록 신종 코로나 바이러스 (SARS-CoV-2, JPN/TY/WK-521 주) 를 접종하고, 1 시간, CO2 인큐베이터 내에서 보온하였다. 무혈청 DMEM 으로 2 회 세정하고, 무혈청 DMEM 을 첨가하였다. 1 장의 플레이트는 그대로 회수하고 (0 시간), 다른 2 장의 플레이트는, 바이러스 접종 후 4 시간, 및 24 시간, CO2 인큐베이터 내에서 보온하였다. 각 플레이트에 대해, 배지도 포함하여 세포를 전체량으로부터 RNA 를 추출하고, 미국 CDC 의 SARS-CoV-2-N1 을 프로브로 한 RT-PCR 을 실시하였다. 미국 CDC 의 N 유전자 플라스미드를 사용하여 검량선을 작성하고, 바이러스의 카피수를 구하였다 (표 A).
그 결과, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 첨가하지 않은 컨트롤군에서는, 어세이 개시 시점 (0 시간) 에서 약 10,000 카피의 WK-521 의 RNA 가 검출되고, 4 시간에서 약 400 배, 24 시간에서 약 20,000 배로 증가하고 있었다. 한편, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가군에 있어서는, 어세이 개시 시점 (0 시간) 에서 약 2,000 카피의 WK-521 의 RNA 가 검출되고, 4 시간에서 약 25 배, 24 시간에서 약 130 배로 증가하고 있었다 (도 1).
어세이 개시 시점의 WK-521 의 카피수가, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가에 의해 20 ％ 까지 저하된 점에서, 코로나 바이러스의 감염 초기 단계가 억제되고 있는 것이 확인되었다. 또, 시간 경과적인 바이러스 증식률에 대해서도, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가에 의해 현저하게 억제되어 있고, 24 시간 후의 바이러스 카피수는, 컨트롤의 카피수에 대하여 0.17 ％ 로, 매우 근소한 양에 그쳐 있었다. 이들 결과로부터, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스는, 신종 코로나 바이러스의 감염 초기나 감염 단계의 바이러스 증식에 대하여 억제 효과를 나타내는 것이 밝혀졌다.
실시예 2
실시예 2 : 신종 코로나 바이러스 변이주에 대한 감염 저해 효과
2019 년 우한에서의 발생 이후, 각국에서 변이주가 보고되고 있는 가운데 특히 WHO 가 감염 확대 등에 대해 우려해야 할 변이주로서 영국, 남아프리카, 브라질에서 유래하는 Alpha, Beta, Gamma 주 등을 지정하고 감시 대상으로 하고 있다. 이들 변이주는 2020년 이후 일본 내에 들어와, 당초의 유행주 WK-521 근친주로 대치되고 있는 점에서, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가에 의해, 신종 코로나 바이러스 감수성 세포인 VeroE6/TMPRSS2 세포에서의 신종 코로나 바이러스 변이주의 증식 등에 억제 효과가 출현하는지를 검토하였다. 표 B 에, 실시예 1 및 2 에 있어서 사용한 신종 코로나 바이러스 일본 내 분리주를 나타낸다.
에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가 농도는, 사전에 VeroE6/TMPRSS2 세포에 대하여 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 독성이 관찰되지 않는 최고 농도를 확인하고, 50 μg/mL 로 하였다. 비교 대조로서 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 첨가하지 않은 컨트롤군을 동시에 검토하였다.
신종 코로나 바이러스의 감염 평가는, VeroE6/TMPRSS2 세포에 각 주를 감염시켜, 1 시간 배양한 후, RNA 를 추출하고, PCR 법에 의해 바이러스의 RNA 량으로서 정량하고, 표준 물질의 검량선으로부터 카피수를 구하였다. 24 시간 후의 배양 상청 중의 감염성 바이러스의 역가를 구하였다.
VeroE6/TMPRSS2 세포를 10 ％ FBS-DMEM 으로 2 × 104 개/well 이 되도록 현탁시키고, 96 웰 플레이트에 파종하고, CO2 인큐베이터에서 24 시간 배양하였다. 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가군은, 50 μg/mL 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가 무혈청 DMEM 으로 교환, 컨트롤군은, 무혈청 DMEM 으로 교환하고, 3 시간, CO2 인큐베이터에서 보온하였다. 각 웰에 MOI (Multiplicity of Infection) ＝ 0.03 이 되도록 SARS-CoV-2 각 변이주를 접종하고, 2 시간, CO2 인큐베이터 내에서 보온하였다. 무혈청 DMEM 으로 1 회 세정하고, 무혈청 DMEM 을 첨가하였다. 바이러스 감염 후 2 시간 (input) 및 24 시간의 시점에서 배지도 포함하여 세포를 전체량으로부터 RNA 를 추출하고, 미국 CDC 의 SARS-CoV-2-N1 을 프로브로 한 RT-PCR 을 실시하였다. 미국 CDC 의 N 유전자 플라스미드를 사용하여 검량선을 작성하고, 바이러스의 카피수를 구하였다.
24 시간 배양 후의 감염성 바이러스의 역가는, 배양 상청 25 μL 를 채취하고, 10 배 계단 희석열을 작성한 후, 96 웰 플레이트에 파종해 둔 VeroE6/TMPRSS2 세포에 감염시켜, 4 일간 배양 후, 세포 변성 효과 (CPE : Cytopathic effect) 를 현미경하에서 확인하고, CPE 출현한 웰수, 희석 배수로부터 산출하였다.
그 결과, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 첨가하지 않은 컨트롤군에서는, 24 시간 배양 후, 평균 2.3 × 107 copies/well, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가군에 있어서는, 평균 5.8 × 105 copies/well 이 되어, 컨트롤군과 비교하여 약 2.5 ％ 로, RNA 증식이 현저하게 억제되고 있었다 (도 2 : 각 변이주의 24 시간 후의 N 유전자 카피수).
24 시간 배양 후의 배양 상청 중의 감염성 바이러스는, 컨트롤군에서는 평균 4.9 × 105 TCID50/mL 가 된 것에 대하여, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 첨가군에 있어서는, 평균 1.8 × 104 TCID50/mL 가 되어, 컨트롤군 100 에 대하여 첨가군에서는 평균 약 3.7 ％ 로, 감염성 바이러스의 산생도 현저하게 억제되고 있었다. 이들 결과로부터, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스는, 신종 코로나 바이러스의 각종 변이주에 있어서도, 바이러스 증식에 대하여 억제 효과를 나타내는 것이 밝혀졌다.
실시예 3
실시예 3 : 신종 코로나 바이러스 감염에 관련된 스파이크 단백질에 대한 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 성분의 결합능
신종 코로나 바이러스가 표적 세포에 결합할 때, 바이러스의 스파이크 단백질이 표적 세포의 수용체 분자에 결합한다. 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 성분이 신형 코로나 바이러스의 스파이크 단백질에 결합하면, 바이러스와 표적 세포의 결합이 저해된다. 그래서, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 성분이 신형 코로나 바이러스의 스파이크 단백질에 대한 결합능에 대해, 분자간 상호 작용 해석 장치를 사용하여 검토하였다.
분자간 상호 작용 해석 장치는, BIACORE (GE Healthcare) 를 사용하였다. 유전자 재조합의 수법으로 제조된 신종 코로나 바이러스의 스파이크 단백질의 S1 도메인 (재조합 S1) 을 센서 칩 CM5 에 아민 커플링법으로 약 500 RU 고정화하였다. 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 HEPES 버퍼 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 ％ (v/v) SurfactantP20) 에 용해시키고, 200 μg/mL 가 되도록 조정하여, 시료 용액으로 하였다. 유속 30 μL/분으로 시료 용액을 60 초간 어플라이한 후, 120 초간 HEPES 버퍼로 세정하였다. 재조합 S1 을 고정화한 플로 셀의 리스폰스로부터 고정화하지 않은 플로 셀의 리스폰스를 뺀 센서그램을 얻은 결과, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 성분이 재조합 S1 에 강하게 결합하고 있는 것이 밝혀졌다 (도 3).
이들 결과로부터, 마황 엑기스나 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 성분이, 신종 코로나 바이러스의 감염에 중요한 역할을 하고 있는 스파이크 단백질의 S1 도메인에 강하게 결합함으로써, 신종 코로나 바이러스의 감염을 억제하는 것으로 생각되었다.
실시예 4
실시예 4 : 신종 코로나 바이러스 감염에 관련된 스파이크 단백질에 대한 마황 유래 고분자 축합형 타닌의 결합
신종 코로나 바이러스의 스파이크 단백질에 대하여, 마황 엑기스 혹은 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 활성 성분으로 생각되는 마황 유래 고분자 축합형 타닌이 결합하는지, 분자간 상호 작용 해석 장치를 사용하여 검토하였다.
분자간 상호 작용 해석은, 실시예 3 에 기재한 장치 및 센서 칩을 사용하여, 동일한 조건에서 검토하였다. 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 HEPES 버퍼에 용해시키고, 40 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL 가 되도록 조정하여, 시료 용액으로 하였다. 유속 30 μL/분으로 시료 용액을 60 초간 어플라이한 후, 120 초간 HEPES 버퍼로 세정하였다. 재조합 S1 을 고정화한 플로 셀의 리스폰스로부터 고정화하지 않은 플로 셀의 리스폰스를 뺀 센서그램을 얻었다. 그 결과, 마황 유래 고분자 축합형 타닌이 재조합 S1 에 농도 의존적으로 결합하고 있는 것이 밝혀졌다 (도 4). 마황 유래 고분자 축합형 타닌의 평균 분자량은 약 100,000 인 점에서, 각 시료의 농도를, 400 nM, 200 nM, 100 nM 으로 간주하고, 센서그램에 대한 커브 피팅법을 사용하여 마황 유래 고분자 축합형 타닌과 재조합 S1 의 결합 모델을 속도론적으로 해석한 결과, 해리 정수 KD 는 30.7 nM 으로 산출되어, 마황 유래 고분자 축합형 타닌은 신종 코로나 바이러스의 스파이크 단백질에 결합 저해제로서 충분히 기능할 수 있는 결합능을 갖는 것이 밝혀졌다.
이들 결과로부터, 마황 엑기스나 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 성분인 마황 유래 고분자 축합형 타닌이, 신종 코로나 바이러스의 감염에 중요한 역할을 하고 있는 스파이크 단백질의 S1 도메인에 강하게 결합하는 것이 밝혀져, 마황 엑기스나 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스와 동일하게, 마황 유래 고분자 축합형 타닌이 신종 코로나 바이러스의 감염을 억제하는 항바이러스제가 될 수 있는 것으로 생각되었다.
실시예 5
실시예 5 : 신종 코로나 바이러스의 스파이크 단백질과 ACE2 의 결합 저해 작용
신종 코로나 바이러스의 스파이크 단백질이 숙주 세포의 ACE2 에 결합하는 것이, 감염의 제 1 단계인 것이 밝혀져 있다. 실시예 4 에서 나타낸, 마황 엑기스 혹은 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 활성 성분으로 생각되는 마황 유래 고분자 축합형 타닌이, 스파이크 단백질에 결합함으로써, ACE2 에 대한 결합을 저해하는지, 효소 표지한 스파이크 단백질을 사용하여 검토하였다.
96 웰 마이크로플레이트에 재조합 ACE2 세포 외 도메인 (스파이크 단백질과의 결합 도메인) 을 고정화하고, 비오틴화 재조합 스파이크 단백질 리셉터 결합 도메인 (S1-RBD) 을 첨가하고, 인산 완충액으로 세정한 후, 아비딘화 HRP 와 HRP 의 기질을 첨가 반응시킴으로써, ACE2 에 대한 스파이크 단백질의 결합량을 측정하는 어세이를 사용하여 검토하였다. 마황 유래 고분자 축합형 타닌을, 최종 농도가 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2.5 μg/mL, 1.25 μg/mL 가 되도록, 비오틴화 재조합 S1-RBD 와 함께 첨가하고, ACE2 에 대한 스파이크 단백질의 결합량을 측정하였다. 그 결과, 마황 유래 고분자 축합형 타닌의 첨가 농도 의존적으로, 재조합 S1-RBD 의 ACE2 에 대한 결합량이 저하되고 있는 것이 밝혀졌다 (도 5). 얻어진 시그모이드 곡선에 대해 4 파라미터 로지스틱 회귀를 실시한 결과, 50 ％ 결합 저해 농도 (IC50) 는, 3 ng/mL 로 산출되어, 마황 유래 고분자 축합형 타닌은 신종 코로나 바이러스의 스파이크 단백질의 ACE2 에 대한 결합을 저해하는 것이 밝혀졌다.
이들 결과로부터, 마황 엑기스나 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 성분인 마황 유래 고분자 축합형 타닌이, 신종 코로나 바이러스의 감염의 제 1 단계를 저해하는 것이 밝혀져, 마황 엑기스나 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스와 동일하게, 마황 유래 고분자 축합형 타닌이 신종 코로나 바이러스의 감염을 억제하는 항바이러스제가 될 수 있는 것으로 생각되었다.
실시예 6
실시예 6 : 마우스 코로나 바이러스 감염 모델에 대한 EFE 의 경구 투여에 의한 효과
니도바이러스목 코로나 바이러스과에 속하는 마우스 코로나 바이러스 (Murine hepatitis virus : MHV) 를 경비 (經鼻) 감염시킨 마우스를 사용하여, EFE 의 in vivo 효과에 대해 평가하였다. MHV 는 마우스에 대하여 폐렴을 발증시키는 것이 보고되어 있다 (Albuquerque, N., et al., J Virol., 80, 10382-10394, 2006).
마우스 (BALB/c Cr Slc, 자성) 에 MHV (MHV-1/ATCC VR-261) 를 경비 접종하고, 접종 1 시간 후부터 EFE 를 6 일간 경구 투여하였다. 비감염군 및 감염 대조군은 주사용수를 투여하였다. 감염군에 대한 EFE 의 투여는 700 ㎎/㎏ × 2 회/일 투여 [EFE 700 × 2 (1400)], 700 ㎎/㎏ × 1 회/일 투여 (EFE 700), 350 ㎎/㎏ × 2 회/일 투여 [EFE 350 × 2 (700)] 로 하였다. 각 군 10 마리의 마우스를 사용하였다. 접종 후 5 일째에 우측폐를 채취하여 플라크 어세이에 의한 바이러스량 측정과 호흡 상태를 관찰하였다. 동물 실험은 츠무라 및 일본 바이오 리서치 센터의 동물 실험 위원회에서 승인되고 후생 노동성이 소관하는 실시 기관에 있어서의 동물 실험 등의 실시에 관한 기본 지침에 따라서 실시되었다.
MHV 접종 후 5 일째에 있어서, 우측폐 및 간장의 바이러스 플라크수는 감염 대조군과 비교하여 모든 EFE 투여군에 있어서 유의한 감소가 확인되었다. 우측폐의 바이러스 플라크수는 감염 대조군에서는 1622.3 ± 271.9 (×102 PFU/g), EFE 700 × 2 (1400) 군에서 96.1 ± 10.7, EFE 700 군에서 250.1 ± 67.9, EFE 350 × 2 (700) 군에서 417.5 ± 121.5 였다 (도 6). 또 감염 대조군에서 관찰된 호흡 부정이 모든 EFE 투여군에서 개선 경향을 나타냈다 (도 7).
이상의 결과로부터, EFE 는 경구 투여에 의해 폐에서 약효 발현하는 것이 밝혀졌다.
실시예 7
실시예 7 : 고분자 축합형 타닌의 정량법
참고예 8 에 나타낸 GPC 를 사용한 고분자 축합형 타닌의 정량법에 대해, 칼럼 길이를 2 배로 증가시킴으로써 협잡물과의 분리능을 높인 정량법을 확립하였다. 이 정량법을 사용하여, 마황 엑기스 3 로트에 대해, 고분자 축합형 타닌 함량을 산출한 결과, 0.03 ∼ 0.69 ％ (평균 0.36 ％) 였다. 또, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 1 로트에 대해, 고분자 축합형 타닌 함량을 산출한 결과, 0.49 ％ 였다.
정량법
시료 및 고분자 축합형 타닌 표준 물질을 정밀하게 칭량하고, 약 10.0 ㎎/mL 가 되도록 이동상에 용해시켜 시료 용액 및 고분자 축합형 타닌 표준 물질 용액으로 하였다. 시료 용액 및 고분자 축합형 타닌 표준 물질 용액에 대해, 다음의 조건에서 GPC 를 실시하고, 데이터 처리 소프트웨어 LabSolutions GPC 를 사용하여, 시료 및 고분자 축합형 타닌 표준 물질의 피크 면적 AT 및 AS 를 측정하였다.
GPC 조건
칼럼 : TSK-gel Super AW4000 (6.0 I.D. × 150 ㎜ × 2 개) (토소)
이동상 : 99.5 ％ N,N-디메틸포름아미드, 0.5 ％ 3 M 포름산암모늄 수용액
칼럼 온도 : 30 ℃
유속 : 0.3 mL/분
측정 파장 : 280 ㎚
피크 면적 측정 범위 : 12 분 ∼ 18 분
계산식
시료 1 ㎎ 당의 고분자 축합형 타닌량 (㎎) ＝ AT/AS × CS/CT
AT : 시료의 피크 면적
AS : 표준 물질의 피크 면적
CT : 시료 농도 (㎎/mL)
CS : 고분자 축합형 타닌 표준 물질 농도 (㎎/mL)
참고예 :
이미 서술한 바와 같이, 발명자들은, 이전에 에페드린알칼로이드에 의존하지 않는 동통 억제 작용 등의 약리 효과를 갖는, 마황 엑기스로부터 에페드린알칼로이드가 선택적으로 제거된 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조법을 확립하였다 (특허문헌 1, 비특허문헌 5). 또, 발명자들은, 마황 엑기스 또는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 원료로 하여 얻어지는 신규 활성 성분인 마황 유래 고분자 축합형 타닌의 제조법을 확립하였다 (특허문헌 2, 비특허문헌 6). 이들 사항을, 이하의 참고예에 의해 설명한다. 또한, 상세한 시험 조건이나 구체적인 데이터에 대해서는, 특허문헌 1 (WO2015/076286) 및 특허문헌 2 (일본 공개특허공보 2019-131536호) 의 실시예의 기재를 원용한다.
참고예 1 : 마황 엑기스의 제조
마황의 건조 원료를 믹서에 의해 분쇄하고, 그 분쇄물 50 g 에 500 mL 의 물을 첨가하고, 교반하면서, 95 ℃, 1 시간 추출하였다. 고액 분리하고, 추출액을 3000 rpm 으로 10 분간 원심 분리를 실시하였다. 얻어진 상청액을 60 ℃ 에서 감압 농축시켰으면, 60 ℃ 에서 하룻밤 감압 건조를 실시하여, 마황 엑기스로서 9.6 g 을 얻었다.
참고예 2 : 이온 교환 크로마토그래피의 충전제의 검토
에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조에 적합한 이온 교환 크로마토그래피의 충전제를 결정하기 위해 검토를 실시하였다. 마황 엑기스를 각종 이온 교환 수지로 처리한 후, 엑기스에 포함되는 에페드린알칼로이드를 TLC 및 HPLC 로 해석하였다. 검토한 이온 교환 수지는, 양이온 교환 수지 13 종류, 양쪽성 이온 교환 수지 1 종류, 음이온 교환 수지 8 종류의 합계 22 종류이다. 그 결과, 에페드린알칼로이드 제거에 적합한 이온 효과 수지는, 양이온 교환 수지인 것을 알 수 있었다. 그래서, 약산성 양이온 교환 수지 WK10, WK11, WK20, WK40L, FPC3500, 강산성 양이온 교환 수지 SK104, SK110, SK1B, UBK530, UBK12, PK216, IR120B, 1060H 를 사용하여, 마황 엑기스를 처리한 후의 엑기스에 포함되는 에페드린알칼로이드 함량을 HPLC 에 의해 정량하였다. 그 결과를 하기의 표에 나타낸다.
참고예 3 : 이온 교환 수지 SK1B 또는 IR120B 에 의한 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 제조
마황의 건조 원료를 믹서에 의해 분쇄하고, 그 분쇄물 50 g 에 500 mL 의 물을 첨가하고, 교반하면서, 95 ℃, 1 시간 추출하였다. 고액 분리하고, 추출액을 3000 rpm 으로 10 분간 원심 분리를 실시하고, 얻어진 상청액을 25 mL 의 강산형 양이온 교환 수지 SK1B (미츠비시 화학 제조) 또는 강산형 양이온 교환 수지 IR120B (오르가노사 제조) 에 통액시켰다. 통과액을 5 ％ 의 NaHCO3 으로 pH ＝ 5.2 까지 조정하고, 60 ℃ 에서 감압 농축시켰으면, 60 ℃ 에서 하룻밤 감압 건조를 실시하여, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스로서 6.3 g 을 얻었다.
참고예 4 : 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의한 마황 엑기스 (참고예 1) 및 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 (참고예 3) 에 포함되는 에페드린의 함량 비교
마황 엑기스 (참고예 1) 및 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 (참고예 3) 의 HPLC 분석으로부터 얻어진 결과를 이하의 표에 나타낸다. 이들 결과로부터, 강산형 양이온 교환 수지 SK1B, 혹은 IR120B 를 사용한 칼럼 크로마토그래피에 의해, 마황 엑기스로부터 에페드린알칼로이드 (에페드린 및 슈도에페드린) 를 검출 한계 (0.05 ppm) 이하까지 제거할 수 있는 것을 알 수 있었다.
참고예 5 : 마황 엑기스 (참고예 1) 및 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 (참고예 3) 의 조성 성분의 비교
3 차원 고속 액체 크로마토그래피 (3D-HPLC) 에 의해 마황 엑기스와 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 조성 성분을 비교한 결과, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스에 있어서는 에페드린알칼로이드의 피크가 소실되었지만, 다른 성분의 패턴은 마황 엑기스와 대략 동일하였다 (데이터는 나타내지 않는다).
또, LC/MS 에 의해 마황 엑기스와 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스의 조성 성분을 비교한 결과, 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스에 있어서는, l-ephedrine, pseudoephedrine, methylephedrine, norephedrine 의 각 피크가 소실되어 있는 것을 확인하였다 (데이터는 나타내지 않는다).
참고예 6 : 마황 유래 고분자 축합형 타닌 조제
에페드린 제거 마황 엑기스 (1.0354 g) 에 대해, Sephadex LH-20 칼럼 (1.1 ㎝ × 40 ㎝, Cytiva) 에 첨가하고, 50 ％ 메탄올 (MeOH), 이어서 80 ％ MeOH 로 용출 후, 70 ％ 아세톤으로 용출시켰다. 70 ％ 아세톤 용출물을 동결 건조시켜, 고분자 축합형 타닌 (125.5 ㎎) 을 얻었다.
참고예 7 : 고분자 축합형 타닌 표준 물질의 조제
고분자 축합형 타닌 약 100 ㎎ 을 정밀하게 칭량하고, 50 ％ 디메틸포름아미드 용액 10 mL 를 정확하게 첨가하고, 완전히 용해시켰다. 이 용액에 대해, 겔 침투 크로마토그래피 (GPC) 로 분석한 결과, 중량 평균 분자량은 85642 이고, 저분자량역에 피크가 확인되지 않는 것을 확인하여, 고분자 축합형 타닌 표준 물질 용액 (10.0 ㎎/mL) 으로 하였다.
참고예 8 : GPC 에 의한 고분자 축합형 타닌 함량의 평가
마황 엑기스 3 로트에 대해, 하기의 조건에서 GPC 시험을 실시하고, 고분자 축합형 타닌 함량을 산출한 결과, 2.84 ㎎/mL 였다.
GPC 시험법
시료를 정밀하게 칭량하고, 약 10.0 ㎎/mL 가 되도록 50 ％ 디메틸포름아미드 용액에 용해시켜 시료 용액으로 하였다. 시료 용액 및 고분자 축합형 타닌 표준 물질 용액에 대해, 다음의 조건에서 GPC 를 실시하고, 데이터 처리 소프트웨어 Chromato-PRO-GPC 를 사용하여, 시료 용액 및 고분자 축합형 타닌 표준 물질 용액의 피크 면적 AT 및 AS, 그리고, 중량 평균 분자량을 산출하였다.
GPC 조건
칼럼 : TSK-gel Super AW4000 (6.0 I.D. × 150 ㎜) (토소)
이동상 : 99.5 ％ N,N-디메틸포름아미드, 0.5 ％ 3 M 포름산암모늄 수용액
칼럼 온도 : 30 ℃
유속 : 0.3 mL/분
측정 파장 : 280 ㎚
피크 면적 측정 범위 : 5 분 ∼ 10 분
시료 용액 1 mL 중의 고분자 축합형 타닌의 양 (㎎) ＝ AT/AS × 10.00
AT : 시료의 피크 면적
AS : 표준 물질의 피크 면적
10.00 : 표준 물질 용액 1 mL 중의 고분자 축합형 타닌의 양 (㎎)
Claims (11)
- 마황 엑기스를 유효 성분으로 하고, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
- 마황 엑기스로부터 에페드린알칼로이드를 제거한 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스를 유효 성분으로 하고, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
- 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 유효 성분으로 하고, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
의약품 제제 또는 한방 제제의 형태인, 항바이러스제. - 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
식품의 형태인, 항바이러스제. - 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 또는 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 포함하는 음식물을 경구적으로 섭취시키는 것을 포함하는, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방을 위한 방법.
- 마황 엑기스 또는 에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스 또는 마황 유래 고분자 축합형 타닌을 유효 성분으로서 함유하는 의약품을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 신종 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 방법.
- 고분자 축합형 타닌을 겔 침투 크로마토그래피로 정량함으로써, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 항바이러스제의 항바이러스 작용의 유효성을 담보하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,
마황 엑기스가 고분자 축합형 타닌을 0.01 ％ 이상 포함하는, 항바이러스제. - 제 2 항에 있어서,
에페드린알칼로이드 제거 마황 엑기스가 고분자 축합형 타닌을 0.01 ％ 이상 포함하는, 항바이러스제. - 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
다른 신종 코로나 바이러스 감염증 치료약을 대상에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
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