KR101653884B1 - 항 콕사키바이러스 활성을 갖는 오리방풀 유래 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콕사키바이러스 증식 억제제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 오리방풀에서 분리한 화합물 3-[3,4-dihydroxyphenyl]acrylic acid 1-[3,4-dihydroxyphenyl]-2-methoxycarbonylethyl ester의 콕사키바이러스 증식 억제 효능과 관련된 것이다.
본 발명의 대상 물질은 심근염을 일으키는 콕사키바이러스에 대한 항바이러스 효능을 가지고 있어 콕사키바이러스에 의해 발병하는 일반감기 또는 심장 염증에 처리하여 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항 콕사키바이러스 활성을 갖는 오리방풀 유래 화합물{A Coxsackie virus proliferation inhibitory composition extracted from Isodon excisus}

본 발명은 콕사키바이러스 증식 억제제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 오리방풀에서 분리한 화합물 3-[3,4-dihydroxyphenyl]acrylic acid 1-[3,4-dihydroxyphenyl]-2-methoxycarbonylethyl ester(이하 편의상 '본 발명의 대상 물질' 또는 '화학식 1의 화합물'이라 칭함)의 콕사키바이러스 증식 억제 효능과 관련된 것이다.

본 발명의 대상 물질은 콕사키바이러스 감염과 함께 처리될 경우 화합물의 세포 성장신호 조절을 통해 세포에 감염된 콕사키바이러스의 증식을 억제한다. 또한 본 발명의 대상 물질은 심근염을 일으키는 콕사키바이러스에 대한 항바이러스 효능을 가지고 있어 콕사키바이러스에 의해 발병하는 일반감기 또는 심장 염증에 처리하여 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 콕사키바이러스를 포함하는 엔테로바이러스의 증식 억제 효능을 가지고 있는 오리방풀 유래 화합물 3-[3,4-dihydroxyphenyl]acrylic acid 1-[3,4-dihydroxyphenyl]-2-methoxycarbonylethyl ester에 관한 것이다.

세균(박테리아)에 의해 야기되는 질환은 다양한 형태의 예방 백신, 항생제가 개발됨에 따라 어느 정도 예방되고 있으나, 바이러스가 일으키는 각종 질환에 대한 치료 및 예방은 아직까지 효율적이지 못할 뿐만 아니라 오히려 최근에는 환경오염으로 인하여 바이러스 질환이 더욱 늘어나고 있다.

특히, 독감을 유발하는 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 등을 유발하는 헤르페스 바이러스, 간염 바이러스 등에 의한 기존의 질환 외에도, 최근 조류독감(avian influenza, AI), 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory, SARS)을 유발하는 신종 바이러스의 출현으로 인하여 인간과 가축의 생명이 심각하게 위협받고 있다. 이에 따라 다양한 바이러스 질환의 예방 및 치료에 대한 관심이 지구촌 전체에 고조되고 있다.

현재 상용화되고 있는 항바이러스제로는 뉴클레오사이드(nucleoside) 유도체나 interferon(IFN)과 같은 단백질이 대부분이지만, 이들 물질은 세포독성, 간독성, 과-내성 등 여러 가지 부작용을 나타낸다. 따라서 부작용이 적고 저가이며 안전한 신규 항바이러스 물질 개발의 필요성은 지속적으로 요구되고 있으며, 기존 화학합성 의약품의 부작용을 회피하기 위해서 부작용이 적고 안전한 천연물질로부터 항바이러스 활성을 갖는 물질을 탐색하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명과 관련이 있는 콕사키바이러스(Coxsackie viruses)는 외피 지질을 갖지 않는 RNA 바이러스(non-enveloped RNA virus)로서, 단일 가닥의 양성 센스(single-stranded positive sense)의 RNA 게놈(약 7.4 kb)을 가지고 있다. 콕사키바이러스(Coxsackieviruses)는 피코르나바이러스(Picornaviridae) 패밀리에 속하며, 또한 폴리오바이러스(Poliovirus)와 함께 엔테로바이러스(Enterovirus) 속에 속한다.

콕사키바이러스 B3(CVB3)은 정상인의 심장에서 약하게 발현되는 콕사키-아데노 바이러스 수용체에 결합하는 심장-감염성(cardiotropic)을 특성으로 하며, 확장성 심근증을 유발하는 바이러스이다. 또한 일반감기를 일으키는 특징을 가진다. 따라서 콕사키 바이러스 증식 억제 물질의 개발은 매우 중요하고 파급효과가 크다.

본 발명자는 이전에도 다양한 항바이러스 물질들을 발명 연구해 왔는바, 본 발명을 통해 식물에서 추출된 신체 독성이 낮은 새로운 항바이러스 물질 3-[3,4-dihydroxyphenyl]acrylic acid 1-[3,4-dihydroxyphenyl]-2-methoxycarbonylethyl ester를 확인하였다.

상기 화합물을 분리해낸 오리방풀(Isodon excisus (Max.) Kudo)은 우리나라 각처의 산에서 자라는 다년생 초본이다. 생육환경은 습기가 많고 반그늘이며 토양이 비옥한 곳에서 자란다. 오리방풀의 새순은 나물로 무쳐 먹거나, 관상용 또는 약용으로 사용되어 왔다.

상기 오리방풀에서 분리된 3-[3,4-dihydroxyphenyl]acrylic acid 1-[3,4-dihydroxyphenyl]-2-methoxycarbonylethyl ester 화합물은 아폽토시스 저해효과가 있는 것으로 알려져 있으나(Journal of Natural Product, 2001, 64, 659-660), 콕사키 바이러스의 증식 억제와 관련하여서는 어떠한 문헌에도 발표된 적이 없다.

전술한 내용에 의해서 시사되었듯이, 본 발명의 목적은 기존 항바이러스제의 문제점을 해결하면서도, 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있을 뿐 아니라, 콕사키 바이러스 증식 억제 효과가 뛰어난 물질을 제공하는 데 있다.

또한, 상기와 같은 물질을 유효성분으로 함유하는 감기 치료 및 예방용 조성물을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

또한, 상기와 같은 물질을 유효성분으로 함유하는 심장 염증 치료 및 예방용 조성물을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 오리방풀로부터 콕사키바이러스 증식 억제활성을 가지는 화합물을 분리해내는 방법을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

발명자들은 위와 같은 목적을 달성하고자 오랜 기간에 걸쳐 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 오리방풀에서 유래된 3-[3,4-dihydroxyphenyl]acrylic acid 1-[3,4-dihydroxyphenyl]-2-methoxycarbonylethyl ester 화합물이 우수한 콕사키바이러스 증식 억제효과를 가짐을 확인하여 본 발명에 이르게 되었다.

상기와 같은 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 화합물과 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 콕사키바이러스 증식 억제제인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물과 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 콕사키바이러스 증식 억제용 건강식품인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 전술한 콕사키바이러스 증식 억제제를 함유하는 감기 치료 및 예방용 조성물인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 전술한 콕사키바이러스 증식 억제제를 함유하는 심장 염증 치료 및 예방용 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한,

1) 오리방풀(Isodon excisus (Max.) Kudo)을 메탄올로 추출하고 감압농축한 후 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계;

2) 상기 에틸아세테이트 추출물을 농축하고 클로로포름과 메탄올의 혼합용매에 용해시킨 후 실리카 젤 칼럼 흡착 크로마토그래피(silica gel column adsorption chromatography)를 수행하여 활성분획을 농축하여 농축액을 얻는 단계;

3) 상기 농축액을 메탄올에 용해시킨 후 세파덱스 LH-20 젤 칼럼 크로마토그래피(sephadex LH-20 gel column chromatography)를 수행하여 활성분획을 모으는 단계; 및

4) 상기 활성분획을 고압액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)로 분리하고 용매를 감압건조기로 제거한 후 냉동 건조하여 목적 화합물을 얻는 단계를 포함하는,

다음 화학식 1 화합물의 추출방법을 제시한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 독성이 없고 우수한 콕사키바이러스 증식 억제효과를 나타내므로 항바이러스 치료제 또는 건강식품 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 화학식 1 화합물의 콕사키바이러스의 증식과 세포 독성 억제 효능 확인 결과이고,
도 2는 화학식 1의 화합물에 의한 세포로부터 추출한 단백질에서 콕사키바이러스의 막 단백질 VP1의 단백질 발현 억제효과를 웨스턴 블럿(Western blot)으로 분석한 결과이며,
도 3은 화학식 1의 화합물에 의한 콕사키바이러스 감염 심근염 동물모델의 항바이러스 효능 검증 결과이다.

본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 오리방풀(Isodon excisus (Max.) Kudo)로부터 분리한 화학식 1로 표시되는 화합물이 콕사키바이러스 증식에 대한 억제효능을 가짐을 확인함으로써 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 콕사키바이러스 증가로 인한 질환치료제 및 건강식품의 가능성을 실증하였다.

먼저, 오리방풀로부터 콕사키바이러스 증식 억제활성물질을 분리 추출하는 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.

오리방풀을 채취하여 메탄올로 48 시간 환류추출하고 감압농축한 후, 에틸아세테이트를 사용하여 추출한다.

농축된 에틸아세테이트 추출물을 클로로포름과 메탄올(100 ~ 10 : 1의 부피비)의 혼합용매를 용출용매로 이용하는 실리카 겔 칼럼 흡착 크로마토그래피(silica gel column adsorption chromatography)를 수행하여 활성분획을 농축한다.

상기 농축된 활성분획을 메탄올에 용해시킨 후 세파덱스 LH-20 젤 칼럼 크로마토그래피(sephadex LH-20 gel column chromatography)를 수행하여 활성분획을 모은다.

C18 칼럼과 물-아세토나이트릴(acetonitrile)(20% 아세토나이트릴~100% 아세토나이트릴, 30분) 용출 용매를 이용하는 고압액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)로 상기 활성분획을 분리하여 화학식 1의 화합물을 얻는다.

화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 예컨대 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 화학식 1의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 형용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

이렇게 얻어진 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 대하여 콕사키바이러스 증식 억제 효능 및 VP1 발현 억제 효과를 측정한 결과, 우수한 콕사키바이러스 증식 저해 활성을 가짐을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하여 비정상적으로 유발하는 콕사키바이러스 증식에 대한 억제효능에 대한 치료조성물 및 건강식품을 제조하는 데 이용될 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용 등으로 투여할 수 있으며, 일반적인 의약품 및 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

또한 상기 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화될 수 있다.

정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 화학식 1의 화합물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

또한, 본 발명의 유효성분은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5 내지 20 mg/일의 유효용량을 가지며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 2~3회 분할하여 투여될 수 있다.

또한 전술한 건강식품이란, 상기 유효성분을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아님을 밝혀둔다.

실시예 1: 오리방풀로부터 콕사키바이러스 증식 억제물질 분리

지리산 일원에서 채집한 후 건조한 오리방풀(Isodon excisus (Max.) Kudo) 2.5kg을 100% 메탄올로 48 시간 동안 추출하여 감압농축한 후 에틸아세테이트로 추출하였다. 상기 에틸아세테이트 층을 농축하여 클로로포름과 메탄올(100:1)을 혼합한 소량의 혼합용매에 용해시킨 후 실리카 젤 칼럼 크로마토그래피(20-230 mes, Merck)를 수행하여 활성분획을 농축하였다. 상기 농축된 활성분획을 메탄올에 용해시킨 후 세파덱스 LH-20 젤 칼럼 크로마토그래피(sephadex LH-20 gel column chromatography)를 수행하여 활성분획을 모았다.

상기 농축된 활성분획을 물-아세토나이트릴(20% 아세토나이트릴~100% 아세토나이트릴, 30분) 용출용매로 이용하는 고압액체 크로마토그래피(컬럼: C18, 유속: 1.5 ㎖/분, 220 nm 검출)를 수행하여 활성분획을 분리하고 감압건조기로 용매를 제거한 후 얻은 잔사(residue)를 냉동 건조하여 콕사키바이러스 증식 억제물질 5.8 ㎎을 얻었다.

실험예 1: 화학식 1의 화합물의 콕사키바이러스 증식 억제효과 측정

화학식 1로 표시되는 화합물의 콕사키바이러스의 증식과 세포독성억제 효능을, HeLa 세포를 사용하여 확인하기 위하여 다음과 같이 실시하였다.

상기 실시예 1의 오리방풀에서 분리된 화학식 1의 화합물을 96well 세포배양 접시에 배양된 HeLa 세포에 1mM 부터 농도별로 희석한 화합물을 세포배양액에 첨가하여 처리하고 콕사키바이러스를 10⁵ pfu/ml 로 18시간 동안 감염시킨 후 세포의 증식 검출 시약인 Cell Counting Kit 8 (CCK-8) 7 ml를 넣고 2시간 동안 더 배양하였다. 그다음 Microplate reader (Molecular device, USA)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존을 확인하여 항바이러스 효능을 확인하였다.

상기 결과를 표현한 도 1과 같이 HeLa 세포의 생존은 콕사키바이러스 감염 후 화학식 1의 화합물의 농도에 의존적으로 증가하였으며, 이로부터 화학식 1의 화합물의 우수한 콕사키바이러스 증식과 세포 독성 억제 효능을 확인할 수 있다.

실험예 2: 화학식 1의 화합물의 VP1의 발현 억제 효과 확인

화학식 1의 화합물의 VP1의 발현 억제효과에 대해 웨스턴 블럿(Western blot) 분석을 통하여 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

HeLa 세포에 오리방풀로부터 분리한 화학식 1의 화합물을 100, 10, 1 ㅅM 농도로 처리하여 콕사키바이러스를 10⁵ pfu/ml 감염시키고 37 ℃, 5% CO₂에서 18시간 동안 배양하였다. 배양된 세포로부터 단백질 추출 완충용액을 이용하여 세포 분해 산물(total cell lysates)을 제조하여, 세포로부터 추출한 단백질에서 콕사키바이러스의 막 단백질 VP1 발현 양상을 VP1 항체를 사용한 웨스턴 블럿으로 분석하였다.

도 2는 화학식 1의 화합물에 의한 세포로부터 추출한 단백질에서 콕사키바이러스의 막 단백질 VP1의 단백질 발현 억제효과를 웨스턴 블럿(Western blot)으로 분석한 결과로서, 화합물의 직접적인 콕사키바이러스의 증식 억제 효능을 확인하였으며 화합물의 농도에 따라 콕사키바이러스의 증식이 조절됨을 확인하였다. 화학식 1의 화합물 첨가에 의한 VP1의 단백질 발현 억제 결과를 도 2에 기재하였다.

실험예 3: 콕사키바이러스 감염 심근염 동물모델을 사용한 항바이러스 효능 검증 실험

6주령 마우스에 화학식 1의 화합물 100ug/ml를 복강주사를 통해 전달한 그룹 (n=10)과 화합물이 포함되지 않은 주사액을 복강주사 한 그룹 (n=10)을 각각 준비하고 바로 콕사키바이러스 10⁴ pfu/ml을 복강주사를 통해 감염시켰다. 바이러스 감염 후 12일까지 바이러스 감염 전기의 생쥐의 생존을 관찰하여 화합물의 콕사키바이러스 증식 억제 효능을 검증하였다. 화합물을 투여한 그룹의 생쥐 생존율은 85%로 투여하지 않은 그룹의 50%와 비교하여 매우 높은 생존율 증가를 기록하였다(도 3).

본 결과를 통해 화학식 1의 화합물의 콕사키바이러스 증식 억제와 감염으로 인한 세독 독성 억제 효과가, 배양된 세포뿐만 아니라 실험동물 모델에서도 유의하게 나타남을 확인하였다.

상기에서 확인된 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 항바이러스 치료제 또는 조성물로 제제되어 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

이하 시럽제, 정제, 주사액제의 제조예를 예시하고자 한다.

제제예 1: 시럽제의 제조

본 발명의 화학식 1의 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다.

화학식 1의 화합물의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르빈산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

화학식 1의 화합물의 염산염 2 g

사카린 0.8 g

당 25.4 g

글리세린 8.0 g

향미료 0.04 g

에탄올 4.0 g

소르빈산 0.4 g

증류수 정량

제제예 2: 정제의 제조

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

화학식 1의 화합물의 염산염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

화학식 1의 화합물의 염산염 250 g

락토오스 175.9 g

감자전분 180 g

콜로이드성 규산 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 160 g

활석 50 g

스테아르산 마그네슘 5 g

제제예 3: 주사액제의 제조

유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

화학식 1의 화합물의 염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르빈산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

화학식 1의 화합물의 염산염 1 g

염화나트륨 0.6 g

아스코르빈산 0.1 g

증류수 정량

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물과 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 감기 치료 및 예방용 약학 조성물.
   

   
4. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물과 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 심장 염증 치료 및 예방용 약학 조성물.
   

   

   
   
5. 삭제

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