KR100998081B1 - 라우릭산을 유효성분으로 함유하는 항바이러스제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라우릭산을 유효성분으로 함유하는 항바이러스 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 라우릭산(raoulic acid)이 감기 등의 호흡기질환을 유발하는 주원인 바이러스인 라이노바이러스, 심근염을 유발하는 코사키바이러스, 수족구병을 일으키는 엔테로바이러스에 대한 증식억제 활성을 나타냄을 확인함으로써 라우릭산을 유효성분으로 함유하는 항바이러스 조성물에 관한 것이다.

라우릭산(raoulic acid), 항바이러스 조성물, 라이노바이러스, 코사키바이러스, 엔테로바이러스

Description

라우릭산을 유효성분으로 함유하는 항바이러스제 조성물{Antiviral effect of raulic acid and thereof}

본 발명은 라우릭산을 유효성분으로 함유하는 항바이러스 조성물에 관한 것이다.

라우릭산(raoulic acid)은 라울리아 아우스트알리스(Raoulia australis)에서 유래된 25개의 탄소로 구성된 테르펜(terpene) 계열의 천연물질[Bloor SJ. 1993. In tetrahedron-lett. Elsevier Science Ltd 34(35):5617-5620]이나, 생물산업 또는 의학적 용도로서 논문이나 특허에 보고된 바 없다.

라이노바이러스는 크게 라이노바이러스 A 형와 라이노바이러스 B형 바이러스로 나뉘며 모두 주로 상기도 호흡기 조직에 감염하여 감기를 일으키는 바이러스로서 전체 감기 원인의 50% 이상을 차지하며 감염의 주증상은 부비강염, 콧물, 중이염, 만성 기관지염 등으로 나타난다[FG Hayden 2004. Rev. Med. Virol. 14:17-31]. 특히, 라이노바이러스 감염은 급성 기관지염이나 천식[Johnston SL 등 1995. Br. Med. J. 310:1225-1229]이나 폐렴[Wald TG 등 1995. Ann Intern. Med. 123:588-593] 등 다른 만성 호흡기 질병의 발생을 초래하기도 한다.

엔테로바이러스 감염 질환은 전 세계 5천만 명의 환자가 있을 것으로 추산되는데[Morens DM 과 Pallansch MA 1995. In; Human enterovirus infections. Rotbalt HA (ed) Washington, DC, ASM Press, pp3-23), 감기(Pallansch MA 2003. In :infectious diseases. Gorbach SL, Barlett JG, Blacklow NR (eds). Philadelphia:Lippincott, Williams and Wilkins, pp 2347-2057], 수족구[Chang LY 등, 1998. Lancet (352): 367-368], 무균척수염이나 뇌염[Chonmaitree T. 등, 1981. Pediatrics. 489-493], 급성근육마비, 심근염[Fujioka S, Kitaura Y. 2001. Biodrugs. 15(12):791-799], type I 형 당뇨[Green J, Casabonne D, Newton R. 2004. Diabet Med. 21(6):507-514] 등 매우 다양한 형태로 나타난다.

라이노바이러스를 억제하는 약제는, sICAM-1형으로 라이노바이러스가 수용체인 ICAM-1과의 결합을 억제하는 약제인 트레마캄라(Tremacamra)[Truner RB 등 1999, JAMA 281:1797-1804], 라이노바이러스(HRV)의 3C 프로테아제를 억제하는 기능을 가지는 약제[Wang, QM, 2001. Prog. drug Res. 229-253; Chen DH .등 2003. Bioorg Med Chem Lett 13:3531-3536.; Dragovich PS 등 2002. J Med Chem 45:1607-1623], 바이러스의 캡시드와 반응하는 제제로는 WIN 51711[Otto MJ 등 1985. Antimicrob Agents Chemother 27(6):883-886], 피로다비르(Pirodavir)[Brown RN 등 2005. Bioorg Med Chem Lett 15(8): 2051-2055], 플레코나릴(Pleconaril)[Pevear DC 등 1999. Antimicrob Agents Chemother 43(9):2109-2115], 바이러스 RNA 합성 저해제로는 엔비록심(enviroxime)[Carraso L. 1994. 64:215-290]들이 개발되고 있 다. 트레마캄라는 분사형 제제로 하루에 자주 처방해야 하는 단점과 효과도 낮은 편이어서 개발이 더 이상은 진행되지 않고 있다. HRV 3C 프로테아제 저해제는 in vitro 시험에서는 HRV 14 에 대하여 효능이 입증되었으나[Chen DH .등 2003. Bioorg Med Chem Lett 13:3531-3536], 원숭이를 감염모델로 한 시험에서 유의성있는 결과를 얻지 못했다[Dragovich PS 등 2002. J Med Chem 45:1607-1623]. 피로다비르는 여러 혈청형의 라이노바이러스의 증식을 저해하나 약리역학의 값이 낮고 쉽게 가수분해되는 성질이 있어 치료의약으로 진행되지 못하고 있으며 피로다비르를 모체로 하여 합성된 피로다비르의 유도체는 피로다비르 보다 개선된 약리역학의 값을 나타내고 있다. 플레코나릴은 라이노바이러스, 엔테로바이러스 등 넓은 적용 범위를 가지고 있으나, 약제 상호작용, 한계효능, 내성바이러스의 생성으로 아직 미국 FDA로부터 승인을 받지 못하고 있다.

RNAi도 최근 라이노바이러스 치료제로 연구되고 있으나[Phipps 등 2004. Antiviral Res. 61:49-55], 100여종이 되는 라이노바이러스의 종류별로 표적 RNAi를 달리 제조해야하는 단점이 있다.

엔테로바이러스는 폴리오바이러스 그룹, 코사키바이러스 그룹, 엔테로바이러스 그룹으로 나뉘어진다. 폴리오바이러스는 여름철 감기나 소아마비 등을 일으킨다. 폴리오바이러스는 바이러스를 약독화한 약독백신으로 질병 발생율이 현저히 감소하고 있다. 이에 대한 약제로는 라이노바이러스저해제인 엔비록심도 폴리오바이러스의 증식을 저해하나 구강 투여 시 부작용이 있다.

코사키바이러스는 심각한 신생아질병을 일으키며 심근염, 본홀름병 등의 원 인바이러스이다. 피코르나바이러스 치료제인 플레코나릴도 코사키바이러스에 효능을 나타내나 부작용으로 실용화되지 못하고 있다

엔테로바이러스는 엔테로바이러스에서 다시 엔테로바이러스 속으로 분류되는 바이러스로 뇌척수염, 수족구(Enterovirus 71) 등의 질병을 일으킨다. 플레코나릴도 엔테로바이러스에 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다[Hsiung GD & Wang JR 2000. J Microbiol Immunol Infect 33(1):1-8].

리바비린은 RNA 바이러스뿐만 아니라 DNA 바이러스에 항바이러스능을 나타내는 항바이러스제로서 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 홍역, 아데노바이러스, 엔테로바이러스 감염질환에 광범위하게 적용되는 의약으로[Chang TW 와 Heel RC 1981. Drugs 22(2):111-128; Rawlinson WD. 2001 Med J Aust 175(2):112-116] 라이노바이러스에도 항바이러스능을 나타내는 의약으로 알려져 있다[Weinberger M 2004. Drug Discov Today 9(19):831-837].

이에, 본 발명자들은 항바이러스 활성을 갖는 화합물을 찾고자 노력한 결과, 천연 식물 성분이며, 천연지방산의 일종인 라우릭산(raoulic acid)이 라이노바이러스, 코사키바이러스, 엔테로바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 가짐을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 라우릭산(raoulic acid)을 이용하여 바이러스 감염질환을 치료 또는 예방할 수 있는 항바이러스 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 라우릭산(raoulic acid)을 유효성분으로 함유하는 항바이러스 조성물을 그 특징으로 한다.

본 발명에 따른 라우릭산(raoulic acid)은 감기 등의 호흡기질환을 유발하는 주원인 바이러스인 라이노바이러스, 심근염을 유발하는 코사키바이러스, 수족구병을 일으키는 엔테로바이러스에 대한 증식 억제 활성을 나타냄을 확인함으로써 이들 바이러스감염으로 인한 질환 치료에 큰 도움이 될 수 있으리라 기대된다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 라우릭산(raoulic acid)이 감기 등의 호흡기질환을 유발하는 주원인 바이러스인 라이노바이러스, 심근염을 유발하는 코사키바이러스, 수족구병을 일으키는 엔테로바이러스에 대한 증식 억제 활성을 나타냄을 확인함으로써 라우릭산을 유효성분으로 함유하는 항바이러스 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 포화지방산의 일종인 라우릭산이 라이노바이러스,코사키바이 러스, 엔테로바이러스에 대하여 뛰어난 바이러스 증식 억제능을 가지고 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 라우릭산은 라이노바이러스, 코사키바이러스 엔테로바이러스의 감염 치료 또는 예방에 큰 도움이 될 수 있으리라 기대된다.

본 발명에 따른 라우릭산을 의학적으로 이용 시에는 약제학적 분야에서 통상적인 담체와 함께 배합한 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제; 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 형태인 주사용 제제; 또는 연고제 등의 다양한 제제로 제형화할 수 있다. 통상적인 담체를 상용하여 제조된 약학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로 예를 들면 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있다.

또한, 추출물의 투여량은 동물의 무게, 연령 상태 등에 따라 차이가 있으나, 일반적으로 1일에 50 ㎎/kg, 바람직하게는 20 ∼ 100 ㎎/kg의 양이 투여되도록 하며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 1회 내지는 4회 분할 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 라우릭산(raoulic acid)을 유효성분으로 하는 건강식품을 포함한다.

건강식품이란, 라우릭산을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

참조예 1: 라우릭산의 분리 및 동정

음건한 후 마쇄한 라울리아 아우스트알리스(Raoulia australis) 200 g을 에테르에 48시간 침지하여 추출하였다. 추출용액을 여과지(Watman No. 2)로 여과한 다음 40 ℃ 이하에서 감압 농축하여 3.8 g의 조추출물을 얻었다. 조추출물을 실리카겔 (silica gel) 70 g이 충진된 컬럼에 에테르와 에틸아세테이트의 농도구배를 이용하여 통과시켜 11개의 분획물을 얻었다. 그 중에서 2번째 분획물이 25개의 탄소로 구성된 테르펜(terpene) 계열의 라우릭산(raoulic acid)임을 확인하였다.

이 화합물의 분자식은 고분해능 매스스펙트로스코피(HRMS) 분석을 통하여 C₂₅H₃₈O₂(계산값 370.2872, 측정값 370.2854) 결정되었다.

¹H-NMR과 ¹³C-NMR 스펙트럼 결과도 이를 뒷받침하였으며, gDQCOSY, HSQC, gHMBC등 2차원 NMR 스펙트럼을 해석하여 각 signal의 상관을 확인하여 raoulic acid의 화학구조를 결정하였으며, 1차원 NMR의 분석결과는 다음과 같다.

¹H-NMR 스펙트럼(500 MHz, CDCl₃) δ 6.32, 5.64, 5.12, 5.10, 4.97, 4.55, 2.92, 2.25, 1.68, 1.57 Hz.

¹³C-NMR 스펙트럼(120 MHz, CDCl₃): δ 173.7, 151.4, 145.5, 144.9, 132.2, 126.2, 123.2, 112.2, 109.0, 51.1, 46.5, 42.2, 41.4, 39.7, 39.2, 37.4, 37.3, 34.1, 29.0, 28.8, 25.8, 23.2, 23.1, 17.8, 14.5 Hz.

참조예 2: 대조군으로 사용된 항바이러스제

라우릭산의 바이러스 증식 억제능을 비교 측정하기 위하여, 현재 항바이러스제로 사용되는 있는 약제(Ribavirin)를 Sigma사로부터 구입하여 세포 배양용액에 희석하여 사용하였다.

참조예 3: 라우릭산의 항바이러스능 측정에 사용된 바이러스의 종류

라우릭산의 바이러스증식 억제능을 측정하기 위해 사용된 바이러스는 라이노바이러스로는 라이노바이러스 2 형과 3형을 대상으로 하였으며, 코사키바이러스는 코사키바이러스 B3 형과 B4형을 대상으로 하였으며, 엔테로바이러스는 엔테로바이러스 71(EV71)을 사용하였다. 각 바이러스는 ATCC로부터 구입하여 본 연구실에서 바이러스 활성을 배양 측정한 후에 -70 ℃에 보존하여 사용하였다.

실시예 1: 라이노바이러스에 대한 라우릭산의 항바이러스능 시험

라우릭산의 라이노바이러스에 대한 바이러스 증식 억제능을 측정하기 위해서, HeLa 세포를 2x10⁴개의 세포를 96 웰 플레이트(well plates)의 각 웰에 넣고 24시간 배양하였다. 24시간 후에 각 웰의 배양 상등액을 제거하고 TCID50으로 적정된 라이노바이러스 2 형과 3형 바이러스 용액을 각 웰에 넣은 다음, 각 라우릭산의 농도가 100, 10, 1, 0.1 ㎍/㎖이 되도록 96 웰 플레이트의 각 웰에 투여하였다. 라우릭산의 바이러스 증식 억제능 측정은 대한민국 등록특허 제682069호에 제시된 방법에 따라 실시하였다.

감염 시험이 종료된 후에 96 웰 플레이트의 각 웰에 10% TCA(trichloroacetic acid)를 100 ㎕씩 첨가한 후 1시간 동안 4 ℃에 방치하고 증류수로 수회 세척하였다. 실온에서 건조시킨 후 1%(v/v) 아세트산에 녹인 0.4% (w/v) SRB(sulforhodamine B) 용액 100 ㎕를 첨가해 30분 동안 염색시켰다. 세포와 결합하지 않은 SRB 염색액은 1%(v/v) 아세트산으로 수회 세척한 다음 다시 건조시켰다. 각 웰에 10 mM 트리스 용액(pH 10.5) 100 ㎕를 각 웰에 가하여 세포와 결합되어 있는 염색제를 충분히 녹인 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 바이러스를 처리하지 않은 군(A), 라우릭산만을 처리한 군(B), 바이러스만을 처리한 군(C), 바이러스와 수용성 추출물을 같이 처리한 군(D)으로 표기하였고, 라우릭산의 1 ㎍/㎖ 농도에서의 세포생존율(%)[수학식 1]과 라우릭산의 바이러스에 대한 증식 억제능(%)[수학식 2]을 구하여 다음 표 1에 나타내었다. 결과에 대한 통계는 동일한 조건에서 수행한 3번의 실험결과 수치에 대한 평균값과 표준편차로 계산한 값을 다음 표 1에 제시하였다.

실시예 2: 코사키 바이러스에 대한 라우릭산의 항바이러스능 시험

라우릭산의 코사키바이러스에 대한 바이러스 증식 억제능을 측정하기 위해서, HeLa 세포를 2x10⁴개의 세포를 96 웰 플레이트(well plates)의 각 웰에 넣고 24시간 배양하였다. 24시간 후에 각 웰의 배양 상등액을 제거하고 TCID 50으로 적정된 코사키바이러스 B3 형과 B4형 바이러스 용액을 각 웰에 넣은 다음, 라우릭산의 농도가 100, 10, 1, 0.1 ㎍/㎖이 되도록 각 웰에 투여하였다. 라우릭산의 바이러스 증식 억제능 측정은 대한민국 등록특허 제682069호에 제시된 방법에 따라 실시하였다.

감염 시험이 종료된 후에 96 웰 플레이트의 각 웰에 10% TCA(trichloroacetic acid)를 100 ㎕씩 첨가한 후 1시간 동안 4 ℃에 방치하고 증류수로 수회 세척하였다. 실온에서 건조시킨 후 1%(v/v) 아세트산에 녹인 0.4% (w/v) SRB(sulforhodamine B) 용액 100 ㎕를 첨가해 30분 동안 염색시켰다. 세포와 결합하지 않은 SRB 염색액은 1%(v/v) 아세트산으로 수회 세척한 다음 다시 건조시켰다. 각 웰에 10 mM 트리스 용액(pH 10.5) 100 ㎕를 각 웰에 가하여 세포와 결합되어 있는 염색제를 충분히 녹인 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 실시예 1과 같은 방법으로 라우릭산의 1 ㎍/㎖ 농도에서의 세포생존율(%)과 바이러스 증식 억제능(%)을 구하여 다음 표 1에 나타내었다.

실시예 3: 엔테로바이러스에 대한 항바이러스능 시험

라우릭산의 엔테로바이러스 71(EV71)에 대한 바이러스 증식억제능을 측정하기 위해서, HeLa 세포를 2x10⁴개의 세포를 96 웰 플레이트(well plates)의 각 웰에 넣고 24시간 배양하였다. 24시간 후에 각 웰의 배양 상등액을 제거하고 TCID 50으로 적정된 엔테로바이러스 EV71 바이러스 용액을 각 웰에 넣은 다음, 라우릭산의 농도가 100, 10, 1, 0.1 ㎍/㎖이 되도록 각 웰에 투여하였다. 라우릭산의 바이러스 증식 억제능 측정은 대한민국 등록특허 제682069호에 제시된 방법에 따라 실시하였다.

바이러스 감염 시험이 종료된 후에 각 웰에 10% TCA(trichloroacetic acid)를 100 ㎕씩 첨가한 후 1시간 동안 4 ℃에 방치하고 증류수로 수회 세척하였다. 실온에서 건조시킨 후 1%(v/v) 아세트산에 녹인 0.4% (w/v) SRB(sulforhodamine B) 용액 100 ㎕를 첨가해 30분 동안 염색시켰다. 세포와 결합하지 않은 SRB 염 색액은 1%(v/v) 아세트산으로 수회 세척한 다음 다시 건조시켰다. 각 웰에 10 mM 트리스 용액(pH 10.5) 100 ㎕를 각 웰에 가하여 세포와 결합되어 있는 염색제를 충분히 녹인 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 실시예 1과 같은 방법으로 라우릭산의 1 ㎍/㎖ 농도에서의 세포생존율(%)과 바이러스 증식 억제능(%)을 구하여 다음 표 1에 나타내었다.

구분	세포생존율(%)	바이러스 증식 억제능(%)
라이노바이러스 2형	100	88.6
라이노바이러스 3형	96.1	96.6
코사키바이러스 B3형	126.59	95.43
코사키바이러스 B4형	89.74	96.07
엔테로바이러스 71형	93.31	60.39

시험예 1: 라우릭산의 항바이러스능 분석

라우릭산은 라이노바이러스 2형에서는 0.1 ㎍/㎖의 농도에서 50% 이상의 억제능을 보였으며 라이노바이러스 3형에 대해서는 0.19 ± 0.11 ㎍/㎖로서 역시 매우 낮은 농도에서 50% 억제능을 나타냈으며, 일반적으로 항바이러스제의 활성을 측정하는 비율값인 TI(CC₅₀/IC₅₀)값이 라이노바이러스 2형과 3형에 대해 2017, 1090의 값을 나타내어 항바이러스제 의약의 일반적인 TI 값이 100 정도를 나타냄과 비교하여 매우 뛰어난 항바이러스능을 나타내고 있음을 나타내고 있다. 리바비린은 100 ㎍/㎖에서 농도에서도 50% 억제능을 보여주지 못했다[표 2 참조].

또한, 라우릭산은 코사키바이러스 B3형에서는 0.33 ± 0.02 ㎍/㎖의 농도에서 50%의 억제능을 보였으며, 코사키바이러스 B4형에 대해서는 0.40 ± 0.05 ㎍/㎖로서 역시 매우 낮은 농도에서 50% 억제능을 나타냈으며, 엔테로바이러스 71에 대해서는 0.1 ㎍/㎖의 농도에서 50% 이상의 억제능을 보였으며, TI(CC₅₀/IC₅₀)값이 코사키바이러스 B3형과 B4형에 대해 199.58, 164.65의 값을 나타내었고 엔테로바이러스 71에 대해서는 658.6 이상의 값을 나타내어 항바이러스제 의약의 일반적인 TI 값이 100정도를 나타냄과 비교하여 매우 뛰어난 항바이러스능을 나타내고 있음을 나타내고 있다. 리바비린은 상기 3종류의 바이러스에 대하여 모두 100 ㎍/㎖에서 농도에서도 50% 억제능을 보여주지 못했다[표 3 참조].

시험예 2: 독성시험

라우릭산을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 100 ㎎/㎏을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없었다.

제조예 1: 분말 및 캅셀제의 제조

라우릭산 10 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 결정성 셀룰로오스 3 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 No.5 젤라틴 캅셀에 채웠다.

상기 분말 및 캡슐제의 구성성분은 다음과 같다.

유효성분 10 ㎎

락토오스 14.8 ㎎

결정성 셀룰로오스 3 ㎎

마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎

제조예 2: 주사액제의 제조

라우릭산 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

라우릭산 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르빈산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

유효성분 1 g

염화나트륨 0.6 g

아스코르빈산 0.1 g

증류수 적량

제제예 3: 음료 제조

라우릭산 500 ㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때, 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

Claims (5)

1. 삭제
2. 다음 화학식 1로 표시되는 라우릭산(raoulic acid)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 라이노바이러스에 대한 항바이러스 조성물.

   [화학식 1]

   
3. 삭제
4. 다음 화학식 1로 표시되는 라우릭산(raoulic acid)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 엔테로바이러스에 대한 항바이러스 조성물.

   [화학식 1]

   
5. 삭제