CN108042600A - 杜仲木脂素及杜仲提取物在制备Hsp90α抑制剂和抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种杜仲木脂素及杜仲提取物在制备Hsp90α抑制剂和抗肿瘤药物中的应用，特别是在制备热休克蛋白90α(heat shock protein 90，Hsp90α)选择性C‑端抑制剂及用于抗乳腺癌和前列腺癌中的应用。本发明发现用杜仲为原料提取制备而成的杜仲木脂素及其提取物可以抑制重组人热激蛋白90αC‑端酶活性，与阳性对照药物新生霉素相比，杜仲木脂素显示出更优的抗肿瘤活性。

Description

杜仲木脂素及杜仲提取物在制备Hsp90α抑制剂和抗肿瘤药物 中的应用

技术领域

本发明属于中药提取物应用技术领域，具体涉及杜仲木脂素及杜仲提取物在制备Hsp90α抑制剂和抗肿瘤药物中的应用，特别设涉及以杜仲为原料提取制备而成的杜仲木脂素及其提取物在制备选择性Hsp90α C-端抑制剂中的应用。

背景技术

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)又名木棉、思仙、思仲、思锦树，为单科单属落叶乔木，是第三世纪冰川运动遗留下来的“活化石”。杜仲是我国特有的经济树种，其野生分布中心在中国的中部地区，并广泛种植于湖南、湖北、河南、山西、四川、贵州、云南等省。杜仲在我国有2000多年的药用历史。《神农本草经》和《本草纲目》均将杜仲列为上品，并记载“杜仲色紫，味甘而辛，其性湿平，甘温能补，微辛能润，故能入肝而补肾；主治腰膝痛，补中益精气，坚筋骨，强志，除阴下痒湿，小便余沥；久服，轻身耐劳”。现代研究表明杜仲具有降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗菌抗病毒、抗炎、抗氧化、保肝护肾、抗骨质疏松等药理作用。

热休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)作为一个抗癌分子靶点已经有十几年的历史。HSP90是细胞内最活跃的伴随蛋白之一，不仅广泛参与多种蛋白的折叠、活化和重组，也调控EGFR、HER2、CDK4、C-Raf、B-Raf、AKT、MET、BCR-ABL等多种蛋白的转运，维持细胞的信号转导。抑制HSP90的表达将阻止这些下游肿瘤基因的代谢和传导，所以理论上HSP90是一个很理想的分子靶点。2008年，施贵宝以高达1.9亿美元的价格收购了Bosan生物科学，后者旗下的HSP90抑制剂是促使施贵宝这次收购的重要原因之一。

Hsp90抑制剂按照结合位点的不同可大体分为N-末端抑制剂、C-末端抑制剂以及结合位点未明确的抑制剂。第一代的HSP90N-端抑制剂主要有Geldanamyvin(GM)和Radicicol(RD)两个代表性化合物。这两个来自天然产物的HSP90抑制剂都是作用于ATP与N端调控盒的结合。但是一代抑制剂有两个致命的缺点：体内稳定性差和严重的肝毒性反应。因此，药物化学家长期以来致力于第二代抑制剂的研发，尤其着重改善一代抑制剂的体内稳定性和肝副作用。从第一代抑制剂的临床经验获知，HSP90抑制剂通常对多发性髓样瘤、乳腺癌、和急性髓样白血病表现应答。第二代HSP90N-端抑制剂已经改良了体内稳定性，减少了肝的副作用。从目前的临床实验结果看，HSP90抑制剂作为单药使用对非小细胞肺癌以及HER、ER阳性的乳腺癌有应答反应；与Docetaxel合用对进展性非小细胞肺癌、急性髓样白血病、肾细胞癌也表现应答；与Bortezomib合用对多发性髄样瘤有应答反应。新生霉素是香豆素类抗生素，研究表明新生霉素是Hsp90α的C-端抑制剂，除了具有与GM相似的生物学效应外，其抑制机制又有所不同，且毒性较小。基础研究表明新生霉素及其衍生物可通过干扰Hsp90α伴侣功能阻断增殖信号通路，主要对乳腺癌和前列腺癌表现应答。目前进入三期临床开发的HSP90抑制剂有Synta pharmaceutical的Ganetespib和Infinity的Retaspimycin等，但大多数临床疗效不尽人意，说明HSP90抑制剤可能不会是个广谱抗癌药。因此开发针对不同HSP90亚组的选择性抑制剂将是HSP90抑制剤开发的重要途径之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杜仲木脂素及其提取物在制备Hsp90α抑制剂中的作用。

本发明的技术方案是，提供杜仲木脂素及杜仲提取物在制备抗肿瘤药物上的应用。

优选地，所述肿瘤为乳腺癌和前列腺癌。

本发明还提供杜仲木脂素及杜仲提取物在制备热休克蛋白90α抑制剂上的应用。

优选地，所述热休克蛋白90α抑制剂为热休克蛋白90α C-端抑制剂。

优选地，所述杜仲木脂素的制备方法为：取杜仲树皮，用体积分数为60-70％的乙醇回流提取，提取液浓缩后用大孔吸附树脂柱层析，柱层析的方法为：使用大孔吸附树脂拌样上样，先水洗2.5-4倍柱体积，再用质量分数为1％的氨水继续洗2.5-4倍柱体积，再水洗至中性，再用体积分数为15-25％的乙醇洗脱2-4倍柱体积，用体积分数为40-50％的乙醇洗2-3倍柱体积，将体积分数为40-50％的乙醇洗脱得到的洗脱液浓缩，干燥，得到杜仲木脂素。

优选地，大孔吸附树脂为D101大孔吸附树脂。

优选地，用体积分数为60-70％的乙醇回流提取两次，将两次提取得到的提取液合并。

上述杜仲木脂素的制备方法实际为杜仲的提取方法，得到的产物也可称为杜仲提取物。

目前国内外对于杜仲木脂素的药理作用研究较少，我们的研究发现杜仲木脂素具有抑制Hsp90α的作用，这为杜仲木脂素开发成通过抑制Hsp90α起到预防和治疗疾病的药物提供了试验基础。

杜仲木脂素是一种混合物，其中的木脂素成分优选占提取物重量的30％-90％。以杜仲木脂素及其提取物为活性物质可制成药物制剂，该药物制剂是通过将杜仲原料经过提取或者其他方式加工，制成活性物质，随后以该活性物质为原料，经过加入药物可接受的载体并按照制剂学的常规技术制成药物制剂。所述的杜仲木脂素及其提取物可以通过采用选自粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇沉、水沉、酯提、酮提、层析、过滤等方法得到。

杜仲木脂素及其提取物的药物制剂选自以下剂型：片剂、糖包衣片剂、薄膜包衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂，需要时可以制成缓控释制剂。给药方式可以是口服、注射、口鼻喷雾、肠腔或经皮给药。

本发明的杜仲木脂素及其提取物在制成药剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体包括：抗氧化剂、螯合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、分散剂、润滑剂、溶剂、稀释材料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用的载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素及其衍生物、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡络烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明采用杜仲木脂素进行体外酶活性的实验，测定不同浓度的杜仲木脂素对重组人热激蛋白90α C-端和N-端酶活性的影响，并以新生霉素作为阳性对照药，结果显示杜仲木脂素具有一定的Hsp90α抑制活性，IC50为46.3μM，且对重组人热激蛋白90α C-端酶活性的抑制作用呈剂量依赖性，随着浓度的增加抑制率不断增加。杜仲木脂素不影响重组人热激蛋白90α N-端酶活性。因此，杜仲木脂素可用于制备Hsp90α选择性C-端抑制剂。

与现有技术效果，本发明的有益效果是：

1、本发明的杜仲木质素或杜仲提取物与阳性对照药物新生霉素相比，杜仲木脂素具对Hsp90α的抑制活性更突出，显示杜仲木质素具有更优的抗肿瘤活性。

2、特别地，新生霉素通过靶点Hsp90α治疗的肿瘤为乳腺癌和前列腺癌，可知杜仲木质素在治疗乳腺癌和前列腺癌上更具有优势。

3、本发明发现杜仲木质素或杜仲提取物可以制备热休克蛋白90α(heat shockprotein 90，Hsp90α)选择性C-端抑制剂。

附图说明

图1a和图1b为重组人热激蛋白90α C-端酶活性随杜仲木脂素浓度的变化曲线；

图2为重组人热激蛋白90α C-端酶活性随新生霉素浓度的变化曲线；

图3为重组人热激蛋白90α N-端酶活性随Geldanamyvin浓度的变化曲线。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

取杜仲树皮(去外皮)2kg，用8L 65％乙醇回流提取两次，每次1h，过滤，合并两次提取液浓缩至800ml。用D101大孔树脂拌样上样(大孔树脂柱体积3L)，水洗3倍柱体积，1％氨水继续洗3倍柱体积，再水洗至中性。用20％乙醇洗脱2倍柱体积，用45％乙醇洗2.5倍柱体积。45％乙醇洗脱液浓缩只至600ml。洗脱液浓缩后干燥成粉末。用松脂醇二葡萄糖苷作为对照，提取物经紫外检测木脂素成分含量为85％，经HPLC检测松脂醇二葡萄糖苷含量为12.5％。

实施例2

杜仲皮(去外皮)粉碎后，加60％乙醇9L回流提取1h，过滤，滤渣再加60％乙醇7L提取1h，过滤，合并两次提取液，浓缩至无乙醇味，得浓缩液约3L。浓缩液经AB-8大孔吸附树脂柱，先用5L水洗脱，再用7L 60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，浓缩至150ml，缓慢加入到450ml水中，过滤，浓缩，得干燥固体粉末。用松脂醇二葡萄糖苷作为对照，提取物经紫外检测木脂素成分含量为75％，经HPLC检测松脂醇二葡萄糖苷含量为9.5％。

实施例1和2所得的杜仲木脂素提取物分别用于制备Hsp90α抑制剂，具有良好的Hsp90α抑制作用。

实施例3

杜仲木脂素抑制重组人热激蛋白90αC-端酶活性的实验研究

1.实验材料

试剂：杜仲木脂素，新生霉素，DMSO，Hsp90αC-terminal，ST标记的PPID亲环素D，Alphascreen Streptavidin-conjugated donor beads(供体)，Alphascreen anti-GSTAcceptor beads(受体)，羟乙基哌嗪乙磺酸，氯化钠，牛血清白蛋白。

仪器：Tecan Infinite M1000 PRO多功能酶标仪，移液器。

2.实验方法

采用TR-FRET技术对重组人热激蛋白90α酶活性进行测定，TR-FRET信号强度与反应体系中与Hsp90α结合的PPID配体数量相关。化合物溶于10％的DMSO中，将2μl的药物溶液加入到20μl的反应体系(25mM HEPES pH 7.4,100mMNaCl,0.1％bovine serum albumin，Hsp90α)中使所有反应中的DMSO终浓度小于1％。所有的结合反应均在室温下孵育120min后进行TR-FRET信号检测。用缓冲液替代配体加入到反应体系中作为阴性对照。运用TecanInfinite M1000 PRO多功能酶标仪读取荧光值，TR-FRET信号值为受体和供体荧光值的比值。

杜仲木脂素和阳性对照药新生霉素的浓度设定均为：0、0.1、0.333、1、3、10、33、100、333、1000μM。

3.实验结果

杜仲木脂素对重组人热激蛋白90α C-端酶活性具有抑制作用，该抑制作用强于阳性药物新生霉素[见图1a(实施例1得到的杜仲木脂素)、图1b(实施例2得到的杜仲木脂素)、图2]。

实施例4

杜仲木脂素抑制重组人热激蛋白90α N-端酶活性的实验研究

1.实验材料

试剂：杜仲木脂素，新生霉素，DMSO，Hsp90α N-terminal，FITC标记的格尔德霉素，羟乙基哌嗪乙磺酸，氯化钠，牛血清白蛋白。

仪器：Tecan Infinite M1000 PRO多功能酶标仪，移液器。

2.实验方法

一系列的测试化合物溶于10％的DMSO中，将10μl的药物溶液加入到100μl的反应体系(25mM HEPES pH 7.4,100mMNaCl,0.1％bovine serum albumin，Hsp90α)中使所有反应中的DMSO终浓度小于1％。所有的反应均在室温下孵育3小时，后进行荧光信号检测。FITC标记的格尔德霉素为阳性对照，用缓冲液替代化合物加入到反应体系中作为阴性对照。运用Tecan Infinite M1000 PRO多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长为485nM，发射波长为530nM。使用Tecan magellan6软件将荧光强度专为荧光偏振态，将不加入化合物时的荧光偏振(FPt)定义为100％活性，不加入蛋白和化合物的荧光偏振(FPb)定义为0％活性，加入化合物时的荧光偏振记为FP。化合物活性百分比的计算公式：％activity＝(FP-FPb)/(FPt-FPb)×100％。运用Graphpad Prism软件计算IC50值。

杜仲木脂素的浓度设定均为：0、0.1、0.333、1、3、10、33、100、333、1000μM。阳性对照药格尔德霉素的浓度设定均为：1、3.3、10、33、100、333、1000nM。

3.实验结果

杜仲木脂素对重组人热激蛋白90α N-端酶活性没有抑制作用(见图3、表1)。

表1.重组人热激蛋白90α N-端酶活性随杜仲木脂素浓度的变化

Claims (7)

1.杜仲木脂素及杜仲提取物在制备抗肿瘤药物上的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌和前列腺癌。

3.杜仲木脂素及杜仲提取物在制备热休克蛋白90α抑制剂上的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述热休克蛋白90α抑制剂为热休克蛋白90αC-端抑制剂。

5.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述杜仲木脂素的制备方法为：取杜仲树皮，用体积分数为60-70％的乙醇回流提取，提取液浓缩后用大孔吸附树脂柱层析，柱层析的方法为：使用大孔吸附树脂拌样上样，先水洗2.5-4倍柱体积，再用质量分数为1％的氨水继续洗2.5-4倍柱体积，再水洗至中性，再用体积分数为15-25％的乙醇洗脱2-4倍柱体积，用体积分数为40-50％的乙醇洗2-3倍柱体积，将体积分数为40-50％的乙醇洗脱得到的洗脱液浓缩，干燥，得到杜仲木脂素。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，大孔吸附树脂为D101大孔吸附树脂。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，用体积分数为60-70％的乙醇回流提取两次，将两次提取得到的提取液合并。