CN108558837B - 黄烷醇生物碱及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了对晚期糖基化末端产物(advanced glycation end products，AGEs)形成有抑制作用的一对黄烷醇生物碱同分异构体及其制备方法和应用，该黄烷醇生物碱由式Ⅰ或式Ⅱ所示结构表示：
Description
技术领域
本发明涉及化学技术领域，具体地说涉及一种黄烷醇生物碱及其制备方法和应用。
背景技术
茶叶是目前世界上三大无酒精饮料之一。古往今来，其独特的风味受到广大消费者的喜爱。随着人们生活水平的提高，对健康问题愈加重视。茶叶的保健功能也受到广泛关注。研究证实茶叶具有抗氧化，抗衰老，降血糖，降血脂，减肥等多种功效。茶叶健康功效的发挥与茶叶中蕴含的活性成分有关。目前，关于茶叶活性成分的研究也不断报道，茶叶中多酚类，黄酮类，生物碱类化合物等活性成分逐渐被发现，其生物活性不断被挖掘、研究。
白牡丹茶是由福鼎大白茶鲜叶加工得到的白茶，属于轻发酵茶，主要产地在中国福建省，取茶树一芽一叶或者一芽二，三叶的鲜叶加工而成，加工过程只有萎凋和干燥两个步骤，因制法独特，不炒不揉，外表满披白毫，很好的保持了茶叶的原始风味。白茶以性清凉，退热，降火，祛暑的治病效果和清幽素雅的风格，在国内外市场素负声誉，尤受侨胞的喜爱。
白茶的种种功效和其中的活性成分密不可分，因此，针对白茶活性成分的分离和鉴定的研究必不可少。如果能成功的从白牡丹茶中研究开发出具有生物活性的生物成分，将会对农业和医药等领域作出重要贡献。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种对晚期糖基化末端产物(AGEs)形成有抑制作用的黄烷醇生物碱，该黄烷醇生物碱，由式Ⅰ或式Ⅱ所示结构表示：
本发明所要解决的技术问题之二是提供上述黄烷醇生物碱在制备降血糖药物中的用途。
具体可提供一种降血糖药物，由上述黄烷醇生物碱和药用辅料制成。
所述降血糖药物的药物剂型包括口服型、外用型和注射型。
所述口服型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂；所述外用型包括栓剂、捈剂、洗剂、膏剂、透皮贴剂；所述注射型包括注射液、混旋液、冻干粉。具体制备方法参照制药领域的常规方法制备，所用药用辅料根据剂型不同选择制药领域通用的辅料。
本发明所要解决的技术问题之三是提供上述黄烷醇生物碱的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料粉碎
取白牡丹茶，对其粉碎处理，得到白牡丹茶粉末；
(2)浸提
用丙酮水溶液浸提白牡丹茶粉末，得到浸提液，对浸提液依次进行萃取处理和减压浓缩处理，得到膏状提取物；
(3)分离纯化
对膏状提取物进行分离纯化处理，得到所述黄烷醇生物碱。
进一步地，丙酮水溶液的浓度为80％。
进一步地，萃取处理采用依次使用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇的分级萃取工艺，其中，使用二氯甲烷和乙酸乙酯萃取时，保留萃取后的母液，使用正丁醇萃取时，保留正丁醇层萃取液。
进一步地，分离纯化处理包括将膏状提取物溶解后依次经Sephadex LH-20凝胶柱层析、MCI柱层析、Toyopearl柱层析和高效液相设备分离。
进一步地，分离纯化处理的具体过程为：将膏状提取物用<10％的甲醇水溶液溶解后过Sephadex LH-20凝胶柱，Sephadex LH-20凝胶柱使用MeOH-H2O体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，然后将其中50％-80％甲醇水溶液洗脱得到的组分过MCI柱，MCI柱使用MeOH-H2O体积比0:100到100:0梯度洗脱，然后将其中60％-80％甲醇水溶液洗脱得到的组分过Toyopearl柱，Toyopearl柱以50％的甲醇水溶液作为洗脱剂洗脱，最后将其中50％甲醇水溶液洗脱得到的组分用高效液相设备分离，高效液相设备采用的分离色谱柱为
Prep C18(10×250mm，5μm，Waters，Ireland)柱，流速2毫升/分钟，洗脱剂为乙腈水，洗脱条件为：0-6分钟，18％乙腈水等度冲；6-8分钟，18％乙腈水-20％乙腈水过渡；8-13分钟，20％乙腈水等度冲；13-13.5分钟，20％乙腈水-18％乙腈水过渡；13.5-22分钟，18％乙腈水等度冲，15.575分钟洗脱样品为式Ⅰ所示结构表示的黄烷醇生物碱，16.153分钟洗脱样品为式Ⅱ所示结构表示的黄烷醇生物碱。
本发明所要解决的技术问题之四是提供上述黄烷醇生物碱的检测方法，其采用UPLC-MS检测方法，流速0.22毫升/分钟，流动相：A相0.1％甲酸水，B相含0.1％甲酸的乙腈，洗脱条件：0-1.5分钟，6％乙腈水；1.5-4分钟，6％乙腈水-12％乙腈水；4-8分钟，12％乙腈水-25％乙腈水；8-10分钟，25％乙腈水-35％乙腈水；10-14分钟，35％乙腈水-90％乙腈水；14-19分钟，90％乙腈水；19-20分钟，90％乙腈水-6％乙腈水；20-23分钟，6％乙腈水。
本发明的有益效果体现在：
1.本发明提供的具有生物活性的黄烷醇生物碱对晚期糖基化末端产物(AGEs)形成有一定抑制作用，可以用于制备降血糖药物，对农业和医药领域具有重要的意义，为有效开发利用白牡丹茶提供了更为广阔的前景。
2.本发明黄烷醇生物碱的制备方法工艺简单，容易实施，成本较低，具有非常好的应用前景。
3.本发明黄烷醇生物碱的检测方法工艺简单，容易实施，准确率高，可用于寻找含有本发明黄烷醇生物碱的生物资源，增加了本发明黄烷醇生物碱获取路径，提高其利用度。
附图说明
图1为80％丙酮水溶液浸提白牡丹茶叶和福鼎大白茶鲜叶的总离子流图及白茶素1和白茶素2的质谱及其离子碎片图。
图2为半制备HPLC分离白茶素1和白茶素2的液相图以及其对应的紫外吸收图(UV光谱)。
图3为白茶素1和白茶素2实测CD谱。
图4为白茶素1和白茶素2以及EGCG对晚期糖基化末端产物(AGEs)的浓度抑制曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
本部分对本发明实验中所使用到的材料以及实验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料、设备和操作方法是本领域公知的。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
黄烷醇生物碱的制备
1.1黄烷醇生物碱的说明
黄烷醇生物碱的结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：
式Ⅰ所示的黄烷醇生物碱(6-(5”'S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-(-)-epigallocatechin-O-gallate)与式Ⅱ所示的黄烷醇生物碱(6-(5”'R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-(-)-epigallocatechin-O-gallate)为一对同分异构体，下面分别命名为白茶素1和白茶素2。
1.2制备方法及结果
(1)取4.0公斤干燥的白牡丹成品茶，对其粉碎处理，得到白牡丹茶粉末；
(2)向白牡丹茶粉末中加入20升80％丙酮水溶液，常温浸提72小时，然后在70Hz下超声浸提2小时，之后过滤得到滤液；按上述步骤浸提三次，合并滤液并将滤液浓缩至3升，得到浸提液；
然后用3升二氯甲烷对上述浸提液进行常温萃取，震荡摇匀静置后，取下层二氯甲烷萃取液，按上述步骤萃取三次，合并二氯甲烷萃取液并将二氯甲烷萃取液浓缩至膏状，得二氯甲烷浸膏300克，保留上层经二氯甲烷萃取后的母液；
之后用3升乙酸乙酯对经二氯甲烷萃取后的母液进行常温萃取，震荡摇匀后静置，取上层乙酸乙酯萃取液，同样方法浸提三次，合并萃取液并将萃取液浓缩至膏状，得乙酸乙酯部位浸膏680克，保留下层经乙酸乙酯萃取后的母液；
最后用3升正丁醇对经乙酸乙酯萃取后的母液进行常温萃取，震荡摇匀后，取上层正丁醇萃取液，同样方法萃取三次后，合并正丁醇萃取液，减压浓缩至膏状，得正丁醇部位浸膏203克并保留这一目标提取物；剩余母液层减压浓缩至膏状，得水部位浸膏205克；
(3)取200克上述正丁醇部位浸膏用<10％的甲醇水溶液溶解后过Sephadex LH-20凝胶柱，Sephadex LH-20凝胶柱使用MeOH-H2O体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，共收集合并5个组分，然后将其中50％-80％甲醇水洗脱得到的组分4过MCI柱，MCI柱使用MeOH-H2O体积比0:100到100:0梯度洗脱，收集合并得20个组分，然后将其中60％-80％甲醇水洗脱得到的组分19再经Toyopearl柱层析，Toyopearl柱以50％甲醇水作为洗脱剂洗脱，收集得到10个洗脱组分，最后将其中50％甲醇水洗脱得到的第1组分用高效液相设备分离，高效液相设备采用的分离色谱柱为
Prep C18(10×250mm，5μm，Waters，Ireland)柱，流速2毫升/分钟，洗脱剂为乙腈水，洗脱条件为：0-6分钟，18％乙腈水等度冲；6-8分钟，18％乙腈水-20％乙腈水过渡；8-13分钟，20％乙腈水等度冲；13-13.5分钟，20％乙腈水-18％乙腈水过渡；13.5-22分钟，18％乙腈水等度冲，依次得到白茶素1(6-(5”'S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-(-)-epigallocatechin-O-gallate)(保留时间15.575分钟，质量60毫克)，白茶素2(6-(5”'R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-(-)-epigallocatechin-O-gallate)(保留时间16.153分钟，质量15毫克)。
1.3黄烷醇生物碱的性状验证
白茶素1的特性如下：
1)、可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)、UV
nm：209，276；
3)、IR(KBr)νmax(cm-1)：3397，1695，1620，1539；
4)、HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝568.1475([M-H]-，C28H26NO12 -理论计算值为568.1455)；
5)、核磁共振光谱数据见表1。
白茶素2的特性如下：
1)、可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)、UV
nm：209，276；
3)、IR(KBr)νmax(cm-1)：3397，1695，1620，1539；
4)、HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝568.1475([M-H]-，C28H26NO12 -计算值为568.1455)；
5)、核磁共振光谱数据见表1。
表1黄烷醇生物碱的核磁共振光谱数据
注：1H NMR在600MHz，13C NMR在150MHz条件下测试，δ单位为ppm，耦合常数J单位为Hz，溶剂为氘代甲醇。
另外，参见图2和图3，可以看出，所有波谱数据均通过紫外光谱UV、红外光谱IR及1H NMR、13C NMR、ESI-HR-MS、1H-1H COSY，HSQC、HMBC和ROSEY等二维核磁共振谱归属，证明了所得化合物的结构。
实施例2
黄烷醇生物碱对晚期糖基化末端产物(AGEs)形成的抑制作用试验
配制反应体系A：用PBS配成牛血清白蛋白浓度10mg/ml，青霉素浓1mg/ml，葡萄糖浓度36mg/ml，果糖浓度36mg/ml的反应体系A。
配制反应体系B：用PBS配成牛血清白蛋白浓度10mg/ml，青霉素浓度1mg/ml的反应体系B。
配制系列浓度梯度的样品：氨基胍用DMSO配制成浓度梯度为1，5，10，50，100，500，1000μM的样品，待测样品EGCG，白茶素1和白茶素2分别用DMSO配制成浓度梯度为0.1，1，5，10，25，50，100μM的样品。
白茶素1、白茶素2与体外非酶糖基化反应体系共孵育：96孔板上，空白对照组每孔加200μl B液和10μl DMSO；阳性对照组每孔加200μl A液和10μl氨基胍稀释样品；实验组每孔加200μl A液和10μl待测样品，每个样品各浓度梯度设置6个平行。加入样品的96孔板放入37℃恒温箱避光孵育14天之后在350nm和450nm条件下测试吸光值。式Ⅰ所示的黄烷醇生物碱、式Ⅱ所示的黄烷醇生物碱对晚期糖基化末端产物(AGEs)的抑制效果见表2和图4。
表2黄烷醇生物碱对晚期糖基化末端产物(AGEs)的抑制效果
实验结果表明，白茶素1和白茶素2对AGEs都有显著的抑制效果，与报道的AGEs抑制剂氨基胍相比，本发明黄烷醇生物碱效果更好，白茶素1和白茶素2的IC50值分别为13.5，25.3μM，氨基胍IC50值为228.8μM。AGEs可通过与血管壁中的蛋白形成共价交联，导致血管结构和功能的损害，从而引发血管病变。此外AGEs还能引起血管内皮细胞膜上阴离子多糖蛋白的降解，致使血管通透性增大，破坏血管内皮的屏障作用。因此，开发AGEs抑制剂，探究抑制AGEs形成的机制，对于防治糖尿病血管病变具有重要意义。
因此本发明名黄烷醇生物碱可应用于降血糖药物的制备。具体地说是将本发明黄烷醇生物碱按医学上可接受的剂量和药学上所通用的辅料制成一种降脂减肥药物。该药物剂型包括口服型、外用型和注射型等。所述口服型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂等；所述外用型包括栓剂、捈剂、洗剂、膏剂、透皮贴剂等；所述注射型包括注射液、混旋液、冻干粉等。具体制备方法参照制药领域的常规方法制备。
实施例3
黄烷醇生物碱的检测方法
检测仪器设备：安捷伦UPLC6545系列Q-TOF液质谱联用仪(安捷伦科技中国有限公司)，ACQUITY 
BEH Shield RP18柱(2.1×150mm，1.7μm)。
茶样制备：将白牡丹茶和干燥福鼎大白茶鲜叶粉碎机粉碎，得粉末状茶样。称取茶样各2.5克，用80％丙酮水定容至100毫升，浸提12小时，期间超声两次，每次超声15分钟。浸提结束后将茶样浸提液过两次0.22微米滤膜后即得待分析样品液。
流速0.22毫升/分钟，流动相：A相0.1％甲酸水，B相含0.1％甲酸的乙腈，洗脱条件：0-1.5分钟，6％乙腈水；1.5-4分钟，6％乙腈水-12％乙腈水；4-8分钟，12％乙腈水-25％乙腈水；8-10分钟，25％乙腈水-35％乙腈水；10-14分钟，35％乙腈水-90％乙腈水；14-19分钟，90％乙腈水；19-20分钟，90％乙腈水-6％乙腈水；20-23分钟，6％乙腈水。
实验结果：以白茶素1和白茶素2为标品，如图1所示可以在白牡丹茶叶中以及福鼎大白茶鲜叶中检测到上述黄烷醇类生物碱白茶素1去质子化离子分子量568.1475，保留时间11.0732分钟和白茶素2去质子化分子量568.1475，保留时间11.8831分钟。
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.黄烷醇生物碱，其特征在于，由式Ⅰ或式Ⅱ所示结构表示：
2.如权利要求1所述的黄烷醇生物碱在制备降血糖药物中的用途。
3.降血糖药物，其特征在于，由如权利要求1所述的黄烷醇生物碱和药用辅料制成。
4.如权利要求3所述的降血糖药物，其特征在于，所述降血糖药物的药物剂型为口服型或外用型或注射型。
5.如权利要求1所述的黄烷醇生物碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）原料粉碎
取白牡丹茶，对其粉碎处理，得到白牡丹茶粉末；
（2）浸提
用丙酮水溶液浸提白牡丹茶粉末，得到浸提液，对浸提液依次进行萃取处理和减压浓缩处理，得到膏状提取物；
（3）分离纯化
对膏状提取物进行分离纯化处理，得到所述黄烷醇生物碱；分离纯化处理包括将膏状提取物溶解后依次经Sephadex LH-20凝胶柱层析、MCI柱层析、Toyopearl柱层析和高效液相设备分离，具体过程为：将膏状提取物用<10%的甲醇水溶液溶解后过Sephadex LH-20凝胶柱，Sephadex LH-20凝胶柱使用MeOH-H2O体积比0:100到100:0作为梯度洗脱，然后将其中50%-80%甲醇水溶液洗脱得到的组分过MCI柱，MCI柱使用MeOH-H2O体积比0:100到100:0梯度洗脱，然后将其中60%-80%甲醇水溶液洗脱得到的组分过Toyopearl柱，Toyopearl柱以50%的甲醇水溶液作为洗脱剂洗脱，最后将其中50%甲醇水溶液洗脱得到的组分用高效液相设备分离，高效液相设备采用的分离色谱柱为XBridge® Prep C18柱，流速2 毫升/分钟，洗脱剂为乙腈水，洗脱条件为：0-6分钟，18%乙腈水等度冲；6-8分钟，18%乙腈水-20%乙腈水过渡；8-13分钟，20%乙腈水等度冲；13-13.5分钟，20%乙腈水-18%乙腈水过渡；13.5-22分钟，18%乙腈水等度冲，15.575分钟洗脱样品为式Ⅰ所示结构表示的黄烷醇生物碱，16.153分钟洗脱样品为式Ⅱ所示结构表示的黄烷醇生物碱。
6.如权利要求5所述的黄烷醇生物碱的制备方法，其特征在于，丙酮水溶液的浓度为80%。
7.如权利要求5所述的黄烷醇生物碱的制备方法，其特征在于，萃取处理采用依次使用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇的分级萃取工艺，其中，使用二氯甲烷和乙酸乙酯萃取时，保留萃取后的母液，使用正丁醇萃取时，保留正丁醇层萃取液。
8.如权利要求1所述的黄烷醇生物碱的检测方法，其特征在于，采用UPLC-MS检测方法，流速0.22毫升/分钟，流动相：A相0.1%甲酸水，B相含0.1%甲酸的乙腈，洗脱条件：0-1.5分钟，6%乙腈水；1.5-4分钟，6%乙腈水-12%乙腈水；4-8分钟，12%乙腈水-25%乙腈水；8-10分钟，25%乙腈水-35%乙腈水；10-14分钟，35%乙腈水-90%乙腈水；14-19分钟，90%乙腈水；19-20分钟，90%乙腈水-6%乙腈水；20-23分钟，6%乙腈水。
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