CN103242275B

CN103242275B - 莪术中倍半萜类化合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN103242275B
Application number: CN201310174267.8A
Authority: CN
Inventors: 邱峰; 刘越; 康宁; 陈丽霞; 赵烽; 吴博
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2013-05-13
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2033-05-13
Also published as: CN103242275A

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了莪术中愈创木烷型和桉烷型倍半萜类化合物及其制备方法和应用。还涉及以该两类化合物为主要成分的组合物及其制备方法和用途。该类倍半萜具有如式(Ⅰ)和式（Ⅱ）的结构，各基团含义如说明书所述。本发明提供的愈创木烷型和桉烷型倍半萜类化合物的组合物采用植物莪术为原料，用有机溶剂和/或水进行提取并且采用层析分离法和/或萃取法进行分离得到。该类倍半萜类化合物的组合物可作为发病机制与一氧化氮的代谢异常有关联的肿瘤、炎症、免疫等疾病的治疗。

Description

莪术中倍半萜类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及莪术中倍半萜类化合物及其制备方法和用途，还包括其药用组合物，确切的说是莪术中倍半萜类化合物及其组合物抑制LPS诱导RAW 264.7细胞产生一氧化氮(NO)的作用，以及这类组合物的制备方法。

背景技术

一氧化氮(NO)作为一种新型信号分子，具有调节内皮细胞、平滑肌细胞和神经细胞等功能，参与炎症与组织损伤恢复，(陈敏珠，一氧化氮与炎症免疫细胞，中国药理学通报，1992.8.409-415)在呼吸、消化、循环、免疫等全身多系统的生理、病理及有关临床疾病中起着重要作用。

一氧化氮(NO)是由精氨酸胍基氮经过一氧化氮合成酶(NOS)的催化氧化而形成的。NO既兼有第二信使和神经递质的功能，又是效应分子，介导和调节包括炎症在内的多种生理和病理过程。一氧化氮合成酶(NOS) 可分为两类，即结构型NOS(cNOS) 和诱导型NOS(iNOS)，cNOS 根据产生部位不同，又可分为神经型NOS(nNOS) 和内皮型NOS(eNOS)。在细胞内的结构型(cNOS)和诱导型(iNOS) NO合成酶中，cNOS在正常情况下可持续表达，而iNOS只有在某些细胞因子，如脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等诱导下才表达其活性。一般认为过多的NO通常伴随有炎症和免疫紊乱、疼痛、神经疾病、动脉粥样硬化和癌症等。

抑制NO的释放可以治疗多种疾病，（章丹丹，刘俊，Ferid Murad,卞卡，诱导性一氧化氮合酶与疾病，现代生物医学进展，2007.7（10）. 1571-1573）包括全身炎症反应综合症、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、骨性关节炎、脊柱关节炎、炎性肠病、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、帕金森症、早老性痴呆、抑郁症、败血病、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰腺炎、中枢神经损伤等。与此同时，NO代谢异常还与癌变及癌组织的增生有关，高浓度的NO也会诱发基因突变和肿瘤，通过抑制NO的释放，也可以发挥抗肿瘤的作用。

莪术为姜科姜黄属 (Curcuma) 多年生草本植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Ling 及温郁金 Curcuma wenyujin Y.H. Chen et C. Ling的干燥根茎，主要分布于我国四川省、广西省和浙江省，它们共同作为中药莪术的来源收载于2010版《中华人民共和国药典》。中药莪术味辛、苦、性温，归肝、脾经，具有行气破血、消积止痛的功效；在临床上作为常用的活血化瘀药，主治血气心痛、饮食积滞、脘腹胀痛、痛经、血滞经闭、癥瘕痞块、跌打损伤等。（国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部 [Z]. 北京：中国医药科技出版社. 2010. 257-258）国内外学者通过体外、体内实验证实了莪术的抗炎(Tohda1, C.; Nakayama, N.; Hatanaka1, F.; Komatsu, K. Comparison of Anti-inflammatory Activities of Six Curcuma Rhizomes: A Possibleb Curcuminoid-independent Pathway Mediatedby Curcuma phaeocaulis Extract. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2006. 3. 255-260)，抗肿瘤(Chen, X. P.; Pei, L, X.; Zhong, Z, F.; Guo, J, J.; Zhang, Q, W.; Wang, Y, T. Anti-tumor potential of ethanol extract of Curcuma phaeocaulis Valeton against breast cancer cells. Phytomedicine 2011.18. 1238-1243), 保肝(Matsuda, H.; Morikawa, T.; Ninomiya, K.; Yoshikawa, M. Heptoprotective Constituents from Zedoariae Rhizoma: Absolute Stereostructures of Three New Carabrane-type Sesquiterpenes, Curcumenolactones. A, B, and C. Bioorganic & Medicinal Chemistry2001. 9. 909-916)等作用。但是本专利公开的愈创木烷型和桉烷型新化合物及其组合物抑制LPS诱导RAW 264.7细胞一氧化氮(NO)释放的作用还未见诸报道。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种愈创木烷型和桉烷型倍半萜类化合物。

本发明的另一目的在于提供包含如上化合物的组合物。

本发明的又一目的在于提供上述化合物及其组合物作为制备治疗发病机制与一氧化氮代谢异常相关联疾病的药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明的化合物为具有如式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所述结构的倍半萜类化合物：

其中：

1-5位，6-7位，9-10位为单键或双键；R₁为OH或H，或R₁和R₅间连接取代基团A，R₂为OH或H，R₃为OH或H，R₄为H或取代基团B、取代基团C，或R₄和R₅间连接取代基团D，R₅为H或羰基，R₆为OH或H，R₇为CH₃或CH₂OH。

其中：

4-5位，6-7位，8-9位为单键或双键；R₁为OH或羰基， R₂为OH，R₃为H，R₄为取代基团A，R₅为羰基，R₄和R₅间连接取代基团B或取代基团C。

所述倍半萜类化合物含有Phaeocaulisin A（如1所示）、phaeocaulisin B（如2所示）、phaeocaulisin C（如3所示）、phaeocaulisin D（如4所示）、phaeocaulisin E（如5所示）、phaeocaulisin F（如6所示）、phaeocaulisin G（如7所示）、phaeocaulisin H（如8所示）、phaeocaulisin I（如9所示）、phaeocaulisinJ（如10所示）、phaeusmane A（如11所示）、phaeusmane B（如12所示）、phaeusmane C（如13所示）、phaeusmane D（如14所示）、phaeusmane E（如15所示）、phaeusmane F（如16所示）、中的一种以上。

上述愈创木烷型和桉烷型倍半萜化合物及其组合物可以作为制备治疗发病机制与一氧化氮代谢异常相关联疾病的药物，其中包括但不限于，全身炎症反应综合症、高血压、脑血栓、心力衰竭、肝硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、脊柱关节炎、炎性肠病、急性胰腺炎、腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎、糖尿病、系统性红斑狼疮、皮炎肌、银屑病、急性髓性白血病、帕金森症、早老性痴呆、抑郁症、败血病、慢性阻塞性肺炎、哮喘、急性胰腺炎、中枢神经损伤等。其次，NO代谢异常还与癌变及癌组织的增生有关，高浓度的NO也会诱发基因突变和肿瘤，上述愈创木烷型和桉烷型倍半萜类化合物可以抑制NO释放，从而发挥抗肿瘤的作用。适用的肿瘤例子包括但不限于：各种实体肿瘤和白血病，如肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫颈癌、黑色素瘤、睾丸癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、胶质细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、淋巴管瘤等。

所述治疗发病机制与一氧化氮的代谢异常相关联疾病的药物含有治疗有效量的上述愈创木烷型和桉烷型倍半萜组合物和药学上可接受的载体。

所述愈创木烷型和桉烷型倍半萜的制备方法，包括以下操作步骤：采用姜科姜黄属多年生草本植物蓬莪术（Curcuma phaeocaulis Val）的干燥茎为原料，用有机溶剂和/或水进行提取并且进行分离。

所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯中的一种或几种；所述提取的提取温度为20-100℃，提取时间为1-48小时；所述分离是采用层析分离法和/或萃取法进行分离。

含有本发明倍半萜组合物的治疗各种由于NO代谢异常所导致疾病的药物可以为适用于口服应用的形式，例如，可为片剂、药片、锭剂、含水或者含油混悬剂、可分散性粉剂或者粒剂、乳剂、液剂、硬胶囊或者软胶囊、或者糖浆剂或者酏剂。

本发明相对现有技术具有如下的优点及效果：(1) 提供了一种结构新颖的愈创木烷型和桉烷型倍半萜的化合物及其组合物；(2) 运用体外活性筛选体系进行活性评价，发现本发明愈创木烷型和桉烷型倍半萜能有效地抑制小鼠巨噬细胞释放一氧化氮(NO)，提示本发明倍半萜类化合物可作为治疗发病机制与一氧化氮代谢异常相关联疾病的药物。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步的详细的描述，但本发明实施方式不限于此。

实施例1：从蓬莪术中提取分离倍半萜类化合物

姜科姜黄属 (Curcuma) 多年生草本植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val的干燥茎（10Kg），用90%（V/V）乙醇-水加热回流提取，浓缩提取物，分别采用乙酸乙酯和正丁醇进行等体积萃取3次，乙酸乙酯萃取部分，即蓬莪术总倍半萜部位（262 g），取其中100 g样品经硅胶柱色谱，环己烷-丙酮（98:2～0:100）梯度洗脱，得到9个子馏分（Fr.1～Fr.9）。子馏分Fr.3（12 g），石油醚-乙酸乙酯（98:2～0:100）梯度洗脱得到6个子馏分（Fr.3-1～Fr.3-6）。Fr.3-3（3 g）经Sephadex LH-20柱色谱，氯仿-甲醇（1:1）洗脱，再经过制备薄层色谱（石油醚-乙酸乙酯）得到化合物5（144 mg）和化合物10 （280 mg）。Fr.4（9.4 g），二氯甲烷-丙酮（98:2～0:100）梯度洗脱得到5个子馏分（Fr.4-1～Fr.4-5）。Fr.4-2（4.3 g）经Sephadex LH-20柱色谱，氯仿-甲醇（1:1）洗脱，再经过ODS柱色谱，甲醇-水（98:2～0:100）梯度洗脱，得到5个子馏分Fr.4-2-1～Fr.4-2-5。Fr.4-2-2（300 mg）经过制备高效液相色谱甲醇-水（40:60）得到化合物1（45 mg），化合物2（23 mg）和化合物3（17 mg）。Fr.4-2-3（230 mg）经过制备高效液相色谱甲醇-水（30:70）得到化合物7（13 mg），化合物8（12 mg）和化合物9（9 mg）。Fr.4-2-4（108 mg）经过制备高效液相色谱甲醇-水（40:60）得到化合物11（37 mg）和化合物12（28 mg）。Fr.5（13 g）经过二氯甲烷-丙酮（98:2～0:100）梯度洗脱得到7个子馏分（Fr.5-1～Fr.5-7）。Fr.5-3（3.6 g）经Sephadex LH-20柱色谱，氯仿-甲醇（1:1）洗脱，再经过ODS柱色谱，甲醇-水（98:2～0:100）梯度洗脱，得到5个子馏分Fr.5-3-1～Fr.5-3-5，子馏分Fr.5-3-1中析出结晶，在甲醇中重结晶得到化合物4（44 mg），子馏分Fr.5-3-3（85 mg）经过制备高效液相色谱甲醇-水（30:70）得到化合物6（17 mg）。Fr.6（7.6 g）经过二氯甲烷-丙酮（98:2～0:100）梯度洗脱得到5个子馏分（Fr.6-1～Fr.6-5）。Fr.6-3（2.9 g）经Sephadex LH-20柱色谱，氯仿-甲醇（1:1）洗脱，再经过ODS柱色谱，甲醇-水（98:2～0:100）梯度洗脱，得到5个子馏分Fr.6-3-1～Fr.6-3-5，Fr.6-3-2（120 mg）经过制备高效液相色谱甲醇-水（40:60）得到化合物13（15 mg）和化合物14（24 mg）。Fr.6-3-3（138 mg）经过制备高效液相色谱甲醇-水（40:60）得到化合物15（55 mg）和化合物16（18 mg）。通过理化常数和现代波谱学手段（MS、NMR），结合文献相关数据，鉴定了它们的结构，化合物 1-16为新化合物，如下所示：

化合物1-16为新化合物。

所得各新倍半萜的物理化学常数如下：

实施例2 ：莪术中倍半萜 1-16 对脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7 释放一氧化氮 (NO) 的抑制活性实验

小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7 (ATCC TIB-71) 培养于含10％热灭活(56℃，30min) 胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素钠(Gibco)、100 μg/mL链霉素(Gibco) 的RPMI 1640 (Gibco) 培养液中，37℃，5％ CO₂ 的恒温培养箱中孵育生长。由于NO极不稳定，在细胞培养上清液内很快代谢成亚硝酸基(NO2^-)，故采用Griess法测定样品中NO2^- 的浓度作为衡量NO水平的指标。Griess试剂 A：0.1％N- 萘乙二胺盐酸盐(naphthylethylene diamine dihydrochloride) 溶于水中；Griess试剂 B：1％对氨基苯磺酰胺(sulphanilamide) 溶于5％H₃PO₄中。使用前等体积混合试剂A和B。用RPMI 1640 培养液将RAW 264.7 细胞稀释至5×105 cells/mL 浓度，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200 μL细胞悬浮液。CO₂培养箱中培养1h后，每孔加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS) (Sigma) (终浓度1 μg/mL) 和DMSO溶解的不同浓度的测试样品0.4 μL，同时设LPS组(加入LPS，但不加入测试样品，对NO释放的抑制率为0％) 和空白对照组(不加入LPS和测试样品，仅加入0.4 μL DMSO，对NO释放的抑制率为100％)，每个样品设4个平行孔。在37℃，5％ CO₂恒温培养箱中培养24 h，吸取100 μL培养液上清至酶标板中，离心(1000×g，4℃，3min)，加入100 μL Griess 试剂，室温避光反应10min，于酶标仪测定其540nm处的吸光值。用浓度分别为1、5、10、50 μmol/L的NaNO₂ 绘制标准曲线，根据NaNO₂标准曲线计算细胞培养上清液中NO2^-的浓度进而计算测试样品对NO释放的抑制率。活性结果如下：

实施例3：颗粒剂的制备

取实施例1所得蓬莪术总倍半萜部位1 g与淀粉29 g混合，加水制成软材，过12目筛进行造粒，干燥后得到颗粒剂。本颗粒剂中，每300 mg中含总倍半萜部位10 mg。

实施例4：Phaeocaulisin A（化合物1）片剂的制备

取Phaeocaulisin A（化合物1）1 g与微晶纤维素27 g及硬脂酸镁2 g混合，混合物用单冲压片机打成直径6 mm，重量300 mg的片。本片剂中每片含Phaeocaulisin A 10 mg。

实施例5：Phaeocaulisin D（化合物4）胶囊剂的制备

取Phaeocaulisin D（化合物4）1 g与乳糖27 g、硬脂酸镁2 g混合，以每300 mg填充胶囊。本胶囊剂中，每个胶囊含Phaeocaulisin D 10 mg。

实施例6：Phaeocaulisin A（化合物1）和phaeusmane C（化合物13）混合胶囊剂的制备

取Phaeocaulisin A（化合物1）和phaeusmane C（化合物13）各0.5 g与乳糖26 g、硬脂酸镁3 g混合，以每300 mg填充胶囊。本胶囊剂中，每个胶囊含倍半萜类化合物10 mg。

Claims

1.一种倍半萜类化合物，其特征在于：所述倍半萜类化合物选自化合物1-5,7-16中的任一种，其结构如下：

。

2.一种药物组合物，包含权利要求1所述化合物中的一种或几种。

3.一种药物组合物，以权利要求1中任何一种或几种作为活性成分，与药学上可接受的赋形剂结合。

4.权利要求1所述的化合物在制备治疗与一氧化氮的代谢异常相关疾病的药物中的应用。

5.权利要求2或3所述的药物组合物在制备治疗与一氧化氮的代谢异常相关疾病的药物中的应用。