CN115813894A

CN115813894A - 一种倍半萜类化合物及其制备方法与应用

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Publication number: CN115813894A
Application number: CN202111096517.1A
Authority: CN
Inventors: 周学明; 陈光英; 宋鑫明; 李小宝
Original assignee: Hainan Normal University
Current assignee: Hainan Normal University
Priority date: 2021-09-18
Filing date: 2021-09-18
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2041-09-18
Also published as: CN115813894B

Abstract

本申请公开了一种愈创木烷型倍半萜化合物在制备增强免疫和抗炎的药物中的应用，本申请首次发现了愈创木烷型倍半萜化合物在抑制LPS诱导RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)NO生成中的活性，丰富了抗炎药物的种类，对促进愈创木烷型倍半萜化合物用于抗炎制药的产业化利用具有重大意义。

Description

一种倍半萜类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及植物化学技术领域，具体涉及一种愈创木烷型倍半萜化合物及其制备方法与应用。

背景技术

瓜馥木(Fissistigma oldhamii(Hemsl.)Merr.)，别名小香花藤、藤龙眼、降香藤，是番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木属植物。该植物可做药用，茎、叶可以治骨折水肿，全株可以治疗风湿骨痛、手足麻木等。从瓜馥木分离得到的愈创木烷型倍半萜类化合物未见在抑制LPS(脂多糖)诱导RAW264.7细胞NO生成中的应用的报道。

发明内容

鉴以此，本申请提出一种愈创木烷型倍半萜化合物及其制备方法、应用。

本申请的技术方案是这样实现的：

愈创木烷型倍半萜化合物在制备增强免疫和和/或抗炎的药物中的应用。

进一步的技术方案是，上述愈创木烷型倍半萜化合物在制备增强巨噬细胞能力的药物中的应用。增强巨噬细胞能力即增强巨噬细胞的吞噬能力和激活淋巴球活其他免疫细胞的免疫作用。

进一步的技术方案是，上述愈创木烷型倍半萜化合物为α,β-不饱和酮的倍半萜化合物、或其药学上可接受的盐/衍生物、或其立体异构体。

再进一步的技术方案是，上述愈创木烷型倍半萜化合物包括结构式：

一种上述愈创木烷型倍半萜化合物的制备方法，所述愈创木烷型倍半萜化合物从瓜馥木茎、叶或根中分离得到或人工合成。

进一步的技术方案是，包括以下步骤：

(1)制备瓜馥木提取物：将瓜馥木干燥的茎、叶或根用30-95％v/v的乙醇冷浸或热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为瓜馥木提取物。所述减压浓缩的条件为温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa。

(2)分离纯化：将上述提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，经柱层析、薄层层析、分子筛层析分离得到所述愈创木烷型倍半萜化合物。

再进一步的技术方案是，所述柱层析的条件为：用200-300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂。

再进一步的技术方案是，所述薄层层析条件为：以乙酸乙酯体积百分数为25％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂。

再进一步的技术方案是，所述分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为40％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。

与现有技术相比，本申请的有益效果是：

(1)本申请首次发现了愈创木烷型倍半萜化合物在抑制LPS诱导RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)NO生成中的活性，可用于制备增强免疫力和抗炎的药物，丰富了抗炎药物的种类，对促进愈创木烷型倍半萜化合物用于抗炎制药的产业化利用具有重大意义。

(2)本申请所述的化合物1浓度为100μg/mL时，其毒性对细胞的生存无明显影响，细胞生存率高于95％。

(3)本申请所述的化合物1能明显的抑制LPS诱导RAW264.7细胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的优选实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请所述化合物1的氢谱图。

图2为本申请所述化合物1的碳谱图。

具体实施方式

为了更好理解本申请技术内容，下面提供具体实施例，并结合附图对本申请做进一步的说明。

实施例1

瓜馥木干燥的茎10Kg用75％v/v的乙醇浸提3次每次7天，得到提取液，将提取液减压浓缩成膏状，得到瓜馥木提取物1200g。将提取物用水稀释成悬浮液，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯混和溶剂(100:0―0:100,V/V)及乙酸乙酯-甲醇(100:0―0:100,V/V)按极性递增进行硅胶柱层析，并按每次约400mL收集馏分。通过TLC检测合并相似流分分成8个组分，即Fr.1―8。Fr.3进行葡聚糖凝胶柱层析，再用高效液相制备以体积配比为2:3的乙腈和水的洗脱剂洗脱，得到愈创木烷型倍半萜化合物Fissistigmaterpene B(化合物1)。

愈创木烷型倍半萜化合物Fissistigmaterpene B的结构鉴定结果如下：

Fissistigmaterpene B：为无色油状物。紫外254nm有暗斑，5％硫酸-香草醛显色显紫红色。旋光度为

(c＝0.2,MeOH)，HR-ESI-MS m/z 235.1701[M-H]^-，结合¹H-NMR和¹³C NMR可知分子式为C₁₅H₂₄O₂，计算不饱和度为4。根据¹H-NMR和DEPT可知化合物中含有3个甲基信号[δ_H 0.73(d,J＝6.4Hz)、0.88(d,J＝6.4Hz)、1.15(s)]；根据¹³C-NMR和DEPT可知化合物中有3个甲基碳、5个次甲基，4个亚甲基,3个季碳。因此，可知化合物1为倍半萜类化合物。根据¹H-¹H COSY可知：H-2/H-3/H-4/H-5相关，H-4/H-12/H-13相关，因此，可以确定片段C-2-C-3-C-4--C-5,C-4-C-11-C-12,C-11-C-3；H-8/H-9-H-10相关，可以确定C-8-C-9-C-10片段。这两个片段的连接是通过HMBC来确认的。在HMBC谱中，H-15与C-2/C-1/C-10/C-5相关，H-5与C-6/C-7相关说明这两个片段分别通过C-1和C-6-C-7连接的。化合物的相对构型是通过NOESY确定以及耦合常数来确定的，H-5的最大耦合常数为9.6Hz，表明H-4与H-5处于反轴位置，NOESY谱中H-5与H-15相关说明这两个氢处于同一侧；H-4与H-10相关说明H-4与H-10处于同一侧。至此，确定该化合物1为愈创木烷型的新的倍半萜化合物。

表1 化合物1的¹H-NMR和¹³C-NMR数据

药理活性实验

实验材料

供试模型：小鼠RAW264.7巨噬细胞来自赛默飞世尔科技有限公司(北京)。

实验仪器：酶标仪(Elx800)、冷冻干燥机、显微镜、CO₂恒温培养箱、多种量程的移液器、高速离心机、超净工作台。

实验试剂：MTT、DMSO、DXM(sigma)、LPS-055(Escherichia 10:1,055:b5,sigma)、S0024总NO检测盒(碧云天生物技术有限公司)、FBS(gibco,澳大利亚)、高糖型DEME培养基(gibco,澳大利亚)、ELISA(TNF-α,IL-1β,IL-6,PGE2)试剂盒(IBL)。

阳性对照：地塞米松(DXM)。

实验方法

采用MTT比色法评估各浓度的化合物1对细胞的毒性作用。

以甲氨蝶呤作为阳性对照，没有任何测试化合物的空白培养基为阴性对照。

(1)细胞培养：取对数生长期的RAW264.7细胞，用质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA消化后，用FBS的质量浓度为10％的(如果生长缓慢可适当加到15％)的DEME培养基制成1×10⁵个/mL的单细胞悬浮液，以每孔100μL接种于96板中，将其放置在体积分数为5％的CO₂环境中培养4h。

(2)加药：加入待测化合物1、甲氨蝶呤(溶度:1.0μM,10μM,50μM,100μM)100μL，最终孔体积为200μL进行初筛，每种化合物每个浓度占6孔，且做平行实验3次。

(3)存活率检测：在培养24h后吸除培养液，每孔加入150μLDMSO，充分振荡3min，使MTT(甲臜)充分溶解，将其放置在470nm、510nm、530nm波长下检测，并相对于空白组计算存活率。

采用griess法测定NO生成量

NO的生成量是一种评估抗炎药物的重要指标，但NO在体内及其不稳定。本方法通过NO重氮化反应的产物与NAPDH(还原型辅酶Ⅱ)反应所得化合物浓度与NO生成浓度成正比例关系。

(1)细胞培养：同MTT比色法第一步。

(2)实验组配置：

空白组只加入DEME培养基；

LPS模型组在空白组基础上加入1mg/L的LPS培养24h；

阳性对照组在空白组基础上先加入DXM 2mg/L预处理2h，在加入脂多糖培养24h；样品组依次加入不同浓度(0.1μM，1μM，10μM，50μM和100μM)的样品预处理2h，再加入LPS培养24h。

(3)NO生成量检测：按照NO检测盒说明书进行；

(4)数据处理：NO抑制率％＝[(对照组OD值-样品组OD值)]/[(对照组OD值-空白组OD值)]×100％

采用ELISA法检测细胞上清液中的TNF-α,IL-1β,IL-6,PGE2的含量

该法是将可溶性的抗原或抗体结合到固相上，在利用相对应的抗原抗体经行专一的免疫检测。

(1)细胞培养：同MTT比色法第一步；

(2)实验组配置:同Griesss法第二步；

(3)TNF-α,IL-1β,IL-6检测：按照各试剂盒的说明书进行

(4)数据处理：按照说明书的方法计算。最终抑制率％＝[(对照组OD值-样品组OD值)]/[(对照组OD值-空白组OD值)]×100％

实验结果

1、细胞毒性实验表明：化合物1浓度为100μM时，其毒性对细胞的生存无明显影响，细胞生存率高于95％(表2)。

表2 不同浓度的样品的细胞毒活性

^a以甲氨蝶呤作为阳性对照，^b没有任何测试化合物的空白培养基为阴性对照。*P<0.05,**P<0.01

2、NO抑制率实验结果表明：当化合物1的IC₅₀值为2.5μM时，化合物1具有显著的NO生产抑制活性。

3、ELISA法实验结果表明：与模型组相比，化合物1能明显的抑制LPS诱导RAW264.7细胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6的含量(表3)，显示较好的抗炎活性，可用于抗炎药物的制备。

表3 各组细胞外液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量比较

注：与正常组比较，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01；与模型组比较，^△P﹤0.05，^△△P﹤0.01

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.愈创木烷型倍半萜化合物在制备增强免疫和/或抗炎的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的愈创木烷型倍半萜化合物在制备增强巨噬细胞能力的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的一种愈创木烷型倍半萜化合物，其特征在于，所述愈创木烷型倍半萜化合物为α,β-不饱和酮的倍半萜化合物、或其药学上可接受的盐/衍生物、或其立体异构体。

4.根据权利要求3所述的一种愈创木烷型倍半萜化合物，其特征在于，所述愈创木烷型倍半萜化合物包括结构式：

5.根据权利要求1、2或4所述的一种愈创木烷型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，所述愈创木烷型倍半萜化合物从瓜馥木茎、叶或根中分离得到或人工合成。

6.根据权利要求4所述的一种愈创木烷型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备瓜馥木提取物：将瓜馥木干燥的茎、叶或根用30-95％v/v的乙醇冷浸或热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为瓜馥木提取物。

7.根据权利要求6所述的一种愈创木烷型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，所述柱层析的条件为：用200-300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂。

8.根据权利要求6所述的一种愈创木烷型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，所述薄层层析条件为：以乙酸乙酯体积百分数为25％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂。

9.根据权利要求6所述的一种愈创木烷型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，所述分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为40％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。