CN112920236B - 二萜糖苷类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

二萜糖苷类化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了二萜糖苷类化合物及其制备方法和用途，特点是该二萜糖苷类化合物是从海洋软珊瑚Lemnalia sp.的次级代谢产物中分离得到，步骤如下1）将冷冻的波伦鳞花软珊瑚用丙酮提取后用乙醚和水萃取，将乙醚萃取液浓缩后得到浸膏；2）将粗浸膏进行硅胶柱色谱分离，以石油醚和乙酸乙酯为流动相进行梯度洗脱，收集流分进行正相减压柱层析，将第5号流分以乙腈和水的混合溶液为流动相，进行高效液相制备纯化，分别得到化合物1‑3；将7号流分进行正相中压柱色谱，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶液为流动相，收集流分将第14号流分进行高效液相制备纯化，得到化合物4‑6，优点是具有中等抑制白血细胞CCRF‑CEM细胞系的活性。

Description

二萜糖苷类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种波伦鳞花软珊瑚Lemnalia sp.中分离得到的具有生物活性的二萜糖苷类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
近年来，海洋无脊椎动物提供了大量结构多样、具有生物活性的次生代谢产物。软珊瑚Lemnalia sp.目前发现的已有30余种，广泛分布在中国南海、中国台湾和澳大利亚海岸等。直到现在，大约15种Lemnalia属的软珊瑚的化学研究得到分离。截至2019年，已有102个不同化学结构的萜类化合物从Lemnalia sp.提取物中分离和鉴定出来，它们表现出广泛的生物特性，包括细胞毒性、抗菌和抗炎活性。
波伦鳞花软珊瑚甙类（lemnaboursides）化合物是一种新型的二萜糖苷，最早于1994年由Zhang Min等人从L. bournei软珊瑚中分离得到，其结构特点是D型葡萄糖通过缩醛键与二萜醛结合。1998年，Zhang Min等又从该种属中分离到两个乙酰化的波伦鳞花软珊瑚苷，命名为lemnabourside B和C，这类化合物具有一定的细胞毒性。接下来Amira Rudi等从软珊瑚L. flava中分离到四个新的二萜糖苷，分别为lemnaflavoside和3个乙酰化二萜糖苷。后续的研究中Guangmin Yao等又从Lemnaliasp中分离出四个新的lemnalosides A-D，对链霉菌85E显示出中等抑菌活性。
近期我们从采自中国 南海西沙群岛的波伦鳞花软珊瑚Lemnalia sp.的丙酮提取物中分离得到6个结构新颖的二萜糖苷类化合物lemnaboursides E-G和lemnadiolboursides A-C。其中，lemnabourside E为lemnabourside的6'-O-醋酸盐，而lemnabourside F和G为lemnabourside醋酸盐的D环开环衍生物。此外，lemnadiolboursides A−C以lemna-1(10)-烯-7,12-二醇作为lemnabourside的另一个苷元。目前，尚未有此6个结构及其抑制白血细胞CCRF-CEM细胞系的活性的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有中等抑制白血细胞CCRF-CEM细胞系的活性的二萜糖苷类化合物及其制备方法和用途。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种二萜糖苷类化合物，其特征在于所述二萜糖苷类化合物是从海洋软珊瑚Lemnalia sp.的次级代谢产物中分离得到，其结构式如下至少一种所示：
Figure 409599DEST_PATH_IMAGE001
。
上述二萜糖苷类化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）浸膏提取：将冷冻的波伦鳞花软珊瑚用丙酮提取，减压浓缩得提取物，将提取物用由等体积的乙醚和水组成的混合液萃取3次，合并乙醚萃取液，并减压浓缩后得到粗浸膏；
（2）将步骤（1）得到的粗浸膏用甲醇溶剂溶解后，进行正相减压柱层析，采用体积比为（100:1）~（1:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相进行梯度洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从小到大排列，合并得到5个流分；
（3）将步骤（2）得到的第3号流分进行中压反相柱层析，采用甲醇含量为40wt%至100wt%的甲醇-水溶液为流动相进行梯度洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从大到小排列，合并得到9个流分；
（4）将步骤（3）得到的第5号流分进行高效液相色谱分离，采用乙腈-水溶液为流动相进行等度洗脱，分别得到化合物lemnaboursides E-G（1-3）；
（5）将步骤（3）得到的第7号流分进行正相中压柱色谱，采用体积比为（30：1）-（5：1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相进行梯度洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从小到大排列，合并得到15个流分；
（6）将步骤（5）得到的第14号流分进行高效液相色谱分离，采用乙腈-水溶液为流动相进行等度洗脱，得到化合物lemnadiolbouarsides A-C（4-6）。
优选的，步骤（2）所述的石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为100：1、50：1、20：1、10：1、5：1、2：1和1：1。
优选的，步骤（3）所述的甲醇-水溶液的洗脱梯度依次为40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%。
优选的，步骤（4）所述的乙腈-水溶液中乙腈含量为80%，流速为8 mL/min，等度时间为60 min，柱温为室温，采集波长为200 nm。
优选的，步骤（5）所述的石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为30：1、20：1、10：1和5：1。
优选的，步骤（6）所述的乙腈-水溶液中乙腈含量为99%，流速为8 mL/min，等度时间为60 min，柱温为室温。
上述二萜糖苷类化合物1-6任一项在制备白血病细胞CCRF-CEM细胞系的抑制剂方面的用途。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种从波伦鳞花软珊瑚中分离提取得到6种二萜糖苷类化合物，本发明提供的二萜糖苷类化合物具有抗肿瘤的生物活性，所述二萜糖苷类化合物也可用作先导化合物，为开发新药奠定了基础。
附图说明
图1为化合物lemnabourside E的核磁共振氢谱；
图2为化合物lemnabourside E的核磁共振碳谱；
图3为化合物lemnabourside F的核磁共振氢谱；
图4为化合物lemnabourside F的核磁共振碳谱；
图5为化合物lemnabourside G的核磁共振氢谱；
图6为化合物lemnabourside G的核磁共振碳谱；
图7为化合物lemnadiolbouarside A的核磁共振氢谱；
图8为化合物lemnadiolbouarside A的核磁共振碳谱；
图9为化合物lemnadiolbouarside B的核磁共振氢谱；
图10为化合物lemnadiolbouarside B的核磁共振碳谱；
图11为化合物lemnadiolbouarside C的核磁共振氢谱；
图12为化合物lemnadiolbouarside C的核磁共振碳谱。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种从Lemnalia属软珊瑚中提取分离到的二萜糖苷类化合物：lemnaboursidesE-G（1-3）和lemnadiolbouarsides A-C（4-6），化学结构式如下所示：
Figure 232061DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例2
二萜糖苷类化合物的制备方法，具体步骤如下：
1、次级代谢产物的提取
将冷冻的软珊瑚（湿重2.5 Kg）切成小块并冻干（干重605 g），然后在超声下用丙酮提取六次，减压浓缩得提取物，然后用由等体积的乙醚和水组成的混合液萃取三次，合并乙醚萃取液，并减压浓缩，得到60.3 g粗浸膏；
2、化合物的分离制备
（1）将上述粗浸膏首先用甲醇溶剂溶解后，进行正相减压柱层析，采用体积比为（100:1）~（1:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相进行梯度洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从小到大排列，合并得到5个流分（编号为Fr.1~Fr.5）；其中石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为100：1、50：1、20：1、10：1、5：1、2：1和1：1；
（2）将步骤（1）得到的第3个流分进行中压反相柱层析，采用甲醇含量为40wt%至100wt%的甲醇-水溶液为流动相进行梯度洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从大到小排列，合并得到9个流分(编号为Fr.3.1~3.9)；其中甲醇-水溶液的洗脱梯度依次为40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%（甲醇的体积百分数）；
（3）将步骤（2）收集的第5号流分（Fr.3.5）进行高效液相色谱分离，采用乙腈-水溶液为流动相进行等度洗脱，乙腈-水溶液中乙腈含量为80%，流速为8 mL/min，等度时间为60min，柱温为室温，采集波长为200 nm，获得化合物1（19.0 mg），化合物2（45.0 mg）和化合物3（33.0mg），保留时间分别为46.0 min、47.3 min和50.3 min；
（4）将步骤（2）得到第7号流分（Fr.3.7）进行正相中压柱色谱分离，采用体积比为（30：1）-（1：1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相进行梯度洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从小到大排列，合并得到15个流分（Fr.3.7.1~3.7.15），其中石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为30：1、20：1、10：1和5：1；
（5）将步骤（4）得到的第14号流分（编号为3.7.14）进行高效液相色谱分离，采用乙腈-水溶液为流动相进行等度洗脱，乙腈-水溶液中乙腈含量为99%，流速为8 mL/min，等度时间为60 min，柱温为室温，获得化合物4（54.5 mg），化合物5（20.0 mg）和化合物6（32.0mg），保留时间分别为41.3 min、45.8 min和50.4 min，其中二萜糖苷类化合物lemnaboursides E-G（1-3）和lemnadiolbouarsides A-C（4-6）的化学结构式如下所示：
Figure 436778DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例3
化合物的结构鉴定及核磁信号归属：
Lemnabourside E (1)：白色固体；[α]25 D﹢33（c 0.1，MeOH)；HRESIMS m/z515.2977 [m + Na]+（calcd for C28H44O7Na, 515.2985），该化合物的1H和13C NMR数据见图1和图2、表1和表2。
Lemnabourside F (2)：白色固体；[α]25 D﹢20（c 0.1，MeOH)；HRESIMS m/z559.3237 [M + Na]+ (calcd for C30H48O8Na, 559.3247)，该化合物的1H和13C NMR数据见图3和图4、表1和表2。
Lemnabourside G (3)：白色固体；[α]25 D﹢13（c 0.1，MeOH)；HRESIMS m/z601.3336 [M + Na]+ (calcd for C32H50O9Na, 601.3353)，该化合物的1H和13C NMR数据见图5和图6、表1和表2。
Lemnadiolbourside A (4)：白色固体；[α]25 D﹢46（c 0.1，MeOH)；HRESIMS m/z707.4481 [M + Na]+ (calcd for C41H64O8Na, 707.4499)，该化合物的1H和13C NMR数据见图7和图8、表1和表2。
Lemnadiolbourside B (5)：白色固体；[α]25 D﹢76（c 0.1，MeOH)；HRESIMS m/z707.4433 [M + Na]+ (calcd for C41H64O8Na, 707.4499)，该化合物的1H和13C NMR数据见图9和图10、表1和表2。
Lemnadiolbourside C (6)：白色固体；[α]25 D﹢25（c 0.1，MeOH)；HRESIMS m/z707.4433 [M + Na]+ (calcd for C41H64O8Na, 707.4499)，该化合物的1H和13C NMR数据见图11和图12、表1和表2。
化合物1-6的1H NMR数据见表1：
表1. 化合物1-6的1H NMR(600MHz, CDCl3)
Figure 635678DEST_PATH_IMAGE003
Figure 304557DEST_PATH_IMAGE004
。
表2. 化合物1-6的13C NMR(150MHz, CDCl3)
Figure 297920DEST_PATH_IMAGE005
Figure 989933DEST_PATH_IMAGE006
。
实施例4
上述一种二萜苷类化合物1-6的白血病细胞CCRF-CEM细胞系的抑制活性
1、实验样品
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例2中分离纯化的所得化合物1-6纯品，精密称取适量样品，用DMSO配制成20 mM的母液50 μL。该实验使用的阳性药为西达本胺。
2、实验方法
首先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内；接种后培养2-4小时使细胞贴壁；在96孔板中配置100 μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）；向培养板加入10 μL不同浓度的待测物质；将培养板在培养箱孵育48小时；向每孔加入10 μL CCK溶液；将培养板在培养箱内孵育1-4小时；用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
3、实验结果
表3. 化合物1-6的抗CCRF-CEM细胞增殖活性
Figure 726945DEST_PATH_IMAGE007
由上表可知化合物1-6具有中等抑制CCRF-CEM白血病细胞系的作用，IC50为10.4~21.0 µM。抑制程度不如阳性药，但仍可以作为活性改造的先导化合物。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种二萜糖苷类化合物，其特征在于所述二萜糖苷类化合物是从海洋软珊瑚Lemnalia sp.的次级代谢产物中分离得到，其结构式如下至少一种所示：
Figure FDA0003570061450000011
2.一种根据权利要求1所述的二萜糖苷类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)浸膏提取：将冷冻的波伦鳞花软珊瑚用丙酮提取，减压浓缩得提取物，将提取物用由等体积的乙醚和水组成的混合液萃取3次，合并乙醚萃取液，并减压浓缩后得到粗浸膏；
(2)将步骤(1)得到的粗浸膏用甲醇溶剂溶解后，进行正相减压柱层析，采用体积比为(100:1)～(1:1)的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相进行梯度洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从小到大排列，合并得到5个流分；
(3)将步骤(2)得到的第3号流分进行中压反相柱层析，采用甲醇含量为40wt％至100wt％的甲醇-水溶液为流动相进行梯度洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从大到小排列，合并得到9个流分；
(4)将步骤(3)得到的第5号流分进行高效液相色谱分离，采用乙腈-水溶液为流动相进行等度洗脱，分别得到化合物1-3，其中所述的乙腈-水溶液中乙腈含量为80％，流速为8mL/min，等度时间为60min，柱温为室温，采集波长为200nm。
3.根据权利要求2所述的二萜糖苷类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为100：1、50：1、20：1、10：1、5：1、2：1和1：1。
4.根据权利要求2所述的二萜糖苷类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的甲醇-水溶液的洗脱梯度依次为40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％。
5.一种权利要求1中二萜糖苷类化合物1-3任一种在制备白血病细胞CCRF-CEM细胞系抑制剂方面的用途。
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