CN112110967B

CN112110967B - 木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112110967B
Application number: CN202010523522.5A
Authority: CN
Inventors: 李兵; 李俊; 卢汝梅; 廖广凤; 陈文雅; 温海成; 潘月梅; 徐念智
Original assignee: Guangxi University of Chinese Medicine
Current assignee: Guangxi University of Chinese Medicine
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2040-06-10
Also published as: CN112110967A

Abstract

本发明公开了一种木犀草素‑4′‑O‑(6”‑O‑乙酰基)‑β‑D葡萄糖苷及其制备方法和应用；制备方法包括：以盒果藤为原料，先乙醇提取后浓缩得到总浸膏；将所得的总浸膏依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇反复萃取，获得正丁醇部位；将所得的正丁醇部位经大孔树脂柱色谱分离洗脱、MCI反相柱色谱分离洗脱、半制备高效液相色谱分离得到的黄色粉末即为所述木犀草素‑4′‑O‑(6”‑O‑乙酰基)‑β‑D葡萄糖苷。本发明以盒果藤为原料提取得到有效成分木犀草素‑4′‑O‑(6”‑O‑乙酰基)‑β‑D葡萄糖苷，步骤简洁高效，促进盒果藤的开发和应用。本发明作为药物应用时能够显著抑制NO释放量，并且呈现剂量依赖性，在抗炎活性上显示出较强的作用。

Description

木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物提取技术领域，更具体地说，本发明涉及一种木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷。

背景技术

壮药盒果藤为旋花科植物盒果藤Operculinaturpethum(Linn.)S.Manso的干燥地上部分，分布于中国的台湾、云南、广西等地，中医认为其具有利水消肿，舒筋活络，泻下导滞之功效，用于水肿，小便不利，筋骨屈伸不利，手足拘挛等病症。

目前针对盒果藤的研究较少，盒果藤的有效化学成分和作用机理尚未清晰，因此无法实现规模化提取应用。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的另一个目的是提供一种新的化合物木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷。

本发明的另一个目的是提供一种从盒果藤中提取新的化合物木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的方法。

本发明的另一个目的是提供一种木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷作为抗炎的应用。

本发明提供的方案具体如下：

木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷，其中，糖苷被酰化，结构式如下：

一种木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的制备方法，包括：

步骤一、以盒果藤为原料，先乙醇提取后浓缩得到总浸膏；

步骤二、将所得的总浸膏依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇反复萃取，获得正丁醇部位；

步骤三、将所得的正丁醇部位经大孔树脂柱色谱分离洗脱、MCI反相柱色谱分离洗脱、半制备高效液相色谱分离得到的黄色粉末即为所述木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷。

上述技术方案中，以盒果藤为原料提取得到有效成分木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷，步骤简洁高效，促进盒果藤的开发和应用。

优选的是，所述的木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的制备方法中，所述步骤一中，依次使用体积分数95％乙醇和70％乙醇回流提取至少3次，然后减压浓缩得到所述总浸膏。

优选的是，所述的木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的制备方法中，所述步骤三大孔树脂柱色谱分离洗脱中，使用水：乙醇＝100:0→70:30→50:50→30:70→10:90→0:100的进行梯度洗脱。

优选的是，所述的木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的制备方法中，所述步骤三大孔树脂柱色谱分离洗脱中，使用水：甲醇＝100:0→80:20→70:30→60:40→50:50→30:70→0:100进行梯度洗脱。

优选的是，所述的木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的制备方法中，所述步骤三的半制备高效液相色谱分离中，使用水：甲醇＝44：56的流动相进行分离。

所述的木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷作为抗炎药物的应用。木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷作为药物应用时能够显著NO释放量，并且呈现剂量依赖性，在抗炎活性上显示出较强的作用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明的木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷从壮药盒果藤中提取得到，是一种新的化合物，作为药物应用时能够显著抑制NO释放量，并且呈现剂量依赖性，在抗炎活性上显示出较强的作用。

本发明的制备方法以盒果藤为原料进行提取得到有效成分木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷，步骤简洁高效，提取率高，适合进行大规模生产开发。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的¹³C-NMR图谱；

图2为本发明所述木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的¹H-NMR图谱；

图3为本发明所述木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的COSY图谱；

图4为本发明所述木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的HMBC图谱；

图5为本发明所述木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的HSQC图谱；

图6为本发明所述木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的ROESY图谱；

图7为实施例3中NO₂ ^-浓度与OD₅₄₀值的关系图表(n＝3)；

图8为实施例3中木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷对LPS刺激RAW264.7细胞释放NO的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的制备：

取盒果藤粗粉2.5kg，依次用10倍量的95％和70％乙醇回流提取三次，减压浓缩得总浸膏500g，加水混悬，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇反复萃取，回收溶剂，分别得到石油醚部位40g，乙酸乙酯部位48g，正丁醇部位200g。

取正丁醇部位浸膏200g，用大孔树脂柱色谱分离，水-乙醇(100:0→70:30→50:50→30:70→10:90→0:100)梯度洗脱，得到流分D1-D5，D2流分采用MCI反相柱色谱进行分离，采用水-甲醇(100:0→80:20→70:30→60:40→50:50→30:70→0:100)进行梯度洗脱，得到流分E1-E7，E3经半制备高效液相色谱(水-甲醇＝44：56)得到化合物产物黄色粉末3.2mg。

实施例2

木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷结构鉴定：

实施例1的化合物产物黄色粉末，难溶于石油醚、氯仿，易溶于甲醇。盐酸-镁粉反应，Molish反应均呈阳性，推测为黄酮苷类化合物。

HR-ESI-MS(m/z)：513.1005[M+Na]+(clacd for C₂₃H₂₂O₁₂Na,513.1009)，综合¹H-NMR和¹³C-NMR可推测该化合物分子式为C₂₃H₂₂O₁₂，分子量为490，不饱和度为13。

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD)δ：7.40(1H,d,J＝2.1Hz),7.39(1H,dd,J＝8.4,2.1Hz)，7.22(1H,d,J＝8.5Hz)表明存在一个ABX系统。6.56(1H,s)为H-3，6.41(1H,brs,H-8)，6.19(1H,d,J＝1.8Hz)表明A环为5,7-二取代。δ4.93(1H,brs,H-1”)为糖端基质子信号；2.09(3H,s)为-COCH₃信号。

¹³C-NMR和DEPT谱(125MHz,CD₃OD)δ：165.3(C-2)，105.0(C-3)，183.7(C-4)，163.3(C-5)，100.4(C-6)，166.5(C-7)，95.2(C-8)，159.4(C-9)，105.3(C-10)，127.3(C-1')，115.0(C-2')，148.6(C-3')，149.8(C-4')，117.8(C-5')，119.6(C-6')为黄酮母核碳信号；以及δ：102.9，77.3，75.6，74.7，71.5，64.7的葡萄糖基碳信号，δ172.7，δ20.8为-OCOCH₃信号，且葡萄糖的C-6”较化合物木犀草素-4'-O-β-D葡萄糖苷向低场位移2.3ppm，推测葡萄糖基中6”-OH被乙酰化。

进一步通过二维谱进行分析，HMBC图谱显示，甲基信号2.09(3H,s)与酯羰基δ172.7有远程相关，葡萄糖的H-6”信号(δ4.27)和(δ4.45)与酯羰基信号δ172.7有远程相关，说明乙酰基的取代位置在C-6”位，另外糖的端基质子δ4.93(1H,d,J＝7.06Hz,H-1”)与黄酮B环的C-4'(δ149.74)有远程相关，则可以推断乙酰葡萄糖基的取代位置在C-4'位。

因此确定实施例1化合物为木犀草素-4'-O-(6”-O-乙酰基)-β-葡萄糖苷(luteolin-4′-O-(6"-O-acetyl)-β-glucopyranoside)。结构式为：

数据见下表1。

表1化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR数据

实施例3

木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷作为药物的抗炎活性研究

一、使用CCK8法测定实施例1的木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷样品对细胞活性影响

实验步骤：取对数生长期细胞，以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，设置给药组和对照组，每组3个复孔，给药组设置8个浓度，采用倍半稀释的方法配置，给予药物后继续培养24h，弃去培养基，用PBS清洗两次，每孔加入含10％CCK-8的DMEM培养基，继续培养1h后，酶标仪于490nm波长处测定吸光度OD值。细胞存活率＝OD给药组/OD对照组×100％。

实验结果：通过CCK8法检测木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷不同给药浓度对RAW264.7细胞的细胞毒作用，结果如表2所示：安全浓度范围7.8125～250。

表2

二、实施例1的木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷样品对NO检测的影响

取对数生长期细胞，配置5x10⁵个/mL的细胞悬液，按每孔100μL加入96孔板，设置给药组(125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL)、LPS组、对照组、地塞米松阳性组，每组3个复孔，在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，给药组和阳性组加入含1μg/mL LPS的样品，LPS组加入等量的1μg/mL LPS溶液，对照组加入等量培养基，继续培养24h,将96孔板在2500rpm离心5min，小心吸取上清70μL，加入等量的Griess试剂，避光反应15min，酶标仪在540nm处测每孔的吸光度。代入标准曲线测NO的含量，并用IBM SPSS软件算出各个部位对RAW264.7细胞的IC₅₀。

由图7可知，Griess法测定NO含量，以NO₂ ^-浓度为横坐标，540nm处相应的吸光值为纵坐标绘制NO标准曲线y＝0.00741x+0.07591，其中相关系数R²＝0.9995。由NO标准曲线可知，在0～150μM范围内线性关系良好。

木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷样品对LPS诱导RAW264.7细胞释放NO的影响结果：

结果下表3和图8所示，LPS组与对照组相比均有显著性差异，表明LPS诱导RAW264.7的炎症细胞模型成功，给药组与LPS组相比，给药组能显著地抑制NO释放量，并且呈现剂量依赖性。

表3样品对LPS诱导RAW26.7细胞释放NO的影响(

n＝3)

结论：木犀草素-4′-O-(6”-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷对LPS诱导后的RAW264.7细胞NO释放量水平明显下降，且呈现剂量依赖性；故在抗炎活性上显示出较强的作用，其机制可能与抑制过量NO释放有关。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。

Claims

1.一种木犀草素-4′-O-(6’’-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，结构式如下：

；

并包括以下步骤：

步骤一、以盒果藤为原料，先乙醇提取后浓缩得到总浸膏；

步骤三、将所得的正丁醇部位用大孔树脂柱色谱分离，采用水-乙醇100:0→70:30→50:50→30:70→10:90→0:100梯度洗脱，得到流分D1-D5；D2流分采用MCI反相柱色谱进行分离，采用水-甲醇100:0→80:20→70:30→60:40→50:50→30:70→0:100进行梯度洗脱，得到流分E1-E7；E3流分使用水：甲醇=44：56的流动相进行半制备高效液相色谱分离得到的黄色粉末即为所述木犀草素-4′-O-(6’’-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷。

2.根据权利要求1所述的木犀草素-4′-O-(6’’-O-乙酰基)-β-D葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，依次使用体积分数95%乙醇和70%乙醇回流提取至少3次，然后减压浓缩得到所述总浸膏。