CN114437145B

CN114437145B - 一种具有糖链结构的甲基苔色苷及其制备方法与用途

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Publication number: CN114437145B
Application number: CN202111135582.0A
Authority: CN
Inventors: 羊学荣; 李典鹏; 宋静茹; 赵雪颖
Original assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Current assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Priority date: 2021-09-27
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2023-11-14
Anticipated expiration: 2041-09-27
Also published as: CN114437145A

Abstract

本发明涉及一种具有糖链结构的甲基苔色苷，其中，所述R₁和R₂为‑H、C₁～C₄烷基、糖基、取代的糖基，所述R₁或R₂至少一个为糖基或取代的糖基；R₃为‑H、C₁～C₄烷基；R₄为C₁～C₄烷基。所述具有糖链结构的甲基苔色苷对宫颈癌Hela细胞显示出一定的抑制活性，同时能有效抑制LPS诱导巨噬细胞NO的释放，表明其具有一定的抗炎活性。

Description

一种具有糖链结构的甲基苔色苷及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及天然药物领域，尤其涉及一种具有糖链结构的甲基苔色苷及其制备方法与用途。

背景技术

羊踯躅Rhododendron molle G.Don为杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属Rhododendron L.植物，最早记载于《神农本草经》，而后历代本草均有记载。其广泛分布于湖南、湖北、广西、江苏等省，根、花、果实均可入药。羊踯躅花从《中国药典》1990年版收录至今，又称闹羊花、闷头花等，有散瘀定痛、祛风除湿等作用，可用于偏正头痛、跌打损伤、风湿痹痛、顽癣等。羊踯躅成熟果序别名六轴子、八厘麻等，性温，味苦，有大毒，具有搜风止痛、止咳平喘等功效，用于风寒湿痹、跌打损伤、咳喘。羊踯躅根称为山芝麻根、巴山虎等，味辛，性温，有毒，入脾经，具有祛风、止咳、散瘀和止痛等功效，用于风寒湿痹、跌打损伤、痔漏、癣疮。现代研究表明羊踯躅中含有大量二萜类、黄酮类、三萜类、木脂素类等化合物。

目前，未见有报道关于羊踯躅中含有糖苷类成分的研究，也未见羊踯躅提取物具有抗癌活性的相关记录。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种具有糖链结构的甲基苔色苷及其制备方法与用途。

本发明提供一种具有糖链结构的甲基苔色苷，所述R₁和R₂为-H、 C₁～C₄烷基、糖基、取代的糖基，所述R₁或R₂至少一个为糖基或取代的糖基；R₃为-H、C₁～C₄烷基；R₄为C₁～C₄烷基。

优选地，所述糖基为六碳糖基；所述取代的糖基为取代的六碳糖基。

更优选地，所述六碳糖基为己醛糖基，包括以下的其中一种：葡萄糖基、阿洛糖基、半乳糖基、甘露糖基；所述取代的六碳糖基为取代的己醛糖基，包括以下的其中一种：取代的葡萄糖基、取代的阿洛糖基、取代的半乳糖基、取代的甘露糖基。

进一步地，所述R₁为-H、C₁～C₄烷基，R₂为葡萄糖基、阿洛糖基、取代的葡萄糖基、取代的阿洛糖基中的其中一种。又或者，所述R₁为葡萄糖基、阿洛糖基、取代的葡萄糖基、取代的阿洛糖基中的其中一种，所述R₂为-H、C₁～C₄烷基。

更进一步地，所述R₁为阿洛糖基，所述R₂、R₃、R₄为甲基。即2-O-β-D- 阿洛糖-甲基苔色苷，命名为羊踯躅苷A。

又或者，所述R₁为葡萄糖基，所述R₂、R₃、R₄为甲基。即2-O-β-D- 葡萄糖-甲基苔色苷，命名为羊踯躅苷B。

本发明还提供一种甲基苔色苷的制备方法，包括如下步骤：

S1：取干燥羊踯躅，按质液比1kg:1～3L加入甲醇，在20～35℃条件分别提取2～3次，浓缩干燥，得到浸膏；取浸膏，按质液比1g： 50～100ml加入乙酸乙酯混合溶液(乙酸乙酯和水按1:1预先混合)萃取2～3次；取乙酸乙酯层合并，浓缩干燥，得乙酸乙酯层浸膏。

S2：将乙酸乙酯层浸膏过MCI柱，分别用浓度为40％、50％、60％、 70％、80％、85％、90％、100％甲醇溶液各300～500ml洗脱，收集40％甲醇洗脱部分，浓缩干燥，得到馏分1干膏，备用。

S3：取馏分1干膏过ODS柱，分别用浓度为20％、40％、60％、 80％、90％、100％甲醇溶液各100～300ml洗脱，收集60％甲醇洗脱部分，浓缩干燥，得到馏分1.3干膏，备用。

S4：取馏分1.3干膏再次经硅胶柱，分别用氯仿：甲醇(5％:95％， 10％：90％，20％：80％，60％:40％)洗脱，每个梯度50～150ml，收集氯仿：甲醇(20％:80％)洗脱部分，浓缩干燥，得到馏分1.3.3干膏，备用。

S5：取馏分1.3.3干膏，使用高效液相经反相制备柱，在3ml/min 流速下用浓度为10～20％乙腈水溶液洗脱，检测波长为254nm，在保留时间25min和27min处分别收集洗脱液，浓缩干燥后，得白色粉末。

本发明的具有糖链结构的甲基苔色苷的特点及优点是：

1.本发明制备所得的羊踯躅苷A和羊踯躅苷B对宫颈癌Hela细胞显示出一定的抑制活性，表明其具有制备成治疗宫颈癌的药物潜力。

2.本发明制备所得的羊踯躅苷A和羊踯躅苷B能有效抑制LPS诱导巨噬细胞NO的释放，表明其具有一定的抗炎活性。

附图说明

图1为羊踯躅苷A酸水解后thiazolidine衍生化产物HPLC分析图。

图2为D-阿洛糖thiazolidine衍生化产物HPLC分析图。

图3为2D NMR相关性和羊踯躅苷A(1)和B(2)平面结构图。

图4为羊踯躅苷A高分辨率质谱。

图5为羊踯躅苷A的核磁共振氢谱(500MHz)。

图6为羊踯躅苷A的核磁共振碳谱(125MHz)。

图7为羊踯躅苷A的氢氢-核磁共振COSY谱(500MHz)。

图8为羊踯躅苷A的核磁共振HSQC谱(500MHz)。

图9为羊踯躅苷A的核磁共振HMBC谱(500MHz)。

图10为羊踯躅苷A的核磁共振NOESY谱(500MHz)。

图11为羊踯躅苷B高分辨率质谱。

图12为羊踯躅苷B的核磁共振氢谱(500MHz)。

图13为羊踯躅苷B的核磁共振碳谱(125MHz)。

图14为羊踯躅苷B的氢氢-核磁共振COSY谱(500MHz)。

图15为羊踯躅苷B的核磁共振HSQC谱(500MHz)。

图16为羊踯躅苷B的核磁共振HMBC谱(500MHz)。

图17为羊踯躅苷B的核磁共振NOESY谱(500MHz)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1羊踯躅苷A和羊踯躅苷B的制备

S1：取干燥羊踯躅(Rhododendron molle(Blume)G.Don，杜鹃花科杜鹃花属)地上部分(1.1kg)经3L甲醇在室温(25℃)条件分别提取3次，浓缩干燥，得到浸膏。取17.7g浸膏经1000ml乙酸乙酯混合溶液(乙酸乙酯和水各500ml预先混合)萃取3次。取乙酸乙酯层合并，浓缩干燥，得乙酸乙酯层浸膏。

S2：将乙酸乙酯层浸膏(9g)经MCI(3*60cm)用浓度为40％、 50％、60％、70％、80％、85％、90％、100％甲醇溶液各400ml洗脱，分别收集各洗脱部位，得到馏分1-8；其中馏分1为40％甲醇洗脱部分，依此类推。将馏分1-8浓缩干燥，得到干膏，备用。

S3：取馏分1(1.5g)经ODS(2*40cm)用20％、40％、60％、 80％、90％、100％甲醇溶液各200ml洗脱，分别收集各洗脱部位，得到馏分1.1-1.6；其中馏分1.1为20％甲醇洗脱部分，依此类推。将馏分1.1-1.6浓缩干燥，得到干膏，备用。

S4：取馏分1.3(210mg)再次经硅胶柱(1.5*30cm)用氯仿：甲醇(5％:95％，10％：90％，20％：80％，60％:40％)洗脱，每个梯度 100ml，分别收集各洗脱部位获得馏分1.3.1-1.3.4；其中馏分1.3.1为氯仿：甲醇(5％:95％)洗脱部分，依此类推。将馏分1.3.1-1.3.4浓缩干燥，得到干膏，备用。

S5：取馏分1.3.3(23.5mg)使用岛津1100型高效液相经反相制备柱(COSMOSIL5C18-AR-II,5μm,10*250mm),在3ml/min流速下用 15％乙腈水溶液洗脱，检测波长为254nm，在保留时间25min和27min 处分别收集洗脱液，浓缩干燥后，得白色粉末，分别为羊踯躅苷A(3.2 mg,0.0002909％)和羊踯躅苷B(4.6mg，0.00041818％)。

实施例2羊踯躅苷A和羊踯躅苷B的鉴定

一、thiazolidine(噻唑烷)衍生化实验。

取羊踯躅苷A(0.5mg)经1M HCl(2.5mL)在80℃下水解2h，获得水解物，利用1MNaOH水溶液进行中和后采用L-cysteine methyl ester hydrochloride(2.5mg)在吡啶中60℃反应1h，接着加入o-tolylisothiocyanate(50μL)再反应1h。所得反应物经过滤处理后使用高效液相在反相柱(COSMOSIL 5C₁₈-AR-II[f 4.6×250mm, CH₃CN/50mM H₃PO₄aq.(25:75),流速1mL/min,检测波长254nm,)下分析，在保留时间65.5分钟时出现特征峰(图1)与在同样化学反应条件处理后的D-阿洛糖衍生物特征峰保留时间一致(图2)。

同样，羊踯躅苷B经与羊踯躅苷A相同处理及检测后发现与D- 葡萄糖衍生物保留时间(17.1分钟)一致。

二、高分辨率质谱及核磁共振谱

(1)羊踯躅苷A

高分辨率质谱显示羊踯躅苷A分子式为C₁₆H₂₂O₉，结合其碳、氢核磁共振谱信息发现羊踯躅苷A是一个含一个苯环，两个甲氧基，一个羰基，一个糖链和一个甲基结构的化合物。进一步通过2D核磁共振谱(COSY、HMBC和NOESY)相关性分析，最终确定其平面结构如图3所示。根据羊踯躅苷A糖链上碳的位移与糖链氢的耦合情况，羊踯躅苷A所链接的糖被确定为阿洛糖。羊踯躅苷A进一步酸水解并采用thiazolidine衍生化的方法最终确定其所含糖为D-阿洛糖。结合羊踯躅苷A糖链端基氢的耦合常数，该化合物最终确定为2-O-β-D-阿洛糖-甲基苔色苷。

(2)羊踯躅苷B

高分辨率质谱和核磁共振谱表明羊踯躅苷B与羊踯躅苷A除了糖链外具有基本相同的化学结构。与羊踯躅苷A相同，根据羊踯躅苷B 的碳谱位移、氢谱耦合常数及酸水解并thiazolidine衍生化处理后，羊踯躅苷B所含糖确定为D-葡萄糖。结合其端基氢的耦合常数，羊踯躅苷B最终确定为2-O-β-D-葡萄糖-甲基苔色苷。

实施例3对Hela细胞株抑制率的影响

MTT法：将Hela细胞株，用含10％的胎牛血清培养于RPMI-1640 培养液，取单细胞悬液分装于96孔板，用不同羊踯躅苷(A和B)(10 和20m)处理细胞。各组设4个平行孔，置37℃，5％CO₂培养箱中培养48h，然后加入MTT(5mg/ml)，再培养4h，弃去培养液，加入DMSO 100μl/孔，置于570nm波长酶标仪下检测吸光度，并计算化合物对细胞生长的抑制率。抑制率结果如表1所示。

表1羊踯躅苷A和B对Hela细胞活性影响

实施例4 LPS诱导小鼠巨噬细胞产生NO抑制率

细胞悬液接种于孔板中培养24h后，LPS诱导组及样品处理组用终浓度为100ng/ml的LPS诱导，同时样品处理组使用10和20μm浓度羊踯躅苷A和B处理细胞。24h后，分别吸取各培养液上清50μl至 96孔板，依次往各孔加入50μl Griess Reagent I液，避光振荡10min后加入50μl Griess Reagent II液，避光振荡反应10min后测定540nm 处吸光度。最后以浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标绘制标准曲线，计算NO含量，并计算各受试样品对LPS诱导小鼠巨噬细胞细胞产生的抑制率。NO抑制率结果如表2所示。

表2羊踯躅苷A和B对巨噬细胞分泌NO的影响

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种制备具有糖链结构的甲基苔色苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：取干燥羊踯躅，按质液比1kg:1～3L加入甲醇，在20～35℃条件分别提取2～3次，浓缩干燥，得到浸膏；取浸膏，按质液比1g：50～100ml加入乙酸乙酯和水按体积比1:1预先混合的混合溶液萃取2～3次；取乙酸乙酯层合并，浓缩干燥，得乙酸乙酯层浸膏；

S2：将乙酸乙酯层浸膏过MCI柱，分别用浓度为40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、100％甲醇溶液各300～500ml洗脱，收集40％甲醇洗脱部分，浓缩干燥，得到馏分1干膏，备用；

S3：取馏分1干膏过ODS柱，分别用浓度为20％、40％、60％、80％、90％、100％甲醇溶液各100～300ml洗脱，收集60％甲醇洗脱部分，浓缩干燥，得到馏分1.3干膏，备用；

S4：取馏分1.3干膏再次经硅胶柱，分别用氯仿：甲醇的体积比浓度为5％:95％，10％：90％，20％：80％，60％:40％洗脱，每个梯度50～150ml，收集氯仿：甲醇体积比浓度为20％:80％的洗脱部分，浓缩干燥，得到馏分1.3.3干膏，备用；

S5：取馏分1.3.3干膏，使用高效液相经反相制备柱，在3ml/min流速下用浓度为10～20％乙腈水溶液洗脱，检测波长为254nm，在保留时间25min处收集洗脱液，浓缩干燥后，得白色粉末，即得；所述甲基苔色苷的结构式如式Ⅰ所示：

式Ⅰ；所述R为阿洛糖基；所述甲基苔色苷为2-O-β-D-阿洛糖-甲基苔色苷。

2.一种具有糖链结构的甲基苔色苷在制备治疗宫颈癌药物方面的用途，其特征在于，所述甲基苔色苷的结构式如式Ⅰ所示：