CN114014899B - 一种抗癌化合物的制备方法 - Google Patents

一种抗癌化合物的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114014899B
CN114014899B CN202111617377.8A CN202111617377A CN114014899B CN 114014899 B CN114014899 B CN 114014899B CN 202111617377 A CN202111617377 A CN 202111617377A CN 114014899 B CN114014899 B CN 114014899B
Authority
CN
China
Prior art keywords
methanol
dichloromethane
elution
eluted
water
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111617377.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114014899A (zh
Inventor
阎新佳
刘圆
杨正明
张绍山
黄艳菲
李文兵
李莹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest Minzu University
Original Assignee
Southwest Minzu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest Minzu University filed Critical Southwest Minzu University
Priority to CN202111617377.8A priority Critical patent/CN114014899B/zh
Publication of CN114014899A publication Critical patent/CN114014899A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114014899B publication Critical patent/CN114014899B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/18—Acyclic radicals, substituted by carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明方法，从连翘中纯化制备出了一种具有抗癌活性的天然化合物，不仅为该化合物的制备提供了一种可行的方法，同时，还为连翘的进一步深入开发利用提供了新的思路和途径。

Description

一种抗癌化合物的制备方法
技术领域
本发明涉及具有抗癌活性的天然化合物的制备方法。
背景技术
癌症指的是恶性肿瘤及其一些来自于间叶组织的肉瘤。起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。相对应的，起源于间叶组织的恶性肿瘤统称为肉瘤。有少数恶性肿瘤不按上述原则命名，如肾母细胞瘤、恶性畸胎瘤等。一般人们所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤。
在癌症的治疗过程中，通常使用化疗、放疗、免疫治疗等手段。而目前常规的手段毒副作用较强，多数患者皆因无法承受治疗中的毒副作用而放弃治疗或治疗失败。
天然植物药物，是从天然植物中寻找到的具有特定治疗活性的药物。天然植物药物在中国发展历程数千年，各天然植物药物的毒副作用也基本了解，若能从中纯化制备得到具备抗癌活性的化合物，或将为癌症治疗带来新的尝试。
发明内容
连翘(Forsythia suspensa)是我国的传统中药，早在《本草图经》中就有记载，其味苦，性微寒，归肺，心，小肠经，具有清热解毒，消肿散结之功效，常用于风热感冒、温病初起、温热入营、高热烦渴、热淋尿闭、痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒和肿毒等症。主要分布于我国山西、陕西、山东、安徽西部、河南等地。本发明拟从连翘中寻找可对癌症有效的活性成分。
本发明在研究中，对连翘果实的75％乙醇提取物经多种柱色谱分离纯化，运用高分辨质谱、核磁共振等波谱技术对各种分离部位进行结构确证，分离得到了1个新化合物(式III结构所示)。
Figure BDA0003436764360000011
通过细胞试验发现，本发明化合物对乳腺癌、恶性黑色素瘤等细胞有显著的抑制活性。
基于本发明研究，提供了如式III所示的化合物的制备方法，它包括如下步骤：
Figure BDA0003436764360000012
(1)连翘果实乙醇提取物，依次用氯仿、乙酸乙酯萃取；
(2)乙酸乙酯萃取部位，通过非极性或弱极性大孔树脂柱，依次用5-15％、25-35％甲醇-水溶液洗脱，收集5-35％甲醇-水溶液洗脱部位；
(3)5-35％甲醇-水溶液洗脱部位上正相硅胶柱，依次以二氯甲烷-甲醇42-38:1、32-28:1、22-18:1洗脱，收集二氯甲烷-甲醇22-18:1洗脱部位；
(4)二氯甲烷-甲醇22-18:1洗脱部位上聚酰胺柱，依次采用二氯甲烷-甲醇27-23:1、22-18:1洗脱，收集二氯甲烷-甲醇22-18:1洗脱部位；
(5)步骤(4)的二氯甲烷-甲醇22-18:1洗脱部位，上述反相硅胶柱，依次用37-43％、47-53％、57-63％、67-73％、77-83％、87-93％甲醇-水、纯甲醇洗脱，收集纯甲醇洗脱部位；
(6)纯甲醇洗脱部位，上制备液相色谱或半制备液相色谱，流动相为40-60％甲醇水洗脱，得到式III化合物。
本发明中，非极性或弱极性大孔树脂柱，包括但不限于HP-20、AB-8、D101、X-5、HPD-100、D1400、ADS-5等或者类似极性或近似型号。
进一步地，步骤(1)所述乙醇提取物，为70-80％乙醇提取物。
进一步地，步骤(1)所述乙醇提取物为75％乙醇提取物。
本发明中，乙醇提取物可以通过常规天然植物提取方式得到，例如可以采用回流、超声、浸渍、超临界萃取、闪式提取等等。
进一步地，步骤(2)中，乙酸乙酯萃取部位，通过HP-20色谱柱，依次用10％、30％甲醇-水溶液洗脱，收集30％甲醇-水溶液洗脱部位。
进一步地，步骤(3)中，30％甲醇-水溶液洗脱部位上正相硅胶柱，依次以二氯甲烷-甲醇40:1、30:1、20:1洗脱，收集二氯甲烷-甲醇20:1洗脱部位。
进一步地，步骤(4)中，二氯甲烷-甲醇20:1洗脱部位上聚酰胺柱，依次采用二氯甲烷-甲醇25:1、20:1洗脱，收集二氯甲烷-甲醇20:1洗脱部位。
进一步地，步骤(5)中，步骤(4)的二氯甲烷-甲醇20:1洗脱部位，上述反相硅胶柱，依次用40％、50％、60％、70％、80％、90％甲醇-水、纯甲醇洗脱，收集纯甲醇洗脱部位。
进一步地，步骤(6)中，流动相为50％甲醇水。在流速为2.5mL/min时候式III化合物的保留时间为约44min。
步骤(6)中，流速、流动相、温度等都可以根据需求进行调整，通过常规方式追踪获取相应条件下的式III化合物保留时间。
本发明方法，从连翘中纯化制备出了一种具有抗癌活性的天然化合物，不仅为该化合物的制备提供了一种可行的方法，同时，还为连翘的进一步深入开发利用提供了新的思路和途径。
具体实施方式
实施例1
1仪器和材料
P850型旋光仪(中国海能公司)；Shimadzu UV-1780紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)；Bruker AV 600NMR型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)；Agilent 6545型高分辨率质谱仪(美国Agilent公司)；Waters 515-2996高效液相色谱仪(美国Waters公司)；YMC-Pack ODS-A反相半制备色谱柱(250×10mm,5μm)。柱色谱硅胶(100-200目，200-300目，青岛海洋化工厂)；GF254(青岛海洋化工厂)；ODS柱色谱填料(60～80μm,德国Merck)；HP-20吸附树脂(日本三菱公司)。
D-葡萄糖标准品(纯度是＞99％，日本和光株式会社)，L-葡萄糖标准品(纯度是＞99％，日本和光株式会社)；浓盐酸(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)、吡啶(99.8％,P111513,Aladdin)、氯仿(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)、邻甲苯异硫氰酸酯(98％,M831176,Macklin)。
2提取与分离
中药连翘(F.suspensa)的干燥果实11.8kg，以75％乙醇超声提取3次，合并提取液并减压浓缩至浸膏，得总提取物1.9kg。浸膏用水复溶，依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇试剂按照1:1的比例进行萃取，得到氯仿层(650.9g)、乙酸乙酯层(213.2g)和正丁醇层(700.3g)。
乙酸乙酯部位通过HP-20色谱柱进行分离，流动相依次为体积分数为10％、30％、50％、70％、90％甲醇-水以及纯甲醇进行梯度洗脱(每个梯度7个柱体积)，得到6个流份(E-1～E-6)(每个梯度合并成为一个流份，下同)。取E-2通过正相硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇(40:1、30:1、20:1、10:1、8:1、4:1)梯度洗脱得6个流份(E-2-1～E-2-6)。E-2-3经聚酰胺柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇(25:1、20:1、15:1、10:1、5:1)进行梯度洗脱得到5个流份(E-2-3-1～E-2-3-5)。E-2-3-2经开放ODS柱色谱分离，流动相依次为体积分数40％、50％、60％、70％、80％、90％甲醇-水以及纯甲醇，梯度洗脱得到7个流份(E-2-3-2-1～E-2-3-2-7)。E-2-3-2-7通过半制备液相分离，流动相为50％甲醇水，流速为2.5mL/min，得到式III化合物(tR＝44min，10.2mg)。
3结构鉴定
式III化合物:浅黄色油状(甲醇)，
Figure BDA0003436764360000031
HR-ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z 489.2108[M+Na]+(Calcd.489.2101，C24H34O9Na)，提示式III化合物的分子式为C24H34O9，不饱和度为8。
1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)谱(Table 1)中，低场区观察到一组AA′BB′偶合系统的苯环氢信号δH 7.00(2H,d,J＝8.5Hz,H-2,H-6)和6.64(2H,d,J＝8.5Hz,H-3,H-5)提示存在一个对位取代的苯环，另外还有一个sp2杂化的烯烃质子δH 6.91(1H,t,J＝2.6Hz,H-2″)。高场区显示有2个连氧亚甲基氢信号δH 3.59(1H,dt,J＝10.2,8.0Hz,H-8a)，3.76(1H,dt,J＝10.2,8.0Hz,H-8b)，4.35(1H,dd,J＝11.5,2.0Hz,H-6′a)和4.08(1H,dd,J＝11.5,6.9Hz,H-6′b)；2个甲基氢信号δH 1.04(3H,s,H-9″)和1.05(3H,s,H-10″)。
13C-NMR(DMSO-d6,150MHz)谱和135°DEPT谱提示存在24个碳信号，其中δC 128.9(C-1)，130.1(C-2,6)，115.5(C-3,5)和156.1(C-4)为苯环上的碳信号；δC 103.52(C-1′)，75.8(C-2′)，77.0(C-3′)，70.7(C-4′)，74.1(C-5′)和64.0(C-6′)为一组葡萄糖碳信号[3]，1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)谱中δH 4.22(1H,d,J＝8.0Hz,H-1′)为葡萄糖上半缩醛的端基质子，结合单糖衍生化样品的保留时间分析，确定为β-D-葡萄糖[5]。13C-NMR谱高场区中1个酯羰基碳信号δC 166.7(7″-C)和2个烯碳信号δC 130.0(1″-C)以及140.5(2″-C)，提示存在一个α,β-不饱和羰基。在1H-1H COSY谱(Figure 2)中，H-2″/H-3″，H-3″/H-4″，H-4″/H-5″和H-5″/H-6″的相关，提示为-CH-CH2-CH-CH2-CH2-片段。结合HMBC谱中H-9″/C-8″以及H-10″/C-4″的远程相关，推断δC 27.6(C-9″)和27.0(C-10″)为偕二甲基，且连在C-8″位季碳上。结合HMBC谱中H-2″/C-6″和C-7″的远程相关，推断存在一个4-(2-羟基丙烷-2-基)环己烯-1-羧酸结构(oleuropeic acid unit)。对式III化合物的酸水解反应产物中苷元部分进行旋光度测定(+40.2°)，与文献报道的S-松油酸(oleuropeic acid)(-114°)和R-松油酸(+46.5°)进行比较，结果表明苷元为R构型。在HMBC谱中H-2″/C-7″的H-6′/C-7″的远程相关，葡萄糖通过C-6′位糖苷键连接到苷元C-7″酯羰基碳上。
综上所述，式III化合物的结构如下：
Figure BDA0003436764360000041
4MTT抗肿瘤活性测定
采用MTT比色法初步研究式III化合物对人乳腺癌细胞MCF-7、人恶性黑色素瘤细胞A-375、人前列腺癌细胞系PC-3和人肝癌细胞Hep-G2的细胞的抑制作用。待测细胞加入0.25％胰酶消化液使贴壁细胞消化脱落，形成细胞混悬液，对细胞进行记数，并将细胞稀释到1×104个/ml。将细胞悬液接种在96孔板上，每孔加入180μL，放置在37℃、5％CO2的恒温箱中培养，培养12h使细胞贴壁。更换新鲜培养液，加入待测化合物和阳性对照药5-氟尿嘧啶，40μM/孔和100μM/孔，在恒温箱中培养48h。吸去上清，加入100μL新鲜DMEM高糖培养液，再加入配置好的10μL MTT溶液(5mg/mL，0.5％MTT)，继续在恒温箱中培养4h。吸去上清液后，每孔加入100μL的formazan溶解液，置摇床上低速振荡10min，在37℃条件下孵育3～4h。待结晶物充分溶解后，在酶联免疫检测仪570nm处测量各个孔的吸光值。结果显示，式III化合物在40μM浓度下对MCF-7，A-375细胞系的抑制率为39.85％和43.38％，在100μM浓度下对PC-3，Hep-G2细胞系没有抑制活性。
5糖取代基绝对构型的确定
式III化合物(1mg)用2M HCl在90℃下水解2h，将混合物在真空下蒸发干燥，残渣用水溶解，用氯仿提取三次，收集水层。在真空中干燥后，将残留物溶解在含有L-半胱氨酸甲酯(1mg)的吡啶(1mL)(Aladdin，China)中。在60℃下加热1小时，再加入邻甲苯异硫氰酸酯(5μL)(Macklin，China)在60℃下加热1小时，减压干燥。将残留物用甲醇水溶解至0.5mL左右，过0.45μm有机滤膜，待用。通过高效液相色谱(HPLC)进行分析。色谱柱为YMC-PackODS-A色谱柱(日本YMC公司，250×4.6mm i.d.，5μm)，柱温25℃，35％甲醇水溶液等梯度洗脱，流速为0.6mL/min的流速洗脱，于250nm处检测峰。标准单糖衍生物的峰出现在tR＝14.0min(L-Glu)和16min(D-Glu)。
6讨论
本发明采用各种色谱分离技术与波谱手段，并结合化学方法，从连翘的果实中分离得到1个新化合物(如式III所示)，且对该化合物进行了抗肿瘤活性初筛，发现该化合物具有一定的抗癌活性。
表1式III化合物的1H-NMR和13C-NMR数据
Figure BDA0003436764360000051
Figure BDA0003436764360000061

Claims (9)

1.如式III所示的化合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
Figure FDA0004111012680000011
(1)连翘果实乙醇提取物，依次用氯仿、乙酸乙酯萃取；
(2)乙酸乙酯萃取部位，通过非极性或弱极性大孔树脂柱，依次用5-15％、25-35％甲醇-水溶液洗脱，收集5-35％甲醇-水溶液洗脱部位；
(3)5-35％甲醇-水溶液洗脱部位上正相硅胶柱，依次以二氯甲烷-甲醇42-38:1、32-28:1、22-18:1洗脱，收集二氯甲烷-甲醇22-18:1洗脱部位；
(4)二氯甲烷-甲醇22-18:1洗脱部位上聚酰胺柱，依次采用二氯甲烷-甲醇27-23:1、22-18:1洗脱，收集二氯甲烷-甲醇22-18:1洗脱部位；
(5)步骤(4)的二氯甲烷-甲醇22-18:1洗脱部位，上反相硅胶柱，依次用37-43％、47-53％、57-63％、67-73％、77-83％、87-93％甲醇-水、纯甲醇洗脱，收集纯甲醇洗脱部位；
(6)纯甲醇洗脱部位，上制备液相色谱或半制备液相色谱，流动相为40-60％甲醇水洗脱，得到式III化合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述乙醇提取物，为70-80％乙醇提取物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述乙醇提取物为75％乙醇提取物。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，乙酸乙酯萃取部位，通过HP-20色谱柱，依次用10％、30％甲醇-水溶液洗脱，收集30％甲醇-水溶液洗脱部位。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，30％甲醇-水溶液洗脱部位上正相硅胶柱，依次以二氯甲烷-甲醇40:1、30:1、20:1洗脱，收集二氯甲烷-甲醇20:1洗脱部位。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，二氯甲烷-甲醇20:1洗脱部位上聚酰胺柱，依次采用二氯甲烷-甲醇25:1、20:1洗脱，收集二氯甲烷-甲醇20:1洗脱部位。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，步骤(4)的二氯甲烷-甲醇20:1洗脱部位，上反相硅胶柱，依次用40％、50％、60％、70％、80％、90％甲醇-水、纯甲醇洗脱，收集纯甲醇洗脱部位。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，流动相为50％甲醇水。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：式III化合物的保留时间为约44min。
CN202111617377.8A 2021-12-28 2021-12-28 一种抗癌化合物的制备方法 Active CN114014899B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111617377.8A CN114014899B (zh) 2021-12-28 2021-12-28 一种抗癌化合物的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111617377.8A CN114014899B (zh) 2021-12-28 2021-12-28 一种抗癌化合物的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114014899A CN114014899A (zh) 2022-02-08
CN114014899B true CN114014899B (zh) 2023-04-07

Family

ID=80069220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111617377.8A Active CN114014899B (zh) 2021-12-28 2021-12-28 一种抗癌化合物的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114014899B (zh)

Also Published As

Publication number Publication date
CN114014899A (zh) 2022-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107459477B (zh) 一种马齿苋中异吲哚生物碱类化合物及其提取分离方法
CN109897077B (zh) 马齿苋中化合物Oleraciamide E及其提取分离方法与应用
CN110627861B (zh) 一种知母甾体皂苷化合物及其制备方法和应用
CN102247393B (zh) 一种齐墩果酸皂苷类成分的制备方法及其用途
CN113321618B (zh) 马齿苋中三种生物碱类化合物及其提取分离方法
Zhang et al. Five new sesquiterpenoids from the fruits of Acanthopanax senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms
CN106083788A (zh) 一种具有抗肿瘤活性和抗炎活性的醌式查尔酮碳苷二聚体化合物及其制备方法
Wang et al. Purine-containing cucurbitane triterpenoids from Cucurbita pepo cv dayangua
Fu et al. Paeonidanins F–H: Three new dimeric monoterpene glycosides from Paeonia lactiflora and their anti-inflammatory activity
CN111548327B (zh) 降碳贝壳杉烷型二萜及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途
CN114014899B (zh) 一种抗癌化合物的制备方法
CN114213375B (zh) 一种倍半萜内酯化合物及其制备方法与应用
CN116120222A (zh) 一种抗肿瘤抗病毒化合物Talachalasin A-C及其制备方法和应用
CN114369076B (zh) 马齿苋中两种茚类化合物及其提取分离方法
Wen et al. Chemical constituents from the aerial parts of Psammosilene tunicoides
CN114989064A (zh) 马齿苋中一种新型吡咯生物碱类化合物及其提取分离方法
Muharini et al. New flavone C-glycosides from leaves of Sarcotheca griffithii (Hook F) Hallier F
CN113735918A (zh) 一种半日花烷型二萜苷化合物及其制备方法
Ishibashi Isolation of bioactive natural products from myxomycetes
Ye et al. Minor cytotoxic cardenolide glycosides from the root of Streptocaulon juventas
CN114262354B (zh) 一种化合物及其用途
CN115141238B (zh) 苯乙醇苷类化合物及其制备方法和用途
CN114456191B (zh) 山药地上部分生育酚衍生物的提取方法和应用
CN113912657B (zh) 马齿苋中三种吲哚类生物碱及其提取分离方法与用途
CN116768912B (zh) 菘蓝中的螺吲哚酮类生物碱化合物及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant