CN106831384A - 一种杜松烷型倍半萜化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种杜松烷型倍半萜化合物及其制备方法与应用，包括如下步骤：(1)制备瓜馥木提取物：将瓜馥木干燥的茎用30～95％v/v的乙醇冷浸或者是热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为瓜馥木提取物；(2)分离纯化：将上述瓜馥木提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩成浸膏，经柱层析、薄层层析、分子筛层析分离以及高效液相分离得到。本发明还公开了该化合物的制备方法和其在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。本发明首次发现了杜松烷型倍半萜化合物在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的活性，可用于制备抗类风湿关节炎的药物。
Description
技术领域
本发明涉及植物化学技术领域，具体涉及一种杜松烷型倍半萜化合物及其制备方法与应用。
背景技术
瓜馥木(Fissistigma oldhamii(Hemsl.)Merr.)，别名小香花藤、藤龙眼、降香藤，是番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木属植物。该植物可做药用，茎、叶可以治骨折水肿，全株可以治疗风湿骨痛、手足麻木等。从瓜馥木分离得到的杜松烷型倍半萜类化合物报道较少，目前未见该杜松烷型倍半萜在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的应用中的报道。
发明内容
鉴以此，本发明的目的是提供一种从瓜馥木中提取分离的杜松烷型倍半萜化合物。
本发明的得另一目的是提供上述杜松烷型倍半萜化合物的制备方法。
此外，本发明还提出上述杜松烷型倍半萜化合物的应用。
为了达到上述的目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种杜松烷型倍半萜化合物，其结构通式如下：
其中，R1、R2、R3、R4分别独立选自为-OH或-H。
优选的，其结构式如下：
所述的杜松烷型倍半萜化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备瓜馥木提取物
将瓜馥木干燥的茎用30～95％v/v的乙醇冷浸或者是热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为瓜馥木提取物；
(2)分离纯化
将上述瓜馥木提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩成浸膏，经柱层析、薄层层析、分子筛层析分离以及高效液相分离得到。
优选的，所述步骤(1)中，减压浓缩条件为：温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa，优选温度为45℃，优选压力为-0.095MPa。
优选的，所述步骤(2)中，减压浓缩条件为：温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa，优选温度为45℃，优选压力为-0.095MPa。
优选的，所述步骤(2)的柱层析过程中：以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂和乙酸乙酯-甲醇按极性递增进行硅胶柱层析，其中，石油醚：乙酸乙酯的体积比为100:0～0:100；乙酸乙酯：甲醇的体积比为100:0～0:100。
优选的，步骤(2)的薄层层析过程中：用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，以乙酸乙酯体积百分数为20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂进行薄层层析。
优选的，步骤(2)中的分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。
本发明还提出所述的杜松烷型倍半萜化合物在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。
本发明还提出所述的杜松烷型倍半萜化合物在制备抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖药物中的应用，其中，滑膜细胞为原代大鼠滑膜细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明首次发现了杜松烷型倍半萜化合物以及发现其在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的活性，可用于制备抗类风湿关节炎的药物。本发明提供的制备方法可获得抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖高活性的杜松烷型倍半萜化合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为化合物1的结构式图；
图2为化合物1在不同药物浓度下的OD值。
其中，图2注：358为化合物1Fissistigmaterpene B，C为空白对照，Y为阳性对照，与空白组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。
具体实施方式
实施例1
杜松烷型倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)瓜馥木干燥的茎10Kg按常规用30～95％v/v，优选为75％v/v的乙醇浸提3次每次7天，得到提取液，将提取液于温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa条件下，优选为45℃，压力为-0.095MPa条件下减压浓缩成膏状，得到瓜馥木提取物1200g。
(2)将提取物用蒸馏水(3L)稀释成悬浮液，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯萃取(3L×3次)，将乙酸乙酯萃取液于温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa条件下，优选为45℃，压力为-0.095MPa条件下减压浓缩成浸膏(250g)。
进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(100:0～0:100,V/V)及乙酸乙酯-甲醇(100:0～0:100,V/V)按极性递增进行硅胶柱层析，并按每次约400mL收集馏分。通过TLC检测合并相似流分分成8个组分，即Fr.1～8。
Fr.3用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，以乙酸乙酯体积百分数为20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂进行薄层层析，根据层析效果合并流分得到3个组分Fr.3-1,Fr.3-2以及Fr.3-3。
Fr.3-1以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂进行分子筛Sephadex LH-20柱层析除去色素后得到组分Fr.3-1-1，Fr.3-1-1用高效液相色谱法进行分离，洗脱剂为乙腈和水，其体积配比为1:1，得到杜松烷型倍半萜化合物Fissistigmaterpene B。
杜松烷型倍半萜化合物Fissistigmaterpene B的结构鉴定结果如下：
Fissistigmaterpene B：为无色油状物。旋光度为[α]24 D-41(c＝0.2,MeOH)，由高分辨以及氢谱碳谱(表1)可以确定该化合物的分子式为C14H24O2。氢谱显示3个甲基氢信号δH0.72(d,J＝6.8Hz)，δH 0.91(d,J＝6.8Hz)和δH 1.12(s)。碳谱显示14个碳信号，包括1个羰基信号(δC 212.8)，4个次甲基信号，5个亚甲基信号，1个连氧碳碳信号以及3个甲基信号。化合物1的氢谱碳谱数据与已知化合物(4aα,5α,8β,8aβ)-octahydro-5,8a-dihydroxy-5-methyl-8-(1-methylethyl)-2(1H)-Naphthalenone非常相似，只是化合物1中少了一个连氧季碳信号而多出一个次甲基碳信号。这说明该化合物1中的6位的为次甲基而不是连氧季碳。仔细分析2D-NMR可以确定该化合物平面结构如图1所示。该化合物的相对构型是通过NOESY确定的，在NOESY谱中H-1/H-5α，H-5α/H-7，H-6/H-11和H-6/H-15分别相关说明该化合物的H-1和H-7是在同一侧而甲基和异丙基是在另外一侧。因此，确定该化合物1为杜松烷型的新倍半萜化合物，该化合物1的结构式如图1所示，命名为Fissistigmaterpene B。
表1化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据
实施例2
药理活性实验
实验材料
细胞：滑膜细胞(原代大鼠滑膜细胞)。
细胞培养液：原代大鼠滑膜细胞培养基。
试剂：噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide，MTT，Sigma生产)。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(购自碧云天公司)。甲氨蝶呤(methot rexate，MTX，上海信宜药厂有限公司，批号20140307)。
仪器：96孔细胞培养板；infinite 200Pro多功能酶标仪。
实验方法
MTT法测定药物对滑膜细胞的抑制作用
取对数期的滑膜细胞接种至96孔培养板(1×104个细胞/孔)，设置为空白组(不给予药物)、甲氨蝶呤组(给予1μg/mL的甲氨蝶呤)、给药组(给予1、10、50、100μg/mL浓度的药物)，培养孵育过夜后用于实验。细胞给予不同浓度的药物培养48h后，每孔加入10μL浓度为5mg/mL MTT，继续培养4h后，小心吸弃培养上清液，每孔加入100μL的DMSO溶解甲瓒结晶，室温震摇5min，完全溶解后，用酶标仪在570nm处检测光密度(OD值)。
LDH活性检测法测药物对滑膜细胞细胞活力的影响
取对数期的滑膜细胞接种至96孔培养板(1×104个细胞/孔)，设置为空白组(不给予药物)、甲氨蝶呤组(给予1μg/mL的甲氨蝶呤)、给药组(给予1、10、50、100μg/mL浓度的药物)，培养孵育过夜，各组细胞培养结束后，取细胞上清液，LDH检测试剂盒检测LDH活性。LDH的活力按照下述公式计算。
统计方法
采用SPSS 22.0统计软件分析实验数据。结果用均数±标准差表示，用单因素方差(one-wayANOVA)分析组间差异。以P<0.05认为具有统计学差异。
实验结果
MTT法测定药物对滑膜细胞的抑制作用结果：
使用不同浓度药物培养48h后，MTT法检测细胞增殖作用结果如图2所示。结果表明Fissistigmaterpene B添加浓度为1μg/mL就表现出对滑膜细胞具有明显的抑制作用。
LDH活性检测法测药物对滑膜细胞细胞活力的影响：
使用不同浓度药物培养48h后，LDH活性检测法检测细胞活力结果见下表2。结果表明Fissistigmaterpene B添加浓度为1μg/mL就表现出明显提高细胞培养液中LDH的活性(P<0.05或P＜0.01)。
表2各药物对滑膜细胞LDH活性的作用
注：与空白组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。
综上所述，本发明提出的杜松烷型倍半萜化合物Fissistigmaterpene B对滑膜细胞具有很好的抑制效果，能提高细胞培养液中LDH活性。本发明杜松烷型倍半萜化合物Fissistigmaterpene B具有良好的抗风湿药效，可以用于抗风湿药物的制备。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种杜松烷型倍半萜化合物，其特征在于，其结构通式如下：
其中，R1、R2、R3、R4分别独立选自为-OH或-H。
2.根据权利要求1所述的杜松烷型倍半萜化合物，其特征在于，其结构式如下：
3.根据权利要求2所述的杜松烷型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备瓜馥木提取物
将瓜馥木干燥的茎用30～95％v/v的乙醇冷浸或者是热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为瓜馥木提取物；
(2)分离纯化
将上述瓜馥木提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩成浸膏，经柱层析、薄层层析、分子筛层析分离以及高效液相分离得到。
4.根据权利要求3所述的杜松烷型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，减压浓缩条件为：温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa。
5.根据权利要求3所述的杜松烷型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，减压浓缩条件为：温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa。
6.根据权利要求3所述的杜松烷型倍半萜化合物，其特征在于，所述步骤(2)的柱层析过程中：以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂和乙酸乙酯-甲醇按极性递增进行硅胶柱层析，其中，石油醚：乙酸乙酯的体积比为100:0～0:100；乙酸乙酯：甲醇的体积比为100:0～0:100。
7.根据权利要求3所述的杜松烷型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)的薄层层析过程中：用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，以乙酸乙酯体积百分数为20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂进行薄层层析。
8.根据权利要求3所述的杜松烷型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。
9.权利要求2所述的杜松烷型倍半萜化合物在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。
10.权利要求2所述的杜松烷型倍半萜化合物在制备抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖药物中的应用。
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