CN108329287B - 大果榕中带有环氧基的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大果榕中的异黄酮类化合物的制备方法及其应用，该异黄酮类化合物的制备如下：将大果榕根粉碎后过筛，用醇溶液冷浸提取，减压浓缩后得浸膏，浸膏中加入蒸馏水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取得各部位浸膏；乙酸乙酯浸膏经柱层析、高效液相即得到异黄酮化合物。本发明从大果榕中提取的异黄酮类化合物具有较好的抑制三种肿瘤细胞增殖作用。

Description

大果榕中带有环氧基的化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种天然的植物提取物，具体涉及一种大果榕中的异黄酮类新化合物及其制备方法。
背景技术
桑科(Moraceae)榕属(Ficus)植物世界上约有 1000 多种，在我国约有 120 种，《中国植物志》记载了 98 种，3 个亚种，《海南植物志》记载了 41 种。榕属植物主要分布在热带和亚热带，在我国主要分布在西南的贵州、云南和东南沿海的福建、广东、广西和海南等地。榕属植物资源丰富，在民间已经广泛地作为药物使用，广泛用于治疗癌症、肺炎、白癜风、腹泻、扁桃体炎、咳嗽、风湿疼痛以及产妇发乳等疾病。部分榕属植物的有效成分已经制成针剂、胶囊等多种形式的药物供临床使用。近年来国内外学者对榕属植物进行了系统研究，发现榕属植物具有丰富的化学成分和多样的药理活性。
邵泰明等（大果榕根中异黄酮类成分的研究 [J]. 有机化学, 2017, 37）从大果榕根中分离得到了5个异黄酮化合物，其中化合物1和2为新化合物，对化合物1-5进行体外抗骨质疏松活性测试，结果表明化合物4和5在100μmol/L 时具有一定的抗骨质疏松活性。
中国专利文献（申请号2018100226260）公开了从大果榕中分离得到的一个异黄酮新化合物及其制备方法和应用，其化合物命名为Ficaurisoflavone A，抗肿瘤结果表明异黄酮化合物均具有一定抑制三种肿瘤细胞增殖作用。
目前尚缺大果榕异黄酮成分的进行更系统研究，同时对其抗肿瘤活性研究还有待进一步研究。
发明内容
本发明目的在于解决上述问题，提供一种大果榕中新的具有抗肿瘤活性的异黄酮类新化合物及其制备方法和应用。
实现本发明目的的技术方案是：一种异黄酮类新化合物，其结构如式（Ⅰ）所示：
Figure 475347DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）。
上述异黄酮类新化合物的制备方法包括以下步骤：
①将大果榕组织自然阴干、粉碎后用醇溶液提取浓缩后得到浸膏，浸膏加蒸馏水悬浮后用石油醚、乙酸乙酯萃取得到石油醚、乙酸乙酯部位；
②将步骤①得到的乙酸乙酯部位经硅胶柱层析得到7个组分A-G，组分C再经石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱，合并相似馏分得到5个组分Fr1-5；
③将步骤②得到的Fr3经高效液相分离得到异黄酮类新化合物。
上述步骤中①中所述的大果榕组织为大果榕根、茎、叶或果，醇溶液为体积分数为75%-95%的乙醇溶液，所述的蒸馏水与浸膏体积比为1:1。
上述步骤中②中柱层析洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯体积比为100:0-0:100。
上述步骤③中所述高效液相溶剂体系为55%甲醇-45%水。
上述异黄酮类新化合物在抑制肿瘤细胞上的应用，所述肿瘤细胞为宫颈癌Hela细胞、乳腺癌MCF-7细胞或者肺腺癌A549细胞。
本发明具有的积极效果：提供一种大果榕中新的具有抗肿瘤活性的异黄酮类化合物及其制备方法。
附图说明
图1为本发明的异黄酮类化合物的1H-NMR谱（核磁共振氢谱）图。
图2为本发明的异黄酮类化合物的13C-NMR谱（核磁共振碳谱）图。
图3为本发明的异黄酮类化合物素的HSQC谱图。
图4为本发明的异黄酮类化合物的HMBC谱图。
图5为本发明的异黄酮类化合物的1H-1H COSY谱（氢氢相关谱）图。
图6为本发明的异黄酮类化合物的HRESIMS（高分辨电喷雾电离质谱）光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述的制备方法进一步说明，但与本发明保护范围并不限于此。
（实施例）
本实施例的异黄酮类化合物的结构式如式（Ⅰ）所示：
Figure 742381DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）。
该异黄酮类化合物的制备方法包括以下步骤：
①将20kg自然阴干的大果榕根粉碎后过筛，用体积分数为95%的乙醇室温下浸泡提取3次，每次6天，减压浓缩回收乙醇得到总浸膏460g，加入等体积的蒸馏水悬浮浸膏，先用3L石油醚萃取3次，得到石油醚部位浸膏175g，后用3L乙酸乙酯多次萃取直至上层溶液颜色明显变淡得到乙酸乙酯部位70g。
②将步骤①中的乙酸乙酯部位70g用石油醚-乙酸乙酯（100:0-0:100, V/V）梯度洗脱，每500mL收集流分，TCL点板检测，合并相似组分得到7个组分A-G；组分C再经石油醚-乙酸乙酯(3:1, V/V)柱层析，TCL点板检测，合并相似组分得到5个组分Fr1-5；
③将步骤②中的Fr3经高效液相(甲醇/水, 55:45, 3 mL/min, tR=15.8 min)分离得到异黄酮类新化合物4.7 mg。
（测试例）
对实施例得到的异黄酮类化合物进行产品分析：
（1）该异黄酮类化合物的1H-NMR谱见图1（溶剂acetone-d 6，400Hz）。
（2）该异黄酮类化合物的13C-NMR谱见图2（溶剂acetone-d 6，100MHz）。
具体数据见表1。
（3）该异黄酮类化合物的HSQC谱见图3（溶剂acetone-d 6）。
（4）该异黄酮类化合物的HMBC谱见图4（溶剂acetone-d 6）。
（5）该异黄酮类化合物的1H-1H COSY谱（氢氢相关谱）见图5（溶剂acetone-d 6）。
（6）该异黄酮类化合物的高分辨电喷雾电离质谱图见图6。
异黄酮类新化合物：淡黄色粉末，易溶于丙酮、甲醇; m.p. 159-160 ℃; [α]25 D +43.5 (c 0.1, CH3OH); UV (CH3OH) λ max (logε): 260 (2.54) nm, 201 (3.52) nm。HRESI-MS给出该化合物分子式为C25H26O7（m/z 439.17526 [M + H]+, 计算值为439.17513），不饱和度为13。在UV光谱中，在260 nm处有吸收，说明该化合物含有苯环，提示该化合物可能为黄酮类化合物。1H NMR谱中低场区给出1个典型的黄酮C-5号位与分子内羰基形成氢键的羟基信号δ H 13.02 (1H, s)，1个典型的异黄酮C-2号位烯氢信号δ H 8.19(1H, s)，1个C-6号位烯氢δ H6.28 (1H, d, J = 2.2 Hz)，1个C-8号位烯氢δ H6.41 (1H, d,J = 2.2 Hz)，3组1,3, 4取代的苯环氢信号δ H 7.67 (1H, d, J = 2.2 Hz)、7.32 (1H,dd, J = 8.2, 2.2 Hz)和6.95 (1H, d, J = 8.2 Hz)，进一步证明该化合物为C-3'被取代的异黄酮类化合物，此外，1H NMR谱中还给出2个反式烯氢信号δ H 6.94 (1H, d, J = 16.1Hz)和6.42 (1H, d, J = 16.1 Hz)，3个甲基信号δ H 1.39 (3H, s)，1.18 (3H, s)和1.14(3H, s)；13C NMR谱中给出1个四取代苯环 (δ C165.5, 163.9, 159.1, 106.0, 100.0,94.6)，1个1,3, 4-取代苯环(δ C155.5, 129.8, 128.4, 125.1, 123.5, 116.4)，1个α, β不饱和酮(δ C181.6, 154.4, 124.0)，以上信息正好符合异黄酮15个碳的骨架，此外，13CNMR谱中还给出2个烯碳信号(δ C137.0, 121.9)，2个亚甲基碳信号(δ C38.6和26.5),3个连氧碳信号δ C86.5, 83.9和71.4,以及3个甲基信号δ C27.7, 26.5和26.2。结合以上信息可以推测该化合物为C-3'号位被取代的异黄酮类化合物。反式双键的连接方式是通过HMBC确定的，在HMBC谱中δ H 6.94 (1H, J = 16.1 Hz)和6.42 (1H, d, J = 16.1 Hz)都与δ C125.1(C-3')相关，说明双键连接在C-3'位，甲基δ H1.39 (3H, s)与δ C137.0 (C-2'')和38.6 (C-4'')相关，说明甲基连在C-3''位；2个甲基δ H 1.14 (3H, s), 1.18 (3H, s)都与δ C86.5(C-6'')和71.4 (C-7'')相关，说明2个甲基连为C-7''位上末端甲基；在1H-1H COSY谱中，δ H1.91(2H, m)分别与δ H 3.88 (1H, t, J = 6.9 Hz)和2.02, 1.80 (2H, m)相关，说明连氧次甲基与2个亚甲基相连。综上所述，该化合物为新的异黄酮化合物，命名为：Ficaurisoflavone H。
Figure 941281DEST_PATH_IMAGE001
Ficaurisoflavone B的结构式
Figure 672476DEST_PATH_IMAGE002
Ficaurisoflavone B的HMBC相关
表1 Ficaurisoflavone B的核磁共振数据(400/100 MHz, acetone-d 6)
Figure DEST_PATH_IMAGE004AAAA
（试验例、体外抗肿瘤活性评价）
试验方法：取实施例分离得到的异黄酮类化合物进行抗肿瘤活性研究。
肿瘤细胞株：宫颈癌Hela细胞、乳腺癌MCF-7细胞、肺腺癌A549细胞（河北大学药学院提供）。
阳性对照：阿霉素。
仪器：冰箱，灭菌锅，酶标仪（BioTek ELx800），显微镜，冷冻干燥机，CO2恒温培箱，96孔板，移液器，电热恒温鼓风干燥箱，微滤器及0.22μm滤膜，高速离心机。
试剂：RPMI1640培养液，胰酶，MTT，DMSO，优级新生牛血清。
具体实验方法：
(1)接种细胞：用含10%胎牛血清的培养液（DMEM）配成单个细胞悬液，以每孔5×104、5×105个/mL接种到96孔板，每孔体积100μL，贴壁细胞提前12小时接种培养。
(2)加入待测化合物溶液（固定浓度40μg/mL初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50%附近的化合物设5个浓度进入梯度复筛，即检测浓度分别为5、1、0.2、0.04、0.008μg/mL，用培养液将待测样品稀释）100μL，每孔终体积100μL，每种处理均设3个复孔。
(3)显色：37摄氏度培养48小时后，每孔加MTT溶液20μL。继续孵育4小时，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加150μL的DMSO溶液，使结晶物充分融解。
(4)比色：选择490nm波长，酶标仪（BioTek ELx800）读取各孔光吸收值，记录结果。计算化合物的IC50值。
数据分析：
以细胞抑制率作纵坐标，浓度的对数值为横坐标，作回归曲线，计算IC50值。其中，抑制率=（加PBS对照组的OD值-试验组的OD值）/加PBS对照组的OD值×100%。
化合物抗肿瘤活性测试结果如下：
表2 异黄酮类化合物抑制肿瘤细胞增殖结果
Figure DEST_PATH_IMAGE006AA
阿霉素a为阳性对照。
结果表明异黄酮类化合物均具有较好的抑制三种肿瘤细胞增殖作用。

Claims (6)

1.一种异黄酮类化合物，其结构如式（Ⅰ）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）。
2.权利要求1所述的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
①将大果榕组织自然阴干、粉碎后用醇溶液提取浓缩后得到浸膏，浸膏加蒸馏水悬浮后用石油醚、乙酸乙酯萃取得到石油醚、乙酸乙酯部位；
②将步骤①得到的乙酸乙酯部位经硅胶柱层析得到7个组分A-G，组分C再经石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱，合并相似馏分得到5个组分Fr1-5；
③将步骤②得到的Fr3经高效液相分离得到异黄酮类化合物。
3.根据权利要求2所述的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于：上述步骤中①中所述的大果榕组织为大果榕根、茎、叶或果，醇溶液为体积分数为75%-95%的乙醇溶液，所述的蒸馏水与浸膏体积比为1:1。
4.根据权利要求2所述的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于：上述步骤中②中柱层析洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯体积比为100:0-0:100。
5.根据权利要求2所述的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于：上述步骤③中所述高效液相溶剂体系为55%甲醇-45%水。
6.权利要求1所述的异黄酮类化合物在制备抑制肿瘤细胞的药物上的应用，所述肿瘤细胞为宫颈癌Hela细胞、乳腺癌MCF-7细胞或者肺腺癌A549细胞。
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