TW201815821A - 抗茲卡病毒抗體及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供結合至ZIKV醣蛋白之單株抗體或其抗原結合片段、包含該等抗體之醫藥組成物、及使用方法。本發明之該等抗體可用於抑制或中和ZIKV活性,因此提供一種治療或預防人類之ZIKV感染之方式。在一些實施例中,本發明提供用於防止病毒附著及/或進入至宿主細胞的一或多種結合至ZIKV之抗體之用途。本發明之該等抗體可預防性或治療性地使用,且可單獨或與一或多種其他抗病毒藥劑或疫苗組合使用。
Description
本發明係關於結合至茲卡(Zika)病毒套膜醣蛋白之抗體、包含這些抗體之醫藥組成物、及其使用方法。
茲卡病毒(ZIKV)是一種黃病毒科家族黃病毒屬中之正股RNA節足動物攜帶性病毒(蟲媒病毒)(Gubler,DJ,等人,在Knipe,DM,等人編,Fields Virology,第5版,Philadelphia,PA:Lippincott Williams & Wilkins Publishers,2007:1155-227中)。其被認為主要由蚊子(埃及斑蚊)傳播給人類。除了由蚊子傳播之外,ZIKV可經由性(Foy,BD,等人,(2011),Emerg.Infect.Dis.17:880-882)及垂直(Mlakar,J.等人,(2016),N.Engl.J.Med.374:951-958)傳播,或經由血液製品或組織樣品傳播。ZIKV通常導致輕度疾病,其中大部分有症狀的個體有皮疹及輕度發熱不適。然而,當孕婦感染ZIKV時,胎兒小頭畸形發育(Schuler-Faccini,L.等人,(2016),MMWR Morb.Mortal.Wkly Rep.65:59-62)或其他發育異常(Brasil等人,(2016)N.Engl.J.Med.,3月4日)之風險增加。亦已有報導,ZIKV在感染該病毒之患者中與格巴二氏(Guillain-Barré)症候群相關聯(Cao-Lormeau,VM,等人,(2016),Lancet,4月9日;387(10027):1531-9)。此外,亦已有ZIKV與腦缺血、脊髓炎、及腦膜腦炎之關聯之報導(Carteaux,G.等人(2016),N.Engl.J.Med.374(16):1595)。
ZIKV之趨性及發病機制在很大程度上是未知的。一般而言,黃 病毒係含有與殼蛋白之多個複本複合的約11,000個鹼基之單股RNA基因體之有套膜病毒,其由二十面體殼包圍,該二十面體殼由套膜醣蛋白(E)(約500個胺基酸)及膜蛋白(M)(約75個胺基酸)或前驅膜蛋白(prM)(約165個胺基酸)之各180個複本組成,所有複本均固定在脂質膜中。基因體亦編碼七種涉及複製及組裝的非結構蛋白(Sirohi,D.等人,(2016),Science,352:467-470)。
在其生命週期期間,黃病毒病毒粒子以不成熟(非感染性)狀態及成熟(感染性)狀態存在(Lindenbach,BD,於Fields Virology,Knipe,DM及Howley,PM編,Philadelphia,PA:Lippincott Williams & Wilkins Publishers,第6版,第1卷,2013,第25章,第712-746頁中)。
ZIKV套膜醣蛋白(E)可為保護性抗體之標靶,但至今臨床測試中無特異於ZIKV套膜醣蛋白之抗體。因此,此項技術中仍需要鑑別可用於預防或治療ZIKV感染的新抗體。
本發明提供結合ZIKV E之抗體及其抗原結合片段。本發明之抗體可用於抑制或中和ZIKV之活性。在一些實施例中,該等抗體可用於阻斷ZIKV附著至宿主細胞、或用於防止病毒融合至宿主細胞膜。如此一來,本發明之抗體阻斷病毒進入至宿主細胞。在某些實施例中,該等抗體可用於預防、治療、或改善個體之ZIKV感染之至少一種症狀。在某些實施例中,本發明之抗體可中和病毒,且如此一來,可防止妊娠女性之病毒傳播至其胎兒,因此預防該妊娠女性之胎兒之畸形小頭(或其他發育異常)。在某些實施例中,該等抗體可預防性或治療性地投與至患有ZIKV感染、或處於獲得ZIKV感染之風險、或處於傳播ZIKV感染之風險的個體。在某些實施例中,含有至少一種本發明之抗體之組成物可投與至疫苗係禁忌的或疫苗不太有 效的個體,例如,老年患者、非常年輕的患者、妊娠女性患者、對疫苗之任何一或多種組分過敏的患者、或可對疫苗之免疫原無反應的免疫受損的患者。在某些實施例中,含有至少一種本發明之抗體之組成物可投與至妊娠女性、醫務人員、住院患者或護理之家居住者、到已知ZIKV爆發的國家旅行或到已知具有攜帶ZIKV之蚊子的國家旅行的個體、或在ZIKV爆發期間的其他高風險患者。在某些實施例中,含有至少一種本發明之抗體之組成物可作為第一線治療投與至已經曝露於ZIKV的患者。
本發明之抗體可係全長的(例如,IgG1或IgG4抗體)或可僅包含抗原結合部分(例如,Fab、F(ab')2、或scFv片段),且可經修飾以影響功能性,例如,增加在宿主中的持續性或消除殘餘效應物功能(Reddy等人,2000,J.Immunol.164:1925-1933)。在某些實施例中,抗體可係雙特異性的。
在第一態樣中,本發明提供單離重組單株抗體或其抗原結合片段,其特異性結合至ZIKV套膜醣蛋白(E)。
在一個實施例中,本發明提供一種單離重組抗體或其抗原結合片段,其特異性結合至ZIKV及/或ZIKV E,其中該抗體或其抗原結合片段以小於或等於10-9M之IC50體外中和ZIKV,且其中該抗體或其抗原結合片段在ZIKV感染動物中顯示體內保護作用。
在一個實施例中,本發明提供一種單離重組抗體或其抗原結合片段,其特異性結合至ZIKV及/或ZIKV E,其中該抗體具有以下特性之一或多者:(a)係完全人類單株抗體;(b)以在約80pM至約150nM之範圍內的EC50結合至表現茲卡prM/E之VLP;(c)以小於10-7M之解離常數(KD)結合至ZIKV E,如在表面電漿子共振檢定 中所測量;或(d)可或可不顯示在pH 5或pH 6下相對於pH 7.4之解離半衰期(t½)之變化。
本發明之例示性抗ZIKV E抗體列舉於本文中之表1及2中。表1闡明例示性抗ZIKV E抗體之重鏈可變區(HCVR)、輕鏈可變區(LCVR)、重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2及HCDR3)、及輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2及LCDR3)之胺基酸序列識別碼。表2闡明例示性抗ZIKV E抗體之HCVRs、LCVRs、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3之核酸序列識別碼。
本發明提供包含一HCVR之抗體或其抗原結合片段,該HCVR包含選自表1中所列舉之HCVR胺基酸序列之任一者的胺基酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供包含一LCVR之抗體或其抗原結合片段,該LCVR包含選自表1中所列舉之LCVR胺基酸序列之任一者的胺基酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供包含HCVR及LCVR胺基酸序列對(HCVR/LCVR)之抗體或其抗原結合片段,該胺基酸序列對包含與表1中所列舉之LCVR胺基酸序列配對之任一者的表1中所列舉之HCVR胺基酸序列之任一者。根據某些實施例,本發明提供包含HCVR/LCVR胺基酸序列對之抗體或其抗原結合片段,該HCVR/LCVR胺基酸序列對含在表1中所列舉之例示性抗ZIKV E抗體之任一者內。
在一個實施例中,單離抗ZIKV單株抗體或抗原結合片段包含:三個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2及HCDR3),其含在選自由下列所 組成之群的重鏈可變區(HCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322及338;及三個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2、及LCDR3),其含在由下列所組成之群的輕鏈可變區(LCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330及346。
在一個實施例中,單離抗ZIKV單株抗體或其抗原結合片段包含具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列的HCVR:SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322及338。
在一個實施例中,單離抗ZIKV單株抗體或其抗原結合片段包含具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列的LCVR:SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330及346。
在一個實施例中,單離抗體或抗原結合片段包含選自由下列所組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對:SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330及338/346。
在某些實施例中,HCVR/LCVR胺基酸序列對係選自由SEQ ID NO:66/74(H4H25598P)、SEQ ID NO:114/122(H4H25619P)、及SEQ ID NO:258/266(H4H25703N)所組成之群。在一個實施例中,HCVR/LCVR胺基酸序列對係選自由SEQ ID NO:114/122(H4H25619P)及SEQ ID NO:258/266(H4H25703N)所組成之群。
在一個實施例中,單離抗體或抗原結合片段包含:(a)HCDR1域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324及340;(b)HCDR2域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326及342;(c)HCDR3域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328及344;(d)LCDR1域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332及348;(e)LCDR2域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334及350;(f)LCDR3域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336及352。
在一個實施例中,單離抗體或其抗原結合片段包含:HCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:68;HCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:70;HCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:72;LCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:76;LCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:78;及LCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:80。
在一個實施例中,單離抗體或其抗原結合片段包含:HCDR1胺 基酸序列SEQ ID NO:116;HCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:118;HCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:120;LCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:124;LCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:126;及LCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:128。
在一個實施例中,單離抗體或其抗原結合片段包含:HCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:260;HCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:262;HCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:264;LCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:268;LCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:270;及LCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:272。
本發明亦提供包含一重鏈CDR1(HCDR1)之抗體或其抗原結合片段,該HCDR1包含選自表1中所列舉之HCDR1胺基酸序列之任一者的胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供包含一重鏈CDR2(HCDR2)之抗體或其抗原結合片段,該HCDR2包含選自表1中所列舉之HCDR2胺基酸序列之任一者的胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供包含一重鏈CDR3(HCDR3)之抗體或其抗原結合片段,該HCDR3包含選自表1中所列舉之HCDR3胺基酸序列之任一者的胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供包含一輕鏈CDR1(LCDR1)之抗體或其抗原結合片段,該LCDR1包含選自表1中所列舉之LCDR1胺基酸序列之任一者的胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供包含一輕鏈CDR2(LCDR2)之抗體或其抗原結合 片段,該LCDR2包含選自表1中所列舉之LCDR2胺基酸序列之任一者的胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供包含一輕鏈CDR3(LCDR3)之抗體或其抗原結合片段,該LCDR3包含選自表1中所列舉之LCDR3胺基酸序列之任一者的胺基酸序列,或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供包含HCDR3及LCDR3胺基酸序列對(HCDR3/LCDR3)之抗體或其抗原結合片段,該胺基酸序列對包含與表1中所列舉之LCDR3胺基酸序列配對之任一者的表1中所列舉之HCDR3胺基酸序列之任一者。根據某些實施例,本發明提供包含HCDR3/LCDR3胺基酸序列對之抗體或其抗原結合片段,該HCDR3/LCDR3胺基酸序列對含在表1中所列舉之例示性抗ZIKV E抗體之任一者內。在某些實施例中,HCDR3/LCDR3胺基酸序列對係SEQ ID NO:72/80(例如,H4H25598P)及264/272(例如,H4H25703N)。
本發明亦提供包含六個CDR之組(即,HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)之抗體或其抗原結合片段,該六個CDR之組含在表1中所列舉之例示性抗ZIKV E抗體之任一者內。在某些實施例中,該HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組係選自由以下所組成之群:SEQ ID NO:68-70-72-76-78-80(例如,H4H25598P);SEQ ID NO:116、118、120、124、126、及128(H4H25619P);及SEQ ID NO:260-262-264-268-270-272(例如,H4H25703N)。
在一相關實施例中,本發明提供包含六個CDR之組(即,HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)抗體或其抗原結合片段, 該六個CDR之組含在如表1中所列舉之例示性抗ZIKV E抗體之任一者所定義之HCVR/LCVR胺基酸序列對內。例如,本發明包括包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組之抗體或其抗原結合片段,該胺基酸序列組含在選自由以下所組成之HCVR/LCVR胺基酸序列對:SEQ ID NO:66/74(例如,H4H25598P)、SEQ ID NO:114/122(例如H4H25619P)、及258/266(例如,H4H25703N)。用於識別HCVR及LCVR胺基酸序列內之CDR的方法及技術係此項技術中熟知的,且可用於鑑別本文中所揭示之指定HCVR及/或LCVR胺基酸序列內之CDR。可用於鑑別CDR之邊界的例示性慣例包括例如Kabat定義、Chothia定義、及AbM定義。一般而言,Kabat定義係基於序列可變性,Chothia定義係基於結構環區之位置,且AbM定義係Kabat與Chothia方法之間的折衷。參見,例如,Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991);Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.273:927-948(1997);及Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)。公共資料庫亦可用於鑑別抗體內之CDR序列。
在一個實施例中,本發明提供一種抗ZIKV抗體,其特異性結合至ZIKV且具有重鏈(HC)胺基酸序列SEQ ID NO:367及輕鏈(LC)胺基酸序列SEQ ID NO:368。
在一個實施例中,本發明提供一種抗ZIKV抗體,其特異性結合至ZIKV且具有重鏈(HC)胺基酸序列SEQ ID NO:370及輕鏈(LC)胺基酸序列SEQ ID NO:371。
在一個實施例中,本發明提供一種抗ZIKV抗體,其特異性結合至ZIKV且具有重鏈(HC)胺基酸序列SEQ ID NO:373及輕鏈(LC)胺基酸序列SEQ ID NO:374。
在一個實施例中,本發明提供一種抗ZIKV抗體,其特異性結合至ZIKV且具有重鏈(HC)胺基酸序列SEQ ID NO:369及輕鏈(LC)胺基酸序列SEQ ID NO:368。
在一個實施例中,本發明提供一種抗ZIKV抗體,其特異性結合至ZIKV且具有重鏈(HC)胺基酸序列SEQ ID NO:372及輕鏈(LC)胺基酸序列SEQ ID NO:371。
在一個實施例中,本發明提供一種抗ZIKV抗體,其特異性結合至ZIKV且具有重鏈(HC)胺基酸序列SEQ ID NO:375及輕鏈(LC)胺基酸序列SEQ ID NO:374。
在一個實施例中,本發明之抗體能夠中和選自由以下所組成之群的ZIKV株:MR766(烏干達1947)、PRVABC59(波多黎各2015)、及FLR(哥倫比亞2015)株。
在本發明之一個態樣中,本發明提供中和ZIKV之人類抗體、抗體變異體、或其抗原結合片段,其中該抗體、抗體變異體、或抗原結合片段不促成、導致、或誘導抗體依賴性增強(ADE)。在一個實施例中,該抗體或其抗原結合片段不促成、導致、或誘導ZIKV感染之抗體依賴性增強(ADE)、或黃病毒家族中之一或多種其他病毒(例如登革熱病毒)感染。
在一個實施例中,本發明提供一種抗體,該抗體中和具有野生型E蛋白之ZIKV(參見例如SEQ ID NO:376),但不中和具有E蛋白質突變形式之ZIKV,其中該突變係在SEQ ID NO:376之位置302絲胺酸突變成苯丙胺酸(S302F)、在SEQ ID NO:376之位置311蘇胺酸突變成異白胺酸(T311I)、或在SEQ ID NO:376之位置369離胺酸突變成麩胺酸(K369E)。
在一個實施例中,本發明提供中和ZIKV之人類抗體、抗體變異體、或其抗原結合片段,其中該抗體、抗體變異體、或抗原結合片段包 含一或多個在Fc區中之突變,其中該一或多個突變減小該抗體對細胞上Fc受體之結合。
在一個實施例中,本發明提供中和ZIKV之人類抗體、抗體變異體、或其抗原結合片段,其中該抗體、抗體變異體、或抗原結合片段包含一或多個在Fc區中之突變,其中該一或多個突變導致更長時間的抗體之血清半衰期。在一個實施例中,該突變由在SEQ ID NO:357之位置131、133及135之YTE修飾(M131Y、S133T及T135E)組成。這些變化顯示在SEQ ID NO:358中之這些位置。
在一個實施例中,本發明提供中和ZIKV之人類抗體、抗體變異體、或其抗原結合片段,其中該抗體、抗體變異體、或抗原結合片段包含至少一個在Fc區中之導致抗體對細胞上之Fc受體之結合減小的突變及至少一個導致抗體之血清半衰期增加的突變。
本發明包括包含Fc域之抗ZIKV抗體,其中該Fc域包含如本文其他地方所述之IgG1或IgG4同型。
在某些實施例中,本發明之抗ZIKV抗體包含一種Fc域,其具有選自由以下SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列:356(IgG1)、357(不具有YTE突變之IgG4)、358(具有YTE突變之IgG4)、365(不具有YTE突變之IgG4)及366(具有YTE突變之IgG4)。
在一個實施例中,本發明之抗ZIKV抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:357之Fc域。
在一個實施例中,本發明之抗ZIKV抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:358之Fc域。
在一個實施例中,本發明之抗ZIKV抗體包含HCVR/LVCR胺基酸序列對SEQ ID NO:258/266及具有胺基酸序列SEQ ID NO:357或358 之Fc域。
在一個實施例中,本發明之抗ZIKV抗體包含HCVR/LVCR胺基酸序列對SEQ ID NO:114/122及具有胺基酸序列SEQ ID NO:357或358之Fc域。
在一個實施例中,本發明之抗ZIKV抗體包含HCVR/LVCR胺基酸序列對SEQ ID NO:114/122及具有胺基酸序列SEQ ID NO:357之Fc域。
在一個實施例中,本發明之抗ZIKV抗體包含HCVR/LVCR胺基酸序列對SEQ ID NO:66/74及具有胺基酸序列SEQ ID NO:357或358之Fc域。
在一個實施例中,本發明之抗ZIKV抗體包含HCVR/LVCR胺基酸序列對SEQ ID NO:66/74及具有胺基酸序列SEQ ID NO:357之Fc域。
本發明包括具有經修飾之醣化模式之抗ZIKV抗體。在一些實施例中,移除不合需要的醣化位點之修飾可用於(或抗體缺乏存在於寡醣鏈上之海藻糖部分)例如增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)功能(參見Shield等人(2002)JBC 277:26733)。在其他應用中,可進行半乳糖化之修飾以修改補體依賴性細胞毒性(CDC)。
本發明亦提供交叉競爭結合至ZIKV,或結合與參考抗體或其抗原結合片段相同表位的抗體及其抗原結合片段,其包含HCVR之CDR及LCVR之CDR,其中該HCVR及LCVR具有選自由表1中所列舉之HCVR及LCVR序列的胺基酸序列。
本發明亦提供單離抗體及其抗原結合片段,其阻斷ZIKV附著至細胞,或防止病毒融合至細胞膜,從而防止病毒進入至宿主細胞中。
在某些實施例中,本發明之抗體或抗原結合片段係雙特異性的, 其包含對ZIKV之第一表位的第一結合特異性及對ZIKV之第二表位的第二結合特異性,其中第一及第二表位不同且不重疊。在某些實施例中,雙特異性可包含結合至病毒套膜醣蛋白中之表位的第一臂及結合至不同病毒抗原中之表位的第二臂。
在第二態樣中,本發明提供編碼抗ZIKV抗體或其部分之核酸分子。例如,本發明提供編碼表1中所列舉之HCVR胺基酸序列之任一者的核酸分子;在某些實施例中,該核酸分子包含選自表2中所列舉之HCVR核酸序列之任一者的多核苷酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供編碼表1中所列舉之LCVR胺基酸序列之任一者的核酸分子;在某些實施例中,該核酸分子包含選自表2中所列舉之LCVR核酸序列之任一者的多核苷酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供編碼表1中所列舉之HCDR1胺基酸序列之任一者的核酸分子;在某些實施例中,該核酸分子包含選自表2中所列舉之HCDR1核酸序列之任一者的多核苷酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供編碼表1中所列舉之HCDR2胺基酸序列之任一者的核酸分子;在某些實施例中,該核酸分子包含選自表2中所列舉之HCDR2核酸序列之任一者的多核苷酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供編碼表1中所列舉之HCDR3胺基酸序列之任一者的核酸分子;在某些實施例中,該核酸分子包含選自表2中所列舉之HCDR3核酸序列之任一者的多核苷酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至 少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供編碼表1中所列舉之LCDR1胺基酸序列之任一者的核酸分子;在某些實施例中,該核酸分子包含選自表2中所列舉之LCDR1核酸序列之任一者的多核苷酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供編碼表1中所列舉之LCDR2胺基酸序列之任一者的核酸分子;在某些實施例中,該核酸分子包含選自表2中所列舉之LCDR2核酸序列之任一者的多核苷酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供編碼表1中所列舉之LCDR3胺基酸序列之任一者的核酸分子;在某些實施例中,該核酸分子包含選自表2中所列舉之LCDR3核酸序列之任一者的多核苷酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。
本發明亦提供編碼HCVR之核酸分子,其中該HCVR包含三個CDR之組(即,HCDR1-HCDR2-HCDR3),其中該HCDR1-HCDR2-HCDR3胺基酸序列組係如表1中所列舉之例示性抗ZIKV E抗體之任一者所定義。
本發明亦提供編碼LCVR之核酸分子,其中該LCVR包含三個CDR之組(即,LCDR1-LCDR2-LCDR3),其中該LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組係如表1中所列舉之例示性抗ZIKV E抗體之任一者所定義。
本發明亦提供編碼HCVR及LCVR兩者之核酸分子,其中該HCVR包含表1中所列舉之HCVR胺基酸序列之任一者之胺基酸序列,且其中該LCVR包含表1中所列舉之LCVR胺基酸序列之任一者之胺基酸序列。在某些實施例中,該核酸分子包含:選自表2中所列舉之HCVR核酸序列之任一者的多核苷酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%、 或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列;及選自表2中所列舉之LCVR核酸序列之任一者的多核苷酸序列,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的其實質上類似的序列。在根據本發明之此態樣之某些實施例中,該核酸分子編碼HCVR及LCVR,其中該HCVR及LCVR兩者均源於表1中所列舉之相同抗ZIKV E抗體。
本發明提供編碼表1中所列舉之重鏈胺基酸序列之任一者的核酸分子。本發明亦提供編碼表1中所列舉之輕鏈胺基酸序列之任一者的核酸分子。
在一相關態樣中,本發明提供能夠表現包含抗ZIKV E抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區之多肽的重組表現載體。例如,本發明包括包含上文所提及之核酸分子(即,編碼如表1中所闡明之HCVR、LCVR、及/或CDR序列之任一者的核酸分子)之任一者的重組表現載體。亦包括在本發明之範疇內的是,引入此類載體之宿主細胞,以及藉由在允許產生抗體或抗體片段之條件下培養宿主細胞來產生抗體或其部分並回收如此產生之抗體或抗體片段之方法。
在一第三態樣中,本發明提供一種醫藥組成物,其包含一或多種特異性結合至ZIKV E之單離單株抗體或其抗原結合片段、及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。該一或多種單離抗體包含選自由表1中所列舉之HCVR及LCVR序列所組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對。在一個實施例中,該一或多種特異性結合至ZIKV的單離單株抗體或其抗原結合片段包含:三個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2、及HCDR3),其含在選自由下列所組成之群的重鏈可變區(HCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322及338;及三個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2、 及LCDR3),其含在由下列所組成之群的輕鏈可變區(LCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330及346。在一個實施例中,該HCVR/LCVR胺基酸序列對係選自由下列所組成之群:SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330及338/346。在一個實施例中,該HCVR/LCVR胺基酸序列對係選自由SEQ ID NO:66/74、114/122及258/266所組成之群。在一個實施例中,該HCVR/LCVR胺基酸序列對係選自由SEQ ID NO:114/122及258/266所組成之群。
在一個實施例中,該醫藥組成物包含:a)特異性結合至ZIKV之第一單離單株抗體或其抗原結合片段,其包含:具有胺基酸序列SEQ ID NO:116之HCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:118之HCDR2;具有胺基酸序列SEQ ID NO:120之HCDR3;具有胺基酸序列SEQ ID NO:124之LCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:126之LCDR2;具有胺基酸序列SEQ ID NO:128之LCDR3;b)特異性結合至ZIKV之第二單離單株抗體或其抗原結合片段,其包含:具有胺基酸序列SEQ ID NO:260之HCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:262之HCDR2;具有胺基酸序列SEQ ID NO:264之HCDR3;具有胺基酸序列SEQ ID NO:268之LCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:270之LCDR2;具有胺基酸序列SEQ ID NO:272之LCDR3;以及c)醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在一相關態樣中,本發明特徵在於一種醫藥組成物,其包含至少兩種本發明之抗體及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在一個實施例中,該醫藥組成物包含至少兩種特異性結合至ZIKV的單離單株抗體或其抗原結合片段、及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑,其中該兩種單株抗體之至少一者以小於或等於約10-9M之IC50體外中和ZIKV,且在ZIKV感染動物中顯示體內保護作用。
在一個實施例中,該至少兩種單離抗體係選自第一及第二抗ZIKV單株抗體或抗原結合片段,其包含:三個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2、及HCDR3),其含在選自由下列所組成之群的重鏈可變區(HCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322及338;及三個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2、及LCDR3),其含在由下列所組成之群的輕鏈可變區(LCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330及346。
在一個實施例中,該至少兩種單離抗體係選自第一及第二抗ZIKV單株抗體或其抗原結合片段,其中該第一抗ZIKV單株抗體或其抗原結合片段包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:116之HCDR1、具有胺基酸序列SEQ ID NO:118之HCDR2、具有胺基酸序列SEQ ID NO:120之HCDR3、具有胺基酸序列SEQ ID NO:124之LCDR1、具有胺基酸序列SEQ ID NO:126之LCDR2、及具有胺基酸序列SEQ ID NO:128之LCDR3;且其中特異性結合至ZIKV之該第二抗ZIKV單株抗體或其抗原結合片段包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:260之HCDR1、具有胺基酸序列SEQ ID NO:262之HCDR2、具有胺基酸序列SEQ ID NO:264之HCDR3、具有胺基酸序列SEQ ID NO:268之LCDR1、具有胺基酸序列SEQ ID NO:270之LCDR2、及具有胺基酸序列SEQ ID NO:272之LCDR3。
在一相關態樣中,本發明特徵在於一種組成物,其包含至少三種本發明之抗體及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在某些實施例中,本發明提供一種醫藥組成物,其包含:(a)包含如表1中所述之HCVR/LCVR胺基酸序列之第一抗ZIKV抗體、或其抗原結合片段;(b)包含如表1中所述之HCVR/LCVR胺基酸序列之第二抗ZIKV抗體、或其抗原結合片段,其中該第一抗體結合至ZIKV E上之第一表位,且該第二抗體結合至ZIKV E上之不同的第二表位,其中該第一表位及該第二表位不同且不重疊;及(c)醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在另一相關態樣中,本發明特徵在於一種組成物,其包含抗ZIKV E抗體及第二治療劑之組合。
在一個實施例中,第二治療劑係有利地與抗ZIKV E抗體組合的任何藥劑。可有利地與抗ZIKV抗體組合之例示性藥劑包括但不限於結合及/或抑制ZIKV活性之其他藥劑(包括其他抗體或其抗原結合片段,等)及/或不直接結合ZIKV但是抑制病毒活性(包括宿主細胞之感染性)及/或病毒發病機制之藥劑。
在某些實施例中,本發明提供一種醫藥組成物,其包含:(a)第一抗ZIKV抗體或其抗原結合片段;(b)第二抗ZIKV抗體或其抗原結合片段,其中該第一抗體不與第二抗體交叉競爭結合至ZIKV;及(c)醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在某些實施例中,本發明提供一種醫藥組成物,其包含:(a)第一抗ZIKV抗體或其抗原結合片段;(b)第二抗ZIKV抗體或其抗原結合片段,其與不同的ZIKV抗原相互作用,其中該第一抗體結合至ZIKV E上之表位,且該第二抗體結合至不同ZIKV抗原上之表位;及(c)醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在某些實施例中,本發明提供一種醫藥組成物,其包含:(a)第一抗ZIKV抗體或其抗原結合片段;(b)第二抗ZIKV抗體或其抗原結合片段;(c)第三抗ZIKV抗體或其抗原結合片段,其中該第一抗體結合至ZIKV E上之第一表位,且該第二抗體及/或該第三抗體結合至ZIKV E上之不同表位,其中該第一表位、該第二表位、及該第三表位不同且不重疊;及(d)醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在某些實施例中,本發明提供一種醫藥組成物,其包含:(a)第一抗ZIKV抗體或其抗原結合片段;(b)第二抗ZIKV抗體或其抗原結合片段;(c)第三抗ZIKV抗體或其抗原結合片段,其中該第一抗體可或可不就與該第二抗體及/或該第三抗體交叉競爭結合至ZIKV;及(d)醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在某些實施例中,本發明提供一種醫藥組成物,其包含:(a)第一抗ZIKV抗體或其抗原結合片段;(b)第二及/或第三抗ZIKV抗體或其抗原結合片段,其與不同的ZIKV抗原相互作用,其中該第一抗體結合至ZIKV E上之表位,且該第二及/或第三抗體結合至不同ZIKV抗原上之表位;及(c)醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在一個實施例中,該醫藥組成物包含:第一抗ZIKV抗體或其抗原結合片段,其結合至ZIKV之一個株上之一個表位或與其相互作用;及第二及/或第三抗ZIKV抗體或其抗原結合片段,其結合至ZIKV之相同株或不同株上之第二及/或第三表位或與其相互作用。
在一相關態樣中,本發明提供一種醫藥組成物,其包含:特異性結合至ZIKV E之第一單離單株抗體或其抗原結合片段,其中該第一單離單株抗體或其抗原結合片段包含HCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:68;HCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:70;HCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:72; LCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:76;LCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:78;及LCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:80;以及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。該醫藥組成物可進一步包含特異性結合至ZIKV E之第二單離單株抗體或其抗原結合片段,其中該第二單離單株抗體或其抗原結合片段包含HCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:116或260;HCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:118或262;HCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:120或264;LCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:124或268;LCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:126或270;及LCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:128或272。
在一個實施例中,該醫藥組成物包含:特異性結合至ZIKV之第一單離單株抗體或其抗原結合片段,其中該第一單離單株抗體或其抗原結合片段包含HCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:116;HCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:118;HCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:120;LCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:124;LCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:126;及LCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:128;以及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。該醫藥組成物可進一步包含特異性結合至ZIKV之第二單離單株抗體或其抗原結合片段,其中該第二單離單株抗體或其抗原結合片段包含HCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:260;HCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:262;HCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:264;LCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:268;LCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:270;及LCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:272。該醫藥組成物可進一步包含特異性結合至ZIKV E之第三單離單株抗體或其抗原結合片段,其中該第三單離單株抗體或其抗原結合片段包含來自表1中所示之抗體之任一者之HCDR1胺基酸序列、HCDR2胺基酸序列、HCDR3胺基酸序列、LCDR1胺基酸序列、LCDR2胺基酸序列、及LCDR3胺基酸序列。
在一相關態樣中,本發明提供一種抗體混合物,其包含至少兩 種特異性結合至ZIKV之抗體之混合物,其中該等抗體包含選自由下列所組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對:SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330及338/346。
在一個實施例中,該混合物包含兩種抗體之混合物,該等抗體包含HCVR/LCVR胺基酸序列對SEQ ID NO:114/122及258/266。在一個實施例中,該抗體混合物可包含第三抗體,該第三抗體包含選自表1中所示之抗體之胺基酸序列對。在一個實施例中,該第三抗體包含HCVR/LCVR胺基酸序列對SEQ ID NO:66/74。
在一個實施例中,該抗體混合物包含兩種抗體之混合物,該等抗體包含重鏈(HC)/輕鏈(LC)胺基酸序列對SEQ ID NO:367/368及370/371。在一個實施例中,該抗體混合物可包含第三抗體,該第三抗體包含HC/LC胺基酸序列對SEQ ID NO:373/374。
在某些實施例中,各抗體可調配成分開的調配物,且若判定需要多於一種抗體來達成最大治療功效,則抗體調配物之各者可視需要共投與(同時或依序)。可替代地,該抗體混合物可係共調配的。
在某些實施例中,當在一種醫藥組成物中將二或更多種抗體組合在一起時,其可或可不結合ZIKV蛋白上之相同或重疊表位。涉及本發明之抗ZIKV抗體之額外組合療法及共調配物揭示於本文其他地方。
在某些實施例中,本發明提供一種醫藥組成物,其包含二或更多種結合ZIKV E之人類抗體或其抗原結合片段,其中至少一種抗體可防止病毒附著至細胞,且第二抗體可防止病毒融合至宿主細胞膜,且因此,該組成物可提供防止病毒進入至細胞中且在細胞內複製。在一相關實施例中, 包含兩種抗茲卡抗體之組成物可提供防止ZIKV進入至宿主細胞中,其中該等抗體不促成ZIKV感染之抗體依賴性增強(ADE)。
在某些實施例中,本發明之中和茲卡病毒而不促成ADE之抗ZIKV抗體包含選自由下列組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對:SEQ ID NO:258/266、114/122及66/74,其各自具有如SEQ ID NO:357中所示之Fc胺基酸序列。
在某些實施例中,本發明之中和茲卡病毒而不促成ADE之抗ZIKV抗體包含HC/LC胺基酸序列對:SEQ ID NO:367/368(H4H25703N)及SEQ ID NO:370/371(H4H25619P)。
在某些實施例中,本發明之中和茲卡病毒而不促成ADE且可具有延長之血清半衰期之抗ZIKV抗體包含選自由下列組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對:SEQ ID NO:258/266、114/122及66/74,其各自具有如SEQ ID NO:358(具有本文中其他地方所述之YTE突變之IgG4)中所示之Fc胺基酸序列。
在某些實施例中,本發明之中和茲卡病毒而不促成ADE且可具有延長之血清半衰期之抗ZIKV抗體包含以下HC/LC胺基酸序列對:SEQ ID NO:369/368(具有本文中其他地方所述之YTE突變之H4H25703N)、SEQ ID NO:372/371(具有本文中其他地方所述之YTE突變之H4H25619P)、及SEQ ID NO:375/373(具有本文中其他地方所述之YTE突變之H4H25598P)。
在一第四態樣中,本發明提供用於使用本發明之抗ZIKV E抗體或抗體之抗原結合部分、或至少二或更多種本發明之抗體之混合物來治療與ZIKV相關聯之疾病或病症(諸如個體之病毒感染)、或至少一種與病毒感染相關聯之症狀、或降低至少一種與ZIKV感染相關聯之症狀之頻率或嚴重 性之治療方法,其中該等治療方法包含向有需要之個體投與治療有效量的一或多種本發明之抗體或抗原結合片段。在一個實施例中,該等方法包含投與至少兩種或至少三種本發明之抗體之組合(混合物(cocktail))。在一個實施例中,該抗體混合物包含兩種抗ZIKV E抗體,其具有如SEQ ID NO:114/122及258/266中所闡明之胺基酸序列對。所治療之病症係藉由抑制ZIKV活性而改良、改善、抑制或預防的任何疾病或病狀。在某些實施例中,本發明提供預防、至少或改善ZIKV感染之至少一種症狀之方法,該方法包含向有需要之個體投與治療有效量的至少一或多種本發明之抗ZIKV E抗體或其抗原結合片段。
在一相關態樣中,本發明提供一種中和感染性ZIKV之方法,該方法包含將感染ZIKV之細胞曝露於包含一或多種抗ZIKV抗體或其抗原結合片段之組成物,其中該曝露導致對防止該細胞感染病毒、或防止細胞死亡之保護增強。在某些實施例中,曝露可係體外或體內。在一個實施例中,該一或多種抗ZIKV抗體或其抗原結合片段中和具有野生型E蛋白之感染性ZIKV,其中該野生型E蛋白具有在SEQ ID NO:376之位置302處的絲胺酸、在SEQ ID NO:376之位置311處的蘇胺酸、及在SEQ ID NO:376之位置369處的離胺酸,但不中和具有該E蛋白之突變形式的感染性ZIKV,其中該E蛋白之該突變形式含有以下變化之一或多者:在SEQ ID NO:376之位置302處的苯丙胺酸、在SEQ ID NO:376之位置311處的異白胺酸、或在SEQ ID NO:376之位置369處的麩胺酸。在一個實施例中,該等方法包含投與一或多種本發明之抗體。在一個實施例中,該等方法包含投與至少兩種本發明之抗體之組合(混合物)。在一個實施例中,該抗體混合物包含兩種抗ZIKV抗體,其具有如SEQ ID NO:114/122及258/266中所闡明之胺基酸序列對。
在一些實施例中,本發明提供藉由投與一或多種本發明之抗ZIKV E抗體來改善或降低ZIKV感染之至少一種症狀之嚴重性、持續時間、或發生頻率之方法,其中該至少一種症狀係選自由以下所組成之群:發熱、頭痛、關節痛、肌痛及斑丘疹。
在某些實施例中,本發明提供減少個體之病毒負荷之方法,該等方法包含向該個體投與有效量的一或多種本發明之抗體或其片段,該一或多種抗體或其片段結合ZIKV E且阻斷附著至細胞膜、或與細胞膜融合、及/或進入至宿主細胞中,減小散佈至男性生殖器官中之可能性。
在一個實施例中,本發明提供減小ZIKV從經感染之個體傳播至另一個體之可能性。在一個實施例中,病毒從經感染之母親傳播至胎兒可使用至少一種本發明之抗體預防。在一相關實施例中,ZIKV從經感染之母親傳播至胎兒可使用至少兩種本發明之抗體預防。如此一來,以本發明之抗體之一或多者治療妊娠女性可預防嬰兒中發育畸形小頭(或發育異常)。
在某一實施例中,ZIKV傳播至性伴侶可使用至少一種本發明之抗體預防。在某一實施例中,ZIKV傳播至性伴侶可使用至少兩種本發明之抗體預防。
在一個實施例中,該有需要之個體係處於曝露於ZIKV感染或獲得ZIKV感染之風險的個體,其中該個體係選自由以下所組成之群:已曝露於ZIKV或已被懷疑帶有ZIKV的蚊子叮咬的孕婦;生活在ZIKV爆發的區域、或正在訪問ZIKV爆發的區域、及正考慮懷孕的女性;或免疫受損的個體;醫護人員;懷疑已曝露於帶有ZIKV的人的人;與感染個體身體接觸或身體緊密靠近的人;醫院員工;醫藥研究者;負責清潔治療ZIKV患者的醫院設備或設施的維護人員;已訪問或計劃訪問已知或懷疑ZIKV爆發的區 域或國家、或已知具有可帶有病毒的蚊子的國家的個體。
在一個實施例中,該有需要之個體可投與至少一種本發明之抗ZIKV抗體或其抗原結合片段、或包含至少一種本發明之抗體或其抗原結合片段以及第二治療劑之醫藥組成物。該第二治療劑可選自由以下所組成之群:抗病毒藥物、抗發炎藥物(諸如皮質類固醇及非類固醇抗發炎藥物,諸如TNF之抗體)、ZIKV之不同抗體、ZIKV疫苗及/或干擾素(α/β/或λ)。
在一個實施例中,該醫藥組成物可皮下、靜脈內、皮內、肌內、鼻內、或經口投與。
在一相關實施例中,保護增強可在曝露於或感染ZIKV之哺乳動物中當該哺乳動物以包含一或多種本發明之抗ZIKV抗體之醫藥組成物、或以包含至少兩或多種本發明之抗體之抗體混合物治療時觀察到。
在一個實施例中,所觀察到之保護增強可藉由至少一個與ZIKV感染相關聯之症狀之嚴重性或頻率降低、或藉由病毒負荷減少來測量。該至少一種症狀可選自由以下所組成之群:發熱、頭痛、關節痛、肌痛及斑丘疹。
在一個實施例中,保護增強係在經一或多種本發明之抗體治療的ZIKV感染哺乳動物中當在病毒感染之後無實質上的重量減輕時觀察到。
在一個實施例中,保護增強係在經一或多種本發明之抗體治療的ZIKV感染哺乳動物中觀察到,如藉由經一或多種抗ZIKV抗體治療之ZIKV感染哺乳動物相較於未經一或多種本發明之抗體治療之ZIKV病毒感染哺乳動物之存活增加來測量。
保護增強可當單獨使用抗體之一或多者時、或當與一或多種額外治療劑或抗ZIKV治療模態組合使用抗體之一或多者時觀察到。
該一或多種額外治療劑可選自由以下所組成之群:抗病毒藥物、抗發炎藥物(諸如皮質類固醇及非類固醇抗發炎藥物,諸如TNF之抗體)、ZIKV之不同抗體、ZIKV疫苗及/或干擾素(α/β/或λ)。
在一個實施例中,該一或多種額外治療劑包含一或多種抗ZIKV抗體。
在一個實施例中,該一或多種抗ZIKV抗體包含選自由表1之HCVR及LCVR胺基酸序列之任一者組成之群之重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列。
在一相關實施例中,該一或多種抗ZIKV抗體包含選自由下列所組成之群的重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列對:SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330及338/346。
在另一相關實施例中,該一或多種抗ZIKV抗體包含選自由SEQ ID NO:66/74及258/266組成之群之重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列對。
在某些實施例中,該一或多種抗體或其抗原結合片段可預防性或治療性地投與至患有ZIKV感染、或處於患有ZIKV感染之風險、或傾向於發展ZIKV感染的個體。有風險之個體包括但不限於:已曝露於ZIKV或已被懷疑帶有ZIKV的蚊子叮咬的妊娠女性;生活在ZIKV爆發的區域、或正在訪問ZIKV爆發的區域、及正考慮懷孕的女性;免疫受損的個體,例如,由於自體免疫疾病而免疫受損的人、或接受免疫抑制療法(例如,在器官移植之後)的那些人;接受來自感染ZIKV之人之移植物或血液樣品的人;或受人類免疫缺乏症候群(HIV)或後天性免疫不全症侯群(AIDS)、耗盡或破壞 白血球的某些形式的貧血折磨的那些人;接受輻射或化療的那些人;或受發炎性病症折磨的那些人。處於獲得ZIKV感染之風險的其他個體包括醫護人員,或與感染個體身體接觸或身體緊密靠近、或曝露於來自經感染之個體之體液或組織、亦具有增加的發展ZIKV感染之風險的任何人。此外,個體由於以下而處於感染ZIKV感染之風險:靠近疾病爆發,例如,個體居住於人口密集的城市或緊密靠近已確認或懷疑ZIKV感染之個體;或職業選擇,例如,負責清潔治療茲卡患者的醫院設備或設施的維護人員、醫院員工、醫藥研究者、已訪問或計劃訪問已知或懷疑ZIKV爆發的區域或國家、或已知具有可帶有ZIKV的蚊子的國家的個體。
在某些實施例中,本發明之抗體或其抗原結合片段係與第二治療劑組合向有需要之個體投與。第二治療劑可選自由以下所組成之群:抗發炎藥物(諸如皮質類固醇及非類固醇抗發炎藥物,例如,抗TNF抗體)、抗感染藥物、抗病毒藥物、ZIKV之不同抗體、ZIKV疫苗、或干擾素、膳食補充劑諸如抗氧化劑、及此項技術中已知可用於改善ZIKV感染之至少一種症狀或減少患者之病毒負荷的任何其他藥物或療法。在某些實施例中,第二治療劑可係有助於抵消或減少與本發明之抗體或其抗原結合片段相關聯之任何可能的負作用之藥劑,若此類負作用發生。該抗體或其片段可皮下、靜脈內、皮內、腹膜內、經口、鼻內、肌內、或顱內投與。在一個實施例中,該抗體可呈單一靜脈內輸注投與以實現個體之血清中抗體之最大濃度。該抗體或其片段可以約0.1mg/kg個體體重至約100mg/kg個體體重之劑量投與。在某些實施例中,本發明之抗體可以包含50mg至600mg之間的一或多個劑量投與。
本發明亦包括本發明之抗ZIKV抗體或其抗原結合片段,其用於治療已患有或懷疑患有ZIKV或已曝露於ZIKV之個體,或用於製造治療 可受益於阻斷ZIKV附著至細胞或與細胞膜融合的疾病或病症的藥劑。
其他實施例將根據隨後的詳細說明而變得顯而易見。
圖1.顯示用於使用與所有黃病毒交叉反應之嵌合抗體測量抗體依賴性增強(ADE)的免疫螢光檢定之結果。
圖2.顯示抗茲卡抗體H4H25703N對防止茲卡病毒感染之小鼠之重量減輕的保護作用。
圖3.顯示抗茲卡抗體H4H25619P對防止茲卡病毒感染之小鼠之重量減輕的保護作用。
圖4.顯示抗茲卡抗體H4H25703N對茲卡病毒感染之小鼠之存活的保護作用。
圖5.顯示抗茲卡抗體H4H25619P對茲卡病毒感染之小鼠之存活的保護作用。
圖6.顯示用於使用製備成IgG1或IgG4之抗茲卡病毒抗體H4H25703N測量抗體依賴性增強(ADE)之檢定之結果。
圖7.顯示用於使用製備成IgG1或IgG4之抗茲卡病毒抗體H4H25619P測量抗體依賴性增強(ADE)之檢定之結果。
圖8A及8B.顯示使用在抗體H4H25703N及H4H25619P存在下所產生之脫逸突變體之ZIKV中和。
在描述本發明方法之前,應瞭解,本發明不限於具體方法及所描述之實驗條件,因此方法及條件可變化。也應瞭解本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的,並且不意欲具有限制性,因為本發明之範疇將 僅受限於隨附申請專利範圍。
除非另外定義,否則本文所用之所有技術及科學術語皆與本發明所屬之技術中之一般技藝人士通常所理解具有相同含義。儘管與本文所述的彼等方法及材料類似或等效的任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試,但現在描述較佳方法及材料。此說明書中所提及之所有專利、申請案、及非專利出版物均以全文引用方式併入本文。
「茲卡病毒」或「ZIKV」係黃病毒科家族之人員,且與曝露於該病毒之孕婦之胎兒之畸形小頭及其他發育異常相關聯(Schuler-Faccini,L.等人,(2016),MMWR Morb.Mortal.Wkly Rep.65:59-62),且亦與成人格巴二氏症候群相關聯(Cao-Lormeau,VM,等人,(2016),Lancet,4月9日;387(10027):1531-9)。術語「ZIKV」亦包括與不同ZIKV分離物單離之ZIKV變異體。
ZIKV套膜醣蛋白(E)(本文指出為「ZIKV E」)之胺基酸序列在GenBank中所見之聚蛋白胺基酸序列內例示為登錄號ALU33341.1(亦參見SEQ ID NO:353)。該術語亦涵蓋偶聯至例如組胺酸標籤(例如參見登錄號ALU33341.1,其具有組胺酸標籤(SEQ ID NO:354及355))、小鼠或人類Fc、或信號序列之ZIKV E或其片段。ZIKV E之胺基酸序列亦顯示於SEQ ID NO:376中。H4H25703N之E蛋白脫逸突變顯示在SEQ ID NO:377之位置302(S302F)。H4H25619P之E蛋白脫逸突變顯示在SEQ ID NO:378之位置311(T311I)及位置369(K369E).
如本文所用,術語「ZIKV感染」或「ZIKV感染」係指由曝露於該病毒(例如在被帶有該病毒之蚊子叮咬之後)、或經感染之動物、或經感染之人類患者,或與患有ZIKV感染之動物或人類患者之體液或組織接觸所 導致的疾病或病狀。「與ZIKV感染相關聯之症狀」包括發熱、頭痛、關節痛、肌痛及斑丘疹。「由曝露於該病毒所導致之病狀」或「與曝露於該病毒相關聯之病狀」亦包括在被帶有該病毒之蚊子叮咬之後感染該病毒的孕婦之胎兒之畸形小頭(或發育異常)。另一「由曝露於該病毒所導致之病狀」或「與曝露於該病毒相關聯之病狀」包括格巴二氏症候群。
如本文所用,術語「抗體」意欲指代包含四條多肽鏈(藉由二硫鍵互相連接之兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈)之免疫球蛋白分子(即,「完全抗體分子」)、以及其多聚體(例如IgM)、或其抗原結合片段。各重鏈包含重鏈可變區(「HCVR」或「VH」)及重鏈恆定區(包含域CH1、CH2、及CH3)。各輕鏈包含輕鏈可變區(「LCVR」或「VL」)及輕鏈恆定區(CL)。VH區及VL區可進一步再分成稱為互補決定區(CDR)之高變區,穿插有稱為構架區(FR)之較保守區。各VH及VL包含三個CDR及四個FR,該等區依以下順序自胺基端至羧基端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明之某些實施例中,抗體(或其抗原結合片段)之FR可與人類生殖系序列一致,或可經天然或人工修飾。胺基酸共通序列可基於兩或更多個CDR之並排分析來定義。
一或多個CDR殘基之取代或一或多個CDR之省略亦係可能的。抗體已描述於科學文獻中,其中可省去一或兩個CDR以供結合。Padlan等人(1995 FASEB J.9:133-139)基於公開的晶體結構分析了抗體與其抗原之間的接觸區,且推斷僅約五分之一至三分之一的CDR殘基實際上接觸抗原。Padlan亦發現許多其中一或兩個CDR不具有與抗原接觸之胺基酸的抗體(亦參見,Vajdos等人2002 J Mol Biol 320:415-428)。
未接觸抗原之CDR殘基可基於先前研究(例如常常不需要CDR H2中之殘基H60-H65),自位於Chothia CDR外側之Kabat CDR之區,藉由 分子模型化及/或憑經驗來鑑別。若CDR或其殘基係省略的,則其通常經佔據另一人類抗體序列或此類序列之共通序列中之對應位置的胺基酸取代。亦可憑經驗選擇待取代的CDR及胺基酸內取代的位置。憑經驗取代可係保守或非保守取代。
本文中所揭示之完全人類抗ZIKV單株抗體可在重鏈可變域及輕鏈可變域之構架及/或CDR區中相較於對應的生殖系序列包含一或多個胺基酸取代、插入、及/或缺失。此類突變可易於藉由將本文中所揭示之胺基酸序列與可購自例如公共抗體序列資料庫之生殖系序列比較來確定。本發明包括源於本文中所揭示之胺基酸序列之任一者之抗體及其抗原結合片段,其中以後多個構架及/或CDR區內之一或多個胺基酸突變成該抗體所衍生之生殖系序列之對應殘基、或另一人類生殖系序列之對應殘基、或對應生殖系殘基之保守胺基酸取代(此類序列變化在本文中共同稱為「生殖系突變」)。一般熟習此項技術者以本文中所揭示之重鏈可變區及輕鏈可變區開始,可容易地產生許多包含一或多個個別生殖系突變或其組合的抗體及抗原結合片段。在某些實施例中,VH及/或VL域內之所有構架及/或CDR殘基突變回抗體所衍生之原始生殖系序列中所見之殘基。在一個實施例中,僅某些殘基突變回原始生殖系序列,例如,僅FR1之前8個胺基酸內或FR4之後8個胺基酸內所見之突變殘基,或僅CDR1、CDR2、或CDR3內所見之突變殘基。在其他實施例中,架構及/或CDR殘基之一或多者突變成不同生殖系序列之對應殘基(即,與抗體最初所衍生之生殖系序列不同的生殖系序列)。此外,本發明之抗體可含有在構架及/或CDR區內兩或更多個生殖系突變之任何組合,例如,其中某些個別殘基突變成具體生殖系序列之對應殘基,同時與原始生殖系序列不同的某些其他殘基保持或突變成不同生殖系序列之對應殘基。一旦獲得,則可容易地測試含有一或多個生殖系突 變的抗體及抗原結合片段之一或多個所要的性質,諸如,改良的結合特異性、增加的結合親和力、改良的或增強的拮抗或對抗生物性質(根據情況而定)、降低的免疫原性、等。以此一般方式獲得之抗體及抗原結合片段涵蓋在本發明內。
本發明亦包括完全人類抗ZIKV單株抗體,其包含本文所揭示之具有一或多個保守取代的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列之任一者之變異體。例如,本發明包括具有相對於本文中所揭示之HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列具有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等保守胺基酸取代之HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的抗ZIKV抗體。
如本文所用,術語「人類抗體」旨在包括具有源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類mAb可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如,藉由體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由體內體細胞突變引入之突變),例如在CDR及具體CDR3中。然而,如本文所用之術語「人類抗體」不旨在包括其中CDR序列源於已移植至人類FR序列上之另一哺乳動物物種(例如,小鼠)之生殖系之mAb。該術語包括在非人類哺乳動物中或在非人類哺乳動物之細胞中重組產生的抗體。該術語不旨在不包括單離自人類個體或在人類個體中產生的抗體。
如本文所用,術語「重組」係指本發明之藉由在此項技術中稱為重組DNA技術的技術或方法(其包括例如DNA剪切及基因轉殖表現)所產生、表現、單離、或獲得之抗體或其抗原結合片段。該術語係指在非人類哺乳動物(包括基因轉殖非人類哺乳動物,例如,基因轉殖小鼠)、或細胞(例如,CHO細胞)表現系統中表現或單離自重組組合人類抗體文庫的抗體。
術語「特異性結合」、或「特異性結合至」、或其類似者意指抗體或其抗原結合片段在生理學條件下與抗原形成相對穩定的複合物。特異性結合可由至少約1x10-7M或更少之平衡解離常數表徵(例如,較小KD表示更緊密結合)。用於判定兩個分子是否特異性結合之方法係此項技術中熟知的,且包括例如平衡透析、表面電漿子共振及其類似者。如本文中所述,已藉由表面電漿子共振例如BIACORETM鑑別出特異性結合至ZIKV之抗體。此外,儘管如此,結合ZIKV中之一個域及一或多個額外抗原之多特異性抗體或結合至ZIKV之兩個不同區之雙特異性抗體仍視為「特異性結合」之抗體,如本文所用。
術語「高親和力」抗體係指具有表現為以下KD之對ZIKV的結合親和力的那些mAb:至少10-7M;較佳10-8M;更佳10-9M;甚至更佳10-10M;甚至更佳10-11M;甚至更佳10-12M,如藉由表面電漿子共振例如BIACORETM或溶液親和力ELISA所測量。
術語「緩慢的解離速率」、「Koff」、或「kd」意指抗體以1 x 10-3s-1或更小、較佳1 x 10-4s-1或更小之速率常數自ZIKV或表現ZIKV E之類病毒粒子解離,如藉由表面電漿子共振例如BIACORETM所判定。
如本文所用,術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」及其類似者包括特異性結合抗原以形成複合物之任何天然存在的以酶促方式可獲得之合成或基因工程改造之多肽或醣蛋白。如本文所用,術語抗體之「抗原結合片段」或「抗體片段」係指抗體之保留對ZIKV結合的能力的一或多個片段。
在特定實施例中,本發明之抗體或抗體片段可結合至諸如配位體之部分或治療部分(「免疫結合物」),諸如抗病毒藥物、第二抗ZIKV抗體、或可用於治療ZIKV所引起的感染的任何其他治療部分。
如本文所用,「單離抗體」旨在指代實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體(Ab)之抗體(例如,特異性結合ZIKV之單離抗體或其片段實質上不含特異性結合非為ZIKV之抗原的Ab)。
如本文所用,「阻斷抗體」或「中和抗體」(或「中和ZIKV活性之抗體」或「拮抗抗體」)旨在指代結合至ZIKV導致ZIKV之至少一種生物活性之抑制的抗體。例如,本發明之抗體可防止或阻斷ZIKV附著至宿主細胞、與宿主細胞融合、及/或進入至宿主細胞中。此外,「中和抗體」係可中和(即,防止、抑制、減小、阻礙或干擾)病原體起始及/或維持宿主之感染的能力的抗體。術語「中和抗體」、及「中和......之抗體」、或「中和......之抗體」可在本文中互換使用。這些抗體可一經適當調配後單獨或與其他抗病毒劑組合用作預防或治療劑、或與活性疫苗關聯使用、或用作診斷工具。
「抗體依賴性增強」或「ADE」係病毒當結合至抗病毒抗體時進入具有Fc受體之細胞,引起細胞之感染性增加的機制。ADE常見於實驗室中培養之細胞中,但體內很少發生,除了感染登革熱病毒,登革熱病毒係黃病毒科家族之成員。此病毒可使用此機制感染巨噬細胞,致使正常輕度病毒感染變得危及生命。
如本文所用,術語「表面電漿子共振」係指一種光學現象,其允許藉由例如使用BIACORETM系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)來偵測生物感測器基質內之蛋白質濃度變化來分析即時生物分子相互作用。
如本文所用,術語「KD」旨在指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。
術語「表位」係指與抗體分子可變區中的稱為抗體互補位之特 異抗原結合位點相互作用之抗原決定子。單個抗原可能具有一個以上的表位。因此,不同抗體可結合於抗原上之不同區域且可具有不同生物作用。術語「表位」亦指代抗原上B細胞及/或T細胞響應之位點。其亦指抗原之由抗體結合的區。表位可定義為結構表位或功能表位。功能表位一般係結構表位之子組,且具有直接促成相互作用之親和力的那些殘基。表位亦可為構形表位,即,包含非線性胺基酸。在某些實施例中,表位可包括決定子,其係分子之化學活性表面基團,諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基、或磺醯基,且在某些實施例中,可具有特定三維結構特性及/或特定電荷特性。
如本文所用,術語「交叉競爭」意指抗體或其抗原結合片段結合至抗原且抑制或阻斷另一抗體或其抗原結合片段之結合。該術語亦包括以兩個定向的兩種抗體之間的競爭,即,第一抗體結合且阻斷第二抗體之結合,且反之亦然。在某些實施例中,第一抗體及第二抗體可結合至相同表位。可替代地,第一抗體及第二抗體可結合至不同但重疊的表位,使得一種抗體之結合例如經由位阻抑制或阻斷第二抗體之結合。抗體之間的交叉競爭可藉由此項技術中已知的方法,例如藉由即時免標定生物層干涉檢定來測量。為了判定測試抗體是否與本發明之參考抗ZIKV抗體交叉競爭,使參考抗體在飽和條件下結合至ZIKV E或肽。接著,評定測試抗體結合至ZIKV E之能力。若測試抗體能夠在與參考抗ZIKV E抗體之飽和結合之後結合至ZIKV E,可推斷該測試抗體結合至與參考抗ZIKV抗體不同的表位。換言之,若測試抗體在與參考抗ZIKV E抗體之飽和結合之後不能結合至ZIKV E,則該測試抗體可能結合至與本發明之參考抗ZIKV E抗體所結合之表位相同的表位。
當指代核酸或其片段時,術語「實質上一致性」或「實質上一致」指示,當在適當核苷酸插入或缺失之情況下與另一核酸(或其互補股) 最佳地比對時,在至少約90%、且更佳至少約95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸鹼基中有核苷酸序列一致性,如藉由任何熟知的序列一致性演算法所測量,諸如FASTA、BLAST或GAP,如下文所討論。在某些情況下,具有與參考核酸分子實質上一致性的核酸分子可編碼與參考核酸分子所編碼之多肽相同或實質上類似的胺基酸序列的多肽。
如應用於多肽,術語「實質上類似性」或「實質上類似」意指,當最佳地比對時,兩個肽序列(諸如藉由使用預設間隙權重之程式GAP或BESTFIT)共有至少90%序列一致性、甚至更佳至少95%、98%或99%序列一致性。較佳的是,不一致的殘基位置因保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係其中胺基酸殘基由具有化學性質(例如,電荷或疏水性)類似的側鏈的另一胺基酸殘基(R基)取代者。一般而言,保守胺基酸取代將不實質上改變蛋白質之功能性質。在兩或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同的情況下,類似性之百分比或程度可向上調整以針對取代之保守本質來校正。用於進行此調整之方式為熟習此項技術者所熟知。參見,例如,Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331,其以引用方式併入本文。具有化學性質類似的側鏈之胺基酸之基團之實例包括:1)脂族側鏈:甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、及異白胺酸;2)脂族-羥基側鏈:絲胺酸及蘇胺酸;3)含醯胺之側鏈:天冬醯胺及麩醯胺;4)芳族側鏈:苯丙胺酸、酪胺酸、及色胺酸;5)鹼性側鏈:離胺酸、精胺酸、及組胺酸;6)酸性側鏈:天冬胺酸鹽及麩胺酸鹽;及7)含硫側鏈:半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守胺基酸取代基係:纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸鹽-天冬胺酸鹽、及天冬醯胺-麩醯胺。可替代地,保守置換係具有Gonnet等人(1992)Science 256:1443 45中所揭示之PAM250對數可能性矩陣中之正值的任何變化,其以引用方式併入本文中。 「中等保守」置換係具有PAM250對數可能性矩陣中之非負值的任何變化。
針對多肽之序列類似性通常係使用序列分析軟體測量。蛋白質分析軟體使用歸因於各種取代、缺失及其他修飾包括保守胺基酸取代的類似性之測量來匹配類似序列。例如,GCG軟體含有諸如GAP及BESTFIT之程式,其可與預設參數一起用於判定緊密相關的多肽諸如來自不同物種有機體或在野生型蛋白質與其突變蛋白之間的同源多肽)之間的序列同源性或序列一致性。參見,例如,GCG 6.1版。多肽序列亦可使用FASTA(GCG 6.1版中之程式)以預設或建議參數比較。FASTA(例如,FASTA2及FASTA3)提供查詢序列與搜索序列之間的最佳重疊之區之比對及序列一致性百分比(Pearson(2000)同上)。當將本發明之序列與含有大量來自不同有機體之序列的資料庫比較時,另一較佳演算法係使用預設參數之電腦程式BLAST,尤其是BLASTP或TBLASTN。參見,例如,Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410及(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402,其各自以引用方式併入本文中。
片語「治療有效量」意指產生投與所要的作用的量。確切量將取決於治療目的,且將可由熟習此項技術者使用已知技術確定(參見,例如,Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。
如本文所用,術語「個體」係指需要疾病或病症諸如病毒感染之改善、預防、及/或治療之動物、較佳哺乳動物、更佳人類。該個體可患有ZIKV感染或傾向於發展ZIKV感染。「傾向於發展ZIKV感染」之個體或「可處於感染ZIKV感染之高風險」的個體係:由於自體免疫疾病而免疫系統受損的那些個體;接受免疫抑制療法(例如,在器官移植之後)的那些人;受人類免疫缺乏症候群(HIV)或後天性免疫不全症侯群(AIDS)折磨的那些 人;當居住或訪問ZIKV爆發之區域時已曝露於ZIKV或可能變得曝露於ZIKV之妊娠女性;以及居住或訪問已知ZIKV爆發的區域且考慮懷孕的女性;耗盡或破壞白血球的某些形式的貧血;接受輻射或化療的那些人;或受發炎性病症折磨的那些人。可替代地,極年輕或年老的個體之風險增加。與經感染之動物或人類患者身體接觸或身體緊密靠近、或曝露於經感染之動物或人類患者之體液或組織的人之發展ZIKV感染之風險增加。此外,個體由於以下而處於感染ZIKV感染之風險:靠近疾病爆發,例如,個體居住於人口密集的城市或緊密靠近已確認或懷疑ZIKV感染之個體;或職業選擇,例如,醫院員工、醫藥研究者、已訪問或計劃訪問已知或懷疑ZIKV爆發的區域或國家的個體。在感染ZIKV感染之個體中亦有嚴重結果之風險增加。當孕婦感染ZIKV時,寶寶出生時患有畸形小頭或其他發育異常的風險增加。因此,若女性懷孕、或考慮懷孕,且其居住於ZIKV爆發的區域、或訪問ZIKV爆發的區域、或處於已知具有帶有ZIKV之蚊子的區域中,則其處於感染ZIKV感染之風險。在個體曝露於ZIKV之後,發展格巴二氏症候群之風險增加。
如本文所用,術語「治療(treat、treating、或treatment)」係指由於向有需要之個體投與治療劑諸如本發明之抗體而減輕或改善ZIKV感染之至少一種症狀或適應症之嚴重性。該等術語包括抑制疾病之進展或感染之惡化。該等術語亦包括疾病之正性預後,即,該個體一經投與治療劑諸如本發明之抗體之後不受感染、或其病毒效價減小或無病毒效價。治療劑可以治療劑量向個體投與。
術語「預防(prevent、preventing、或prevention)」係指一經投與本發明之抗體之後抑制ZIKV感染之表現或ZIKV感染之任何症狀或適應症。該術語包括預防感染在曝露於病毒或處於ZIKV感染之風險的個體中的蔓 延。
如本文所用,術語「抗病毒藥物」係指用於治療、預防、或改善個體之病毒感染的任何抗感染劑或療法,不管是化學部分還是生物療法。例如,在本發明中,抗病毒藥物可包括但不限於ZIKV之抗體(在一個實施例中,ZIKV之抗體可與本文中所述之抗體不同)、ZIKV疫苗、直接作用抗病毒劑、及干擾素(或其他免疫調節物)。在本發明中,待治療之感染係由ZIKV所致。
ZIKV感染一般在健康個體中係輕度疾病,但曝露於該病毒之孕婦處於分娩出患有畸形小頭或其他發育異常之風險。該病毒係黃病毒科家族之成員。
該病毒之基因體由長度大致11kb之單股正義RNA組成且編碼約10個基因。茲卡病毒粒子含有三種結構蛋白:殼蛋白(C)、膜蛋白/前膜蛋白(M/prM)、及套膜醣蛋白(E)。該病毒基因體亦編碼七種非結構蛋白。
本文所述者係特異性結合至ZIKV E且調節ZIKV與宿主細胞之相互作用的完全人類抗體及其抗原結合片段。抗ZIKV E抗體可以高親和力結合至ZIKV。在某些實施例中,本發明之抗體可防止病毒附著至細胞,或可阻斷病毒融合至宿主細胞膜。如此一來,抗體阻斷病毒進入細胞且因此抑制或中和宿主細胞之病毒感染。在一些實施例中,抗體可用於治療罹患ZIKV感染之個體、或處於獲得ZIKV感染之風險的個體(例如居住於或訪問ZIKV爆發的國家的妊娠女性)。當向有需要之個體投與時,抗體可降低個體中病毒諸如ZIKV之感染。其可用於減小個體之病毒負荷。其可單獨或作為輔助療法與此項技術中已知的其他治療部分或模態一起用於治療病毒感染。經鑑別之抗體可預防性地(在感染之前)用於保護哺乳動物免遭感染,或 可治療性地(在感染建立之後)用於改善先前所確立之感染、或改善與感染相關聯之至少一種症狀。
例示性ZIKV聚蛋白之全長胺基酸序列在GenBank中顯示為登錄號ALU33341.1且亦顯示在SEQ ID NO:353中。ZIKV E之片段可偶聯至組胺酸標籤,諸如SEQ ID NO:354或355中所示。在某些實施例中,本發明之抗體係獲自以一級免疫原諸如與prM共表現之全長ZIKV E、或以ZIKV E之重組形式或其片段、或包含prM及E之粒子免疫,接著以二級免疫原、或以ZIKV E之免疫原活性片段免疫之小鼠。在某些實施例中,抗體係獲自以編碼ZIKV prM/E之DNA免疫之小鼠。
免疫原可係ZIKV E之生物活性及/或免疫原性片段或編碼其活性片段之DNA。該片段可源於病毒E之任何區。該等肽可經修飾以包括某些殘基之添加或取代以供標記或達成結合至攜帶物分子諸如KLH之目的。例如,可將半胱胺酸添加在肽之N末端或C末端,或可添加連接子序列以製備結合至例如KLH的肽以供免疫。
本發明之某些抗ZIKV抗體能夠結合至ZIKV且中和ZIKV之活性,如藉由體外或體內檢定所判定。本發明之抗體結合至ZIKV且中和ZIKV之活性的能力、及因此該病毒附著及/或進入宿主細胞、接著病毒感染可使用熟習此項技術者已知的任何標準方法測量,包括結合檢定或活性檢定,如本文中所述。
用於測量結合活性之非限制性例示性體外檢定說明於本文中之實例3中。在實例3中,抗ZIKV E之結合係藉由對表現prM/E之細胞中所產生之類病毒粒子(VLP)之結合來判定。在實例4中,平衡解離常數係在Biacore 4000儀器中使用即時表面電漿子共振判定。中和檢定在實例5中用於判定抗茲卡病毒對ZIKV之感染性的作用。在實例6中進行交叉競爭檢定 以判定抗茲卡抗體之交叉反應性。
特異於ZIKV E之抗體可不含有額外標記或部分,或其可含有N端或C端標記或部分。在一個實施例中,該標記或部分係生物素。在結合檢定中,標記(若有的話)之位置可判定肽相對於肽所結合之表面之定向。例如,若表面塗佈有抗生物素蛋白,則含有N端生物素之肽將經定向,使得肽之C端部分將在表面之遠側。在一個實施例中,該標記可為放射性核種、螢光染料、或MRI可偵測標記。在某些實施例中,此類標記抗體可用於診斷檢定包括成像檢定中。
除非另外特定指示,否則如本文所用,術語「抗體」應理解為涵蓋包含兩條免疫球蛋白重鏈及兩條免疫球蛋白輕鏈之抗體分子(即,「完全抗體分子」)以及其抗原結合片段。如本文所用,術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」、及其類似者包括特異性結合抗原以形成複合物之任何天然存在的以酶促方式可獲得之合成或基因工程改造之多肽或醣蛋白。如本文所用,術語抗體之「抗原結合片段」或「抗體片段」係指抗體之保留對ZIKV特異性結合的能力的一或多個片段。抗體片段可包括Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR之片段、或單離CDR。在某些實施例中,術語「抗原結合片段」係指多特異性抗原結合分子之多肽片段。抗體之抗原結合片段可使用任何適合之標準技術例如源於完整抗體分子,該等標準技術諸如為蛋白分解或重組遺傳工程改造技術,其涉及操作及表現DNA編碼抗體可變域及(視情況選用之)恆定域。此類DNA係已知的及/或可易於得自例如商業來源、DNA文庫(包括例如噬菌體-抗體文庫),或可經合成。DNA可經定序且以化學方式或藉由使用分子生物學技術來操縱例如以將一或多個可變域及/或恆定域排列成合適組態,或引 入密碼子、產生半胱胺酸殘基、修飾、添加、或刪除胺基酸等。
抗原結合片段之非限制性實例包括:(i)Fab片段;(ii)F(ab')2片段;(iii)Fd片段;(iv)Fv片段;(v)單鏈Fv(scFv)分子;(vi)dAb片段;及(vii)由模擬抗體高變區(例如,單離互補決定區(CDR),諸如CDR3肽)之胺基酸殘基組成之最小識別單元、或約束FR3-CDR3-FR4肽。其他工程改造之分子,諸如特定域抗體、單域抗體、域刪除抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、二價奈米抗體、等)、小模組免疫醫藥(SMIP)、及鯊魚可變IgNAR域,亦涵蓋在表述「抗原結合片段」內,如本文所用。
抗體之抗原結合片段將通常包含至少一個可變域。可變域可具有任何大小或胺基酸組成,且一般將包含至少一個CDR,其相鄰於一或多個構架序列或與其同框。在具有與VL域締合之VH域的抗原結合片段中,VH及VL域可以任何合適排列彼此相對定位。例如,可變區可係二聚的且含有VH-VH、VH-VL、或VL-VL二聚物。可替代地,抗體之抗原結合片段可含有單體VH或VL域。
在某些實施例中,抗體之抗原結合片段可含有至少一個共價連接至至少一個恆定域之可變域。在本發明之抗體之抗原結合片段內可見之可變域及恆定域之非限制性例示性組態包括:(i)VH-CH1;(ii)VH-CH2;(iii)VH-CH3;(iv)VH-CH1-CH2;(v)VH-CH1-CH2-CH3;(vi)VH-CH2-CH3;(vii)VH-CL;(viii)VL-CH1;(ix)VL-CH2;(x)VL-CH3;(xi)VL-CH1-CH2;(xii)VL-CH1-CH2-CH3;(xiii)VL-CH2-CH3;及(xiv)VL-CL。在可變域及恆定域之任何組態中,包括上文所列舉之例示性組態之任一者,可變域及恆定域可彼此直接連接或可由完全或部分鉸鏈區或連接子區連接。鉸鏈區可由至少2個(例如,5、10、15、20、40、60、或更多個)胺基酸組成,該等胺基酸導 致單一多肽分子中相鄰可變域及/或恆定域之間的撓性或半撓性鍵聯。此外,本發明之抗體之抗原結合片段可包含上文所列舉之可變域及恆定域組態之任一者之均二聚物或雜二聚物(或其他多聚物),其彼此及/或與一或多個單體VH或VL域(例如,藉由二硫鍵)非共價締合。
與完全抗體分子一樣,抗原結合片段可係單特異性或多特異性(例如,雙特異性)。抗體之多特異性抗原結合片段將通常包含至少兩個不同的可變域,其中各可變域能夠特異性結合至分開的抗原或相同抗原上之不同表位。任何多特異性抗體格式,包括本文中所揭示之例示性雙特異性抗體格式,可適於使用此項技術中可供使用之常規技術在本發明之抗體之抗原結合片段之情況中使用。
用於在基因轉殖小鼠中產生人類抗體之方法係此項技術中已知的。任何此類方法可用於本發明之製備特異性結合至ZIKV E之人類抗體的情況中。包含以下之任一者之免疫原可用於產生ZIKV之抗體。在某些實施例中,本發明之抗體係獲自以全長ZIKV聚蛋白(參見,例如,GenBank登錄號ALU33341.1(SEQ ID NO:353))之片段免疫之小鼠,該全長ZIKV聚蛋白由prM/E或其片段組成。可替代地,ZIKV E或其片段可使用標準生物化學技術產生且經修飾並用作免疫原。在一個實施例中,免疫原係重組產生之ZIKV E或其片段。在本發明之某些實施例中,免疫原可係可商業購得之ZIKV E。在某些實施例中,可投與一或多次追加注射。在某些實施例中,追加注射可包含一或多種可商業購得之ZIKV套膜醣蛋白。在某些實施例中,免疫原可係在大腸桿菌(E.coli)中或在任何其他真核細胞或哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)中表現之重組ZIKV E。
使用VELOCIMMUNE®技術(參見,例如,US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals,VELOCIMMUNE®)或用於產生單株抗體之任何其他已知方法,起初單離出具有人類可變區及小鼠恆定區的對ZIKV E之高親和力嵌合抗體。VELOCIMMUNE®技術涉及產生具有包含可操作地連接至內源性小鼠恆定區基因座之人類重鏈可變區及輕鏈可變區之基因體的基因轉殖小鼠,使得該小鼠回應於抗原刺激產生包含人類可變區及小鼠恆定區之抗體。編碼抗體之重鏈及輕鏈之可變區之DNA經單離且可操作地連接至編碼人類重鏈恆定區及輕鏈恆定區之DNA。隨後,DNA在能夠表現完全人類抗體之細胞中表現。
一般而言,將VELOCIMMUNE®小鼠以所關注之抗原攻擊,且從表現抗體之小鼠回收淋巴細胞(諸如B細胞)。淋巴細胞可與骨髓瘤細胞株融合以製備永生融合瘤細胞株,且此類融合瘤細胞株經篩選並選擇以鑑別產生特異於所關注之抗原的抗體之融合瘤細胞株。編碼重鏈及輕鏈之可變區之DNA可經單離並連接至重鏈及輕鏈之所要的同型恆定區。此類抗體蛋白可產生於細胞諸如CHO細胞中。可替代地,編碼抗原特異性嵌合抗體或輕鏈及重鏈之可變域之DNA可直接自抗原特異性淋巴球單離。
最初,單離出具有人類可變區及小鼠恆定區之高親和力嵌合抗體。如在下文實驗部分中,抗體經表徵並選擇其所要的特性,包括親和力、選擇性、表位、等。小鼠恆定區經所要的人類恆定區置換以產生本發明之完全人類抗體,例如野生型或修飾IgG1或IgG4。儘管所選擇之恆定區可根據特定用途而變化,但是高親和力抗原結合及標靶特異性特性存在於可變區中。
本發明之抗ZIKV E及抗體片段涵蓋胺基酸序列與所描述之抗體之胺基酸序列不同,但保留與ZIKV反應之能力的蛋白質。此類變異體抗 體及抗體片段包含當相較於親本序列時胺基酸之一或多個添加、缺失、或取代,但展現基本上等效於所描述之抗體之生物活性的生物活性。同樣,本發明之編碼抗體之DNA序列涵蓋以下序列,其包含當相較於所揭示之序列時核苷酸之一或多個添加、缺失或取代,但編碼基本上生物等效於本發明之抗體或抗體片段的抗體或抗體片段。
若例如兩種抗原結合蛋白(或抗體)為當以相同莫耳劑量在類似實驗條件下以單劑量或多劑量投與時吸收速率及程度不顯示顯著差異的醫藥等效物或醫藥替代物,則其被視為生物等效的。一些抗體若其吸收程度等效但其吸收速率不等效,則可被視為等效物或醫藥替代物,且仍可被視為生物等效的,因為吸收速率之此類差異係有意的,並且在標記時反映出、對例如慢性使用時達到有效身體藥物濃度係不重要的、且針對所研究之具體藥物產品被視為醫學上不顯著的。
在一個實施例中,若兩種抗原結合蛋白之安全性、純度、或效力無臨床上有意義之差異,則其為生物等效的。
在一個實施例中,若患者可在參考產品與生物產品之間切換一或多次,如相較於無此類切換之持續療法,不良作用之風險無預期增加,包括免疫原性之臨床上顯著的變化或有效性削弱,則兩種抗原結合蛋白係生物等效的。
在一個實施例中,若兩種抗原結合蛋白均藉由常見機制或針對一或多個使用條件的作用機制起作用(在此類機制係已知的情況下),則其係生物等效的。
生物等效性可藉由體內及/或體外方法證明。生物等效性測量包括例如(a)在人類或其他哺乳動物中之體內測試,其中測量血液、血漿、血清、或其他生物流體中隨時間而變的抗體或其代謝物之濃度;(b)一種體外 測試,其與人類體內生物有效性資料相關且合理地預測人類體內生物有效性資料;(c)在人類或其他哺乳動物中之體內測試,其中測量隨時間而變的抗體(或其標靶)之適當敏銳的藥理作用;及(d)以良好控制的臨床試驗之形式,該臨床試驗確立抗體之安全性、功效、或生物有效性或生物等效性。
本發明之抗體之生物等效變異體可藉由例如進行殘基或序列之各種取代或刪除生物活性不需要的末端或內部殘基或序列來構築。例如,可將對於生物活性而言不必需的半胱胺酸殘基刪除或以其他胺基酸置換以防止不必要的或錯誤的分子內二硫橋在複性後形成。在其他情況下,生物等效抗體可包括包含胺基酸變化之抗體變異體,其修改抗體之醣化特性,例如,消除或移除醣化之突變。
根據本發明之某些實施例,可製備包含Fc域之抗ZIKV抗體,該Fc域包含削弱抗體對FcRn受體之結合的一或多個突變。
在一個實施例中,本發明包括包含嵌合重鏈恆定(CH)區之抗ZIKV抗體,其中該嵌合CH區包含源自多於一種免疫球蛋白同型之CH區之區段。例如,本發明之抗體可包含嵌合CH區,其包含源自人類IgG1、人類IgG2、或人類IgG4分子之部分或所有CH2域,以及源自人類IgG1、人類IgG2、或人類IgG4分子之部分或所有CH3域。根據某些實施例,本發明之抗體包含具有嵌合鉸鏈區之嵌合CH區。例如,嵌合鉸鏈可包含源自人類IgG1、人類IgG2、或人類IgG4鉸鏈區之「上鉸鏈」胺基酸序列(根據EU編號從位置216至位置227之胺基酸殘基),以及源自人類IgG1、人類IgG2、或人類IgG4鉸鏈區之「下鉸鏈」序列(根據EU編號從位置228至位置236之胺基酸序列)。根據某些實施例,嵌合鉸鏈區包含源自人類IgG1或人類IgG4上鉸鏈之胺基酸殘基及源自人類IgG2下鉸鏈之胺基酸殘基。在某些實 施例中,包含如本文中所述之嵌合CH區之抗體可展現修飾Fc效應物功能,而不會不利地影響抗體之治療性質或藥物動力學性質。(參見,例如美國專利第US9,359,437號,其揭示內容以全文引用反式併入本文中)。
在本發明之某些實施例中,用於本發明情況之修飾Fc域可包含IgG1 Fc,其包含如SEQ ID NO:356中所示之胺基酸序列。可替代地,用於本發明情況之修飾Fc可包含IgG4 Fc,其包含SEQ ID NO:357或SEQ ID NO:358中所示之胺基酸序列。可用於本發明情況之非限制性例示性修飾Fc域闡明於美國專利第9,359,437號及US 62/140,350中,其揭示內容以及其中所闡明之修飾Fc區之任何功能上等效的變異體以全文引用方式併入本文中。
在某些實施例中,本發明亦包括抗ZIKV E抗體,其包含具有以下突變之Fc域:M131Y、S133T及T135E(基於如SEQ ID NO:358中所編號之殘基),其中該突變提供延長的抗體之血清半衰期。
可用於本發明情況之其他修飾Fc域及Fc修飾包括如US 2014/0171623、US 8,697,396、US 2014/0134162、WO 2014/043361中所闡明之修飾,其揭示內容特此以全文引用方式併入。構築包含如本文所述之修飾Fc域之抗體或其他抗原結合融合蛋白之方法為此項技術中已知的。
抗體依賴性增強(ADE)係病毒當結合至抗病毒抗體時進入具有Fc受體之細胞,引起細胞之感染性增加的機制。已體外證明許多病毒(包括ZIKV)之ADE,但在人中ADE之唯一引人注目的資料來自登革熱病毒感染。此病毒可使用此機制感染巨噬細胞,致使正常輕度病毒感染變得危及生命。例如,大多數情況之初始登革熱病毒感染臨床上表現為登革熱發熱(DF),其為自限性發熱不適。儘管很少致命,但是DF特徵為常常嚴重的瀰漫性身 體疼痛、發熱、頭痛、皮疹、淋巴腺病、及白血球減少症。後續感染異源性登革熱病毒可引起更為嚴重至致命的疾病登革熱出血性發熱(DHF)或登革熱休克症候群(DSS)。假設造成初次感染之血清型之抗體之存在在再度感染中增強異源性血清型之感染。在此類再度感染期間,非中和性的交叉反應性抗體與登革熱病毒之不同血清型形成病毒-抗體複合物,其進入單核細胞及蘭格漢氏細胞(樹狀細胞)中,且增加感染細胞之數目。這引起細胞毒性淋巴球之活化,其可導致血漿滲漏及特徵為DHF及DSS之出血性特徵。感染之此抗體依賴性增強為已證明開發成功的針對登革熱病毒之疫苗如此困難的一個原因。儘管頻率較低,但是DHF/DSS可在初次感染之後發生,所以亦相信病毒毒性及免疫活化促成疾病之發病機制。
ZIKV感染發生於先前曝露於登革熱病毒之區域中,登革熱病毒與ZIKV密切相關。此外,進來已顯示對登革熱病毒有免疫的患者之血漿顯示實質的對ZIKV的交叉反應性。此外,使用一組與登革熱病毒套膜蛋白反應的人類血清及抗體,顯示這些抗體亦與ZIKV反應。這些抗體之某些抗體能夠結合ZIKV,但不能中和該病毒,而是體外促進ADE。
所提出之ADE發生之機制係藉由使病毒結合至含有豐富FcγR之細胞表面,但其他病毒附著因子之位準低。這在其他病毒附著因子不存在下導致細胞內化,經由正常感染途徑起始病毒感染。
在某些實施例中,本發明之抗ZIKV抗體包含效應物功能減小的修飾Fc域。如本文所用,「效應物功能減小的修飾Fc域」意指已相對於野生型天然存在之Fc域修飾、突變、截斷等,使得包含修飾Fc之分子相對於包含野生型天然存在之Fc部分版本之比較分子展現選自由細胞殺傷(例如,ADCC及/或CDC)、補體活化、吞噬作用、及助噬作用組成之群之至少一個作用之嚴重性或程度降低的免疫球蛋白之任何Fc部分。在某些實 施例中,「效應物功能減小的修飾Fc域」係對Fc受體(例如,FcγR)的結合減小或削弱的Fc域。
因此,在本發明之某些實施例中,抗ZIKV抗體包含對抗體之Fc區的修飾以允許對巨噬細胞及帶有Fc受體之其他細胞上的Fc受體的結合減小,同時維持中和病毒的能力,且如此一來起作用以防止ADE發生,同時允許經由正常病毒附著及/或融合之中和的病毒感染減少。
根據某些實施例,效應物功能減小的修飾Fc域為變異體IgG4 Fc,其包含SEQ ID NO:357(無在位置131、133、及135之YTE修飾)或SEQ ID NO:358(帶有在位置131、133、及135之YTE修飾)中所示之胺基酸序列,如上文所述。因此,具有無YTE修飾之變異體IgG4 Fc之抗體不顯示抗體依賴性增強,且不具有延長的半衰期(例如具有SEQ ID NO:367/368之HC/LC的H4H25703N),而具有帶有YTE修飾之變異體IgG4 Fc之抗體(例如具有SEQ ID NO:369/368之HC/LC的H4H25703)不顯示抗體依賴性增強,但具有延長的半衰期。因此,可進行相較於野生型IgG4 Fc導致抗體之效應物功能減小及血清半衰期更長之一或兩者的Fc修飾。
在本發明之一個態樣中,本發明包含中和ZIKV之人類抗體、抗體變異體、或其抗原結合片段,其中該抗體、抗體變異體、或抗原結合片段不促成ZIKV感染之抗體依賴性增強。在一個實施例中,本發明包含中和ZIKV之人類抗體、抗體變異體、或其抗原結合片段,其中該抗體、抗體變異體、或抗原結合片段包含Fc區中之突變,且其中該突變減小抗體對Fc受體的結合。
在本發明之另一實施例中,本發明包含一種醫藥組成物,其包含二或更多種結合ZIKV E之人類抗體或其抗原結合片段。該等抗體或抗原結合片段可放置病毒附著至細胞,或可防止病毒融合至宿主細胞膜,且因 此防止病毒進入細胞並在細胞內複製,且不促成ZIKV感染之抗體依賴性增強。
一般而言,本發明之抗體藉由結合至ZIKV套膜醣蛋白(E)來起作用。例如,本發明包括以小於10-7M之KD結合ZIKV E(例如,在25℃或在37℃)之抗體及抗體之抗原結合片段,如藉由表面電漿子共振例如使用如本文所述之檢定格式所測量。在某些實施例中,抗體或其抗原結合片段以小於約100nM、小於約50nM、小於約5nM、小於約1nM、小於約500pM、小於約250pM、小於約100pM、或小於約1pM之KD結合ZIKV E,如藉由表面電漿子共振例如使用如本文所述之檢定格式或實質上類似的檢定所測量。
本發明亦包括以大於約0.5分鐘(如藉由表面電漿子共振在25℃下所測量)或大於約0.3分鐘(如藉由表面電漿子共振在37℃下所測量)之解離半衰期(t½)結合ZIKV之抗體及其抗原結合片段,且例如使用如本文中所定義之檢定格式或實質上類似的檢定可或可不顯示在pH 5或pH 6下相對於pH 7.4的解離半衰期(t½)之變化。在某些實施例中,本發明之抗體或抗原結合片段以大於約10分鐘、大於約30分鐘、大於約60分鐘、大於約100分鐘、大於約200分鐘、大於約300分鐘、大於約400分鐘、大於約500分鐘、大於約600分鐘、大於約700分鐘、大於約800分鐘、大於約900分鐘、或大於約1000分鐘之t½結合ZIKV,如藉由表面電漿子共振、在25℃下或在37℃下、例如使用如本文所定義之檢定格式(例如,mAb捕獲或抗原捕獲格式)或實質上類似的檢定所測量。
本發明亦包括中和其宿主細胞之ZIKV感染之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,抗體以在約10-11M至10-9M之範圍內的IC50展 現針對ZIKV的中和效力。本發明之抗體亦與包括MR766(烏干達1947)、PRVABC59(波多黎各2015)、及FLR(哥倫比亞2015)之ZIKV株交叉反應。本發明之抗體亦以在約80pM至約150nM之範圍內的EC50結合至源自表現ZIKV prM/E之細胞之VLP。此外,本發明之抗體與結合ZIKV E之其他抗體交叉競爭。
在一個實施例中,本發明提供一種單離重組抗體或其抗原結合片段,其特異性結合至ZIKV及/或ZIKV E,其中該抗體具有以下特性之一或多者:(a)包含:三個重鏈互補決定區(CDR)(HCDR1、HCDR2及HCDR3),其含在選自由下列所組成之群的重鏈可變區(HCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322及338;及三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2、及LCDR3),其含在由下列所組成之群的輕鏈可變區(LCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330及346;(b)係完全人類單株抗體;(c)以約80pM至約150nM之EC50結合至表現茲卡prM/E之VLP;(d)以小於10-7M之解離常數(KD)結合至ZIKV E,如在表面電漿子共振檢定中所測量;(e)可或可不顯示在pH 5或pH 6下相對於pH 7.4之解離半衰期(t½)之變化;(f)顯示以在約10-11M至約10-9M之範圍內的IC50中和ZIKV;(g)顯示在ZIKV感染動物中之體內保護作用;(h)與參考抗體交叉競爭,其中參考抗體包含選自由表1之HCVR及LCVR胺基酸序列之任一者組成之群的重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR) 胺基酸序列。
本發明之抗體可擁有前述生物特性之一或多者、或其任何組合。下文概述本發明之抗體之某些性質。本發明之抗體之其他生物特性將根據本揭露包括本文中之工作例為一般熟習此項技術者所顯而易知。
本發明包括與ZIKV之E內所見之一或多個胺基酸相互作用的抗ZIKV抗體。抗體所結合之表位可由定位在ZIKV E內的3或更多個(例如,3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多個)胺基酸之單一鄰接序列組成(例如域中之線性表位)。可替代地,表位可由定位在ZIKV E內的複數個非鄰接胺基酸(或胺基酸序列)組成(例如構形表位)。
可使用一般熟習此項技術者已知的各種技術判定抗體是否與多肽或蛋白質內的「一或多個胺基酸反應」。例示性技術包括例如常規交叉阻斷檢定,諸如Antibodies,Harlow及Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)中所述者。其他方法包括丙胺酸掃描突變分析、肽墨點分析(Reineke(2004)Methods Mol.Biol.248:443-63)、肽裂解分析結晶學研究、及NMR分析。此外,可採用諸如表位切除、表位提取、及抗原之化學修飾的方法(Tomer(2000)Prot.Sci.9:487-496)。可用於鑑別多肽內與抗體相互作用的胺基酸的另一方法為藉由質譜法偵測之氫/氘交換。一般而言,氫/氘交換方法涉及氘標記所關注之蛋白質,接著使抗體結合至氘標記蛋白。接著,將蛋白質/抗體複合物轉移至水,且胺基酸內由抗體複合物保護之可交換質子在比非為界面之一部分的胺基酸內之可交換質子慢的速率下經歷氘-氫反向交換。因此,形成蛋白質/抗體界面之一部分的胺基酸可保留氘,且因此相較於不包括在界面中的胺基酸展現相對較高的質量。在抗體解離 之後,靶蛋白經受蛋白酶裂解及質譜法分析,從而顯露對應於抗體所相互作用之特定胺基酸的氘標記殘基。參見例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267:252-259;Engen及Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
術語「表位」係指抗原上B細胞及/或T細胞響應之位點。B細胞表位可由鄰接胺基酸或藉由蛋白質之三級折疊並列的非鄰接胺基酸形成。由鄰接胺基酸形成之表位通常在曝露於變性溶劑時保留,然而由三級折疊形成之表位通常在用變性溶劑處理時喪失。表位通常包括呈獨特空間構形之至少3個,且更通常至少5個或8-10個胺基酸。
修飾輔助剖析(Modification-Assisted Profiling,MAP)(亦稱為基於抗原結構之抗體剖析(Antigen Structure-based Antibody Profiling,ASAP))為根據各抗體對化學或酶修飾抗原表面的結合概況之類似性分類大量針對相同抗原之單株抗體(mAb)的方法(參見US 2004/0101920,其特別以全文引用方式併入本文中)。各類別可反映與另一類別所表現之表位截然不同或部分重疊的獨特表位。此技術允許快速過濾遺傳一致的抗體,使得表徵可聚焦於遺傳不同的抗體。當應用於融合瘤篩選時,MAP可促進產生具有所要特性的mAb的罕見融合瘤純系之鑑別。MAP可用於將本發明抗體分選成結合不同表位之抗體之群。
在某些實施例中,ZIKV抗體或其抗原結合片段結合ZIKV E中所例示之區之任何一或多者內的表位(以自然形式或重組產生)或其片段。
在一個實施例中,脫逸突變係使用H4H25703N及H4H25619P抗體產生。這些抗體之結果證明在SEQ ID NO:376之位置302之絲胺酸在結合至E蛋白之H4H25703N抗體中起作用,因為從絲胺酸至苯丙胺酸的變化導致抗體對突變E蛋白的結合損失,且亦導致H4H25703N抗體之病毒中 和能力損失。同樣,以使用H4H25619P抗體所產生之脫逸突變體的結果證明在SEQ ID NO:376之位置311之蘇胺酸及在SEQ ID NO:376之位置369之離胺酸在H4H25619P對E蛋白的結合中起作用,因為在SEQ ID NO:376之位置311從蘇胺酸至異白胺酸的變化及在位置369從離胺酸至麩胺酸的變化導致抗體對突變E蛋白的結合損失,且亦導致H4H25619P抗體之病毒中和能力損失。
本發明包括結合至相同表位或表位之一部分的抗ZIKV E抗體。同樣,本發明亦包括與本文中所述之特異性例示性抗體之任一者競爭結合至ZIKV E或其片段的抗ZIKV E抗體。例如,本發明包括與獲自表1及2中所述之那些抗體的一或多個抗體交叉競爭結合至ZIKV的抗ZIKV E抗體。
人們可藉由此項技術中已知的常規方法判定抗體是結合至與參考抗ZIKV E抗體相同的表位還是與參考抗ZIKV E抗體競爭結合。例如,為了判定測試抗體是否結合至與本發明之參考抗ZIKV E抗體相同的表位,使參考抗體在飽和條件下結合至ZIKV E或肽。接著,評定測試抗體結合至ZIKV E之能力。若測試抗體能夠在與參考抗ZIKV E抗體之飽和結合之後結合至ZIKV E,可推斷該測試抗體結合至與參考抗ZIKV抗體不同的表位。換言之,若測試抗體在與參考抗ZIKV E抗體之飽和結合之後不能結合至ZIKV E,則該測試抗體可能結合至與本發明之參考抗ZIKV E抗體所結合之表位相同的表位。
為了判定抗體使用與參考抗ZIKV E抗體競爭結合,以兩個定向執行上文所述之結合方法:在第一定向中,使參考抗體在飽和條件下結合至ZIKV E,接著評定測試抗體對ZIKV E的結合。在第二定向中,使測試抗體在飽和條件下結合至ZIKV E,接著評定參考抗體對ZIKV E的結合。 在兩個定向中,若僅第一(飽和)抗體能夠結合至ZIKV E,則推斷測試抗體及參考抗體競爭結合至ZIKV E。如一般熟習此項技術者將瞭解的,與參考抗體競爭結合的抗體可不必結合至與參考抗體相同的表位,但可藉由結合重疊或相鄰表位而空間上阻斷參考抗體之結合。
若兩種抗體各自競爭抑制(阻斷)另一抗體對抗原的結合,則該兩種抗體結合至相同或重疊表位。即,1、5、10、20或100倍過量的一種抗體抑制另一抗體之結合至少50%、但較佳75%、90%或甚至99%,如在競爭性結合檢定中所測量(參見例如Junghans等人,Cancer Res.1990 50:1495-1502)。可替代地,若抗原中減少或消除一種抗體之結合的基本上所有胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合,則兩種抗體具有相同表位。若減少或消除一種抗體之結合的一些胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合,則兩種抗體具有重疊表位。
隨後可進行額外常規實驗(例如,肽突變及結合分析)以確認所觀察之缺乏測試抗體之結合實際上是否歸因於結合至與參考抗體相同的表位,或空間阻斷(或另一現象)是否導致缺乏所觀察之結合。此分選之實驗可使用ELISA、RIA、表面電漿子共振、流動式細胞測量術、或此項技術中可獲得之任何其他定量或定性抗體結合檢定。
本發明涵蓋結合至治療部分的人類抗ZIKV E單株抗體(「免疫結合物」),諸如治療ZIKV感染之抗病毒藥物。如本文所用,術語「免疫結合物」係指化學或生物連接至放射性劑、細胞介素、干擾素、標靶或報導部分、酶、肽或蛋白質或治療劑的抗體。該抗體可在任何位置連接至放射性劑、細胞介素、干擾素、標靶或報導部分、酶、肽或治療劑,只要其能夠結合其標靶。免疫結合物之實例包括抗體藥物結合物及抗體毒素融合 蛋白。在一個實施例中,該藥劑可為ZIKV或ZIKV E之第二不同抗體。在某些實施例中,該抗體可結合至特異於病毒感染細胞之藥劑。可結合至抗ZIKV抗體之治療部分之類型將考慮欲治療的條件及欲達成之所要治療作用。用於形成免疫結合物之合適藥劑之實例為此項技術中已知的;參見例如,WO 05/103081。
本發明之抗體可為單特異性、雙特異性、或多特異性。多特異性抗體可特異於一種靶多肽之不同表位,或可含有特異於多於一種靶多肽的抗原結合域。參見例如,Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60-69;Kufer等人,2004,Trends Biotechnol.22:238-244。
本發明之任一多特異性抗原結合分子或其變異體可使用標準分子生物技術(例如,重組DNA及蛋白質表現技術)構築,如一般熟習此項技術者所已知。
在一些實施例中,ZIKV特異性抗體係以雙特異性格式產生(「雙特異性抗體」),其中結合至ZIKV之不同域的可變區連接在一起以在單一結合分子內賦予雙域特異性。適當設計之雙特異性抗體可經由增加特異性及結合親合力來增強總體ZIKV-蛋白抑制功效。具有對個別域(例如,N端域之區段)之特異性或可結合至一個域內之不同區的可變區在結構支架上配對,該結構支架允許各區同時結合至分開的表位、或一個域內之不同區。在雙特異性抗體之一個實例中,來自具有對一個域之特異性的結合劑之重鏈可變區(VH)與來自具有對第二域之特異性的一系列結合劑之輕鏈可變區(VL)組合以鑑別可與原始VH配對而不破壞對該VH之原始特異性的非同族VL搭配物。以此方式,單一VL區段(例如,VL1)可與兩個不同的VH域(例如,VH1及VH2)組合以產生包含兩條結合「臂」(VH1-VL1及VH2-VL1)之雙 特異性抗體。使用單一VL區段減小系統之複雜性,且從而簡化並增加用於產生雙特異性抗體之選殖、表現、及純化過程(參見,例如USSN13/022759及US2010/0331527)。
可替代地,結合多於一個域及第二標靶的抗體(諸如,但不限於,例如,第二不同的抗ZIKV抗體)可以雙特異性格式、使用本文中所述之技術或熟習此項技術者已知的其他技術製備。結合至不同區的抗體可變區可與結合至例如ZIKV上之相關位點的可變區連接在一起;以在單一結合分子內賦予雙抗原特異性。此本質之適當設計之雙特異性抗體提供雙重功能。具有對細胞外域之特異性的可變區與具有對細胞外域之外之特異性的可變區組合,且在結構支架上配對,該結構支架允許各可變區結合至分開的抗原。
可用於本發明情況之例示性雙特異性抗體格式涉及施用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域及第二Ig CH3域,其中該第一Ig CH3域及該第二Ig CH3域彼此相差至少一個胺基酸,且其中至少一個胺基酸差異相較於缺乏該胺基酸差異之雙特異性抗體減小該雙特異性抗體對蛋白質A的結合。在一個實施例中,第一Ig CH3結合蛋白質A,且第二Ig CH3域含有減小或消除蛋白質A結合之突變,諸如H95R修飾(藉由IMGT外顯子編號;H435R,藉由EU編號)。第二CH3可進一步包含Y96F修飾(藉由IMGT;Y436F,藉由EU)。在第二CH3內可見之進一步修飾包括:在IgG1抗體之情況下,D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、及V82I(藉由IMGT;D356E、L358M、N384S、K392N、V397M、及V422I,藉由EU);在IgG2抗體之情況下,N44S、K52N、及V82I(IMGT;N384S、K392N、及V422I,藉由EU);以及在IgG4抗體之情況下,Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、及V82I(藉由IMGT;Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、及V422I,藉由EU)。 本發明之範疇內涵蓋上文所述之雙特異性抗體格式之變異體。
可用於本發明情況之其他例示性雙特異性格式包括但不限於,例如,基於scFv或雙功能抗體雙特異性格式、IgG-scFv融合、雙重可變域(DVD)-Ig、四源雜交瘤(Quadroma)、孔中結(knobs-into-holes)、共同輕鏈(例如,具有孔中結之共同輕鏈等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、白胺酸拉鍊、Duobody、IgG1/IgG2、雙重作用性Fab(DAF)-IgG、及Mab2雙特異性格式(參見,例如,Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11,及其中引用的參考文獻,針對前述格式)。雙特異性抗體亦可使用肽/核酸結合構築,例如,其中使用具有正交化學反應性之非天然胺基酸產生位點特異性抗體-寡核苷酸結合物,其隨後自組裝成具有經定義之組成、化合價、及幾何形狀的多聚物複合物。(參見,例如,Kazane等人,J.Am.Chem.Soc.[Epub:2012年12月4日])。
本發明提供治療性組成物,其包含本發明之抗ZIKV E抗體或其抗原結合片段。根據本發明之治療性組成物將與合適之載劑、賦形劑、及併入調配物中以提供改良之轉移、遞送、耐受性、及其類似者的其他藥劑一起投與。眾多適當調配物可見於所有醫藥化學師已知的處方集(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA)中。這些調配物包括例如粉末、糊劑、軟膏、膠凍、蠟、油、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)之囊泡(諸如LIPOFECTINTM)、DNA結合物、無水吸收糊劑、水中油及油中水乳液、乳液卡波蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠、及含半固體混合物之卡波蠟。亦參見Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
抗體之劑量可取決於欲投與之個體之年齡與體型、目標疾病、病狀、投與途徑、及其類似者而變化。當本發明之抗體用於治療成人患者之疾病或病症、或用於預防此類疾病時,有利的是通常以約0.1至約60mg/kg體重、更佳約5至約60mg/kg體重、約10至約50mg/kg體重、或約20至約50mg/kg體重之單一劑量投與本發明之抗體。取決於病狀之嚴重性,治療之頻率及持續時間可經調整。在某些實施例中,本發明之抗體或其抗原結合片段可呈至少約0.1mg至約800mg、約1mg至約500mg、約5mg至約300mg、或約10mg至約200mg、至約100mg、或至約50mg之初始劑量投與。在某些實施例中,初始劑量可繼之以可與初始劑量之量大致相同或小於初始劑量之量投與第二劑量或複數個後續劑量的抗體或其抗原結合片段,其中該等後續劑量可相隔至少1天至3天;至少一週;至少2週;至少3週;至少4週;至少5週;至少6週;至少7週;至少8週;至少9週;至少10週;至少12週;或至少14週。
各種遞送系統係已知的,且可用於投與本發明之醫藥組成物,例如,囊封於脂質體中、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒之重組細胞、受體介導之胞吞作用(參見,例如,Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入方法包括但不限於皮內、透皮、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外、及經口途徑。該組成物可藉由任何便利途徑投與,例如藉由輸注或彈丸注射、藉由經由上皮或黏膜皮膚內襯(例如,口腔黏膜、直腸及腸黏膜、等)之吸收,且可與其他生物活性藥劑一起投與。投與可為全身性或局部。該醫藥組成物亦可於囊泡(具體而言脂質體)中遞送(參見,例如,Langer(1990)Science 249:1527-1533)。
本文中亦涵蓋使用奈米粒子遞送本發明之抗體。抗體結合之奈米粒子可用於治療性及診斷性應用。抗體結合之奈米粒子及製備與使用方 法由Arruebo,M.等人2009(「Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications」於J.Nanomat.第2009卷,文章ID 439389,第24頁,doi:10.1155/2009/439389中)詳細描述,其以引用方式併入本文中。奈米粒子可經開發且結合至含於醫藥組成物中之抗體以靶向病毒感染之細胞。用於藥物遞送之奈米粒子亦描述於例如US 8257740或US 8246995中,其各自全文併入本文中。
在某些情況下,該醫藥組成物可在控制釋放系統中遞送。在一個實施例中,可使用泵。在另一實施例中,可使用聚合材料。在又另一實施例中,控制釋放系統可靠近組成物之標靶放置,因此僅需要全身劑量之一部分。
可注射製劑可包括用於靜脈內、皮下、皮內、顱內、腹膜內、及肌內注射、點滴輸注、等的劑量形式。這些可注射製劑可藉由公眾已知的方法製備。例如,可注射製劑可例如藉由溶解、懸浮、或乳化上文所述之抗體或其鹽於習知用於注射的無菌水介質或油性介質中來製備。呈用於注射之水介質,有例如生理食鹽水、含有葡萄糖之等滲壓溶液、及其他助劑等,其可與諸如醇(例如,乙醇)、多元醇(例如,丙二醇、聚乙二醇)、非離子界面活性劑[例如,聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化篦麻油之聚氧乙烯(50mol)加合物)]、等之適當助溶劑組合使用。呈油性介質,採用例如芝麻油、大豆油、等,其可與諸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇、等之助溶劑組合使用。如此製備之注射劑較佳填充於適當安瓿中。
本發明之醫藥組成物可利用標準針及注射器皮下或靜脈內遞送。此外,就皮下遞送而言,筆式遞送裝置已應用於遞送本發明之醫藥組成物。此類筆式遞送裝置可為可再用的或拋棄式的。可再用的筆式遞送裝置一般利用含有醫藥組成物之可替換筒。一旦已投與筒內之所有醫藥組成物,且 該筒為空的,則可易於將空筒拋棄並用含有該醫藥組成物之新筒替換。隨後可再使用該筆式遞送裝置。在拋棄式筆式遞送裝置中,不存在可替換筒。實情為,拋棄式筆式遞送裝置預填充有醫藥組成物,該醫藥組成物保持在裝置內的儲器中。一旦該儲器之醫藥組成物清空,則將整個裝置拋棄。
許多可再用筆式及自我注射器遞送裝置已應用於本發明之醫藥組成物之皮下遞送中。實例包括但當然不限於AUTOPENTM(Owen Mumford,公司,Woodstock,UK)、DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly公司,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II、及III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM、以及OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany),僅舉幾例。已應用於本發明之醫藥組成物之皮下遞送之拋棄式筆式遞送裝置之實例包括但當然不限於SOLOSTARTM筆(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)、及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自我注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)、以及HUMIRATM筆(Abbott Labs,Abbott Park,IL),僅舉幾例。
有利的是,用於上文所述之經口或腸胃外用途之醫藥組成物製備成以適合於配合活性成分之劑量的單位劑量之劑量形式。此類以單位劑量之劑量形式包括例如錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑、等。所含之抗體之量一般係約5mg至約500mg每以單位劑量之劑量形式;尤其是以注射劑之形式,較佳的是其他劑量形式以約5mg至約100mg且以約10mg至約250mg含有該抗體。
本發明之抗體可用於治療及/或預防與ZIKV感染相關聯之疾病或病症或病狀,及/或用於改善至少一種與此類疾病、病症、或病狀相關聯之症狀。
在一些實施例中,本發明之抗體可用於降低病毒效價或減小宿主中之病毒負荷。在一個實施例中,本發明之抗體或其抗原結合片段可以治療劑量向患有ZIKV感染之患者投與。
本發明之一或多種抗體可經投與以緩解或預防或降低該疾病或病症之一或多種症狀或病狀之嚴重性。該等抗體可用於改善或減輕ZIKV感染之至少一種症狀之嚴重性,症狀包括但不限於發熱、頭痛、關節痛、肌痛及斑丘疹。
本文中亦涵蓋預防性地向處於發展ZIKV感染之風險的個體使用一或多種本發明之抗體,個體諸如免疫受損的個體;已被相信帶有ZIKV的蚊子叮咬的人;已曝露於ZIKV的孕婦;居住於或正訪問已知ZIKV爆發的國家以及考慮懷孕的女性;正訪問或居住於已知帶有懷疑攜帶ZIKV的蚊子的區域的個體;已訪問或計劃訪問已知或懷疑ZIKV爆發的國家的個體。
在本發明之一進一步實施例中,本發明抗體用於製備用於治療罹患ZIKV感染、或經由帶有該病毒的蚊子叮咬而曝露於ZIKV的患者之醫藥組成。在本發明之另一實施例中,本發明抗體與熟習此項技術者已知可用於治療或改善ZIKV感染的任何其他藥劑或任何其他療法一起用作輔助療法。
組合療法可包括本發明之抗ZIKV E抗體及額外治療劑,該額外治療劑可有利地與本發明之抗體或與本發明之抗體之生物活性片段組合。 本發明之抗體可與一或多種用於治療ZIKV感染之藥物或藥劑協同地組合。
例如,用於治療病毒感染之例示性藥劑可包括例如抗病毒藥物、抗發炎藥物(諸如皮質類固醇及非類固醇抗發炎藥物,諸如抗TNF)、ZIKV之不同抗體、ZIKV疫苗、干擾素、免疫調節劑、或治療ZIKV感染之任何其他姑息療法。
在一些實施例中,本發明之看題看與第二治療劑組合以減小患有ZIKV感染之患者中之病毒負荷,或改善感染之一或多種症狀、及/或向胎兒或男性生殖器官的蔓延。
在某些實施例中,第二治療劑為特異於ZIKV E之另一不同抗體或抗體混合物,其中該不同抗體或混合物內的抗體可或可不結合至與本發明抗體相同的表位或重疊的表位。在某些實施例中,第二治療劑為不同ZIKV蛋白之抗體。第二抗體可特異於來自不同病毒株之一或多種不同的ZIKV蛋白。本文中涵蓋使用具有針對ZIKV之中和或抑制活性的本發明抗體之組合(「混合物」)。在一些實施例中,非競爭抗體可經組合且向有需要之個體投與,以降低ZIKV由於突變而脫逸之能力。在一些實施例中,組成該組合之抗體結合至E上之不同的非重疊表位。組成該組合之抗體可阻斷病毒附著至細胞,及/或可抑制病毒與細胞膜融合,且如此一來,可阻斷ZIKV進入至宿主細胞中。抗體可與選自MR766(烏干達1947)、PRVABC59(波多黎各2015)、及FLR(哥倫比亞2015)株之ZIKV株的E相互作用,且當單獨或與任何一或多種上文所指出之藥劑組合使用時,可中和任何一或多種所指出之ZIKV株或其變異體。
本文中亦涵蓋使用本發明之抗ZIKV E抗體之組合,其中該組合包含一或多種不交叉競爭的抗體。在某些實施例中,該組合包括混合,其 包含至少兩種或至少三種本發明抗體之混合物。該混合物內之抗體之不同之處可為其中和病毒或病毒感染細胞的能力,或其阻斷病毒附著至細胞、或阻斷病毒融合至細胞膜的能力,或其結合ZIKV E的能力。
如本文所用,術語「與......組合」意指額外的治療活性組分可在投與至少一種本發明之抗ZIKV E抗體或包含二或更多種本發明抗體之混合物之前、同時、或之後投與。術語「與......組合」亦包括順序或伴隨投與抗ZIKV E抗體及第二治療劑。
額外治療活性組分可在投與本發明抗ZIKV E抗體之前向個體投與。例如,若第一組分在投與第二組分之前1週、72小時、60小時、48小時、36小時、24小時、12小時、6小時、5小時、4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘、15分鐘、10分鐘、5分鐘、或少於1分鐘投與,則可認為第一組分為在第二組分「之前」投與。在其他實施例中,額外治療活性組分可在投與本發明抗ZIKV E抗體之後向個體投與。例如,托第一組分在投與第二組分之後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時投與,則可認為第一組分在第二組分「之後」投與。在又其他實施例中,額外治療活性組分可在投與本發明抗ZIKV E抗體同時向個體投與。出於本發明之目的,「同時」投與包括例如以單一劑量形式向個體投與抗ZIKV E抗體及額外治療活性組分,或以分開的劑量形式在彼此約30分鐘或更少時間內向個體投與。若以分開劑量形式投與,則各劑量形式可經由相同途徑投與(例如,抗ZIKV E抗體及額外治療活性組分可靜脈內投與等);可替代地,各劑量形式可經由不同途徑投與(例如,抗ZIKV E抗體可靜脈內投與,且額外治療活性組分可經口投與)。在任何情況下,出於本揭露之目的,以單一劑量形式、藉由相同途徑以分開劑量形式、 或藉由不同途徑以分開劑量形式投與組分皆視為「同時投與」。出於本揭露之目的,在投與額外治療活性組分「之前」、「同時」、或「之後」(如同本文上文定義那些術語)投與抗ZIKV E抗體被視為與額外治療活性組分「組合」投與抗ZIKV E抗體。
本發明包括其中本發明之抗ZIKV E抗體與一或多種額外治療活性組分共調配的醫藥組成物,如本文其他地方所述。
根據某些實施例,可將單一劑量的本發明之抗ZIKV E抗體(或包含一或多種本發明抗體、或一或多種抗ZIKV E抗體及任何本發明所提及之額外治療活性藥劑之組合的醫藥組成物)向有需要之個體投與。根據本發明之某些實施例,可在定義時程內向個體投與多劑量的抗ZIKV E抗體(或包含抗ZIKV E抗體或一或多種本發明抗體及任何本文所提及之額外治療活性藥劑之組合的醫藥組成物)。根據本發明之此態樣的方法包括向個體順序地投與多劑量的一或多種本發明抗ZIKV E抗體。如本文所用,「順序地投與」意指在不同時間點,例如,在相隔預定間隔(例如,數小時、數天、數週、或數月)的不同天向個體投與各劑量的抗ZIKV E抗體。本發明包括以下方法,其包含向患者順序地投與單一初始劑量的抗ZIKV E抗體,接著一或多個二級劑量的抗ZIKV E抗體,及視情況接著一或多個三級劑量的抗ZIKV E抗體。
術語「初始劑量」、「二級劑量」、及「三級劑量」係指投與本發明抗ZIKV E抗體之時間順序。因此,「初始劑量」為在開始治療方案時投與的劑量(亦稱為「基線劑量」);「二級劑量」為在初始劑量之後投與的劑量;及「三級劑量」為在二級劑量之後投與的劑量。初始劑量、二級劑量、及三級劑量可均含有相同量的抗ZIKV E抗體,但就投與頻率而言一 般可彼此不同。然而,在某些實施例中,初始劑量、二級劑量、及/或三級劑量中所含有的抗ZIKV E抗體之量在治療之過程期間彼此不同(例如,適當時上下調整)。在某些實施例中,在開始治療方案時呈「負荷劑量」投與二或更多個(例如,2、3、4、或5個)劑量,接著投與基於較小頻率投與的後續劑量(例如,「維持劑量」)。
在本發明之某些例示性實施例中,各二級劑量及/或三級劑量係在上一劑量之後1至48小時(例如,1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½、15、15½、16、16½、17、17½、18、18½、19、19½、20、20½、21、21½、22、22½、23、23½、24、24½、25、25½、26、26½、或更長時間)投與。如本文所用,片語「上一劑量」意指在多次投與之順序中,在無介入劑量之情況下以該順序投與下一劑量之前向患者投與的抗ZIKV E抗體之劑量。
根據本發明之此態樣的方法可包含向患者投與任何數目的二級劑量及/或三級劑量的抗ZIKV E抗體。例如,在某些實施例中,僅向患者投與單一二級劑量。在其他實施例中,向患者投與二或更多個(例如,2、3、4、5、6、7、8、或更多個)二級劑量。同樣,在某些實施例中,僅向患者投與單一三級劑量。在其他實施例中,向患者投與二或更多個(例如,2、3、4、5、6、7、8、或更多個)三級劑量。
在本發明之某些實施例中,向患者投與二級劑量及/或三級劑量之頻率可在治療方案之過程內變化。取決於臨床檢查之後個別患者之需要,醫師亦可在治療過程期間調整投與頻率。
本發明之抗ZIKV E抗體可用於偵測及/或測量樣品中之ZIKV 例如以達成診斷目的。一些實施例涵蓋在檢定中使用一或多種本發明抗體偵測諸如病毒感染之疾病或病症。ZIKV之例示性診斷檢定可包含例如使樣品(獲自患者)與本發明抗ZIKV E抗體接觸,其中該抗ZIKV E抗體標記有可偵測標記或報導分子或用作捕獲配位體以從患者樣品選擇性單離ZIKV。可替代地,未標記之抗ZIKV E抗體可與本身經可偵測標記之二級抗體組合用於診斷應用中。可偵測標記或報導分子可為放射性同位素,諸如3H、14C、32P、35S、或125I;螢光或化學發光部分,諸如異硫氰酸螢光素或玫瑰紅;或酶,諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧物酶、或螢光素酶。可用於偵測或測量樣品中之ZIKV的特定例示性檢定包括酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、及螢光活化細胞分選(FACS)。
可用於根據本發明之ZIKV診斷檢定的樣品包括可在正常或病理狀況下獲自患者之任何組織或流體樣品,其含有可偵測量的ZIKV或其片段。一般而言,獲自健康患者(例如,未受與ZIKV相關聯之疾病折磨的患者)之具體樣品中ZIKV之位準將經測量以初始確立ZIKV之基線(或標準)位準。隨後可將ZIKV之基線位準與獲自懷疑患有與ZIKV相關聯之病狀或與此類病狀相關聯之症狀的個體之樣品中所測量之ZIKV位準比較。
特異於ZIKV之抗體可不含有額外標記或部分,或其可含有N端或C端標記或部分。在一個實施例中,該標記或部分係生物素。在結合檢定中,標記(若有的話)之位置可判定肽相對於肽所結合之表面之定向。例如,若表面塗佈有抗生物素蛋白,則含有N端生物素之肽將經定向,使得肽之C端部分將在表面之遠側。
提供以下實例以便向一般熟習此項技術者提供如何製備及使用本發明方法及組成物之完全揭露及描述,且以下實例不旨在限制被發明者 視為其發明之事物之範疇。已努力確保關於所用數值(例如,量、溫度、等)之準確性,但應慮及一些實驗誤差及偏差。除非另外指示,否則份數為重量份數,分子量為重量平均分子量,溫度為攝氏溫度,室溫為約25℃,且壓力為大氣壓或接近大氣壓。
在小鼠中產生ZIKV之人類抗體,其包含編碼人類免疫球蛋白重鏈可變區及κ輕鏈可變區之DNA。在一個實施例中,在VELOCIMMUNE®小鼠中產生ZIKV之人類抗體。在一個實施例中,將VelocImmune®(VI)小鼠以編碼ZIKV prM/E之DNA免疫化(亦參見GenBank登錄號ALU33341.1及SEQ ID NO:353)。根據包含相隔2週的2次免疫之加速方案產生抗體。藉由ZIKV E特異性免疫分析監測抗體免疫反應。例如,檢定血清之對產生自表現ZIKV prM/E之細胞的類病毒粒子(VLP)的特異性抗體效價。使用B細胞分選技術(BST)及融合瘤方法單離產生抗體之純系。例如,當達成所要的免疫反應時,收集脾細胞且將其與小鼠骨髓瘤細胞融合以保存其生存力並形成融合瘤細胞株。將融合瘤細胞株篩選且選擇以鑑別產生ZIKV E特異性抗體之細胞株。使用此技術及上文所述之各種免疫原,獲得若干嵌合抗體(即,擁有人類可變域及小鼠恆定域之抗體)。以此方式產生之例示性抗體指定為H2aM25703N、H2aM25704N、H2aM25708N、H2aM25709N、H2aM25710N、及H2aM25711N。
將抗ZIKV抗體直接從抗原陽性小鼠B細胞單離,而不融合至骨髓瘤細胞,如美國專利7582298中所述,其特別以全文引用方式併入本文中。使用此方法,獲得若干完全人類抗ZIKV E抗體(即,擁有人類可變域及人類恆定域之抗體);以此方式產生之例示性抗體指定為H4H25566P、H4H25587P、H4H25591P、H4H25592P、H4H25598P、H4H25602P、 H4H25617P、H4H25619P、H4H25622P、H4H25626P、H4H25630P、H4H25633P、H4H25634P、H4H25637P、H4H25640P、H4H25641P、H4H25703N、H4H25704N、H4H25708N、H4H25709N、H4H25710N、H4H25711N。
根據此實例之方法產生之例示性抗體之生物性質詳細描述於下文所闡明之實例中。
表1闡明本發明之選擇抗ZIKV抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區及CDR之胺基酸序列識別碼。對應核酸序列識別碼闡明於表2中。
抗體通常根據以下命名法在本文中提及:Fc前綴(例如「H1H」、「H4H」、「H2aM」等),接著數字識別碼(例如「25566」、「25587」、「25710」等,如表1或2中所示)、接著「P」、「P2」、「N」、「N2」、 或「B」後綴。本文中所用之抗體命名之H1H及H4H前綴指示抗體之具體Fc區同型。因此,根據此命名法,抗體可在本文中稱為例如「H4H25566P」、「H2aM25703N」、等。例如,「H4H」抗體具有人類IgG4 Fc,且「H2aM」抗體具有小鼠IgG2a Fc(所有可變區為完全人類可變區,如藉由抗體命名之第一『H』所表示)。如一般熟習此項技術者所理解,具有具體Fc同型之抗體可轉換成具有不同Fc同型之抗體(例如,具有小鼠IgG1 Fc之抗體可轉換成具有人類IgG4之抗體,等),但在任何情況下,可變域(包括CDR)(其由表1或2中所示之數字識別碼指示)將保持相同,且預期對抗原的結合性質相同或實質上類似,不論Fc域之本質。
為了研究一組抗ZIKV單株抗體結合ZIKV E之能力,開發一種體外結合檢定,其在基於電致化學發光之偵測平台(MSD)中利用由表現prM/E之細胞製備類ZIKV病毒粒子(VLP)。
VLP產生自短暫表現ZIKV prM/E聚蛋白之HEK293T/17細胞(登錄號ALU33341.1(亦顯示為SEQ ID NO:353),ZIKV聚蛋白之胺基酸123-795)。亦產生由表現水泡性口炎病毒(VSV)醣蛋白(G)之細胞製備之VLP作為陰性結合對照。人類IgG4及小鼠IgG2a抗體之陰性對照包括在實驗中,作為IgG偵測抗體之無關陰性對照。
根據以下程序進行實驗。將來自上文所述之兩種來源的VLP在PBS中稀釋,接種至96孔碳電極盤(多陣列高結合盤,MSD)中,且在4℃下培育隔夜以使VLP黏附。在室溫下將非特異性結合位點由含2% BSA(w/v)之PBS阻斷1小時。向盤結合粒子添加在1.7pM至100nM之範圍內於1X PBS+0.5% BSA中連續稀釋的抗ZIKV及對照抗體以及僅緩衝液一式兩份, 且將盤在室溫下培育1小時。隨後使用AquaMax2000盤洗滌器(MDS Analytical Technologies)將盤於1X PBS中洗滌以移除未結合抗體。在室溫下以SULFO-TAGTM結合抗人類IgG抗體(Meso Scale Development)或SULFO-TAGTM結合抗小鼠IgG抗體(Jackson Immunoresearch)偵測盤結合抗體持續1小時。洗滌之後,根據製造商所建議之程序將盤用讀取緩衝液(MSD)顯影,且用SECTOR成像器600(MSD)儀器讀取發光信號。隨抗體濃度變化分析直接結合信號(以RLU),且使用GraphPad PrismTM軟體將資料與S形(四參數邏輯)劑量-反應模型擬合。判定ZIKV prM/E VLP之EC50值(定義為偵測到50%最大結合信號時的抗體濃度)以指示各抗體之效力。此外,計算11.1nM之抗體在ZIKV prM/E VLP與無關VSV G VLP之結合信號之比率。結合比率小於2的抗體在表3中標示為NB。NB係指在檢定條件下未觀察到特異性結合。
使用免疫結合檢定評定抗ZIKV單株抗體特異性結合由表現prM/E之細胞所製備之ZIKV VLP相較於無關含VSV G之VLP的能力。使用SULFO-TAGTM結合抗人類IgG或抗小鼠IgG抗體偵測在高達100nM之抗體濃度之情況下,在96孔高結合盤(MSD)上結合至固定VLP之抗體劑量依賴性,且在Sector成像器600(MSD)上記錄以電致化學發光之形式的結合信號。判定結合至VLP之抗體之RLU值。針對ZIKV prM/E VLP,將EC50值計算為效力之量度。針對具有影響ZIKV結合概況之無關背景的抗體,較高濃度排除在EC50值之計算之外,且將值斜體表示於表中。使用11.1nM之抗體對ZIKV prM/E與無關表現VLP之結合信號之比較評估ZIKV蛋白之結合特異性。將特異性結合定義為抗體對表現ZIKV prM/E之VLP相較於在該濃度下對無關VLP具有2倍或更高比率的結合。
結合結果概述於表3中。結合至ZIKV prM/E VLP之EC50值係經報導且測試抗體之EC50值在87pM至133nM之範圍內。對於抗體H4H25640P及H4H25704N,較高濃度下的結合值排除在EC50值之計算之外,以補償無關VSV G VLP之高背景。在11.1nM濃度下對ZIKV prM/E VLP的結合相對於對VSV G VLP的結合之比率亦經報導。所有評估之測試抗體均特異性結合至ZIKV prM/E VLP。陰性同型對照抗體未特異性結合,如所預期(資料未顯示)。
斜體值具有高抗體濃度,其排除在EC50計算之外。
使用即時表面電漿子共振生物感測器、使用Biacore 4000儀器(目錄號28-9643-21)判定結合至純化抗ZIKV mAb之茲卡(prM80E)-mmH之解離速率常數。藉由胺與多株山羊抗人類Fc抗體(Jackson Laboratories,#BR-109005-098)之偶聯衍生化Biacore CM5感測器表面以捕獲與人類恆定區一起表現的抗ZIKV抗體。在pH 7.4、6.0、5.5、及5.0下,在包含0.01M Na2HPO4/NaH2PO4、0.15M NaCl、0.05% v/v界面活性劑P20(PBS-P電泳緩衝液之緩衝液中執行Biacore pH追蹤研究。在PBS-P電泳緩衝液(在30nM之濃度下)中製備具有C端myc-myc-his標籤(SEQ ID NO:354)之ZIKV(prM80E)(因此稱為ZIKV-mmH),且將其在30μL/分鐘之流速下注射於抗ZIKV mAb捕獲表面上。在pH 7.4下、在PBS-P電泳緩衝液中監測ZIKV-mmH與捕獲單株抗體之締合持續3分鐘,且監測在pH7.4、pH6.0、pH5.5、或pH5.0下、在PBS-P電泳緩衝液中ZIKV-mmH之解離持續10分鐘。所有pH追蹤實驗均在37℃下執行。藉由使用Scrubber 2.0c曲線擬合軟體,將即時感測圖與1:1結合模型擬合來判定動力學解離(k d)速率常數。根據動力學速率常數將解離半衰期(t½)計算為:t½(min)=ln2/(60xkd)
在37℃下ZIKV-mmH結合至純化抗ZIKV mAb之結合動力學參數顯示於表4A及4B中。
IC=非決定性
NB無結合
IC=非決定性
NB無結合
在37℃下,在pH 7.4、6.0、5.5、及5.0下研究pH對來自抗ZIKV抗體之ZIKV.mmH之解離(kd及t1/2)的作用。本發明之抗ZIKV抗體H4H25710N、H4H25602P、及H4H25598P顯示解離中的最高pH依賴性變化。抗ZIKV抗體H4H25566P顯示解離中的中等pH依賴性變化,同時剩餘ZIKV抗體不顯示解離中的顯著pH依賴性變化。
使用即時表面電漿子共振生物感測器檢定在Biacore 4000儀器上判定ZIKV(prM80E)-mmH蛋白結合至純化抗ZIKV單株抗體之平衡解離常數(K D值)。藉由胺與多株山羊抗人類Fc抗體(Jackson Laboratories,#BR-109005-098)之偶聯衍生化Biacore感測器表面以捕獲與人類恆定區一起表現的抗ZIKV抗體。在HBS-P電泳緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.05% v/v界面活性劑P20)中執行Biacore結合研究。內部製備具有C端myc-myc-六組胺酸標籤(mmH)之ZIKV(prM80E)蛋白,且因此稱為ZIKV-mmH(參見SEQ ID NO:354)。將不同濃度(3倍稀釋)的ZIKV-mmH(在30nM至0.37nM之範圍內)(在HBS-P電泳緩衝液中製備)在30μL/min之流速下注射在抗ZIKV抗體捕獲表面上。監測ZIKV-mmH對各捕獲單株抗體之締合持續3分鐘,且在HBS-P電泳緩衝液中監測解離持續8分鐘。在25℃或37℃下執行所有結合動力學實驗。藉由使用Scrubber 2.0c曲線擬合軟體,將即時感測圖與1:1結合模型擬合來判定動力學締合(k a)及解離(k d)速率常數。根據動力學速率常數將結合解離平衡常數(K D)及解離半衰期(t½)計算為:
在25℃及37℃下ZIKV-mmH結合至抗ZIKV抗體之結合動力學參數顯示於表5及6中。
表6:在37℃下抗ZIKV單株抗體結合至ZIKV(prM80E)-mmH之結合動力學參數。
在25℃下,本發明之所有20種抗茲卡抗體均結合至ZIKV-.mmH,其中K D值在70pM至27.7nM之範圍內(表5)。在37℃下,本發明之抗ZIKV抗體結合至ZIKV-mmH,其中K D值在621pM至52.5nM之範圍內(表6)。如所預期,陰性同型對照顯示無結合(資料未顯示)。
將Vero細胞(非洲綠猴腎-ATCC® CCL81)在感染ZIKV之前1天,以10,000個細胞每孔,接種於具有透明底部的Corning黑色96孔細胞培養盤 中,在含有10%熱滅活FBS及青黴素/鏈黴素/L-麩醯胺之MEM-α完全培養基中。
用於感染Vero細胞之ZIKV株為MR766(1947年單離自烏干達之警哨恆河猴,登錄# AY632535)、FLR(2015年12月單離自哥倫比亞之人類,登錄# KU820897)、及PRVABC59(2015年12月單離自波多黎各之人類,登錄# KU501215)。
在中和/感染當天,將測試抗體在含有2%熱滅活FBS、青黴素/鏈黴素/L-麩醯胺之DMEM中稀釋至2X濃度,且在37℃下與ZIKV 1:1混合30分鐘。
將培養基從經鋪板之Vero細胞移除,隨後將其在37℃下、在每15分鐘溫和地攪拌檢定盤之情況下用抗體與病毒之1:1混合物培育1小時。將抗體處理之病毒接種物移除,且將細胞用100uL含有1%熱滅活FBS、青黴素/鏈黴素/L-麩醯胺、及1%甲基纖維素之DMEM覆蓋,且在37℃、5% CO2下培育隔夜(12-16小時)。第二天,將覆蓋培養基吸出細胞,將細胞用PBS洗滌兩次,隨後在4℃下用冰冷的1:1丙酮及甲醇之混合物固定30分鐘。將固定細胞用PBS洗滌兩次,隨後在室溫下用含有0.1%曲通(Triton)-X及5% FBS之PBS透化15分鐘。將細胞用單獨PBS洗滌一次,接著在室溫下用含有5% FBS之PBS培育30分鐘以阻斷非特異性結合。隨後在室溫下將細胞用在1:10,000稀釋下於含有5% FBS及0.1%吐溫-20之PBS中的多株抗體(茲卡小鼠免疫腹水,其得自UTMB)培育1小時。將細胞用300uL PBS、使用Molecular Devices AquaMax 4000盤洗滌器洗滌6次,隨後在室溫下、在黑暗中用二級抗體(Life Technologies Alexa-488結合山羊-抗小鼠IgG)培育1小時。將細胞在盤洗滌器上洗滌6次,且在分析之前添加100uL PBS。使用具有Mini Max盤讀取器之SpectraMax, 藉由對各孔成像且使用計數不同螢光焦點之設置完成分析。
中和%計算如下:
使用非線性迴歸(4參數邏輯)利用Prism 5軟體(GraphPad Software公司)分析結果(表現為中和%)以獲得IC50值。結果顯示於下文表7及8中。
顯示於下文表7及8中之資料顯示,使用本文中所述之實驗設計,20種本發明之抗ZIKV病毒抗體中有18種以在約10-11M至約10-9M之範圍內的IC50有效地中和ZIKV株MR766、PRVABC59(波多黎各2015)、及FLP(哥倫比亞2015)之感染性。如所預期,陰性同型對照顯示無中和(資料未顯示)。
為了評定兩種抗體是否彼此競爭結合至其在ZIKV(prM80E)-mmH(據此稱為ZIKV.mmH(SEQ ID NO:354))上之表位,使用即時無標記生物層干涉檢定在Octet RED384生物感測器(Pall ForteBio公司)上判定抗ZIKV單株抗體之間的結合競爭。在25℃下,於0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.05% v/v界面活性劑吐溫-20、0.1mg/mL BSA(HBS-P緩衝液)中,在1000rpm之速度下振盪盤之情況下執行交叉競爭實驗。所測試之所有抗ZIKV抗體及ZIKV-mmH溶液均在Octet HBS-P緩衝液中製備。為了評定兩種抗體是否能夠彼此競爭結合至其在ZIKV-mmH上的相應表位,首先在抗His塗佈之Octet生物感測器尖端上,從含有10μg/mL ZIKV-mmH之孔捕獲大致約0.97-0.112nm ZIKV-mmH持續90秒。將ZIKV-mmH捕獲Octet生物感測器尖端藉由浸沒至含有20ug/ml第一抗ZIKV單株抗體(據此稱為mAb-1)之孔中5分鐘,接著浸沒於含有第二抗ZIKV單株抗體(據此稱為mAb-2)之孔中來飽和。在步驟之間,將Octet生物感測器尖端於HBS-P緩衝液中洗滌30秒。
在實驗過程期間監測即時結合反應,且記錄每個步驟結束時的 結合反應。將ZIKV-mmH結合至mAb-1及隨後阻斷mAb之反應針對背景結合來校正,比較,且判定不同抗ZIKV單株抗體之競爭性/非競爭性行為。
表9在兩個方向上明確地定義抗體競爭之關係,與結合次序無關。兩種抗ZIKV單株抗體H4H25619P及H4H25703N不與本發明中所述之剩餘抗體競爭。
使用免疫螢光檢定(下文描述)進行實驗以判定ZIKV抗體對抗體 依賴性增強(ADE)的作用。
在一個實施例中,使用GenBank登錄號KJ438784(κ輕鏈)及KJ438785.1(重鏈)中所見之重鏈及輕鏈序列製備與所有黃病毒交叉反應的嵌合抗體。製備三種抗體,命名為REGN4203(hIgG1)、REGN4204(hIgG4s)、及REGN4206(hIgG4us)。REGN4203具有SEQ ID NO:359中所示之重鏈(HC)及SEQ ID NO:360中所示之輕鏈(LC)。REGN4204具有SEQ ID NO:361中所示之重鏈(HC)及SEQ ID NO:362中所示之輕鏈(LC),且REGN4206具有SEQ ID NO:363中所示之重鏈(HC)及SEQ ID NO:364中所示之輕鏈(LC)。
在另一實驗中,使用相同的免疫螢光檢定測試兩種抗茲卡病毒抗體(命名為H4H25703N(HCVR/LCVR胺基酸序列對EQ ID NO:258/266)及H4H25619P(HCVR/LCVR胺基酸序列對SEQ ID NO:114/122))之對ADE的作用。各抗茲卡病毒(H4H25703N及H4H25619P)製備成具有包含胺基酸序列SEQ ID NO:356之Fc的IgG1、或具有包含SEQ ID NO:357中所示之胺基酸序列之Fc的IgG4。H4H25703N之重鏈(HC)之全長胺基酸序列顯示為SEQ ID NO:367,且H4H25703N之輕鏈(LC)之全長胺基酸序列顯示為SEQ ID NO:368。H4H25619P之重鏈(HC)之全長胺基酸序列顯示為SEQ ID NO:370,且H4H25619P之輕鏈(LC)之全長胺基酸序列顯示為SEQ ID NO:371。
將抗體在RPMI+10% FBS、1X青黴素/鏈黴素/麩醯胺中稀釋至2X以達成50、10、2、0.4、及0.08ug/mL之最終濃度。隨後在37℃、5% CO2下將100uL各抗體與含有2500ffu(螢光焦點單位)病毒之RPMI完全培養基1:1混合30分鐘。隨後將含80,000個K562細胞之300uL RPMI完全培養基添加至抗體/病毒混合物中,且在37℃、5% CO2下培育3天。在注射後1及2天,將100uL上清液移除,且冷凍至-80℃。在第3天,將剩餘上清液收集並冷凍至-80℃。
為了偵測上清液之病毒負荷,將Vero細胞在10,000個細胞/孔下接種於黑色/透明底部96孔細胞培養盤中,在含有10% FBS、1X青黴素/鏈黴素/麩醯胺之MEM-α中。在37℃、5% CO2下培育細胞隔夜。在注射當天,將上文之上清液樣品稀釋於RPMI完全培養基中。將50uL各稀釋液添加至Vero細胞中,且在37℃、5% CO2下,在每15分鐘溫和地攪拌盤之情況下培育1小時。將接種物從細胞移除,且將細胞覆蓋100uL DMEM+1% FBS、1X青黴素/鏈黴素/麩醯胺、1%甲基纖維素,且在37℃、5% CO2下培育隔夜。
如先前實例5中所述,藉由免疫螢光檢定定量感染細胞。
如圖1中所示,REGN4203顯示當抗體濃度從10-10M增加至10-7M時,如藉由病毒產率增加所示,ADE增加。REGN4204顯示當抗體濃度從10-10M增加至10-7M時病毒產率之中等增加。然而,當抗體濃度從10-10M增加至10-7M時,REGN4206對ADE無作用,如藉由其病毒產率無法增加所示。實際上,REGN4206顯示相較於僅病毒對照無差異。
如圖6及7中所示,不同於其IgG1版本,當製備成具有包含SEQ ID NO:357中所示之胺基酸序列之Fc的IgG4時,抗ZIKV抗體不誘導ADE活性。
進行研究以判定ZIKV感染之小鼠模型中抗ZIKV抗體之作用。
簡言之,在感染之前一天,將兩種抗ZIKV抗體(命名為H4H25703N及H4H25619P)稀釋於PBS中以達成200、50、或12.5μg每200μL劑量之最終濃度。一天之後,將干擾素α/β受體1(IFNAR1)KO小鼠經由皮下注射至鬆散背頸區域中用抗體給藥。在感染當天,將ZIKV株FSS13025稀釋於含有2%熱滅活胎牛血清與1X青黴素/鏈黴素/麩醯胺之DMEM培養基中 達105ffu每200μL劑量。將小鼠經由腹膜內注射來用病毒給藥。在整個實驗過程中監測小鼠之重量減輕,多達感染後21天。將體重減小低於80%臨限或經歷極端病態(顫抖、虛弱、及非反應性)的動物安樂死。經安樂死的那些動物顯示死亡日期為安樂死後一天(例如,將感染後6天剔出之動物指示為存活直至第7天)。
如圖2-5中所示,結果顯示接受同型對照抗體之所有小鼠截至感染之後第9天損失大於20%的體重,且根據IACUC準則必須處死。接受H4H25703抗ZIKV抗體(圖2)或H4H25619P抗ZIKV抗體(圖3)之小鼠能夠較好地控制其體重損失多達感染後21天;200ug及50ug組中沒有小鼠且12.5ug組中40%小鼠顯示多於20%臨限的重量損失。用H4H25703N(圖4)或H4H25619(圖5)預治療小鼠亦提高其存活;用200ug或50ug任一抗體治療的100%小鼠或用12.5ug各抗體治療的60%小鼠倖存於以ZIKV之攻擊。
在各抗體之IC50、IC75、IC85、IC99、IC99、及IC99.99下,將4x105ffu MR766 ZIKV與遞增濃度的H4H25703N或H4H25619P(或同型對照抗體)組合,如當在GraphPad Prism中作圖時根據中和曲線分析之IC50及希爾斜率所計算(log(抑制劑)相對於反應-可變斜率(四參數))。計算可如下完成,其中f=所要的分率(對於IC85,f=85)且H=希爾斜率:
將病毒及抗體在37℃下在一起培育30分鐘,之後添加至2x105個Vero細胞*中,該等細胞在感染前一天已接種於24孔盤中。將細胞在37℃、5% CO2下培育,且每天檢查其細胞病變作用。一旦細胞病變作用在用同型 對照抗體治療的孔中為明顯的,從H4H25703N及H4H25619P治療之細胞收集病毒上清液,且藉由離心清除碎屑。隨後將孔之具有最高抗體濃度、見到細胞病變作用的病毒上清液用新鮮抗體培育,且傳遞至新鮮預接種的細胞上,且在37℃、5% CO2下再培育直至細胞病變作用為明顯的。重複此循環直至在最高抗體濃度(IC99.99)下見到細胞病變作用。將病毒上清液從IC99.99孔收集,且傳遞至預接種有6X106個Vero細胞之T25瓶。一旦在這些細胞上可見細胞病變作用,將病毒收集、藉由離心清除、且用於中和檢定,以驗證其脫逸,且亦判定病毒是否仍能夠由第二抗體中和。亦將來自此病毒擴增之感染細胞收集至1mL Trizol中以供病毒之RNA單離及序列分析。
為了確認在H4H25703N及H4H25619P之壓力下所產生之脫逸突變體是否對中和具有抗性,在Vero細胞中執行中和檢定。簡言之,為了完成中和,將病毒與遞減濃度的H4H25703N、H4H25619P、或同型對照抗體在從10ug/mL稀釋三倍至200pg/mL之濃度下組合以實現11點曲線。將病毒及抗體在37℃下在一起培育30分鐘,之後添加至預接種於黑色透明底96孔細胞培養盤中的10,000個Vero細胞上。將細胞用病毒/抗體混合物培育1小時,其中在整個培育過程中週期性地溫和攪拌。在培育之後,將接種物移除,且將細胞覆蓋含有1%甲基纖維素之DMEM,且在37℃、5% CO2下培育隔夜。將甲基纖維素覆蓋吸出細胞,隨後將細胞用PBS洗滌兩次,且在4C下用冰冷的1:1丙酮及甲醇之混合物固定30分鐘。將固定細胞用PBS洗滌兩次,隨後在室溫下用含有5% FBS及0.1%曲通(Triton)-X之PBS透化15分鐘。將細胞用PBS洗滌,隨後在室溫下用含有5% FBS之PBS培育以阻斷非特異性循環持續30分鐘。隨後在室溫下將細胞用一級抗體(多株免疫小鼠腹水)在1:10,000稀釋下於PBS+5% FBS及0.1%吐溫(Tween)-20中培育1小時。將細 胞用PBS使用Molecular Devices AquaMax 4000盤洗滌器洗滌6次,隨後在室溫下於黑暗中用二級抗體(Alexa-488結合山羊-抗小鼠IgG)在1ug/mL下於PBS+5% FBS及0.1%吐溫-20中培育1小時。將細胞在盤洗滌器上洗滌6次,且留在100uL PBS中以供在具有MiniMax盤讀取器之Spectramax上分析以計數螢光焦點。如下計算中和百分比且在GraphPad Prism中以非線性迴歸作圖(log(抑制劑)相對於反應-可變斜率(四參數)):中和%=(1-((孔值-僅培養基對照)/(僅病毒對照-僅培養基對照)))*100一旦確認了中和,根據製造商之規程,使用Trizol(Life Technologies),從病毒擴增,將RNA從感染細胞中單離出。使用Life Technologies SuperScript III第一股合成系統,將所得RNA用於cDNA合成。將此cDNA用作PCR之模板以使用以下參數放大茲卡E序列:
將所得PCR產物(預期大小:2113bp)在120V下在含有1X Sybr Safe DNA株(Life Technologies)之1%瓊脂糖TBE凝膠上電泳1小時。將擴增子切出且使用Qiagen QiaQuick凝膠提取套組(Qiagen QiaQuick Gel Extraction Kit)根據製造商之說明書純化。所得純化產物使用Sanger方法使用以下引子定序:
對序列進行分析並組裝以構成完全茲卡E序列。序列組件之轉譯顯露出脫逸突變。
序列分析確認,H4H25703N之脫逸突變見於茲卡病毒E蛋白質位置302(SEQ ID NO:376;S302E)。H4H25619P之脫逸突變見於茲卡病毒E蛋白質胺基酸位置311及369(SEQ ID NO:376;分別是T311I及K369E)。顯示H4H25703N之E蛋白脫逸突變(S302F)之胺基酸序列顯示為SEQ ID NO:377。顯示H4H25619P之E蛋白脫逸突變(T311I及K369E)之胺基酸序 列顯示為SEQ ID NO:378。這些研究之資料表明ZIKV E蛋白上可在病毒中和中起主要作用的H4H25703N及H4H25619P之結合位點。此外,圖8A及8B中所示之結果證明,儘管一種抗體可能由於E蛋白中之突變而不中和ZIKV,但第二抗體可能夠中和含有E蛋白中之突變的該病毒,因此為抗體混合物之使用提供支持。
進行研究以判定當單獨或以組合形式使用時ZIKV感染之小鼠模型中抗ZIKV抗體之作用。
收到6-8週齡的干擾素α/β受體1(IFNAR1)KO小鼠,且將其皮下注射含有陰性同型對照抗體或抗ZIKV抗體的200μL PBS,以實現200、50、或12.5μg抗體每小鼠之最終劑量。當將抗體之兩者組合時,各抗體在100、25、或6.25μg之劑量下給定,使得兩種抗體當組合時總劑量為200、50、或12.5μg。治療後一天,將小鼠經由腹膜內注射稀釋於DMEM+2% FBS、1X青黴素/鏈黴素/麩醯胺(PSG)中之105ffu茲卡病毒株FSS13025來感染。監測動物之重量損失或極端疾病持續多達3週。若動物降至低於80%開始重量之重量臨限或展現極端疾病,則將其安樂死(藉由震顫或非反應性來認定,在實驗中監測患有後肢麻痺的動物之恢復)。
結果顯示接受同型對照抗體之所有小鼠截至感染之後第9天損失大於20%的體重,且根據IACUC準則必須處死。在200ug或50ug之劑量下以H4H25703N或H4H25619預治療小鼠導致100%存活。60%以12.5ug H4H25703治療的小鼠倖免於以ZIKV之攻擊。75%以12.5ug H4H25619治療的小鼠倖免於以ZIKV之攻擊。在200ug(各抗體100ug)或50ug(各抗體25ug)之總劑量下以兩種抗體預治療小鼠導致100%存活。在12.5ug(各抗體6.25ug) 之總劑量下預治療小鼠亦導致100%存活。這些結果表明,較低劑量的各抗體可以組合形式使用以達成較大功效,如與當單獨使用各抗體時所達到的功效相比較。結果示於下文表10中。
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<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<223> 合成
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<220>
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<223> 合成
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<223> 合成
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 345
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 346
<210> 347
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 347
<210> 348
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 348
<210> 349
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 349
<210> 350
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 350
<210> 351
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 351
<210> 352
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 352
<210> 353
<211> 3423
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Zika Virus polyprotein(GenBank No.ALU33341.1)
<400> 353
<210> 354
<211> 629
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZIka prM80E.mmH
<400> 354
<210> 355
<211> 624
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZIka prM80E.BirA.6xHis
<400> 355
<210> 356
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgG1恆定區
<400> 356
<210> 357
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgG4 us
<400> 357
<210> 358
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有YTE之hIgG4 us
<400> 358
<210> 359
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1 IgG1 HC
<400> 359
<210> 360
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb1 IgG1 LC
<400> 360
<210> 361
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb2 IgG4 s HC
<400> 361
<210> 362
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb2 IgG4 s LC
<400> 362
<210> 363
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb3 IgG4 us HC
<400> 363
<210> 364
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb3 IgG4 us LC
<400> 364
<210> 365
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 無YTE之IgG4s Fc
<400> 365
<210> 366
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4s Fc+YTE
<400> 366
<210> 367
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H25703N HC(無YTE之IgG4us)
<400> 367
<210> 368
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H25703N LC
<400> 368
<210> 369
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H25703N HC(IgG4us+YTE)
<400> 369
<210> 370
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H25619P HC(無YTE之IgG4us)
<400> 370
<210> 371
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H25619P LC
<400> 371
<210> 372
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H25619P HC(IgG4us+YTE)
<400> 372
<210> 373
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H25598P HC(無YTE之IgG4us)
<400> 373
<210> 374
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H25598P LC
<400> 374
<210> 375
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H25598P HC(IgG4us+YTE)
<400> 375
Claims (47)
- 一種單離重組單株抗體或其抗原結合片段,其特異性結合至ZIKA病毒(ZIKV)及/或ZIKV套膜醣蛋白(E),其中該抗體或其抗原結合片段以小於或等於約10 -9M之IC 50體外中和ZIKV,且其中該抗體或其抗原結合片段在ZIKV感染動物中顯示體內保護作用。
- 如申請專利範圍第1項之單離單株抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含:三個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2、及HCDR3),其含在選自由下列所組成之群的重鏈可變區(HCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322及338;及三個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2、及LCDR3),其含在由下列所組成之群的輕鏈可變區(LCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330及346。
- 如申請專利範圍第1或2項之單離單株抗體或其抗原結合片段,其包含具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列的HCVR:SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322及338。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之單離單株抗體或其抗原結合片段,其包含具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列的LCVR:SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330及346。
- 如申請專利範圍第1至4項中任一項之單離單株抗體或其抗原結合片段,其包含:(a)HCDR1域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324及340;(b)HCDR2域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326及342;(c)HCDR3域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328及344;(d)LCDR1域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332及348;(e)LCDR2域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334及350;(f)LCDR3域,其具有選自由下列所組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336及352。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單離單株抗體或其抗原結合片段,其包含選自由下列所組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對:SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330及338/346。
- 如申請專利範圍第5項之單離單株抗體或其抗原結合片段,其包含:HCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:116;HCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:118; HCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:120;LCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:124;LCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:126;及LCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:128。
- 如申請專利範圍第5項之單離單株抗體或其抗原結合片段,其包含:HCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:260;HCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:262;HCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:264;LCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:268;LCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:270;及LCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:272。
- 如申請專利範圍第1至8項中任一項之單離單株抗體或其抗原結合片段,其中該抗體進一步包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:357之Fc域。
- 如申請專利範圍第1至9項中任一項之單離單株抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段不促成抗體依賴性增強(ADE)。
- 如申請專利範圍第2至10項中任一項之單離單株抗體或其抗原結合片段,其具有以下特徵之一或多者:(a)係完全人類單株抗體;(b)以在約80pM至約150nM之範圍內的EC 50結合至表現ZIKV prM/E之VLP;(c)以小於10 -7M之解離常數(K D)結合至ZIKV E,如在表面電漿子共振檢定中所測量;或(d)可或可不顯示在pH 5或pH 6下相對於pH 7.4之解離半衰期(t½)之變化。
- 一種單離單株抗體或其抗原結合片段,其與參考抗體或抗原結合片段競爭結合至ZIKV及/或ZIKV E,該參考抗體或抗原結合片段包含:HCVR之CDR,其中該HCVR具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322及338;及LCVR之CDR,其中該LCVR具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330及346。
- 一種單離單株抗體或其抗原結合片段,其結合至ZIKV及/或ZIKV E上與參考抗體或抗原結合片段相同的表位,該參考抗體或抗原結合片段包含:HCVR之CDR,其中該HCVR具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322及338;及LCVR之CDR,其中該LCVR具有選自由下列所組成之群組的胺基酸序列:SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330及346。
- 一種中和感染性ZIKV之方法,該方法包含將感染ZIKV之細胞曝露於包含如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗ZIKV抗體或其抗原結合片段之一或多者之組成物,其中該曝露導致對防止該細胞感染病毒、或防止細胞死亡之保護增強。
- 如申請專利範圍第14項之方法,其中該一或多種抗ZIKV抗體或其抗原結合片段中和具有野生型E蛋白之感染性ZIKV,其中該野生型E蛋白具有在SEQ ID NO:376之位置302處的絲胺酸、在SEQ ID NO:376之位置311處的蘇胺酸、及在SEQ ID NO:376之位置369處的離胺酸,但不中和具有該E蛋白之突變形式的感染性ZIKV,其中該E蛋白之該突變形式含有以下變化之一或多者:在SEQ ID NO:376之位置302處的苯丙胺酸、在SEQ ID NO:376之位置311處的異白胺酸、或在SEQ ID NO: 376之位置369處的麩胺酸。
- 如申請專利範圍第14項之方法,其中該保護增強係當單獨使用該抗體時、或當其與一或多種額外治療劑或抗ZIKV治療模態(treatment modalities)組合使用時觀察到,其中該一或多種額外治療劑係選自由下列所組成之群:抗病毒藥物、抗發炎藥物(例如,皮質類固醇及非類固醇抗發炎藥物)、一或多種不同的抗ZIKV抗體、ZIKV疫苗、免疫調節劑及干擾素。
- 如申請專利範圍第16項之方法,其中該一或多種不同的抗ZIKV抗體包含選自由下列所組成之群的重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列對:SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330及338/346。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1至11項中任一項之一或多種特異性結合至ZIKV的單離單株抗體或其抗原結合片段、及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
- 如申請專利範圍第18項之醫藥組成物,其中該一或多種特異性結合至ZIKV的單離單株抗體或其抗原結合片段包含:三個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2、及HCDR3),其含在選自由下列SEQ ID NO所組成之群的重鏈可變區(HCVR)序列之任一者內:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322及338;及三個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2、及LCDR3),其含在由下列所組成之群的輕鏈可變區(LCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330及346。
- 如申請專利範圍第18或19項中任一項之醫藥組成物,其中該一或多種 特異性結合至ZIKV的單離單株抗體包含選自由下列所組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對:SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330及338/346。
- 如申請專利範圍第18至20項中任一項之醫藥組成物,其中該一或多種特異性結合至ZIKV的單離單株抗體包含選自由下列所組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對:SEQ ID NO:66/74、114/122及258/266。
- 如申請專利範圍第21項之醫藥組成物,其中該一或多種特異性結合至ZIKV的單離單株抗體包含選自由下列所組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對:SEQ ID NO:114/122及258/266。
- 如申請專利範圍第18至22項中任一項之醫藥組成物,其中該一或多種特異性結合至ZIKV的單離單株抗體包含:a)特異性結合至ZIKV之第一單離單株抗體或其抗原結合片段,其包含:具有胺基酸序列SEQ ID NO:116之HCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:118之HCDR2;具有胺基酸序列SEQ ID NO:120之HCDR3;具有胺基酸序列SEQ ID NO:124之LCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:126之LCDR2;具有胺基酸序列SEQ ID NO:128之LCDR3;b)特異性結合至ZIKV之第二單離單株抗體或其抗原結合片段,其包含:具有胺基酸序列SEQ ID NO:260之HCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:262之HCDR2;具有胺基酸序列SEQ ID NO:264之HCDR3;具有胺基酸序列SEQ ID NO:268之LCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:270之LCDR2;具有胺基酸序列SEQ ID NO:272之LCDR3;以及 c)醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
- 如申請專利範圍第18至23項中任一項之醫藥組成物,其中該一或多種抗ZIKV抗體中和一或多種選自由以下所組成之群的ZIKV株:MR766(烏干達1947)、PRVABC59(波多黎各2015)、及FLR(哥倫比亞2015)株。
- 一種醫藥組成物,其包含至少兩種特異性結合至ZIKV的單離單株抗體或其抗原結合片段、及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑,其中該兩種單株抗體之至少一者以小於約10 -9M之IC 50體外中和ZIKV且在ZIKV感染動物中顯示體內保護作用。
- 如申請專利範圍第25項之醫藥組成物,其中該組成物包含:(a)第一抗ZIKV單株抗體或其抗原結合片段;(b)第二抗ZIKV單株抗體或其抗原結合片段;其中該第一抗體結合至ZIKV上之第一表位或與其相互作用,且該第二抗體結合至ZIKV上之不同的第二表位或與其相互作用;以及(c)醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
- 如申請專利範圍第25或26項中任一項之醫藥組成物,其中該等第一抗ZIKV單株抗體及該第二抗ZIKV單株抗體或其抗原結合片段包含:三個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2、及HCDR3),其含在選自由下列所組成之群的重鏈可變區(HCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322及338;及三個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2、及LCDR3),其含在由下列所組成之群的輕鏈可變區(LCVR)序列之任一者內:SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330及346。
- 如申請專利範圍第25至27項中任一項之醫藥組成物,其中: a)該第一抗ZIKV單株抗體或其抗原結合片段包含:具有胺基酸序列SEQ ID NO:116之HCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:118之HCDR2;具有胺基酸序列SEQ ID NO:120之HCDR3;具有胺基酸序列SEQ ID NO:124之LCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:126之LCDR2;及具有胺基酸序列SEQ ID NO:128之LCDR3;且其中b)特異性結合至ZIKV之該第二抗ZIKV單株抗體或其抗原結合片段包含:具有胺基酸序列SEQ ID NO:260之HCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:262之HCDR2;具有胺基酸序列SEQ ID NO:264之HCDR3;具有胺基酸序列SEQ ID NO:268之LCDR1;具有胺基酸序列SEQ ID NO:270之LCDR2;及具有胺基酸序列SEQ ID NO:272之LCDR3。
- 如申請專利範圍第25至28項中任一項之醫藥組成物,其中該至少兩種特異性結合至ZIKV的抗ZIKV抗體包含HCVR/LCVR胺基酸序列對SEQ ID NO:114/122及SEQ ID NO:258/266。
- 如申請專利範圍第25至29項中任一項之醫藥組成物,其中該至少兩種抗ZIKV抗體中和一或多種選自由以下所組成之群的ZIKV株:MR766(烏干達1947)、PRVABC59(波多黎各2015)、及FLR(哥倫比亞2015)株。
- 一種醫藥組成物,其包含:特異性結合至ZIKV之第一單離單株抗體或其抗原結合片段,其中該第一單離單株抗體或其抗原結合片段包含HCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:116;HCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:118;HCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:120;LCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:124;LCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:126;及LCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:128;以及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
- 如申請專利範圍第31項之醫藥組成物,其進一步包含特異性結合至ZIKV之第二單離單株抗體或其抗原結合片段,其中該第二單離單株抗體或其抗原結合片段包含HCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:260;HCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:262;HCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:264;LCDR1胺基酸序列SEQ ID NO:268;LCDR2胺基酸序列SEQ ID NO:270;及LCDR3胺基酸序列SEQ ID NO:272。
- 一種單離核酸分子,其編碼如申請專利範圍第1至11項中任一項之特異性結合至ZIKV之單株抗體或其片段。
- 一種載體,其包含如申請專利範圍第33項之核酸分子。
- 一種單離細胞,其表現如申請專利範圍第34項之載體。
- 一種預防、治療或改善ZIKV感染之至少一種症狀或降低ZIKV感染之至少一種症狀之頻率或嚴重性的方法,該方法包含向有需要之個體投與一或多種如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗ZIKV抗體或其抗原結合片段、或包含一或多種如申請專利範圍1至11項中任一項之抗ZIKV抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物。
- 如申請專利範圍第36項之方法,其中該一或多種抗ZIKV抗體包含HCVR/LCVR胺基酸序列對SEQ ID NO:114/122及258/266。
- 如申請專利範圍第37項之方法,其中該至少一種症狀係選自由以下所組成之群:發熱、頭痛、關節痛、肌痛及斑丘疹。
- 如申請專利範圍第36項之方法,其中該醫藥組成物係預防性地或治療性地向該有需要之個體投與。
- 如申請專利範圍第36項之方法,其中該有需要之個體係處於曝露於ZIKV感染或獲得ZIKV感染之風險,且其中該個體係選自由以下所組成之群:已曝露於ZIKV或已被懷疑帶有ZIKV的蚊子叮咬的孕婦;生活 在ZIKV爆發的區域、或正在訪問ZIKV爆發的區域、及正考慮懷孕的女性;免疫受損的個體;懷疑已曝露於帶有ZIKV的人的人;與感染個體身體接觸或身體緊密靠近的人;醫院員工;醫藥研究者;負責清潔治療ZIKV患者的醫院設備或設施的維護人員;已訪問或計劃訪問已知或懷疑ZIKV爆發的區域或國家、或已知具有帶有ZIKV的蚊子的國家的個體。
- 如申請專利範圍第36項之方法,其中該抗體或其抗原結合片段、或包含該抗體或其抗原結合片段之該醫藥組成物係與第二治療劑組合投與,其中該第二治療劑係選自由以下所組成之群:抗病毒藥物、抗發炎藥物(例如皮質類固醇及非類固醇抗發炎藥物)、ZIKV之不同抗體、ZIKV疫苗、免疫調節劑及干擾素。
- 如申請專利範圍第36項所述之方法,其中該醫藥組成物係皮下、靜脈內、皮內、肌內、鼻內或經口投與。
- 一種減小ZIKV傳播至妊娠女性之胎兒之可能性及/或防止傳播至男性生殖器官的方法,該方法包含投與至少一種如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或抗原結合片段、或包含至少一種如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或抗原結合片段之醫藥組成物。
- 如申請專利範圍第43項之方法,其包含投與包含至少兩種抗ZIKV抗體之混合物的抗體混合物,其中該至少兩種抗ZIKV抗體包含HCVR/LCVR胺基酸序列對SEQ ID NO:114/122及258/266。
- 如申請專利範圍第43項之方法,其中該抗體或其抗原結合片段、或包含該抗體或其抗原結合片段之該醫藥組成物係預防性或治療性地向該有需要之個體投與。
- 如申請專利範圍第43項之方法,其中該抗體或其抗原結合片段、或包含 該抗體或其抗原結合片段之該醫藥組成物係與第二治療劑組合投與,其中該第二治療劑係選自由以下所組成之群:抗病毒藥物、抗發炎藥物(例如皮質類固醇及非類固醇抗發炎藥物)、ZIKV之不同抗體、ZIKV疫苗、免疫調節劑及干擾素。
- 如申請專利範圍第46項所述之方法,其中該醫藥組成物係皮下、靜脈內、皮內、肌內、鼻內或經口投與。
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