BR112020002050A2

BR112020002050A2 - epimerases engenheiradas alcaloides benzilisoquinolina e métodos de produção de alcaloides benzilisoquinolina

Info

Publication number: BR112020002050A2
Application number: BR112020002050-8A
Authority: BR
Inventors: Christina D. Smolke; Derek H. Wells
Original assignee: Antheia, Inc.
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2020-09-08
Also published as: WO2019028390A1; JP2020529848A; GB2579940B; JP7199417B2; US11427827B2; US20200157551A1; US20190078100A1; IL272363A; GB202002867D0; GB2579940A; US10544420B2

Abstract

A presente invenção refere-se a sistemas e métodos para aumento da produção de um produto alcaloide através da epimerização de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimerase engenheirada em uma célula hospedeira engenheirada. Um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina é contatado com a dita epimerase engenheirada. Contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase engenheirada converte o dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina no dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EPIME- RASES ENGENHEIRADAS PARA ALCALOIDES BENZILISOQUI- NOLINA E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ALCALOIDES BENZILI- SOQUINOLINA”".

REFERÊNCIA CRUZADA

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Pa- tente Provisório U.S. No. 62/541.038, depositado em 3 de agosto de 2017, pedido que é aqui incorporado a título de referência.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a métodos para a produção de alcaloides benzilisoquinolina (BIAs) diversos em células hospedei- ras engenheiradas compreendendo epimerases engenheiradas. Ainda, a presente invenção provê métodos para a produção de uma epimera- se engenheirada. Epimerases engenheiradas podem compreender epimerases fundidas engenheiradas e epimerases divididas engenhei- radas. Epimerases fundidas engenheiradas podem ter uma ou mais modificações em uma porção oxidase da epimerase fundida engenhei- rada. Essas uma ou mais modificações podem aumentar a atividade da epimerase. Em algumas modalidades, uma enzima fundida enge- nheirada pode ter uma porção de enzima oxidase e uma porção de enzima redutase que se originaram de enzimas parentais diferentes, respectivamente.

[0003] Epimerases engenheiradas podem também compreender epimerases divididas engenheiradas. Em algumas modalidades, uma epimerase dividida pode compreender um sistema de epimerase tendo dois componentes separados. Em algumas modalidades, uma epime- rase dividida pode compreender uma primeira proteína compreenden- do um componente oxidase e uma segunda proteína, separada, com- preendendo um componente redutase. Em alguns casos, o componen- te oxidase e o composto redutase de uma epimerase dividida são codi-

ficados por MRNAs separados. Em alguns casos, o componente oxi- dase e o componente redutase de uma epimerase dividida são codifi- cados por um mesmo mRNA e são traduzidos a partir de sítios de ini- ciação de tradução separados. Em alguns casos, o componente oxi- dase de uma epimerase dividida é codificado por um primeiro MRNA e o componente redutase da mesma polimerase dividida é codificado por um segundo mRNA, separado. Em alguns casos, o componente oxidase de uma epimerase dividida compreende uma primeira molécu- la e um componente redutase da mesma epimerase compreende uma segunda molécula. Em alguns casos, uma epimerase dividida compre- ende uma primeira proteína codificada por uma primeira unidade de transcrição em um primeiro local genômico e uma segunda proteína codificada por uma segunda unidade de transcrição em uma segunda localização genômica.

[0004] Em algumas modalidades, um epimerase dividida enge- nheirada pode compreender duas enzimas separadas codificando uma oxidase e uma redutase, em células hospedeiras engenheiradas. Em algumas modalidades, uma epimerase dividida engenheirada pode compreender ainda uma porção oxidase engenheirada tendo uma ou mais modificações para aumentar a atividade da epimerase. Em algu- mas modalidades, uma epimerase dividida engenheirada pode ter uma enzima oxidase e enzima redutase divididas de uma enzima fundida parental. Em algumas modalidades, uma epimerase dividida engenhei- rada pode ter uma enzima oxidase dividida de uma primeira enzima fundida parental e uma enzima redutase dividida de uma segunda en- zima fundida parental que é diferente da primeira enzima fundida pa- rental. Em algumas modalidades, uma epimerase dividida engenheira- da pode ter uma enzima oxidase que se origina de uma porção de uma primeira enzima parental e uma enzima redutase que se origina de uma porção de uma segunda enzima parental.

[0005] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para aumento da produção de um produto alcaloide através da epimeriza- ção de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1- benzilisoquinolina através de uma epimerase dividida engenheirada em uma célula hospedeira engenheirada em comparação com a epi- merização de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em uma alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimerase fundida em condi- ções similares. Em alguns métodos, os métodos compreende contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada na dita célula hospedeira engenheirada, desta maneira aumentando a produção de um produto alcaloide, em que contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada converte o dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina no dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina dentro da dita célula hospedeira en- genheirada.

[0006] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para produção de um produto alcaloide através da epimerização de um al- caloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquino- lina através de uma epimerase dividida engenheirada em uma célula hospedeira engenheirada. Em alguns métodos, os métodos compre- endem contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase fundida na dita célula hospedeira engenheirada. Desta ma- neira aumentando a produção de um produto alcaloide, em que conta- to do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase divi- dida engenheirada converte o dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina no dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina dentro da dita célula hospedeira engenheirada, em que a dita epimerase dividida engenheirada com- preende um componente oxidase e um componente redutase, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO: 17 e em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 80% homólo- ga à SEQ ID NO: 18.

[0007] Em algumas modalidades, a descrição provê células hos- pedeiras engenheiradas que compreendem uma epimerase dividida engenheirada, em que a dita epimerase dividida engenheirada aumen- ta a conversão de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloi- de (R)-1-benzilisoquinolina em relação à conversão de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina atra- vés de uma epimerase fundida sob condições similares.

[0008] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para aumento da produção de produtos alcaloides diversos através da epi- merização de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de epimerases engenheiradas em uma célula hospedeira engenheirada. Em modalidades adicionais, a presente invenção provê métodos para aumento da produção de pro- dutos alcaloides diversos através da epimerização de (S)-reticulina em (R)-reticulina através de uma epimerase engenheirada compreenden- do duas enzimas separadas codificando uma oxidase e uma redutase comparado com a produção de produtos alcaloides diversos através da epimerização de (S)-reticulina em (R)-reticulina através de uma epimerase do tipo selvagem.

[0009] Um aspecto adicional da invenção provê um método de aumento da eficiência de epimerização de um alcaloide (S)-1-benzili- soquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em relação a uma epimerase do tipo selvagem através da utilização de uma ou mais epimerases engenheiradas. O método compreende contato do alcaloi- de (S)-1-benzilisoquinolina com uma ou mais epimerases engenheira- das. Em algumas modalidades, uma epimerase dividida engenheirada compreende duas enzimas separadas codificando uma oxidase e uma redutase. Contato do alcaloide (S)-1-benzoisoquinolina com a enzima oxidase da epimerase dividida engenheirada e, separadamente, a en- zima redutase da epimerase dividida engenheirada, converte mais de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benziliso- quinolina em relação a uma epimerase do tipo selvagem.

[0010] Embora epimerases divididas engenheiradas possam ser compostas de enzima oxidase e enzima redutase separadas que po- dem se originar de uma epimerase parental ou do tipo selvagem, epi- merases engenheiradas podem também compreender enzima oxidase e enzima redutase separadas que se originam de epimerases separa- das parentais ou do tipo selvagem. Exemplos de epimerases parentais tendo um componente oxidase e redutase compreendem sequências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 1, 2,3,4,5,6,7,8,9, 10,11, 12,12, 14 e 15, como listado na Tabela 1.

[0011] Um aspecto adicional da invenção provê um processo para conversão de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina compreendendo contato do alcaloide (S)-1- benzilisoquinolina com uma oxidase engenheirada, compreendendo pelo menos uma modificação, e uma redutase em uma quantidade su- ficiente para converter o alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina. A oxidase engenheirada pode ter uma ou mais modificações que melhoram a conversão de um alcaloide (S)-1- benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina. Em algu- mas modalidades, a oxidase engenheirada pode estar dentro de uma epimerase dividida engenheirada, em que a enzima oxidase e a enzi- ma redutase engenheiradas são separadas. Em algumas modalida- des, a oxidase engenheirada pode estar dentro de uma epimerase fundida engenheirada, onde a enzima oxidase e a enzima redutase engenheiradas são fundidas.

[0012] Em um outro aspecto da invenção, um método de epimeri- zação de um estereocentro de um alcaloide 1-benzilisoquinolina é pro-

vido. O método compreende contato do alcaloide 1-benzilisoquinolina com pelo menos uma epimerase engenheirada. Contato do alcaloide 1-benzilisoquinolina com uma epimerase dividida engenheirada inverte e estereoquímica do estereocentro do alcaloide 1-benzilisoquinolina para a estereoquímica oposta do estereocentro do alcaloide 1-benzili- soquinolina mais eficientemente do que usando uma epimerase do tipo selvagem.

[0013] Em alguns exemplos, uma célula não planta engenheirada compreende uma pluralidade de sequências de codificação, cada uma codificando uma enzima que é selecionada do grupo de enzimas lista- das na Tabela 3. Em alguns exemplos, as sequências de codificação heterólogas podem ser operavelmente conectadas. Sequências de co- dificação heterólogas que são operavelmente conectadas podem estar dentro da mesma via de produção de um produto alcaloide benziliso- quinolina através de uma atividade de epimerase engenheirada, com- preendendo enzimas oxidase e redutase engenheiradas.

[0014] Em um aspecto adicional da invenção, uma célula não plan- ta engenheirada que produz uma quantidade aumentada de um produ- to alcaloide bisbenzilisoquinolina usando uma epimerase dividida en- genheirada em contraste com o uso de uma epimerase do tipo selva- gem é provida. Em um aspecto adicional da invenção, uma célula não planta engenheirada que produz uma quantidade aumentada de pro- duto bisbenzilisoquinolina usando uma epimerase fundida engenheira- da em contraste com o uso de uma epimerase do tipo selvagem é pro- vida. O alcaloide bisbenzilisoquinolina é produzido usando uma enzi- ma de acoplamento que está presente dentro da célula não planta en- genheirada. Ainda, a célula não planta engenheirada compreende pelo menos duas sequências de codificação heterólogas codificando uma epimerase dividida engenheirada, tendo uma enzima oxidase e uma enzima redutase separada, usadas na produção de pelo menos um monômero de alcaloide benzilisoquinolina dentro da célula não planta engenheirada. Ainda, a pelo menos uma enzima de acoplamento pode dimerizar dois monômeros de alcaloide de benzilisoquinolina dentro da célula não planta engenheirada, desta maneira formando o alcaloide bisbenzilisoquinolina.

[0015] Em um aspecto adicional da invenção, uma célula não planta engenheirada que produz uma quantidade aumentada de um produto alcaloide promorfinano ou morfinano usando uma epimerase dividida en- genheirada em contraste com o uso de uma epimerase do tipo selvagem é provida. Em um aspecto adicional da invenção, uma célula não planta engenheirada que produz uma quantidade aumentada de um produto alcaloide promorfinano ou morfinano usando uma epimerase fundida engenheirada em contraste com o uso de uma epimerase do tipo selva- gem é provida. A célula não planta engenheirada compreende pelo me- nos duas sequências de codificação heterólogas codificando uma epime- rase dividida engenheirada, tendo uma enzima oxidase separada e uma enzima redutase separada, usadas na produção de pelo menos um alca- loide morfinano dentro da célula não planta engenheirada.

[0016] Em um aspecto adicional da invenção, uma célula não plan- ta engenheirada que produz uma quantidade aumentada de um produ- to nal-opioide ou nor-opioide usando uma epimerase fundida enge- nheirada em contraste com o uso de uma epimerase do tipo selvagem é provida. A célula não planta engenheirada compreende pelo menos duas sequências de codificação heterólogas codificando uma epimerase dividida engenheirada, tendo uma enzima oxidase separada e uma en- zima redutase separada, usadas na produção de pelo menos um nal- opioide ou nor-opioide dentro da célula não planta engenheirada.

[0017] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para aumento da produção de produtos alcaloides diversos através da con- versão de um alcaloide promorfinano em um alcaloide morfinano atra-

vés de tebaína sintase em uma célula hospedeira engenheirada. Em modalidades adicionais, a presente invenção provê métodos para pro- dução aumentada de produtos alcaloides diversos através da conver- são de salutaridino|l-7-O-acetato em tebaína através de uma tebaína sintase. Exemplos de tebaína sintases parentais compreendem se- quências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33 e 34, como listado na Tabela 2.

[0018] Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para aumento da produção de produtos alcaloides diversos através da con- versão de um alcaloide promorfinano em um alcaloide morfinano atra- vés de tebaína sintases engenheiradas em uma célula hospedeira en- genheirada. Em modalidades adicionais, a presente invenção provê métodos para aumento da produção de produtos alcaloides diversos através da conversão de salutaridinol-7-O-acetato em tebaína através de uma tebaína sintase engenheirada.

[0019] Em algumas modalidades, a tebaína sintase engenheirada é uma enzima de fusão. Em modalidades adicionais, a tebaína sintase é fundida a uma enzima acetil transferase. Em modalidades adicionais, a tebaína sintase é codificada dentro de uma enzima acetil transfera- se. Em outras modalidades, a tebaína sintase é fundida a uma enzima redutase.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

[0020] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente men- cionados no presente pedido são aqui incorporados a título de referên- cia até o mesmo ponto que se cada publicação, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado ser incorpo- rado a título de referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0021] Os novos elementos da invenção são mostrados com parti- cularidade nas reivindicações apensas. Uma melhor compreensão dos elementos e vantagens da invenção será obtida através de referência à descrição detalhada que segue que mostra modalidades ilustrativas, em que os princípios da invenção são utilizados, e cujos desenhos acompanhantes:

[0022] A FIG. 1 ilustra exemplos de síntese, reciclagem e vias de salvamento de tetra-hidrobiopterina, de acordo com modalidades da invenção.

[0023] A FIG. 2 ilustra um esquema biossintético para conversão de glicose em 4-HPA, dopamina e 3,4-DHPA, de acordo com modali- dades da invenção.

[0024] A FIG. 3 ilustra um exemplo esquemático de formação de alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina, de acordo com modalidades da in- venção.

[0025] A FIG. 4 ilustra uma sequência de aminoácido de uma en- zima de fusão DRS-DRR parental, de acordo com modalidades da in- venção.

[0026] A FIG. 5 ilustra sequências de aminoácido de uma enzima DRS e uma enzima DRR, respectivamente, que são derivadas de uma enzima de fusão parental ilustrada na FIG. 4, de acordo com modali- dades da invenção.

[0027] A FIG. 6 ilustra uma enzima tendo atividade opioide 3-O- desmetilase, de acordo com modalidades da invenção.

[0028] A FIG. 7 ilustra uma enzima tendo atividade opioide N-des- metilase, de acordo com modalidades da invenção.

[0029] A FIG. 8 ilustra uma enzima tendo atividade N-metiltransfe- rase, de acordo com modalidades da invenção.

[0030] A FIG. 9 ilustra a expressão funcional de variantes de BM3, de acordo com modalidades da invenção.

[0031] A FIG. 10 ilustra um esquema de biossíntese para conver- são de L-tirosina em um nor-opioide ou nal-opioide em uma célula mi-

crobiana, de acordo com modalidades da invenção.

[0032] A FIG. 11 ilustra vetores de plasmídeo/YAC compreenden- do sequência de aminoácido com códon otimizado de enzimas DSR- DRR e DRS e DRR para expressão e engenharia de enzima, de acor- do com modalidades da invenção.

[0033] A FIG. 12 ilustra um esquema biossintético para conversão de L-tirosina em reticulina através de norcoclaurina, de acordo com modalidades da invenção.

[0034] A FIG. 13 ilustra um esquema biossintético para conversão de L-tirosina em reticulina através de norlaudanosolina, de acordo com modalidades da invenção.

[0035] A FIG. 14 ilustra um esquema biossintético para conversão de L-tirosina em alcaloides morfinano, de acordo com modalidades da invenção.

[0036] A FIG. 15 ilustra um esquema biossintético para produção de opioides semissintético, de acordo com modalidades da invenção.

[0037] A FIG. 16 ilustra um esquema biossintético para produção de opioides, de acordo com modalidades da invenção.

[0038] A FIG. 17 ilustra (A) um esquema biossintético para con- versão de L-tirosina em bisBIAs e (B) cepas de levedura engenheira- das para biossintetizar bisBIAs, de acordo com modalidades da inven- ção.

[0039] A FIG. 18 ilustra que expressão de DRS e DRR separadas produziu quantidades maiores de salutaridina em comparação com a parental fundida, de acordo com modalidades da invenção.

[0040] A FIG. 19 ilustra que a concentração de quase todos os intermediários de via foi aumentada na cepa expressando enzimas DRS e DRR separadas em relação à cepa expressando a parental fundida, de acordo com modalidades da invenção.

[0041] A FIG. 20 ilustra separação quiral de reticulina, de acordo com modalidades da invenção.

[0042] A FIG. 21 ilustra que quando expressão de DRS é alta (promotor TDH3) e expressão de DRR é baixa (ou promotor CYC1), uma quantidade máxima de salutaridina em torno de 20 uM foi produ- zida, de acordo com modalidades da invenção.

[0043] As FIGURAS 22 e 23 ilustram, cada uma, um modelo ho- mólogo de DRS com base em 4NKX, de acordo com modalidades da invenção.

[0044] A FIG. 24 ilustra um alinhamento entre PDDRS-DRR, PrDRS e PrDRR, de acordo com modalidades da invenção.

[0045] A FIG. 25 ilustra expressão de variantes separadas de DRS e DRR, em que a variante de DRS é engenheirada com mutações de aumento que produziram quantidades maiores de tebaína em compa- ração com a variante de DRS parental, de acordo com modalidades da invenção.

[0046] A FIG. 26 ilustra cepas de plataforma de levedura para a produção de reticulina a partir de L-tirosina, de acordo com modalida- des da invenção.

[0047] A FIG. 27 ilustra cepas de levedura para a produção de te- baína e hidrocodona a partir de L-tirosina, de acordo com modalidades da invenção.

[0048] A FIG. 28 ilustra a reação de fechamento de anel geral convertendo uma base de tetraciclina em uma base de pentaciclina, de acordo com modalidades da invenção.

[0049] A FIG. 29 ilustra a produção de alcaloide morfinano tebaína a partir de açúcar e L-tirosina a partir de uma cepa de levedura enge- nheirada, de acordo com modalidades da invenção.

[0050] A FIG. 30 ilustra a produção de alcaloides promorfinano e um alcaloide morfinano tebaína a partir de açúcar e L-tirosina a partir de uma cepa de levedura engenheirada, de acordo com modalidades da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0051] A invenção provê métodos para produção aumentada de produtos alcaloides diversos, em comparação com o uso de uma epi- merase DRS-DRR fundida, através da expressão independente de di- edro reticulina sintase (DRS) e diedro reticulina redutase (DRR) e o uso de enzimas DRS e DRR em epimerização de um alcaloide (S)-1- benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina. A presen- te invenção também provê métodos para a produção de alcaloides benzilisoquinolina diversos (BIAs) em células hospedeiras engenheira- das usando epimerases engenheiradas. Ainda, a presente invenção provê métodos para a produção de um conjunto de epimerases enge- nheiradas em células hospedeiras engenheiradas. Em alguns casos, as enzimas DRS e DRR podem ser derivadas de uma epimerase pa- rental. Em alguns casos, as enzimas DRS e DRR podem ser, cada uma, derivadas de uma epimerase parental separada. Em alguns ca- sos as enzimas DRS e DRR podem ser derivadas de uma ou mais epimerases parentais. Como discutido aqui, a expressão independente de DRS e DRR, quando comparada com a expressão de DRS-DRR fundida, melhora substancialmente a conversão de um alcaloide (S)-1- benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina, incluindo (S)-reticulina em (R)-reticulina. Em casos particulares, a invenção pro- vê métodos para produção de produtos alcaloides bisbenzilisoquinoli- na, promorfinano, morfinano, nal-opioide e nor-opioide através da con- versão aumentada de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um al- caloide (R)-1-benzilisoquinolina em uma célula hospedeira engenhei- rada. Em casos particulares adicionais, a invenção provê métodos pa- ra produção de produtos alcaloides promorfinano, morfinano, nal- opioide e nor-opioide através da conversão aumentada de (S)- reticulina em (R)-reticulina em uma célula hospedeira engenheirada.

Em casos particulares adicionais, a presente invenção provê métodos para produção de produtos alcaloides diversos através da conversão aumentada de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina.

[0052] A conversão de (S)-reticulina em (R)-reticulina é uma etapa importante na produção de alcaloides morfinano e papoulas de ópio. Nos últimos anos, vários grupos acadêmicos diferentes identificaram independentemente variantes de DRS-DRR fundidas que realizam es- sa etapa (Winzer e outros, 2015, Farrow e outros, 2015, Galanie e ou- tros, 2015). Uma característica notável dessa enzima é que nas plan- tas de produção de alcaloide morfinano, ele é encontrado como uma fusão traducional entre duas enzimas, uma citocromo P450 e uma al- do-ceto redutase. Em plantas intimamente relacionadas que não pro- duzem esses compostos, essas enzimas não são fundidas e então são expressas separadamente. É pensado que a fusão das duas enzimas permite canalização de substrato aperfeiçoada, uma vez que o produto da primeira enzima, que converte (S)-reticulina em diedro-reticulina, é o substrato direto da segunda enzima, que converte deidro-reticulina em (R)-reticulina (Winzer e outros, 2015).

[0053] O presente pedido descreve aperfeiçoamentos em enge- nharia de proteína para variantes de DRS-DRR que resultaram em aumentos substanciais em atividade em comparação com uma molé- cula parental. Resultados experimentais mostram que a separação e expressão independente de duas enzimas, uma citocromo P450 cha- mada deidro-reticulina sintase (DRS) e uma aldo-ceto redutase cha- mada deidro-reticulina redutase (DRR), derivadas de uma enzima pa- rental evolucionariamente fundida, substancialmente melhoraram a conversão de (S)- em (R)-reticulihna em uma célula hospedeira de le- vedura heteróloga. Melhorias em DRS através de mutagênese e avali- ação também melhoraram atividade da enzima.

[0054] Os exemplos descritos aqui mostram que a separação e expressão de enzimas DRS e DRR independentes, derivadas de uma ou mais epimerases parentais, em uma cepa carregando uma via de benzilisoquinolina alcaloide (BIA), resultou em um aumento substancial em produção de salutaridina, quando atividade de salutaridina sintase (SalSyn) não era limitante com relação à quantidade de (R)-reticulina produzida. A cepa expressando DRS e DRR separadamente ainda mostrou uma quantidade aumentada em todos os intermediários de via de BIA até salutaridina. Quando da separação quiral de reticulina de levedura, as células que expressaram DRS e DRR separadamente produziram predominantemente (R)-reticulina, em comparação com fusão de enzima DRS-DRR parental, que produziu quantidades equi- valentes de (S)- e (R)-reticulina. Para investigar qual das atividades de DRS e DRR independentes era limitante, uma série de vetores com resistências de promotor variáveis foi construída. Expressão diferencial de DRS e DRR mostrou que atividade de DRS intracelular era limitante com relação à DRR. Para compreender melhor a função de DRS em levedura, e atribuir função a resíduos benéficos identificados por me- lhorias em engenharia de proteína, um modelo de homologia estrutural foi construído com base na estrutura existente de citocromo esteroido- gênica humana P450 CYP17A1. Para melhorar a atividade de DRS intracelular, a ORF de DRS foi aleatoriamente mutagenizada e quase

5.000 variantes mutantes independentes foram avaliadas quanto à produção de salutaridina. A partir dessas variantes, uma variante com- binatorial contendo 6 mutações diferentes foi identificada e seleciona- da para introdução e expressão em cepas de produção de BIA.

[0055] Em casos particulares, a invenção provê métodos para pro- dução de produtos alcaloides promorfinano, morfinano, nal-opioide e nor-opioide através da conversão aumentada de um alcaloide promor- finano em um alcaloide morfinano em uma célula hospedeira enge-

nheirada. Em casos particulares adicionais, a invenção provê métodos para produção de produtos alcaloides morfinano, nal-opioide e nor- opioide através da conversão aumentada de um alcaloide promorfina- no em um alcaloide morfinano em uma célula hospedeira engenheira- da. Em casos particulares adicionais, a presente invenção provê mé- todos para produção de diversos produtos alcaloides através da con- versão aumentada de um alcaloide promorfinano em um alcaloide morfinano. Alcaloides Benzilisoquinolina (BIAs) de Interesse

[0056] Células hospedeiras que produzem BIAs de interesse são providas. Em alguns exemplos, cepas engenheiradas de células hos- pedeiras tais como as cepas engenheiradas da invenção proveem uma plataforma para produção de alcaloides benzilisoquinolina de inte- resse e modificações dos mesmos através de várias classes estrutu- rais incluindo, mas não limitado a, BIAs precursoras, benzilisoquinoli- na, promorfinanos, morfinanos, bisbenzilisoquinolina, nal-opioides, nor- opioides e outros. Cada uma dessas classes pretende incluir precurso- res biossintéticos, intermediários, e metabolitos dos mesmos, de qual- quer membro conveniente de uma via biossintética de célula hospedei- ra engenheirada que pode levar a um membro da classe. Exemplos não limitantes de compostos são dados abaixo para cada uma dessas classes estruturais. Em alguns casos, a estrutura de um dado exemplo pode ou não ser caracterizada em si como um alcaloide benzilisoqui- nolina. As presentes entidades químicas pretendem incluir todos os isômeros possíveis, incluindo enantiômeros simples, misturas racêmi- cas, formas opticamente puras, misturas de diastereômeros e misturas intermediárias.

[0057] Precursores de alcaloide benzilisoquinolina podem incluir, mas não estão limitados a, norcoclaurina (NC) e norlaudanosolina (NL), bem como precursores de NC e NL, tais como tirosina, tiramina, 4-

hidroxifenilacetaldeído (4-HPA), ácido 4-hidroxifenilpirúvico (4-HPPA), L-3,4-di-hidroxifenilalanina — (L-DOPA), — 3,4-di-hidroxifenilacetaldeído (3,4-DHPA) e dopamina. Em algumas modalidades, o um ou mais pre- cursores de BIA são 3,4-di-hidrofenilacetaldeído (3,4-DHPA) e dopa- mina. Em certos casos, o um ou mais precursores de BIA são 4-hidro- xifenilacetaldeído (3,4-DHPA) e dopamina. Em certos casos, o um ou mais precursores de BIA são 4-hidroxifenilacetaldeído (4-HPA) e do- pamina. Em particular, NL e NC podem ser sintetizados, respectiva- mente, a partir de moléculas precursoras através de uma reação de condensação Pictet-Spengler, onde a reação pode ocorrer espontane- amente ou pode ser catalisada por quaisquer enzimas de conversão.

[0058] Benzilisoquinolinas podem incluir, mas não estão limitadas a, norcoclaurina, norlaudanosolina, coclaurina, 3'-hidroxicoclaurina, 4'- O-metilnorlaudanosolina, 4 -O-metil-laudanosolina, N-metilnorcoclau- rina, laudanosolina, N-metilcoclaurina, 3'-hidróxi-N-metilcoclaurina, re- ticulina, norreticulina, papaverina, laudanina, laudanosina, tetra-hi- dropapaverina, 1,2-di-hidropapaverina e orientalina.

[0059] Promorfinanos podem incluir, mas não estão limitados a, salutaridina, salutaridinol e salutaridinol-7-O-acetato.

[0060] Morfinanos podem incluir, mas não estão limitados a, tebaí- na, codeinona, codeína, morfina, morfinona, oripavina, neopinona, ne- opina, neomorfina, hidrocodona, di-hidrocodeína, 14-hidroxicodeinona, oxicodona, 14-hidroxicodeína, morfinona, hidromorfona, di-hidromorfi- na, di-hidroetorfina, etilmorfina, etorfina, metopona, buprenorfina, fol- codina, heterocodeína e oximorfona.

[0061] Bisbenzilisoquinolinas podem incluir, mas não estão limita- das a, berbamunina, guategaumerina, dauricina e liensinina.

[0062] Nal-opioides podem incluir, mas não estão limitados a, nal- trexona, naloxona, nalmefe, nalorfina, nalodeína, naldemedina, nalo- xegol, 6B-naltrexol, naltrindol, metilnaltrexona, metilsamidorfano, alvi-

mopam, axelopram, bevenpram, dinicotinato, levalorfano, samidorfano, buprenorfina, dezocina, eptazocina, butorfanol, levorfanol, nalbufina, pentazocina, fenazocina, norbitaltorfimina e diprenorfina.

[0063] Nor-opioides podem incluir, mas não estão limitados a, nor- codeína, noroxicodona, nortebaína, noridrocodona, nordi-hidro-codeína, nor-14-hidróxi-codeína, norcodeinona, nor-14-hidróxi-codeinona, nor- morfina, noroximorfona, nororipavina, nor-hidromorfolina, nordi-hidro- morfina, nor-14-hidróxi-morfina, normorfinona e nor-14-hidróxi-morfi- nona.

[0064] Em certas modalidades, as cepas engenheiradas da inven- ção podem prover uma plataforma para produção de compostos rela- cionados à síntese de tetra-hidrobiopterina incluindo, mas não limitado a, trifosfato de di-hidroneopterina, 6-piruvoil tetra-hidropterina, 5,6,7,8- tetra-hidrobiopterina, 7,8-di-hidrobiopterina, tetra-hidrobiopterina 4a- carbinolamina, di-hidrobiopterina quinonoide e biopterina. Células Hospedeiras

[0065] Quaisquer células convenientes podem ser utilizadas nas cé- lulas hospedeiras e métodos objetos. Em alguns casos, as células hos- pedeiras são células não planta. Em alguns casos, as células hospedei- ras podem ser caracterizadas como células microbianas. Em certos ca- Sos, as células hospedeiras são células de inseto, células de mamífero, células bacterianas, células fúngicas ou células de levedura. Qualquer tipo conveniente de célula hospedeira pode ser utilizado na produção das células produtoras de BIA objeto, vide, por exemplo, US2008/017675A4, US2014/0273109, PCT/US2014/063738, PCT/US2016/ 030808, PCT/ US2015/060891, POCT/US2016/031506 e PCT/US2017/057237, cujas descrições são aqui incorporadas a título de referência em sua totali- dade. Células hospedeiras de interesse incluem, mas não estão limita- das a, células bacterianas tais como Bacillus subtilis, Escherichia coli, Streptomyces, Anabaena, Arthrobacter, Acetobacter, Acetobacterium,

Bacillus, Bifidobacterium, Brachybacterium, Brevibacterium, Carnobac- terium, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Escherichia, Glu- conacetobacter, Gluconobacter, Hafnia, Halomonas, Klebsiella, Kocu- ria, Lactobacillus, Leucononstoc, Macrococcus, Methylomonas, Me- thylobacter, Methylocella, Methylococcus, Microbacterium, Micrococ- cus, Microcystis, Moorella, Oenococcus, Pediococcus, Prochlorococ- cus, Propionibacterium, Proteus, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Psychrobacter, Rhodobacter, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Ser- ratia, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Synechococcus, Synechocystis, Tetragenococcus, Weissella, Zymomonas e Salmonella typhimuium, células de inseto tais como células de Drosophila mela- nogaster S2 e Spodoptera frugiperda Sf9 e células de levedura tais como células de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe e Pichia pastoris.

Em alguns exemplos, as células hospedeiras são células de levedura ou células de E. coli.

Em alguns casos, a célu- la hospedeira é uma célula de levedura.

Em alguns casos, a célula hospedeira é de uma cepa de levedura engenheirada para produzir uma BIA de interesse, tal como alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina.

Em alguns casos, a célula hospedeira é de uma cepa de levedura enge- nheirada para produzir enzimas de interesse.

Em alguns casos, a célu- la hospedeira é de uma levedura engenheirada para produzir uma epimerase engenheirada.

Em algumas modalidades, uma epimerase engenheirada pode ser uma epimerase dividida engenheirada.

Em al- gumas modalidades, uma epimerase engenheirada pode ser uma epimerase fundida engenheirada.

Em algumas modalidades, atividade de epimerase pode ser codificada por enzimas oxidase e redutase se- paradas.

Ainda, em algumas modalidades uma epimerase engenhei- rada pode ser capaz de converter mais eficientemente um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em relação à epimerase parental.

Em algumas modalidades, uma epime-

rase parental pode ser uma epimerase do tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma epimerase parental pode ser substancialmente si- milar a uma epimerase do tipo selvagem. Em alguns casos, uma epi- merase parental que é substancialmente similar a uma epimerase do tipo selvagem pode ter uma sequência de aminoácido que é pelo me- nos 75% ou mais, 80% ou mais, 81% ou mais, 82% ou mais, 83% ou mais, 84% ou mais, 85% ou mais, 86% ou mais, 87% ou mais, 88% ou mais, 89% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais similar a uma sequência de aminoácido de uma epimerase do tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma epimera- se engenheirada pode ser separada em enzimas menores que exibem atividades de oxidase e redutase que convertem mais eficientemente um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benziliso- quinolina em relação à sua epimerase parental correspondente.

[0066] Em alguns casos, a célula hospedeira é de uma cepa de levedura engenheirada para produzir uma tebaína sintase. A tebaína sintase pode ser capaz de converter mais eficientemente um salutari- dinol-7-O-acetato em uma tebaína relativa a uma reação espontânea. Em alguns casos, a célula hospedeira é de uma cepa de levedura en- genheirada para produzir uma tebaína sintase engenheirada. Em al- gumas modalidades, uma tebaína sintase engenheirada pode ser uma enzima de fusão engenheirada. Ainda, a tebaína sintase engenheirada pode ser capaz de converter mais eficientemente um salutaridinol-7-O- acetato em uma tebaína relativa a uma tebaína sintase parental. Em algumas modalidades, a tebaína sintase parental pode ser uma tebaí- na sintase do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a tebaína sin- tase parental pode ser substancialmente similar a uma tebaína sintase do tipo selvagem. Em alguns casos, uma tebaína sintase parental que é substancialmente similar a uma tebaína sintase do tipo selvagem pode ter uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75% ou mais, 80% ou mais, 81% ou mais, 82% ou mais, 83% ou mais, 84% ou mais, 85% ou mais, 86% ou mais, 87% ou mais, 88% ou mais, 89% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais similar a uma sequência de aminoácido de uma tebaína sin- tase do tipo selvagem. A tebaína sintase engenheirada pode ser en- genheirada como uma enzima de fusão com uma outra enzima para converter mais eficientemente um salutaridinol-7-O-acetato em uma tebaína em relação à tebaína sintase parental.

[0067] Qualquer uma das células hospedeiras descritas nos US2008/0176754, US2014/0273109, PCTUS2014/063738, PCT/ US2016/030808, PCT/US2015/060891, PCT/US2016/031506, PCT/ US2017/057237 e Pedido de Patente Provisório No. 62/627,264 de Smolke e outros pode ser adaptada para uso nas células hospedeiras e métodos. Em certas modalidades, as células de levedura podem ser da espécie Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Em certas mo- dalidades, as células de levedura podem ser da espécie Schizosac- charomyces pombe. Em certas modalidades, as células de levedura podem ser da espécie Pichia pastoris. Levedura é de interesse como uma célula hospedeira porque proteínas citocromo P450 são capazes de dobrar apropriadamente na membrana do retículo endoplásmico de modo que sua atividade é mantida. Em exemplos, as proteínas cito- cromo P450 estão envolvidas em algumas vias biossintéticas de inte- resse. Em exemplos adicionais, proteínas citocromo P450 estão en- volvidas na produção de BIAs de interesse. Em exemplos adicionais, proteínas citocromo P450 estão envolvidas na produção de uma enzi- ma de interesse.

[0068] Cepas de levedura de interesse que encontram uso na in- venção incluem, mas não estão limitadas a, CEN.PK (Genótipo: MA-

Tala ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 leu2-3 112/leu2-3 112 his3 A1/his3 01 MAL2-8C/MAL2-8C SUC2/SUC2), S288C, W303, D273- 10B, X2180, A3S64A, >1278B, AB972, SK1 e FL100. Em certos casos, a cepa de levedura é qualquer uma de S288C (MATa; SUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1i flo8-1 hap1), BY4741 (MATa; his3A1; leu2A0; met15A0; ura3AO), BY4742 (MATa; his341; leu2AO; Iys2A0; ura3AO), BY4743 (MATa/MATa; his3A1/his3A1; leu2AO/leu2AO0; met15A0/ MET15; LYS2/Iys2A0; ura3AO/ura3AO), eWAT11 ou W(R), derivados da cepa W303-B (MATa; ade2-1; his3-11, -15; leu2-3,-112; ura3-1; canR; cyr+) que expressam a ATR1 redutase NADPH-P450 de Arabi- dopsis thaliana e a CPR1 redutase de NADPH-P450 de levedura, res- pectivamente. Em uma outra modalidade, a célula de levedura é W303alpha (MATa; his3-11,15 trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1). A identi- dade e o genótipo de cepas de levedura adicionais de interesse po- dem ser encontrados em EUROSCARF (web.uni-frankfurt.de/fb15/ mi- kro/euroscarf/col index.html).

[0069] Em alguns casos, a célula hospedeira é uma célula fúngica. Em certas modalidades, as células fúngicas podem ser da espécie As- pergillus e as cepas incluem Aspergillus niger (ATCC 1015, ATCC 9029, CBS 513.88), Aspergillus oryzae (ATCC 56747, RIB40), Asper- gillus terreus (NIH 2624, ATCC 20542) e Aspergillus nidulans (FGSC A4).

[0070] Em certas modalidades, sequências de codificação heteró- logas podem ser otimizadas no códon para expressão em Aspergillus Sp. e expressas a partir de um promotor apropriado. Em certas moda- lidades, o promotor pode ser selecionado de promotor de fosfoglicera- to cinase (PGK), promotor MbfA, promotor de subunidade de citocro- ma c oxidase (CoxA), promotor SrpB, promotor TvdA, promotor da ma- lato desidrogenase (MdhA), promotor de beta-manosidase (ManB). Em certas modalidades, um terminador pode ser selecionado de termina-

dor da glucoamilase (GIlaA) ou terminador de TrpC. Em certas modali- dades, o cassete de expressão consistindo em um promotor, sequên- cia de codificação heteróloga e terminador pode ser expresso a partir de um plasmídeo ou integrado ao genoma do hospedeiro. Em certas modalidades, seleção de células mantendo o plasmídeo ou cassete de integração pode ser realizada com seleção com antibiótico tal como utilização de higromicina ou utilização de fonte de nitrogênio, tal como usando acetamida como a única fonte de nitrogênio. Em certas moda- lidades, construtos de DNA podem ser introduzidos nas células hos- pedeiras usando métodos de transformação estabelecidos tal como transformação de protoplasto, acetato de lítio ou eletroporação. Em certas modalidades, as células podem ser culturadas em ME líquido ou MEA sólido (extrato de malte 3%, peptona 0,5% e ágar 1,5%) ou em meio mínimo de Vogel com ou sem seleção.

[0071] Em alguns casos, a célula hospedeira é uma célula bacteri- ana. A célula bacteriana pode ser selecionada de qualquer gênero bacteriano. Exemplos de gêneros a partir dos quais a célula bacteriana pode vir incluem Anabaena, Arthrobacter, Acetobacter, Acetobacte- rium, Bacillus, Bifidobacterium, Brachybacterium, Brevibacterium, Car- nobacterium, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Escherichia, Gluconacetobacter, Gluconobacter, Hafnia, Halomonas, Klebsiella, Kocuria, Lactobacillus, Leucononstoc, Macrococcus, Methylomonas, Methylobacter, Methylocella, Methylococcus, Microbacterium, Micro- coccus, Microcystis, Moorella, Oenococcus, Pediococcus, Prochloro- coccus, Propionibacterium, Proteus, Pseudoalteromonas, Pseudomo- nas, Psychrobacter, Rhodobacter, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Synechococ- cus, Synechocystis, Tetragenococcus, Weissella, and Zymomonas. Exemplos de espécies bacterianas que podem ser usadas com os mé- todos da presente invenção incluem Arthrobacter nicotianae, Aceto-

bacter aceti, Arthrobacter arilaitensis, Bacillus cereus, Bacillus coagu- lans, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Baci- Ilus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis, Brachybacterium tyrofermentans, Brevibacterium linens, Carnobacte- rium divergens, Corynebacterium flavescens, Enterococcus faecium, Gluconacetobacter europaeus, Gluconacetobacter johannae, Gluco- nobacter oxydans, Hafnia alvei, Halomonas elongata, Kocuria rhizophi- la, Lactobacillus acidifarinae, Lactobacillus jensenii, Lactococcus lactis, Lactobacillus yamanashiensis, Leuconostoc citreum, Macrococcus ca- seolyticus, Microbacterium foliorum, Micrococcus Iylae, Oenococcus oeni, Pediococcus acidilactici, Propionibacterium acidipropionici, Pro- teus vulgaris, Pseudomonas fluorescens, Psychrobacter celer, Sta- bphylococcus condimenti, Streptococcus thermophilus, Streptomyces griseus, Tetragenococcus halophilus, Weissella cibaria, Weissella ko- reensis, Zymomonas mobilis , Corynebacterium glutamicum, Bifidobac- terium bifidum/breve/longum, Streptomyces lividans, Streptomyces co- elicolor, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sakei, Lactobacillus ca- sei, Pseudoalteromonas citrea, Pseudomonas putida, Clostridium ljungdahlii/aceticum/acetobutylicum/beijerinckii/butyricum e Moorella themocellum/thermoacetica.

[0072] Em certas modalidades, as células bacterianas podem ser de uma cepa de Escherichia coli. Em certas modalidades, a cepa de E. coli pode ser selecionada de BL21, DH5a, XL1-Blue, HB101, BL21 e K12. Em certas modalidades, sequências de codificação heterólogas podem ser otimizadas no códon para expressão em E. coli e expres- sas a partir de um promotor apropriado. Em certas modalidades, o promotor pode ser selecionado do promotor T7, do promotor tac, pro- motor trc, promotor induzível por tetraciclina (tet), promotor do operon lac (lac), promotor lacO1. Em certas modalidades, o cassete de ex- pressão consistindo em um promotor, sequência de codificação hete-

róloga e terminador pode ser expresso a partir de um plasmídeo ou integrado ao genoma. Em certas modalidades, o plasmídeo é selecio- nado de pUC19 ou pBAD. Em certas modalidades, seleção de células mantendo o plasmídeo ou cassete integrado pode ser realizada com seleção com antibiótico tal como canamicina, cloranfenicol, estrepto- micina, espectinomicina, gentamicina, eritromicina ou ampicilina. Em certas modalidades, construtos de DNA podem ser introduzidos nas células hospedeiras usando métodos de transformação estabelecidos tal como conjugação, transformação química por choque térmico ou eletroporação. Em certas modalidades, as células podem ser cultura- das em meio líquido Luria-Bertani (LB) em cerca de 37ºC com ou sem antibiótico.

[0073] Em certas modalidades, as células bacterianas podem ser uma cepa de Bacillus subtilis. Em certas modalidades, a cepa de B. subtilis pode ser selecionada de 1779, GP25, RO-NN-1, 168, BSn5, BEST195, 1A382 e 62178. Em certas modalidades, sequências de co- dificação heteróloga podem ser otimizadas no códon para expressão em Bacillus sp. e expressas a partir de um promotor apropriado. Em certas modalidades, o promotor pode ser selecionado de promotor grac, promotor p43 ou promotor trnQ. Em certas modalidades, o cas- sete de expressão consistindo no promotor, sequência de codificação heteróloga e terminador pode ser expresso a partir de um plasmídeo ou integrado ao genoma. Em certas modalidades, o plasmídeo é sele- cionado de pHP13, pE 194, pC194, pHTO1 ou pHT43. Em certas moda- lidades, vetores de integração tal como pDG364 ou pDG1730 podem ser usados para integrar o cassete de expressão no genoma. Em cer- tas modalidades, seleção de células mantendo o plasmídeo ou casse- te de integração pode ser realizada com seleção com antibiótico tais como eritromicina, canamicina, tetraciclina e espectinomicina. Em cer- tas modalidades, construtos de DNA podem ser introduzidos nas célu-

las hospedeiras usando métodos de transformação estabelecidos tal como competência natural, choque térmico ou transformação química. Em certas modalidades, as células podem ser culturadas em meio lí- quido Luria-Bertani (LB) a 37ºC ou meio M9 mais glicose e triptofano. Modificações Genéticas para Células Hospedeiras

[0074] As células hospedeiras podem ser engenheiradas para in- cluir uma ou mais modificações (tais como duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou até mesmo mais modificações) que provejam a produção de BIAs de interesse. Adicionalmente ou alterna- tivamente, as células hospedeiras podem ser engenheiradas para in- cluir uma ou mais modificações (tais como duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou até mesmo mais modificações) que provejam a produção de enzimas de interesse. Em alguns casos, uma modificação é uma modificação genética, tal como uma mutação, adi- ção ou deleção de um gene ou fragmento do mesmo ou regulagem de transcrição de um gene ou fragmento do mesmo. Como aqui usado, o termo "mutação" se refere a uma deleção, inserção ou substituição de um resíduo de aminoácido(s) ou resíduo de nucleotídeo(s) em relação a uma sequência ou motivo de referência. A mutação pode ser incor- porada como uma mutação direcionada para o gene nativo no locus original. Em alguns casos, a mutação pode ser incorporada como uma cópia adicional do gene introduzido como uma integração genética em um locus separado ou como uma cópia adicional em um vetor episso- mal tal como um plasmídeo de 2 yu ou centromérico. Em certos casos, a cópia inibida por substrato da enzima está sob a regulagem transcri- pcional de célula nativa. Em alguns casos, a cópia inibida por substra- to da enzima é introduzida com regulagem constitutiva ou dinâmica engenheirada de expressão de proteína ao pô-la sob o controle de um promotor sintético. Em alguns exemplos, o objeto de uma ou mais mo- dificações pode ser um gene nativo. Em alguns exemplos, o objeto de uma ou mais modificações pode ser um gene não nativo. Em alguns exemplos, um gene não nativo pode ser inserido em uma célula hos- pedeira. Em exemplos adicionais, um gene não nativo pode ser altera- do por uma ou mais modificações antes de ser inserido em uma célula hospedeira.

[0075] Uma célula hospedeira engenheirada pode produzir em ex- cesso uma ou mais BIAs de interesse. Por produção em excesso quer dizer que a célula tem produção melhorada ou aumentada de uma mo- lécula de BIA de interesse em relação a uma célula controle (por exemplo, uma célula não modificada). Por produção melhorada ou aumentada quer dizer ambos a produção de alguma quantidade da BIA de interesse onde o controle não tem nenhuma BIA de produção de interesse, bem como um aumento de cerca de 10% ou mais, tal como cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, tal como 2 vezes ou mais, tal como 5 vezes ou mais, incluindo 10 vezes ou mais em situações onde o con- trole tem alguma BIA de produção de interesse.

[0076] Uma célula hospedeira engenheirada pode produzir em excesso um ou mais alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina. Em alguns ca- sos, a célula hospedeira engenheirada pode produzir alguma quanti- dade de alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina de interesse onde o controle não tem nenhuma produção de alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina, bem como um aumento de cerca de 10% ou mais, tal como cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, tal como 2 vezes ou mais, tal como 5 vezes ou mais, incluindo 10 vezes ou mais em situações onde o controle tem um pou- co de alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina de produção de interesse.

[0077] Uma célula hospedeira engenheirada pode ainda produzir em excesso um ou mais alcaloides (R)-1-benzilisoquinolina. Em alguns casos, a célula hospedeira engenheirada pode produzir alguma quan- tidade de alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina de interesse onde o contro- le não tem nenhuma produção de alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina, bem como um aumento de cerca de 10% ou mais, tal como cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, tal como 2 vezes ou mais, tal como 5 vezes ou mais, incluindo 10 vezes ou mais em situações onde o controle tem um pou- co de alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina de produção de interesse. Uma célula hospedeira engenheirada pode ainda produzir em excesso um ou mais de alcaloides 1-benzilisoquinolina.

[0078] Uma célula hospedeira engenheirada pode ainda produzir em excesso um ou mais alcaloides morfinano. Em alguns casos, a cé- lula hospedeira engenheirada pode produzir alguma quantidade de alcaloide morfinano de interesse onde o controle não tem nenhuma produção de alcaloide morfinano, bem como um aumento de cerca de 10% ou mais, tal como cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou amis, cerca de 50% ou mais, cerca e 60% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, tal como 2 vezes ou mais, tal como 5 vezes ou mais, incluindo 10 vezes ou mais em situa- ções onde o controle tem um pouco de alcaloide morfinano de produ- ção de interesse. Em alguns casos, o alcaloide morfinano é formado de um produto alcaloide 1-benzilisoquinolina, ou derivado do mesmo, de uma reação de epimerização catalisada por uma epimerase enge- nheirada dentro de uma célula hospedeira engenheirada. A epimerase engenheirada pode compreender duas enzimas separadas que traba- lham para produzir uma reação de epimerase. Uma célula hospedeira engenheirada pode ainda produzir em excesso um ou mais alcaloides promorfinano, nor-opioide ou nal-opioide.

[0079] Em alguns casos, a célula hospedeira engenheirada tendo uma epimerase dividida engenheirada é capaz de produzir uma quan- tidade aumentada de (R)-reticulina em relação a uma célula hospedei- ra tendo uma epimerase fundida engenheirada. Em alguns casos, a célula hospedeira engenheirada tendo modificações em uma porção oxidase de uma epimerase engenheirada é capaz de produzir uma quantidade aumentada de (R)-reticulina em relação a uma célula hos- pedeira controle que não tem a uma ou mais modificações na porção oxidase da epimerase engenheirada (por exemplo, como descrito aqui). Em certos casos, a quantidade aumentada de (R)-reticulina é cerca de 10% ou mais em relação à célula hospedeira controle, tal como cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca e 60% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, cerca de 2 vezes ou mais, cerca de 5 vezes ou mais ou até mesmo cerca de 10 vezes ou mais em relação à célula hospedeira controle. Em alguns casos, (R)-reticulina é o produto de uma reação de epimerização catalisada por pelo menos uma epi- merase engenheirada dentro de uma célula hospedeira engenheirada. Nesses casos, (S)-reticulina pode ser o substrato da reação de epime- rização.

[0080] Em alguns casos, a célula hospedeira engenheirada é ca- paz de produzir uma quantidade aumentada de tebaína em relação a uma célula hospedeira controle que não tem a uma ou mais modifica- ções (por exemplo, como descrito aqui). Em alguns casos, a célula hospedeira engenheirada tendo uma tebaína sintase é capaz de pro- duzir uma quantidade aumentada de tebaína em relação a uma célula hospedeira que não tem uma tebaína sintase. Em alguns casos, a cé- lula hospedeira engenheirada tendo uma tebaína sintetase engenhei- rada é capaz de produzir uma quantidade aumentada de tebaína em relação a uma célula hospedeira tendo uma tebaína sintase parental

(por exemplo, como descrito aqui). Em certos casos, a quantidade aumentada de tebaína é cerca de 10% ou mais em relação à célula hospedeira controle, tal como cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, cerca de 2 ve- zes ou mais, cerca de 5 vezes ou mais ou até mesmo cerca de 10 ve- zes ou mais com relação à célula hospedeira controle. Em alguns ca- sos, a tebaína é o produto de uma reação de tebaína sintase dentro de uma célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, tebaína é o produto de uma reação de tebaína sintase catalisada por pelo menos uma tebaína sintase engenheirada dentro de uma célula hospedeira engenheirada. Nesses casos, salutaridinol-7-O-acetato pode ser o substrato da reação de tebaína sintase.

[0081] Ainda, uma célula hospedeira engenheirada pode produzir em excesso uma ou mais enzimas de interesse. Por produção em ex- cesso quer dizer que a célula tem uma produção melhorada ou au- mentada de uma enzima de interesse em relação a uma célula contro- le (por exemplo, uma célula não modificada). Por produção melhorada ou aumentada quer dizer ambos a produção de alguma quantidade da enzima de interesse onde o controle não tem nenhuma produção, bem como um aumento de cerca de 10% ou mais, tal como cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, tal como cerca de 2 vezes ou mais, tal como 5 vezes ou mais, incluindo 10 vezes ou mais em situações onde o controle tem um pouco de enzima de produção de interesse.

[0082] Uma célula hospedeira engenheirada pode produzir em ex- cesso uma ou mais enzimas DRS-DRR engenheiradas. Em alguns ca- sos, a célula hospedeira engenheirada pode produzir alguma quanti- dade de epimerase DRS-DRR engenheirada onde o controle não tem nenhuma produção de enzima DSR-DRR, ou onde o controle tem um mesmo nível de produção de epimerase do tipo selvagem em compa- ração com a célula hospedeira engenheirada, bem como um aumento de cerca de 10% ou mais, tal como cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou amis, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, tal como 2 vezes ou mais, tal como 5 vezes ou mais, incluindo 10 vezes ou mais em situações onde o controle tem alguma produção de enzima DSR-DRR. Em alguns casos, uma epimerase DRS-DRR engenheirada pode ser uma epimerase dividida engenheirada. Em alguns casos, uma epimerase DRS-DRR engenheirada pode ser uma epimerase fundida engenheirada.

[0083] Uma célula hospedeira engenheirada pode produzir em ex- cesso uma ou mais enzimas tebaína sintase. Em alguns casos, a célu- la hospedeira engenheirada pode produzir alguma quantidade da en- zima tebaína sintase onde o controle não tem nenhuma produção de enzima tebaína sintase, bem como um aumento de cerca de 10% ou mais, tal como cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, tal como 2 vezes ou mais, tal como 5 vezes ou mais, incluindo 10 vezes ou mais em situações onde o controle tem alguma produção de enzima tebaína sintase.

[0084] Uma célula hospedeira engenheirada pode produzir em ex- cesso uma ou mais enzimas tebaína sintase engenheiradas. Em al- guns casos, a célula hospedeira engenheirada pode produzir alguma quantidade da tebaína sintase engenheirada onde o controle não tem nenhuma produção de enzima tebaína sintase, ou onde o controle tem um mesmo nível de produção de tebaína sintase do tipo selvagem em comparação com a célula hospedeira engenheirada, bem como um aumento de cerca de 10% ou mais, tal como cerca de 20% ou mais,

cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, tal como 2 vezes ou mais, tal como 5 vezes ou mais, incluindo vezes ou mais em situações onde o controle tem alguma produção de enzima tebaína sintase. Em alguns casos, uma tebaína sintase en- genheirada pode ser uma enzima de fusão engenheirada.

[0085] Uma célula hospedeira engenheirada pode ainda produzir em excesso uma ou mais enzimas que são derivadas da enzima teba- ína sintase. Em alguns casos, a célula hospedeira engenheirada pode produzir alguma quantidade das enzimas que são derivadas da enzi- ma tebaína sintase, onde o controle não tem nenhuma produção de enzimas que são derivadas da enzima tebaína sintase, bem como um aumento de cerca de 10% ou mais, tal como cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, tal como 2 vezes ou mais, tal como 5 vezes ou mais, incluindo 10 vezes ou mais em situações onde o controle tem alguma produção de enzimas que são derivadas da enzima tebaína sintase.

[0086] Ainda, uma célula hospedeira engenheirada pode produzir em excesso um ou mais alcaloides bisbenzilisoquinolina (bisBIAs). Em particular, uma célula hospedeira engenheirada é capaz de produzir uma quantidade aumentada de alcaloides bisbenzilisoquinolina (bis- BIAs) em relação a uma célula hospedeira controle que não tem as uma ou mais modificações (por exemplo, como descrito aqui), incluin- do modificações relacionadas ao abrigo de uma epimerase engenhei- rada. Em certos casos, a quantidade aumentada de bisBIAs é cerca de 10% ou mais em relação à célula hospedeira controle, tal como cerca de 20% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 40% ou mais, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 100% ou mais, tal como 2 vezes ou mais, tal como 5 vezes ou mais ou até mesmo 10 vezes ou mais em relação à célula hospedeira con- trole. Em alguns casos, a bisBIAs é formada de pelo menos um mo- nômero de BIA que é o produto, ou derivado do mesmo, de uma rea- ção de epimerização catalisada por uma epimerase engenheirada den- tro de uma célula hospedeira engenheirada. A epimerase engenheira- da pode compreender duas enzimas separadas que trabalham para produzir uma reação de epimerase. Uma célula hospedeira engenheira- da pode ainda produzir em excesso uma ou mais de cefarantina, fanqui- nolina, liensinina, neferina, tubocurarina, dauricina, tetrandrina, curina, berbamunina, guategaumerina, 2'-norberbamunina e berbamina.

[0087] Em alguns casos, as uma ou mais modificações (tais como duas ou mais, três ou mais ou quatro ou mais) podem ser seleciona- das de: uma mutação de localização; uma mutação de interação de citocromo P450 redutase; uma mutação de acessibilidade; uma muta- ção de aumento de atividade; uma modificação de epimerase fundida engenheirada; uma modificação de tebaína sintase fundida engenhei- rada; e uma modificação de epimerase dividida engenheirada. Uma célula que inclui uma ou mais modificações pode ser referida como uma célula engenheirada. Mutações de Alívio de Inibição de Substrato

[0088] Em alguns casos, as células hospedeiras engenheiradas são células que incluem uma ou mais mutações de alívio de inibição de substrato (tais como duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou até mais) em um ou mais genes de enzima biossinté- tica da célula. Em alguns exemplos, o um ou mais genes de enzima biossintética são nativos para a célula (por exemplo, está presente em uma célula não modificada). Em alguns exemplos, o um ou mais ge- nes de enzima biossintética são não nativos para a célula. Como aqui usado, o termo "mutação de alívio de inibição de substrato" se refere a uma mutação que alivia um mecanismo de controle de inibição de substrato da célula.

[0089] Uma mutação que alivia inibição de substrato reduz a inibi- ção de uma enzima regulada na célula de interesse em relação à célu- la controle e provê um nível aumentado do composto regulado ou um produto biossintético a jusante do mesmo. Em alguns casos, por abrandar inibição da enzima da enzima regulada quer dizer que a ICso de inibição é aumentada em 2 vezes ou mais, tal como em 3 vezes ou mais, 5 vezes ou mais, 10 vezes ou mais, 30 vezes ou mais, 100 ve- zes ou mais, 300 vezes ou mais, 1000 vezes ou mais ou ainda mais. Por nível aumentado quer dizer um nível que é 110% ou mais aquele do composto regulado em uma célula controle ou um produto a jusante do mesmo, tal como 120% ou mais, 130% ou mais, 140% ou mais, 150% ou mais, 160% ou mais, 170% ou mais, 180% ou mais, 190% ou mais ou 200% ou mais, tal como pelo menos 3 vezes ou mais, pelo menos 5 vezes ou mais, pelo menos 10 vezes ou mais ou ainda mais do composto regulado na célula hospedeira engenheirada ou um pro- duto a jusante do mesmo.

[0090] Uma variedade de mecanismos de controle de inibição de substrato e enzimas biossintéticas na célula hospedeira engenheirada que são direcionados à regulagem de níveis de BIAs de interesse, ou precursores das mesmas, podem ser alvo para alívio de inibição de substrato. A célula hospedeira engenheirada pode incluir uma ou mais mutações de alívio de inibição de substrato em um ou mais genes de enzima biossintética. As uma ou mais mutações podem estar localiza- das em quaisquer genes de enzima biossintética convenientes onde a enzima biossintética é submetida a controle regulador. Em algumas modalidades, os um ou mais genes de enzima biossintética codificam uma ou mais enzimas tirosina hidroxilase. Em certos casos, as uma ou mais mutações de alívio de inibição de substrato estão presentes em um gene de enzima biossintética que é TyrH. Em algumas modalida-

des, a célula hospedeira engenheirada pode incluir uma ou mais mu- tações de alívio de inibição de substrato em um ou mais genes de en- zima biossintética tal como um daqueles genes descritos na Tabela 3.

[0091] Em certas modalidades, as uma ou mais mutações de alívio de inibição de substrato estão presentes no gene TyrH. O gene TyrH codifica tirosina hidroxilase, que é uma enzima que converte tirosina em L-DOPA. No entanto, TyrH é inibida por seu substrato, tirosina. Ati- vidade de tirosina hidroxilase de mamífero, tal como aquela vista em humanos ou ratos, pode ser melhorada através de mutações no gene TyrH que aliviam inibição de substrato. Em particular, inibição de subs- trato a partir de tirosina pode ser abrandada por uma mutação por pon- to W1I66Y no gene TyrH. A mutação por ponto W166Y no gene TyrwH pode também melhorar a ligação do cossubstrato de tirosina hidroxila- se, BH, para catalisar a reação de tirosina em L-DOPA. Os mutantes de TyrH, quando expressos em cepas de levedura para produzir BIAS a partir de açúcar (tais como aqueles descritos no Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. de Série 61/899.496) podem me- lhorar significantemente a produção de BIAs.

[0092] Quaisquer números e tipos de mutações convenientes po- dem ser utilizados para abrandar um mecanismo de controle de inibi- ção de substrato. Em certas modalidades, as células hospedeiras en- genheiradas da presente invenção podem incluir 1 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais ou até mesmo 15 ou mais mutações de alívio de inibição de substrato, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 mutações de alívio de inibição de substrato em um ou mais genes de enzima bios- sintética dentro da célula hospedeira engenheirada. Mecanismos de Promoção de Recuperação de Cofator

[0093] Em alguns casos, as células hospedeiras engenheiradas são células que incluem um ou mais mecanismos de promoção de re- cuperação de cofator (tais como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou ainda mais) em um ou mais genes de enzima biossintética da célula. Em alguns exemplos, os um ou mais genes de enzima biossintética são nativos para a célula (por exemplo, está pre- sente em uma célula não modificada). Em alguns exemplos, o um ou mais genes de enzima biossintética são não nativos para a célula. Como aqui usado, o termo "mecanismo de promoção de recuperação de cofator" se refere a um mecanismo que promove um mecanismo de controle de recuperação de cofator da célula.

[0094] Uma variedade de mecanismos de controle de recuperação de cofator e enzimas biossintéticas na célula hospedeira engenheirada que são direcionados à regulagem de níveis de BIAs de interesse, ou precursores das mesmas, pode ser alvo para promoção de recupera- ção de cofator. A célula hospedeira engenheirada pode incluir um ou mais mecanismo de promoção de recuperação de cofator em um ou mais genes de enzima biossintética. Em exemplos, a célula hospedei- ra engenheirada pode incluir uma sequência de codificação heteróloga que codifica di-hidrofolato redutase (DHFR). Quando DHFR é expres- sa, ela pode converter 7,8-di-hidrobiopterina (BH2) na tetra-hidrobiopte- rina (BH4), desta maneira recuperando BHa como um cossubstrato de TyrH. Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode incluir um ou mais mecanismos de promoção de recuperação de cofa- tor em um ou mais genes de enzima biossintética tal como um daque- les genes descritos na Tabela 2.

[0095] Quaisquer números e tipos convenientes de mecanismos podem ser utilizados para promover um mecanismo de controle de re- cuperação de cofator. Em certas modalidades, as células hospedeiras engenheiradas da presente invenção podem incluir 1 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais ou até mesmo 15 ou mais mecanismos de promoção de recuperação de cofator tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 me- canismos de promoção de recuperação de cofator em um ou mais ge- nes de enzima biossintética dentro da célula hospedeira engenheirada. Mutações de Alívio de Inibição de Produto

[0096] Em alguns casos, as células hospedeiras engenheiradas são células que incluem uma ou mais mutações de alívio de inibição de produto (tais como duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cin- co ou mais ou até mesmo mais) em um ou mais genes de enzima bio- cinética da célula. Em alguns exemplos, o um ou mais genes de enzi- ma biossintética são nativos para a célula (por exemplo, está presente em uma célula não modificada). Em alguns exemplos, o um ou mais genes de enzima biossintética são não nativos para a célula. Como aqui usado, o termo "mutação de alívio de inibição de produto" se refe- re a uma mutação que alivia um mecanismo de controle de inibição de produto a curto prazo e a longo prazo de uma célula hospedeira enge- nheirada. Inibição de produto a curto prazo é um mecanismo de con- trole da célula em que há ligação competitiva em um sítio de ligação de cossubstrato. Inibição de produto a longo prazo é um mecanismo de controle da célula em que há ligação irreversível de um composto distante de uma via desejada.

[0097] Uma mutação que alivia inibição de produto reduz a inibi- ção de uma enzima regulada na célula de interesse em relação a uma célula controle e provê um nível aumentado do composto regulado ou um produto biossintético a jusante do mesmo. Em alguns casos, por abrandar inibição da enzima regulada quer dizer que a IC5o de inibição é aumentada em 2 vezes ou mais, tal como em 3 vezes ou mais, 5 ve- zes ou mais, 10 vezes ou mais, 30 vezes ou mais, 100 vezes ou mais, 300 vezes ou mais, 1000 vezes ou mais ou ainda mais. Por nível au-

mentado quer dizer um nível que é 110% ou mais daquele do compos- to regulado em uma célula controle ou um produto a jusante do mes- mo, tal como 120% ou mais, 130% ou mais, 140% ou mais, 150% ou mais, 160% ou mais, 170% ou mais, 180% ou mais, 190% ou mais ou 200% ou mais, tal como pelo menos 3 vezes ou mais, pelo menos 5 vezes ou mais, pelo menos 10 vezes ou mais ou ainda mais do com- posto regulado na célula hospedeira engenheirada ou um produto a jusante do mesmo.

[0098] Uma variedade de mecanismos de controle de inibição de produto e enzimas biossintéticas na célula hospedeira engenheirada que são direcionados à regulagem de níveis de BIAs de interesse po- de ser alvo para alívio de inibição de produto. A célula hospedeira en- genheirada pode incluir uma ou mais mutações de alívio de inibição de produto em um ou mais genes de enzima biossintética. A mutação po- de estar localizada em quaisquer genes de enzima biossintética con- venientes onde a enzima biossintética é submetida a controle regula- dor. Em algumas modalidades, os um ou mais genes de enzima bios- sintética codificam uma ou mais enzimas tirosina hidroxilase. Em cer- tos casos, a uma ou mais mutações de alívio de inibição de produto estão presentes em um gene de enzima biossintética que é TyrH. Em algumas modalidades, a célula hospedeira engenheirada inclui uma ou mais mutações de alívio de inibição de produto em um ou mais genes de enzima biossintética tal como um daqueles genes descritos na Ta- bela 3.

[0099] Em certas modalidades, a uma ou mais mutações de alívio de inibição de produto estão presentes no gene TyrH. O gene TyrH codifica tirosina hidroxilase, que é uma enzima que converte tirosina em L-DOPA. TyrH requer tetra-hidrobiopterina (BHa) como um cossub- strato para catalisar a reação de hidroxilação. Algumas cepas microbi- anas, tal como Saccharomyces cerevisiae, não produzem BH. natu-

ralmente, mas podem ser engenheiradas para produzir esse substrato através de uma via de síntese e reciclagem de quatro enzimas, como ilustrado na FIG. 1. A FIG. 1 ilustra exemplos de vias de síntese, reci- clagem e salvamento de tetra-hidrobiopterina, de acordo com modali- dades da invenção. A FIG. 1 provê o uso das enzimas PTPS, piruvoil tetra-hidropterina sintase; SepR, sepiapterina redutase; PCD; pterina 4a-carbinolamina deidrase; QDHPR, di-hidropteridina redutase; e DHFR; di-hidrofolato redutase. Das enzimas que são ilustradas na FIG. 1, levedura sintetiza uma GTP cicloidrolase | endógena. GTP e trifosfato de di-hidroneopteridina são naturalmente sintetizadas em le- vedura. Ainda, outros metabolitos na FIG. 1 não são produzidos natu- ralmente em levedura.

[00100] TyrH é inibido por seu produto L-DOPA, bem como outras catecolaminas, particularmente dopamina. A atividade de tirosina hi- droxilase de mamífero, tal como de humanos ou ratos, pode ser me- lhorada através de mutações que aliviam inibição de produto. Por exemplo, a inibição de produto de curto prazo, tal como ligação com- petitiva no sítio de ligação de cossubstrato, pode ser abrandada por uma mutação por ponto W166Y no gene TyrH. Em particular, a muta- ção por ponto W166Y no gene TyrH pode melhorar a ligação do cos- substrato. Ainda, inibição de produto a curto prazo para abrandar liga- ção competitiva no sítio de ligação de cossubstrato pode ser melhora- da por uma mutação por ponto S40D no gene TyrH. Inibição de produ- to a curto prazo pode também ser melhorada pelas mutações conjun- tas R37E, R38E no gene TyrH. Em particular, mutações R37E, R38E podem juntas melhorar especificamente atividade de tirosina hidroxila- se na presença de dopamina.

[00101] — Ainda, inibição de produto a longo prazo pode ser abranda- da por mutações por ponto no gene TyrH. Alívio de inibição de produto a longo prazo pode incluir a ligação irreversível de catecolamina a fer-

ro no sítio ativo de modo que há menos catecolamina presente para agir como um inibidor de produto de atividade de tirosina hidroxilase. Inibição de produto a longo prazo pode ser abrandada pelas mutações E332D e Y371F, respectivamente, no gene TyrH.

[00102] “Combinações das mutações podem ser feitas (tais como duas ou três ou mais mutações de uma vez) para abrandar múltiplos tipos de inibição de substrato e produto para melhorar mais a atividade de TyrH. Os mutantes de TyrH, quando expressos em cepas de leve- dura para produzir BIAs a partir de açúcares (tais como aqueles descri- tos no Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. de Série 61/899.496), podem melhorar significantemente a produção de BIAs.

[00103] “Quaisquer números e tipos convenientes de mutações po- dem ser utilizados para abrandar o mecanismo de controle de inibição de produto. Em certas modalidades, as células hospedeiras engenhei- radas da presente invenção podem incluir 1 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais ou até mesmo 15 ou mais mutações de alívio de inibição de produto, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 mutações de alí- vio de inibição de produto em um ou mais genes de enzima biossinté- tica dentro da célula hospedeira engenheirada. Mutações de Abrandamento de Inibição de Feedback

[00104] Em alguns casos, as células hospedeiras engenheiradas são células que incluem uma ou mais mutações de alívio de inibição de feedback (tais como duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou ainda mais) em um ou mais genes de enzima bios- sintética da célula. Em alguns casos, o um ou mais genes de enzima biossintética são nativos para a célula (por exemplo, está presente em uma célula não modificada). Adicionalmente ou alternativamente, em alguns exemplos o um ou mais genes de enzima biossintética são não nativos para a célula. Como aqui usado, o termo "mutação de abran- damento inibição de feedback" se refere a uma mutação que abranda um mecanismo de controle de inibição de feedback de uma célula hospedeira engenheirada. Inibição de feedback é um mecanismo de controle da célula em que uma enzima na via sintética de um compos- to regulado é inibida quando esse composto acumulou para um certo nível, desta maneira equilibrando a quantidade do composto na célula. Uma mutação que alivia inibição de feedback reduz a inibição de uma enzima regulada na célula hospedeira engenheirada com relação a uma célula controle. Desta maneira, célula hospedeira engenheirada provê um nível aumentado do composto regulado ou um produto bios- sintético a jusante do mesmo. Em alguns casos, por aliviar inibição da enzima regulada quer dizer que a IC50 de inibição é aumentada em 2 vezes ou mais, tal como em 3 vezes ou mais, 5 vezes ou mais, 10 ve- zes ou mais, 30 vezes ou mais, 100 vezes ou mais, 300 vezes ou mais, 1000 vezes ou mais ou ainda mais. Por nível aumentado quer dizer um nível que é 110% ou mais daquele do composto regulado em uma célula controle ou um produto a jusante do mesmo, tal como 120% ou mais, 130% ou mais, 140% ou mais, 150% ou mais, 160% ou mais, 170% ou mais, 180% ou mais, 190% ou mais ou 200% ou mais, tal como pelo menos 3 vezes ou mais, pelo menos 5 vezes ou mais, pelo menos 10 vezes ou mais ou ainda mais do composto regulado na célula hospedeira ou um produto a jusante do mesmo.

[00105] Uma variedade de mecanismos de controle de inibição de feedback e enzimas biossintéticas que são direcionados à regulagem de níveis de BIAs de interesse podem ser alvo para alívio na célula hospedeira. A célula hospedeira pode incluir uma ou mais mutações de alívio de inibição de feedback em um ou mais genes de enzima bi- ossintética nativos para a célula. A uma ou mais mutações podem es- tar localizadas em quaisquer genes de enzima biossintética convenien-

tes onde e enzima biossintética é submetida a controle regulador. Em algumas modalidades, o um ou mais genes de enzima biossintética podem codificar uma ou mais enzimas selecionadas de uma 3-desóxi- d-arabinose-heptulosonato-7-fosfato (DAHP) sintase e uma corismato mutase. Em algumas modalidades, o um ou mais genes de enzima biossintética codificam uma 3-desóxi-4-arabinose-heptulosonato-7- fosfato (DAHP) sintase. Em alguns casos, o um ou mais genes de en- zima biossintética podem codificar uma corismato mutase. Em certos casos, a uma ou mais mutações de alívio de inibição de feedback po- dem estar presentes em um gene de enzima biossintética selecionado de ARO4 e ARO7. Em certos casos, a uma ou mais mutações de alí- vio de inibição de feedback podem estar presentes em um gene de enzima biossintética que é ARO4. Em certos casos, a uma ou mais mutações de alívio de inibição de feedback estão presentes em um gene de enzima biossintética que é ARO7. Em algumas modalidades, a célula hospedeira engenheirada pode incluir uma ou mais mutações de alívio de inibição de feedback em um ou mais genes de enzima bi- ossintética tal como um daqueles genes descritos na Tabela 3.

[00106] Quaisquer números e tipos convenientes de mutações po- dem ser utilizados para aliviar um mecanismo de controle de inibição de feedback. Como aqui usado, o termo "mutação" se refere a uma deleção, inserção ou substituição de um resíduo de aminoácido(s) ou resíduo de nucleotídeo(s) com relação a uma sequência ou motivo de referência. A mutação pode ser incorporada como uma mutação dire- cionada ao gene nativo no locus original. Em alguns casos, a mutação pode ser incorporada como uma cópia adicional do gene introduzido como uma integração genética em um /ocus separado, ou como uma cópia adicional em um vetor epissomal tal como um plasmídeo 24 ou centromérico. Em certos casos, a cópia inibida em feedback da enzima está sob a regulagem transcripcional da célula nativa. Em alguns ca-

sos, a cópia inibida em feedback da enzima é introduzida com regula- gem constitutiva ou dinâmica engenheirada de expressão de proteína ao pô-la sob o controle de um promotor sintético.

[00107] Em certas modalidades, a uma ou mais mutações de alívio de inibicao de feedback podem estar presentes no gene ARO4. Muta- ções em AROA4 de interesse podem incluir, mas não estão limitadas a, substituição do resíduo lisina na posição 229 com uma leucina, uma substituição do resíduo glutamina na posição 166 com um resíduo lisi- na ou uma mutação como descrito por Hartmann M. e outros ((2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100(3):862-867) ou Fukuda e outros ((1992) J Ferment Bioeng 74(2):117-119). Em alguns casos, mutações para conferir inibição em feedback podem ser selecionadas de uma biblio- teca mutagenizada de mutantes de enzima. Exemplos de tais seleções podem incluir resgate de crescimento de o-fluor-D,L-fenilalanina ou cultivo de cepas de levedura mutantes aro3 em meio com excesso de tirosina como descrito por Fukuda e outros ((1990) Breeding of Bre- wing Yeast Producing a Large Amount of Beta-Phenylethyl Alcohol and Beta-Phenylethyl Acetate. Agr Biol Chem Tóquio 54(1):269-271).

[00108] Em certas modalidades, as células hospedeiras engenhei- radas da presente invenção podem incluir 1 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais ou até mesmo 15 ou mais mutações de alívio de inibição de feedback tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 mutações de alí- vio de inibição de feedback em um ou mais genes de enzima biossin- tética dentro da célula hospedeira engenheirada. Modificações de Modulação Transcripcional

[00109] As células hospedeiras podem incluir uma ou mais modifi- cações de modulação transcripcional (tais como duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou até mesmo mais modificações)

de um ou mais genes de enzima biossintética da célula.

Em alguns exemplos, os um ou mais genes de enzima biossintética são nativos para a célula.

Em alguns exemplos, o um ou mais genes de enzima biossintética são não nativos para a célula.

Quaisquer genes de enzi- ma biossintética convenientes da célula podem ser alvo para modula- ção de transcrição.

Por modulação de transcrição quer dizer que a ex- pressão de um gene de interesse em uma célula modificada é modu- lada, por exemplo, aumentada ou diminuída, intensificada ou reprimi- da, em relação a uma célula controle (por exemplo, uma célula não modificada). Em alguns casos, modulação transcripcional do gene de interesse inclui aumento ou intensificação de expressão.

Por aumento ou intensificação de expressão quer dizer que o nível de expressão do gene de interesse é aumentado em 2 vezes ou mais, tal como em 5 vezes ou mais e algumas vezes em 25, 50 ou 100 vezes ou mais e em certas modalidades 300 vezes ou mais e superior, comparado com um controle, isto é, expressão na mesma célula não modificada (por exemplo, usando qualquer ensaio de expressão de gene conveniente). Alternativamente, em casos onde expressão do gene de interesse em uma célula é tão baixa que é não detectável, o nível de expressão do gene de interesse é considerado ser aumentado se expressão for au- mentada para um nível que é facilmente detectável.

Em certos casos, modulação transcripcional do gene de interesse inclui diminuição ou repressão de expressão. por diminuir ou reprimir expressão que dizer que o nível de expressão do gene de interesse é diminuído em 2 ve- zes ou mais, tal como em 5 vezes ou mais e algumas vezes em 25, 50 ou 100 vezes ou mais e em certas modalidades 300 vezes ou mais ou superior, comparado com um controle.

Em alguns casos, expressão é diminuída para um nível que é não detectável.

Modificações de pro- cessos da célula hospedeira de interesse que podem ser adaptados para uso nas células hospedeiras objeto são descritas na Publicação

U.S. No. 20140273109 (14/211,611) de Smolke e outros, cuja descri- ção é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

[00110] Quaisquer genes de enzima biossintética convenientes po- dem ser transcripcionalmente modulados, e incluem, mas não estão limitados a, aquelas enzimas biossintéticas descritas na FIG. 2. Em particular, a FIG. 2 ilustra um esquema biossintético para conversão de glicose em 4-HPA, dopamina e 3,4-DHPA, de acordo com modali- dades da invenção. Exemplos de enzimas descritas na FIG. 2 incluem ARO3, AROA4, ARO1, ARO7, TYR1, TYR, TyrH, DODC, MAO, ARO10, AROS9, ARO8 e TKL. Em alguns casos, o um ou mais genes de enzima biossintética podem ser selecionados de ARO1, ARO9, AROB8 e TKL. Em alguns casos, o um ou mais genes de enzima biossintética podem ser ARO9. Em algumas modalidades, o um ou mais genes de enzima biossintética podem ser TKL. Em algumas modalidades, a célula hos- pedeira inclui uma ou mais modificações de modulação transcripcional para um ou mais genes tal como um daqueles genes descritos na Ta- bela 3.

[00111] Em algumas modalidades, a modificação de modulação transcripcional pode incluir uma substituição de um promotor nativo por um promotor forte do um ou mais genes de enzima biossintética ou a expressão de uma cópia(s) adicional(is) do gene ou genes sob o controle de um promotor forte. Os promotores que dirigem a expressão dos genes de interesse podem ser promotores constitutivos ou promo- tores induzíveis, contanto que os promotores possam ser ativos nas células hospedeiras. Os genes de interesse podem ser expressos a partir de seus promotores nativos. Adicionalmente ou alternativamente, os genes de interesse podem ser expressos a partir de promotores não nativos. Embora não uma necessidade, tais promotores podem ser de resistência média a alta no hospedeiro em que eles são usados. Promotores podem ser regulados ou constitutivos. Em algumas moda-

lidades, promotores que não são reprimidos por glicose, ou apenas reprimidos levemente pela presença de glicose no meio de cultura, podem ser usados.

Há vários promotores adequados, cujos exemplos incluem promotores de genes glucolíticos tal como o promotor do gene de B. subtilis (codificando frutose bifosfato aldolase) ou promotor GA- PDH de levedura S. cerevisiae (codificando gliceraldeído fosfato desi- drogenase) (Bitter G.

A., Meth.

Enzymol. 152:673 684 (1987)). Outros promotores de interesse fortes incluem, mas não estão limitados a, promotor ADHI de levedura de padeiro (Ruohonen L. e outros, J.

Bio- technol. 39:193 203 (1995)), os promotores induzidos por carência de fosfato tal como o promotor PHOS5 de levedura (Hinnen, A. e outros, em Yeast Genetic Engineering, Barr, P.

J. e outros, eds.

Butterworths (1989), the alkaline phosphatase promoter from B. licheniformis (Lee.

J. W.

K. e outros, J.

Gen.

Microbiol. 137:1127 1133 (1991)), GPD1 e TEF1. Promotores de levedura de interesse incluem, mas não estão limitados a, promotores induzíveis tal como Gal-10, Gal1, GalL, GalS, promotor repressível Met25, teto e promotores constitutivos tal como promotor de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GPD), promotor de álcool desidrogenase (ADH), promotor de alongamento de tradução de fator-1-alfa (TEF), promotor de citocromo c-oxidase (CYC1), promotor MRP7, etc.

Em alguns casos, o promotor forte é GPD1. Em certos ca- sos, o promotor forte é TEF1. Vetores de expressão de levedura de replicação autônoma contendo promotores induzíveis por hormônios tais como glucocorticoides, esteroides e hormônios da tireoide são também conhecidos e incluem, mas não estão limitados a, elemento responsivo a glucocorticoide (GRE) e elemento responsivo a hormônio da tireoide (TRE), vide, por exemplo, aqueles promotores descritos na Pat.

U.S.

No. 7.045.290. Vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis tais como fator alfa, álcool oxidase e PGH podem ser usa- dos.

Ainda, qualquer combinação de promotor/intensificador (de acor-

do com o Eukaryotic Promoter Data Base EPDB) poderia ser também usada para dirigir a expressão de genes de interesse. É compreendido que quaisquer promotores convenientes específicos para a célula hos- pedeira podem ser selecionados, por exemplo, E. coli. Em alguns ca- sos, seleção de promotor pode ser usada para otimizar transcrição e, portanto, níveis de enzima para maximizar a produção enquanto mini- mizando recursos energéticos.

Mutações de Inativação

[00112] As células hospedeiras engenheiradas podem incluir uma ou mais mutações de inativação para uma enzima da célula (tais como duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou ainda mais). A inclusão de uma ou mais mutações de inativação pode modi- ficar o fluxo de uma via sintética de uma célula hospedeira engenhei- rada para aumentar os níveis de uma BIA de interesse ou uma enzima desejável ou precursor levando à mesma. Em alguns exemplos, a uma ou mais mutações de inativação são em uma enzima nativa para a cé- lula. Adicionalmente ou alternativamente, a uma ou mais mutações de inativação são em uma enzima não nativa para a célula. Como usado aqui, por "mutação de inativação" quer dizer uma ou mais mutações em um gene ou sequência de DNA reguladora da célula, onde a(s) mutação(ões) inativa(s) uma atividade biológica da proteína expressa por esse gene de interesse. Em alguns casos, o gene é inativo para a célula. Em alguns casos, o gene codifica uma enzima que é inativada e é parte de ou conectada à via sintética de uma BIA de interesse pro- duzida pela célula hospedeira. Em alguns casos, uma mutação de ina- tivação está localizada em uma sequência de DNA reguladora que controla um gene de interesse. Em certos casos, a mutação de inati- vação é em um promotor de um gene. Quaisquer mutações conveni- entes (por exemplo, como descrito aqui) podem ser utilizadas para ina- tivar um gene ou sequência de DNA reguladora de interesse. Por "ina-

tivado" ou "inativa" quer dizer que uma atividade biológica da proteína expressa pelo gene mutado é reduzida em 10% ou mais, tal como em 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 97% ou mais ou 99% ou mais, em relação a uma proteína controle expressa por um gene controle não mutado. Em alguns casos, a proteína é uma enzima e na mutação de inativação reduz a atividade da enzima.

[00113] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenheirada inclui uma mutação de inativação em uma enzima nativa para a célula. Quaisquer enzimas convenientes podem ser alvo para inativação. En- zimas de interesse podem incluir, mas não estão limitadas a, aquelas enzimas descritas na Tabela 3 cuja ação na via sintética da célula hospedeira engenheirada tende a reduzir os níveis de uma BIA de in- teresse. Em alguns casos, a enzima tem atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mu- tação de inativação á ZWF1. Em alguns casos, a enzima tem atividade de álcool desidrogenase. Em algumas modalidades, a enzima que in- clui uma mutação de inativação é selecionada de ADH2, ADH3, ADHA, ADH5, ADH6, ADH7 e SFA1. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de ativação é ADH2. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de inativação é ADH3. Em cer- tas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de inativação é ADH4. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma muta- ção(ões) de inativação é ADH6. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de inativação é ADH7. Em alguns casos, a enzima tem atividade de aldeído oxidorredutase. Em certas modalida- des, a enzima que inclui uma mutação de inativação é selecionada de ALD2, ALD3, ALDA4, ALD5 e ALD6. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de ativação é ALD2. Em certas modali- dades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de inativação é ALD3.

Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de ina- tivação é ALDA4. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mu- tação(ões) de inativação é ALD5. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de inativação é ALD6. Em alguns casos, a enzima tem atividade de aril-álcool desidrogenase. Em algumas mo- dalidades, a enzima que inclui uma mutação de inativação é selecio- nada de AADA4, AAD6, AAD10, AAD14, AAD15, AAD16. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de inativação é AADA. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de inativação é AAD6. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de inativação é AAD10. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de inativação é AAD14. Em cer- tas modalidades, a enzima que inclui uma mutação(ões) de inativação é AAD15. Em certas modalidades, a enzima que inclui uma muta- ção(ões) de inativação é AAD16. Em algumas modalidades, a célula hospedeira inclui uma ou mais mutações de inativação para um ou mais genes descritos na Tabela 3.

Modificações de epimerização

[00114] Alguns métodos, processos e sistemas providos aqui des- crevem a conversão de alcaloides (S)-1-benzilisoquinolina em alcaloi- des (R)-benzilisoquinolina. Alguns desses métodos, processos e sis- temas podem compreender uma célula hospedeira engenheirada. Em alguns exemplos, a conversão de alcaloides (S)-1-benzilisoquinolina em alcaloides (R)-1-benzilisoquinolina é uma etapa-chave na conver- são de um substrato em uma faixa diversa de alcaloides. Em alguns exemplos, a conversão de alcaloides (S)-1-benzilisoquinolina em alca- loides (R)-1-benzilisoquinolina compreende uma reação de epimeriza- ção através de uma epimerase engenheirada. Em alguns casos, epi- merização de um alcaloide substrato pode ser realizada através da oxidação de um substrato (S) para a base Schiff correspondente ou intermediário imina, então reduzindo estereoespecificamente esse in- termediário em um produto (R) conforme provido na FIG. 3 e como ge- ralmente representado no Esquema 1. Como provido no Esquema 1, R1, R2, Rg e Ra podem ser H ou CH3, R5 pode ser H, OH ou OCH;. Esquema 1 Ro. Ro. Ro. CL. CX Po A, "or vor: 'oR Alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina Alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina

[00115] Em alguns exemplos, a conversão do substrato (S) no pro- duto (R) pode envolver pelo menos uma reação de oxidação e pelo menos uma reação de redução. Em alguns casos, uma reação de oxi- dação é opcionalmente seguida por uma reação de redução. Em al- guns casos, pelo menos uma das reações e oxidação e redução é rea- lizada na presença de uma enzima. Em alguns casos, pelo menos uma das reações de oxidação e redução é catalisada por uma epime- rase engenheirada. Em alguns casos, as reações de oxidação e redu- ção são ambas realizadas na presença de uma epimerase fundida en- genheirada. Em alguns casos, as reações de oxidação e redução são ambas realizadas na presença de uma epimerase dividida engenhei- rada tendo um componente oxidase e um componente redutase sepa- radamente expressos, respectivamente. Em alguns casos, uma epime- rase engenheirada é útil para catalisar as reações de oxidação e redu- ção. As reações de oxidação e redução podem ser catalisadas pela mesma epimerase engenheirada.

[00116] Em alguns métodos, processos e sistemas descritos aqui, uma reação de oxidação pode ser realizada na presença de uma en- zima que é parte de uma epimerase engenheirada. Em alguns exem- plos, a epimerase engenheirada pode ter um componente oxidase. Em alguns casos, o componente oxidase pode ser um componente de uma epimerase fundida engenheirada. Em alguns casos, o componen- te oxidase pode ser independentemente expresso como parte de uma epimerase dividida engenheirada. A oxidase pode usar uma (S)-1-ben- zilisoquinolina como um substrato. A oxidase pode converter o subs- trato (S) em uma imina correspondente ou derivado de base Schiff. A oxidase pode ser referida como 1,2-desidrorreticulina sintase (DRS). Exemplos não limitantes de enzimas adequadas para oxidação de al- caloides (S)-1-benzilisoquinolina na presente descrição incluem uma citocromo P450 oxidase, uma oxidase dependente de 2-oxoglutarato e uma flavoproteína oxidase. Por exemplo, (S)-tetra-hidroprotoberberina oxidase (STOX, E.C. 1.3.3.8) pode oxidar (S)-norreticulina em outros alcaloides (S)-1-benzilisoquinolina em 1,2-desidronorreticulina e outros produtos 1,2-desidro correspondentes. Em alguns exemplos, uma pro- teína que compreende um domínio oxidase de qualquer um dos exem- plos precedentes pode realizar a oxidação. Em alguns exemplos, a oxidase pode catalisar a reação de oxidação com uma célula hospe- deira, tal como uma célula hospedeira engenheirada, como descrito aqui. Em alguns casos, a oxidase pode ter um ou mais componentes de aumento de atividade como discutido aqui e como descrito nos Exemplos 6 e 8.

[00117] Em alguns exemplos, uma reação de redução pode seguir a reação de oxidação. A reação de redução pode ser realizada por uma enzima que é parte de uma epimerase engenheirada. Em alguns exemplos, a redutase pode usar uma imina ou derivado de base Schiff de uma 1-benzilisoquinolina como um substrato. A redutase pode con- verter a imina ou derivado de base Schiff em uma (R)-1-benzilisoqui- nolina. A redutase pode ser referida como 1,2-desidrorreticulina redu- tase (DRR). Exemplos não limitantes de enzimas adequadas para re- dução de uma imina ou base Schiff derivada de um alcaloide (S)- benzilisoquinolina incluem uma aldo-ceto redutase (por exemplo, uma enzima do tipo codeinona redutase (EC 1.1.1.247)) e uma desidroge- nase de cadeia curta (por exemplo, uma enzima do tipo salutaridina redutase (EC 1.1.1.248)). Em alguns exemplos, uma proteína que compreende um domínio redutase de qualquer um dos exemplos ante- riores pode realizar a redução. Em uma modalidade adicional, a redu- ção é estereoespecífica. Em alguns exemplos, a redutase pode catali- sar a reação de redução dentro de uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira engenheirada, como aqui descrito.

[00118] Um exemplo de uma enzima que pode realizar uma reação de epimerização que converte alcaloides (S)-1-benzilisoquinolina em alcaloides (R)-1-benzilisoquinolina inclui uma epimerase tendo um domínio oxidase e um domínio redutase. Em particular, a epimerase pode ter um domínio do tipo 82Y2 de citocromo P450 oxidase. Ainda, a epimerase pode ter um domínio do tipo codeinona redutase. Uma epimerase tendo um domínio do tipo 82Y2 e3 citocromo P450 oxidase e também tendo um domínio do tipo codeinona redutase pode ser refe- rida como uma enzima DRS-DRR. Em particular, uma enzima DRS- DRR pode ser uma enzima de fusão que é uma epimerase de fusão. Ainda, quando uma enzima DRS-DRR é modificada por pelo menos uma modificação de aumento de atividade, a enzima de fusão pode ser uma epimerase de fusão engenheirada. Exemplos de modificações de aumento de atividade são discutidos nos Exemplos 6 e 8 abaixo.

[00119] Um exemplo de uma sequência de aminoácido de uma en- zima DRS-DRR que pode ser usada para realizar a conversão de alca- loides (S)-1-benzilisoquinolina em alcaloides (R)-1-benzilisoquinolina é provido na FIG. 4. Em particular, a FIG. 4 ilustra uma sequência de aminoácido de uma enzima DRS-DRR que foi otimizada no códon, de acordo com modalidades da invenção. Ainda, a FIG. 5 ilustra uma divi- são de uma porção oxidase e porção redutase, cada uma da enzima DRS-DRR da FIG. 4. Sequências de aminoácido adicionais de uma enzima DRS-DRR são mostradas na Tabela 1. Uma sequência de aminoácido para uma epimerase que é utilizada na conversão de um alcaloides (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoqui- nolina pode ser 75% ou mais idêntica a uma dada sequência de ami- noácido como listado na Tabela 1. Por exemplo, uma sequência de aminoácido para tal epimerase pode compreender uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75% ou mais, 80% ou mais, 81% ou mais, 82% ou mais, 83% ou mais, 84% ou mais, 85% ou mais, 86% ou mais, 87% ou mais, 88% ou mais, 89% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idêntica a uma se- quência de aminoácido como aqui provido. Ainda, em certas modali- dades, uma sequência de aminoácido "idêntica" contém pelo menos 80%-99% de identidade no nível de aminoácido para a sequência de aminoácido específica. Em alguns casos, uma sequência de aminoá- cido "idêntica" contém pelo menos cerca de 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e mais em certos casos, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade, no nível de aminoácido. Em al- guns casos, a sequência de aminoácido pode ser idêntica, mas a se- quência de DNA é alterada de modo a otimizar uso de códon para o organismo hospedeiro, por exemplo.

[00120] Resíduos de aminoácido de epimerases homólogas podem ser referidos de acordo com o esquema de numeração de SEQ ID NO: 16, e esse sistema de numeração é usado em toda a descrição para se referir a resíduos de aminoácido específicos de epimerases que são homólogos à SEQ ID NO: 16. Epimerases homólogas à SEQ ID NO: 16 podem ter pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16. Em alguns casos, um aminoácido referido como posição 50 em uma epimerase homóloga pode não ser o 50º aminoácido na epi-

merase homóloga, mas seria o aminoácido que corresponde ao ami- noácido na posição 50 na SEQ ID NO: 16 em um alinhamento de pro- teína da epimerase homóloga com SEQ ID NO: 16. Em alguns casos, enzimas homólogas podem ser alinhadas com a SEQ ID NO: 16 ou de acordo com a sequência primária, estrutura secundária ou estrutura terciária.

[00121] Uma célula hospedeira engenheirada pode ser provida, a qual produz uma epimerase engenheirada que converte alcaloide (S)- 1-benzilisoquinolina em alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina, em que a epimerase compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18, e tendo uma ou mais modificações de aumento de atividade como descrito na Tabela 13. A epimerase que é produzi- da dentro da célula hospedeira engenheirada pode ser recuperada e purificada de modo a formar um biocatalisador. Em alguns casos, a epimerase pode ser dividida em uma ou mais enzimas. Ainda, uma ou mais enzimas que são produzidas através da divisão da epimerase podem ser recuperadas a partir da célula hospedeira engenheirada. Essas uma ou mais enzimas que resultam de divisão da epimerase podem ser também usadas para catalisar a conversão de alcaloides (S)-1-benzilisoquinolina em alcaloides (R)-1-benzilisoquinolina. Ainda, o uso de uma epimerase dividida engenheirada pode ser feito para aumentar a produção de produtos de alcaloide benzilisoquinolina den- tro de uma célula quando comparado com a produção de produtos de alcaloide benzilisoquinolina dentro de uma célula utilizando uma epi- merase fundida.

[00122] Em casos adicionais, a uma ou mais enzimas que são re- cuperadas a partir da célula hospedeira engenheirada que produzem a epimerase podem ser usadas em um processo para conversão de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoqui-

nolina. O processo pode incluir contato do alcaloide (S)-1-benzilisoqui- nolina com uma epimerase em uma quantidade suficiente para conver- ter o dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina no alcaloide (R)-1-benziliso- quinolina. Em exemplos, o alcaloides (S)-1-benzilisoquinolina pode ser contatado com uma quantidade suficiente de uma ou mais enzimas de modo que pelo menos 5% do dito alcaloides (S)-1-benzilisoquinolina sejam convertidos no alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina. Em exemplos adicionais, o alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina pode ser contatado com uma quantidade suficiente de uma ou mais enzimas de modo que pelo menos pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo me- nos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pe- lo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100% do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina são convertidos no alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina.

[00123] A uma ou mais enzimas que podem ser usadas para con- verter alcaloides (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-ben- Zzilisoquinolina podem contatar o alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina in vitro. Ainda, ou alternativamente, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para converter um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina podem contatar o alcaloide (S)-1- benzilisoquinolina in vivo. Ainda, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para converter um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina podem ser providas a uma célula tendo o alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina dentro ou podem ser produ- zidas dentro de uma célula hospedeira engenheirada.

[00124] Em alguns exemplos, os métodos proveem células hospe- deiras engenheiradas que produzem um produto de alcaloide, em que a epimerização de um substrato de (S) em um produto de (R) pode compreender uma etapa-chave na produção de um produto de alcaloi- de. Em alguns exemplos, o alcaloide produzido é um alcaloide (R)-1- benzilisoquinolina. Em ainda outras modalidades, o alcaloide produzi- do é derivado de um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina incluindo, por exemplo, alcaloides promorfinano de 4 anéis e morfinano de 5 anéis. Em uma outra modalidade, um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina é um intermediário em relação ao produto da célula hospedeira engenheira- da. Em ainda outras modalidades, o produto alcaloide é selecionado do grupo consistindo em 1-benzilisoquinolina, morfinano, promorfina- no, nor-opioide, nal-opioide ou alcaloides bisbenzilisoquinolina.

[00125] Em alguns exemplos, o substrato (S) é um alcaloide (S)-1- benzilisoquinolina selecionado do grupo consistindo em (S)-norreticu- lina, (S)-reticulina, (S)-tetra-hidropapaverina, (S)-norcoclaurina, (S)- coclaurina, (S)-N-metilcoclaurina, (S)-3'-hidróóxi-N-metilcoclaurina, (S)- norisoorientalina, (S)-orientalina, (S)-isoorientalina, (S)-norprotosino- menina, (S)-protosinomenina, (S)-norlaudanosolina, (S)-laudanosolina, (S)-4'-O-metil-laudanosolina, (S)-6-O-metilnorlaudanosolina, (S)-4'-O- metilnorlaudanosolina.

[00126] Em alguns exemplos, o substrato (S) é um composto de Fórmula |: R'o. CG 'ORº Fórmula |, ou um sal do mesmo, em que: R', R?à, Rº e Rº são independentemente selecionados de hidrogênio e metila; e

Rº é selecionado de hidrogênio, hidróxi e metóxi.

[00127] Em alguns outros exemplos, pelo menos um de R', R?º, R3, Rº e Rº é hidrogênio.

[00128] Em ainda outros exemplos, o substrato (S) é um composto de Fórmula |l: (R) E NR3 nº O (Rr Formula Il, ou um sal do mesmo, em que: Rº é selecionado de hidrogênio e C1-Ca alquila; Rº e R7 são independentemente selecionados em cada ocorrência de hidróxi, flúor, cloro, bromo, carboxaldeído, C1-Ca acila, C1-Ca alquila e C1-Ca alcóxi; né 0, 1,2,3ou4;e n' é 0,1,2,3,40u5.

[00129] “Quando uma ligação é desenhada através de um anel, sig- nifica que a substituição pode ocorrer em um átomo ou posição de anel não específico. Por exemplo, na Fórmula Il mostrada acima, o hidrogênio de qualquer -CH no anel de 6 membros pode ser substituí- do com R? para formar —-CR?-.

[00130] Em alguns exemplos, Rô e R? são independentemente meti- la ou metóxi. Em alguns outros exemplos, n e nº são independente- mente 1 ou 2. Em ainda outras modalidades, Rô é hidrogênio ou meti- la.

[00131] Em alguns exemplos, os métodos proveem células hospe- deiras engenheiradas que produzem produtos de alcaloide a partir de (S)-reticulina. A epimerização de (S)-reticulina em (R)-reticulina pode compreender uma etapa-chave na produção de produtos de alcaloides diversos a partir de um precursor. Em alguns exemplos, o precursor é L-tirosina ou um açúcar (por exemplo, glicose). Os produtos de alca-

loide diversos podem incluir, sem limitação, alcaloides 1-benzilisoqui- nolina, morfinano, promorfinano, nor-opioide ou nal-opioides.

[00132] Qualquer fonte de carbono adequada pode ser usada como um precursor em relação a um alcaloide 1-benzilisoquinolina epimeri- zado. Precursores adequados podem incluir, sem limitação, monossa- carídeos (por exemplo, glicose, frutose, galactose, xilose), oligossaca- rídeos (por exemplo, lactose, sacarose, rafinose), polissacarídeos (por exemplo, amido, celulose) ou uma combinação dos mesmos. Em al- guns exemplos, misturas não purificadas a partir de matérias-primas renováveis podem ser usadas (por exemplo, licor de milho, melaço de beterraba-açucareira, malte de cevada, hidrolisado de biomassa). Em ainda outras modalidades, o precursor de carbono pode ser um com- posto de um carbono (por exemplo, metanol, dióxido de carbono) ou um composto de dois carbonos (por exemplo, etanol). Em ainda outras modalidades, outros compostos contendo carbono podem ser utiliza- dos, por exemplo, metilamina, glucosamina e aminoácidos (por exem- plo, L-tirosina). Em alguns exemplos, um alcaloide 1-benzilisoquinolina pode ser adicionado diretamente a uma célula hospedeira engenheira- da da invenção incluindo, por exemplo, norlaudanosolina, laudanosoli- na, norreticulina e reticulina. Em modalidades adicionais, um alcaloide 1-benzilisoquinolina pode ser adicionado à célula hospedeira enge- nheirada como um enantiômero único (por exemplo, um alcaloide (S)- 1-benzilisoquinolina), ou uma mistura de enantiômeros incluindo, por exemplo, uma mistura racêmica.

[00133] Em alguns exemplos, os métodos proveem a epimerização de um estereocentro de um alcaloide 1-benzilisoquinolina, ou um deri- vado do mesmo, usando uma epimerase engenheirada. Em uma mo- dalidade adicional, o método compreende contato do alcaloide 1- benzilisoquinolina com uma epimerase engenheirada. A epimerase engenheirada pode inverter a estereoquímica de um estereocentro de um alcaloide 1-benzilisoquinolna, ou derivado do mesmo, na estereo- química oposta. Em alguns exemplos, a epimerase engenheirada con- verte um alcaloides (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1- benzilisoquinolina. Em alguns exemplos desta conversão de um alca- loide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina utilizando a epimerase engenheirada, o alcaloide (S)-1-benzilisoquino- lina é selecionado do grupo consistindo em (S)-norreticulina, (S)-reti- culina, (S)-tetra-hidropapaverina, (S)-norcoclaurina, (S)-coclaurina, (S)- N-metilcoclaurina, (S)-3'-hidróxi-N-metilcoclaurina, (S)-norisoorientalina, (S)-orientalina, (S)-isoorientalina, (S)-norprotosinomenina, (S)-protosi- nomenina, (S)-norlaudanosolina, (S)-laudanosolina, (S)-4'-O-metilau- danosolina, (S)-6-O-metilnorlaudanosolina e (S)-4'-O-metilnorlaudano- solina.

[00134] Em ainda outras modalidades, o alcaloide 1-benzilisoquino- lina que é epimerizado usando uma epimerase engenheirada pode compreender dois ou mais estereocentro, em que apenas um dos dois ou mais estereocentro é invertido para produzir um diastereômero do substrato (por exemplo, alcaloide (S, R)-1-benzilisoquinolina converti- do em alcaloide (R, R)-1-benzilisoquinolina). Em exemplos onde ape- nas um estereocentro de alcaloide 1-benzilisoquinolina é invertido quando contatado com a pelo menos uma enzima, o produto é referido como um epímero do alcaloide 1-benzilisoquinolina.

[00135] Em alguns exemplos, o alcaloide 1-benzilisoquinolina é apresentado à enzima como um estereoisômero único. Em alguns ou- tros exemplos, o alcaloide 1-benzilisoquinolina é apresentado à enzi- ma como uma mistura de estereoisômeros. Ainda em modalidades adicionais, a mistura de estereoisômeros pode ser uma mistura racê- mica. Em alguns outros exemplos, a mistura de estereoisômeros pode ser enriquecida em um estereoisômero comparado com um outro este- reoisômero.

[00136] Em alguns exemplos, um alcaloide 1-benzilisoquinolina, ou um derivado do mesmo, é recuperado. Em alguns exemplos, o alcaloi- de 1-benzilisoquinolina é recuperado a partir de uma cultura celular. Ainda em modalidades adicionais, o alcaloide 1-benzilisoquinolina re- cuperado é enantiomericamente enriquecido em um estereoisômero comparado com a mistura original de alcaloides 1-benzilisoquinolina apresentada à enzima. Em modalidades adicionais, o alcaloide 1-ben- Zilisoquinolina recuperado tem um excesso enantiomérico de pelo me- nos pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo me- nos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pe- lo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100%.

[00137] Em alguns exemplos, um promorfinano, ou um derivado do mesmo, é recuperado. Em alguns exemplos, o promorfinano é recupe- rado a partir de uma cultura celular. Em modalidades adicionais, o promorfinano recuperado tem um excesso enantiomérico de pelo me- nos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 82%, pe- lo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo me- nos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100%.

[00138] Em alguns exemplos, um morfinano, ou um derivado do mesmo, é recuperado. Em alguns exemplos, o morfinano é recuperado a partir de uma cultura celular. Ainda em modalidades adicionais, o morfinano recuperado tem um excesso enantiomérico de pelo menos

50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pe- lo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100%.

[00139] Em alguns exemplos, uma bisbenzilisoquinolina, ou um de- rivado da mesma, é recuperada. Em alguns exemplos, a bisbenziliso- quinolina é recuperada a partir de uma cultura celular. Ainda em moda- lidades adicionais, a bisbenzilisoquinolina recuperada é enantiomeri- camente enriquecida em um estereoisômero comparado com a mistu- ra original de bisbenzilisoquinolina apresentada para a enzima. Ainda em modalidades adicionais, a bisbenzilisoquinolina recuperada tem um excesso enantiomérico de pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100%.

[00140] Em alguns exemplos, um nal-opioide, ou um derivado do mesmo, é recuperado. Em alguns exemplos, o nal-opioide é recupera- do a partir de uma cultura celular. Ainda em modalidades adicionais, o nal-opioide recuperado tem um excesso enantiomérico de pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pe- lo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos

98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100%.

[00141] Em alguns exemplos, um nor-opioide, ou um derivado do mesmo, é recuperado. Em alguns exemplos, o nor-opioide é recupera- do de uma cultura celular. Em modalidades adicionais, o nor-opioide recuperado tem um excesso enantiomérico de pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pe- lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo me- nos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100%.

[00142] "“Isômeros" são compostos diferentes que têm a mesma fórmula molecular. "Estereoisômeros" são isômeros que diferem ape- nas na maneira que os átomos são dispostos no espaço. "Enantiôme- ros" são um par de estereoisômeros que são imagens de espelho não superpostas um do outro. Uma mistura 1:1 de um par de enantiômeros é uma mistura "racêmica". "Diastereoisômeros" ou "diastereômeros" são estereoisômeros que têm pelo menos dois átomos assimétricos, mas não são imagens de espelho um do outro. O termo "epímero" co- mo aqui usado se refere a um composto tendo a fórmula química idên- tica, mas uma configuração óptica diferente em uma posição particular. Por exemplo, os estereoisômeros (R, S) e (S, S) de um composto são epímeros um do outro. Em alguns exemplos, um alcaloide 1-benziliso- quinolina é convertido em seu epímero (por exemplo, alcaloide epi-1- benzilisoquinolina). A estereoquímica absoluta é especificada de acordo com o sistema R-S de Cahn-Ingold-Prelog. Quando um composto é um enantiômero puro, a estereoquímica em cada carbono quiral pode ser especificada ou por R ou S. Compostos separados cuja configuração absoluta é desconhecida podem ser designados (+) ou (-) dependendo da direção (dextro- ou levogiratória) em que eles giram o plano de luz polarizada no comprimento de onda da linha de sódio D.

Certos com- postos descritos aqui contêm um ou mais centros assimétricos e po- dem então dar origem a enantiômeros, diastereômeros e outras for- mas estereoisoméricas que podem ser definidas, em termos de este- reoquímica absoluta, como (R)- ou (S)-.

Tabela 1. Sequências de aminoácido exemplares de enzimas DRS-DRR, enzimas DRS e DRR divididas e outras se- quências de nucleotídeo MELQYISYFQPTSSVVALLLALVSILSSVVVLRKTFLNNYSSSPASSTKTAVLSHORQOSC | Fonte de planta P. somniferum; sequência | SEQ. ID ALPISGLLHIFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNND | de aminoácido de comprimento integral NO. 1

TAFSNRPIPLAFKTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIIS QVDTSFNKLYELCKNSEDNHGNYTTTTTTAAGMVRIDDWLAELSFNVIGRIVCGFOSGPK | .RONK-2062398 TGAPSRVEQFKEAINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDOLTGLTRNMKHCGKKLDLVVES! | sm Fpyz.2037562, BMRX-2007040, INDHRQKRRFSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNNPSQIPIKSIVLDMIGGE | om pxaaITO) À TDTTKLTTNWTLSLLLNNPHVLDKAKQEVDAHFRTKRRSTNDAAAAvvDFDDIRNLvY1Iaal | EMEP2018197) IKESMRLYPASPVVERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMQRDPKVWDDPLVFRP o DRFLSDEQKMVDVRGONYELLPFGAGRRVCPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGK o VDMTATPGLMSYKVIPLDILLTHRRIKPCVASAASERDMESSGVPVITLGSGKVMPVLGM 8 GTFEKVGKGSERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLVKSRDELFIS o

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NANNILVSAISVLGSNGTPWGSNAVLGSEVLKKIAMAKGKSVAQVSMRWVYEQGASLVV KSFSEERLRENLNIFDWELTKEDHEKIGEIPQCRILSAYFLVSPNGPFKSQEELWDDEA* MELQYISYFQPTSSVVALLLALVSILSSVVVLRKTFLNNYSSSPASSTKTAVLSHORQOSC | Fonte de planta P. somniferum; sequência | SEQ. ID ALPISGLLHIFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNND | de aminoácido de comprimento integral NO. 2

TAFSNRPIPLAFKTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIIS

QVDTSFNKLYELCKNSEDNHGNYTTXLLLPOLAWRQPWKLYYXTTTTAAGMVRIDDWLA ELSFNVIGRIVCGFOSGPKTGAPSRVEQFKEAINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDOLTG | xCW-2026866 LTRNMKHCGKKLDLVVESIINDHROKRRFSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPG : NNNPSQIPIKSIVLDMIGGGTDTTKLTTIWTLSLLLNNPHVLDKAKQEVDAHFRTKRRSTND | (também FPYZ-2037562, MLPX-2016197)

AAAAVVDFDDIRNLVYIQAIIKESMRLYPASPVVERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWANVW KMQRDPKVWDDPLVFRPDRFLSDEQKMVDVRGQNYELLPFGAGRRVCPGVSFSLDLM QLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTATPGLMSYKVIPLDILLTHRRIKPCVOSAASERDMESS

GVPVITLGSGKVMPVLGMGTFEKVGKGSERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGE AIlAEALQLGLVKSRDELFISSMLWCTDAHADRVLLALQNSLRNLKLEYVDLYMLPFPASLK

PGKITMDIPEEDICRMDYRSVWAAMEECQNLGFTKSIGVSNFSCKKLQELMATANIPPAV NQVEMSPAFQQKKLREY CNANNILVSAISVLGSNGTPWGSNAVLGSEVLKKIAMAKGKS

VAQVSMRWVYEQGASLVVKSFSEERLRENLNIFDWELTKEDHEKIGEIPQCRILSAYFLV SPNGPFKSQEELWDDEA* MELQYISYFQPTSSVVALLLALVSILSSVVVLRKTFLNNYSSSPASSTKTAVLSHORQQSCAL | Fonte de planta P. somniferum; sequência | SEQ. ID PISGLLHIFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNNDTAFS | de aminoácido de comprimento parcial NO. 3

NRPIPLAFKTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIISQVDTSF

NKLYELCKNSEDNHGNYTTTTTTAAGMVRIDDWLAELSFNVIGRIVCGFOSGPKTGAPSRVE QFKEAINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDQLTGLTRNMKHCGKKLDLVVESIINDHRQKRRF >SUFP-2025636 o

SRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNNPSQIPIKSIVLDMIGGGTDTTKLTTIWTLS PP

LLLNNPHVLDKAKQEVDAHFRTKRRSTNDAAAAVVDFDDIRNLVYIQAIIKESMRLYPASPVV S ERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMQRDPKVWDDPLVFRPDRFLSDEQKMVDVRG o

QNYELLPFGAGRRVCPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTATPGLMSYKVIPLDI LLTHRRIKPCVOSAASERDMESSGVPVITLGSGKVMPVLGMGTFEKVGKGSERERLAILKAI

EVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLVKSRDELFISSMLWCTDAHADRVLLALQNSL RNLKLEYVDLYMLPFPASLKPGKITMDIPEEDICRMDYRXVSKPWLH* MRWHRXIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIISQVDTSFNKLYELC | Fonte de planta P. somniferum; sequência | SEQ. ID KNSEDNQGNYPTTTTAAGMVRIDDWLAELSFNVIGRIVCGFOSGPKTGAPSRVEQFKEAI | de aminoácido de comprimento parcial NO. 4

NEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDQLTGLTRNMKHCGKKLDLVVESIINDHRQOKRRFSRT

KGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNNPSQIPIKSIVLDMIGGGTDTTKLTTIWTLSL LLNNPHVLDKAKQEVDAHFRTKRRSTNDAAAAVVDFDDIRNLVYIQAIIKESMRLYPASPV >MIKW-2013651

VERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMQRDPKVWDDPLVFRPDRFLSDEQKMVDV RGQNYELLPFGAGRRVCPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTATPGLMSYK VIPLDILLTHRRIKPCVOSAASERDMESSGVPVITLGSGKVMPVLGMGTFEKVGKGSERE RLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLVKSRDELFISSMLWCTDAHADR VLLALQNSLRNLKLEYVDLYMLPFPASLKPGKITMDIPEEDICRMDYRSVWAAMEECONL GFTKSIGVSNFSCKKLQELMATANIPPAVNQVEMSPAFQQKKLREYCNANNILVSAISVLG

SNGTPWGSNAVLGSEVLKKIAMAKGKSVAQVSMRWVYEQGASLVVKSFSEERLRENLNI FDWELTKEDHEKIGEIPQCRILSAYFLVSPNGPFKSQEELWDDEA* MELQYISYFQPTSSVVALLLALVSILSSVVVLRKTFLNNYSSSPASSTKTAVLSHORQOSC |Fonte de planta P. setigerum; sequência | SEQ. ID ALPISGLLHIFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNND | de aminoácido de comprimento integral NO. 5

TAFSNRPIPLAFKTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIIS QVDTSFNKLYELCKNSEDNQGNYTTTTTAAGMVRIDDWLAELSFNVIGRIVCGFOSGPKT | .EprK-2027940 GAPSRVEQFKEAINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDQLTGLTRNMKHCGKKLDLVVESI! | sm Fpyz-2037562, STDO-2019715, NDHROKRRFSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNNPSQIPIKSIVLDMIGGGT | py 5920312 MLPX2016106 MLPX DTTKLTTIWTLSLLLNNPHVLDKAKQEVDAHFRTKRRSTNDAAAMAVVDFDDIRNLVYIQAN Índigo KESMRLYPASPVVERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMORDPKVWDDPLVFRPD | 2228122 o RFLSDEQKMVDVRGQNYELLPFGAGRRVCPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKV a DMTATPGLMSYKVIPLDILLTHRRIKPCVQSAASERDMESSGVPVITLESGKVMPVLGMG & TFEKVGKGSERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLVKSRDELFISS o

MLWCTDAHADRVLLALQNSLRNLKLEYVDLYMLPFPASLKPGKITMDIPEEDICRMDYRS VWAAMEECQNLGFTKSIGVSNFSCKKLQELMATANIPPAVNQVEMSPAFQQKKLREYCN

ANNILVSAISVLGSNGTPWGSNAVLGSEVLKKIAMAKGKSVAQVSMRWVYEQGASLVVK SFSEERLRENLNIFDWELTKEDHEKIGEIPQCRILSAYFLVSPNGPFKSQEELWDDEA* MELQYISYFQPTSSVVALLLALVSILSSVVVLRKTFLNNYSSSPASSTKTAVLSHORQOSCAL | Fonte de planta P. setigerum; sequência de | SEQ. ID PISGLLHIFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNNDTAFS | aminoácido de comprimento parcial NO. 6

NRPIPLAFKTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIISQVDTSF NKLYELCKNSEDNQGNYTTTTTAAGMVRIDDWLAELSFNVIGRIVCGFOSGPKTGAPSRVE | >qcou-2000833

QFKEAINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDQLTGLTRNMKHCGKKLDLVVESIINDHROKRRF SRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNNPSQIPIKSIVLDMIGGGTDTTKLTTIWTLS LLLNNPHVLDKAKQEVDAHFRTKRRSTNDAAAAVVDFDDIRNLVYIQALYPASPVVERLSGE DCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMQRDPKVWDDPLVFRPDRFLSDEQKMVDVRGQNYELL PFGAGRRVCPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTATPGLMSYKVIPLDILLTHRR IKPCVOSAASERDMESSGVPVITLGSGKVMPVLGMGTFEKVGKGSERERLAILKAIEVGYRY FDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLVKSRDELFISSMLWCTDAHADRVLLALONSLRNLKLEY

VDLYMLPFPASLKPGKITMDIPEEDICRMDYRSVWAAMEE MELQYFSYFQPTSSVVALLLALVSILFSVVVLRKTFSNNYSSPASSTETAVLCHORQOSC | Fonte de planta P. bracfeatum; sequência | SEQ. ID ALPISGLLHVFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNND | de aminoácido de comprimento integral | NO. 7

TAFSNRPIPLAFOQTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIIS

QVDTSFNKLYELCKNSEDNQGMVRMDDWLAQLSFNVIGRIVCGFQSDPKTGAPSRVEQ FKEVINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDQLTGLTRNMKHCGKKLDLVVESIIKDHROKRR | ss50 2915634

FSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNSPPOQIPIKSIVLDOMIGGGTDTTKLTTIW TLSLLLNNPHVLDKAKQEVDAHFRKKRRSTDDAAAAVVDFDDIRNLVYIQAIIKESMRLYP. | (também SSDU-2015636, ZSNV-2027701, ASPVVERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMORDPKVWDDPLVFRPERFLSDEQK | RRID-2004435) MVDVRGONYELLPFGAGRRICPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTATPGL o MSYKVVPLDILLTHRRIKSCVQLASSERDMESSGVPVITLSSGKVMPVLGMGTFEKVGKG o SERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLIESRDELFISSMLWCTDAH 3 PDRVLLALONSLRNLKLEYLDLYMLPFPASLKPGKITMDIPEEDICRMDYRSVWSAMEEC o

QNLGFTKSIGVSNFSSKKLQELMATANIPPAVNQVEMSPAFQQKKLREYCNANNILVSAV

SILGSNGTPWGSNAVLGSEVLKQIAMAKGKSVAQVSMRWVYEQGASLVVKSFSEERLR ENLNIFDWELTKEDNEKIGEIPQCRILTAYFLVSPNGPFKSQEELWDDKA"* MELQYFSYFQPTSSVVALLLALVSILFSVVVLRKTFSNNYSSPASSTETAVLCHORQOSC | Fonte de planta P. bracfeatum; sequência | SEQ. ID ALPISGLLHVFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNND | de aminoácido de comprimento integral | NO. 8

TAFSNRPIPLAFOQTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIIS

QVDTSFNKLYELCKNSEDNQGMVRMDDWLAQLSFNVIGRIVCGFQSDPKTGAPSRVEQ FKEVINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDQLTGLTRNMKHCGKKLDLVVESIIKDHROKRR | no 2927320

FSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNSPPOQIPIKSIVLDOMIGGGTDTTKLTTIW À TLSLLLNNPHVLDKAKQEVDAHFRKKRRSTDDAAAAVVDFDDIRNLVYIQAIIKESMRLYP | (também RRID-2004435)

ASPVVERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMQRDPKVWDDPLVFRPERFLSDEQK MVDVRGQNYELLPFGAGRRICPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTATPGL MSYKVVPLDILLTHRRIKSCVQLASSERDMESSGVPVITLSSGKVMPVLGMGTFEKVGKG SERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLIESRDELFISSMLWCTDAH PDRVLLALONSLRNLKLEYLDLYMLPFPASLKPGKITMDIPEEDICRMDYRSVWSAMEEC QNLGFTKSIGVSNFSCKKLQELMATANIPPAVNQVEMSPAFQQKKLREYCNANNILVSAV

SILGSNGTPWGSNAVLGSEVLKQIAMAKGKSVAQVSMRWVYEQGASLVVKSFSEERLR ENLNIFDWELTKEDNEKIGEIPQCRILTAYFLVSPNGPFKSQEELWDDKA* SSPASSTETAVLCHORQQOSCALPISGLLHIFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRI | Fonta de planta P. bracteatum; sequência | SEQ. ID LVVSSWEMVKECFTGNNDTAFSNRPIPLAFKTIFYACRGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVC | de aminoácido de comprimento parcial NO. 9

VHNLLSNQQLLKFRHLIISQVDTSFNKLYELCKNSEDNQGMVRMDDWLAQLSFSVIGRIVC GFQSDPKTGAPSRVEQFKEAINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDQLTGLTRNMTHCGKKL | spprPBRSTIPF. 89405

DLVVESIINDHROKRRFSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNNPPKIPIKSIVLD MIGAGTDTTKLTIMWTLSLLLNNPNVLAKAKQEVDAHFETKKRSTNEASVVVDFDDIGNLVY! QAIIKESMRLYPVSPVVERLSSEDCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMQRDPKVWDDPLVFR o PERFLSDEQKMVDVRGQNYELLPFGAGRRICPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKV - DMTATPGLMSYKVVPLDILLTHRRIKSCVQLASSERDMESSGVPVITLRSGKVMPVLGMGT & FEKAGKGSERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLIKSRDELFISSML o

WCTDAHPDRVLLALQNSLRNLKLEYVDLYMLPFPASLKPGKITMDIPEEDICPMDYRSVWS AMEECQNLGLTKSIGVSNFSCKKLEELMATANIPPAVNQVEMSPAFQQKKLREYCNANNIL

VSAVSILGSNGTPWGSNAVLGSEVLKKIAMAKGKSVAQVSMRWVYEQGASLVVKSFSEE RLRENLNIFDWOQLTKEDNEKIGEIPQCRILSAYFLVSPKGPFKSQEELWDDKA* SSPASSTETAVLCHORQQSCALPISGLLHIFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRI | Fonte de planta P. bracteatum; sequência | SEQ. ID LVVSSWEMVKECFTGNNDTFFSNRPIPLAFKIIFYAGGVDSYGLALVPYGKYWRELRKICV. | de aminoácido de comprimento parcial NO. 10

HNLLSNQQLLKFRHLIISQVDTSFNKLYELCKNSEDNQGMVRMDDWLAQLSFSVIGRIVCG FOSDPKTGAPSRVEQFKEAINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDOQLTGLTRNMTHCGKKLD | , npr PpBRSTIPF. 4328

LVVESIINDHROKRRFSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNNPPKIPIKSIVLDM IGGGTDTTKLTTIWTLSLLLNNPHVLDKAKQEVDAHFLTKRRSTNDAAVVDFDDIRNLVYIQ AIIKESMRLYPASPVVERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWVNVWKMORDPNVWADPMVFRP ERFLSHGQKKMVDVRGKNYELLPFGAGRRICPGISFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKV DMTATPGLMSYKVVPLDILLTHRRIKSCVQLASSERDMESSGVPVITLRSGKVMPVLGMGT FEKAGKGSERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLIKSRDELFISSML WCTDAHPDRVLLALQNSLRNLKLEYVDLYMLPFPASLKPGKITMDIPEEDICPMDYRSVWS AMEECOQNLGLTKSIGVSNFSCKKLEELMATANIPPAVNQVEMSPAFQQKKLREYCNANNIL

VSAVSILGSNGTPWGSNAVLGSEVLKKIAMAKGKSVAQVSMRWVYEQGASLVVKSFSEE RLRENLNIFDWOQLTKEDNEKIGEIPQCRILSAYFLVSPKGPFKSQEELWDDKA* SSPASSTETAVLCHORQQOSCALPISGLLHIFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRI | Fonte de planta P. bracteatum; sequência | SEQ. ID LVVSSWEMVKECFTGNNDTFFSNRPIPLAFKIIFYAGGVDSYGLALVPYGKYWRELRKICV. | de aminoácido de comprimento parcial NO. 11

HNLLSNQQLLNFRHLIISQVDTSFNKLYDLSNKKKNTTTDSGTVRMDDWLAQLSFNVIGRIV CGFQTHTETSATSSVERFTEAIDEASRFMSIATVSDTFPWLGWIDQLTGLTRKMKHYGKKL | xpprPBRSTIPF. 12180

DLVVESIIEDHRQNRRISGTKQGDDFIDICLSIMEQPQIIPGNNDPPRQIPIKSIVLDMIGGGTD

TTKLTTTWTLSLLLNNPHVLEKAREEVDAHFGTKRRPTNDDAVMVEFDDIRNLVYIQAIIKES MRLYPASPVVERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWVYNVWKMQRDPNVWADPMVFRPERFL o SDEQKMVDVRGQNYELLPFGAGRRICPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTA & TPGLMSYKVVPLDILLTHRRIKSCVQLASSERDMESSGVPVITLRSGKVMPVLGMGTFEKA & GKGSERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLIKSRDELFISSMLWCTD o

AHPDRVLLALQNSLRNLKLEYVDLYMLPFPASLKPGKITMDIPEEDICPMDYRSVWSAMEE CONLGLTKSIGVSNFSCKKLEELMATANIPPAVNQVEMSPAFQQKKLREYCNANNILVSAV

SILGSNGTPWGSNAVLGSEVLKKIAMAKGKSVAQVSMRWVYEQGASLVVKSFSEERLRE NLNIFDWOQLTKEDNEKIGEIPQCRILSAYFLVSPKGPFKSQEELWDDKA* VALRKKILKNYYSSSSSTATAVSHQWPKASRALPLIDLLHVFFNKTDLMHVTLGNMADKF | Fonte de planta P. bracteatum; sequência | SEQ. ID GPIFSFPTGSHRTLVVSSWEKAKECFTGNNDIVFSGRPLPLAFKLIFYAGGIDSYGISQVP | de aminoácido de comprimento parcial NO. 12

YGKKWRELRNICVHNILSNQQLLKFRHLMISQVDNSFNKLYEVCNSNKDEGDSATSTTAA GIVRMDDWLGKLAFDVIARIVCGFOSQTETSTTSSMERFTEAMDEASRFMSVTAVSDTV | »pprPBRSTIPF. 4329

PWLGWIDQLTGLKRNMKHCGKKLNLVVKSIIEDHRQKRRLSSTKKGDENIIDEDEQDDFID ICLSIMEQPQLPGNNNPPKIPIKSIVLDMIGGGTDTTKLTTIWTLSLLLNNPHVLDKAKQEVD AHFLTKRRSTNDAAVVDFDDIRNLVYIQAIIKESMRLYPASPVVERLSGEDCVVGGFHVPA GTRLWVNVWKMQRDPNVWADPMVFRPERFLSDEQKMVDVRGQNYELLPFGAGRRICP GVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTATPGLMSYKVVPLDILLTHRRIKSCVQLA SSERDMESSGVPVITLRSGKVMPVLGMGTFEKAGKGSERERLAILKAIEVGYRYFDTAAA YETEEVLGEAIAEALQLGLIKSRDELFISSMLWCTDAHPDRVLLALONSLRNLKLEYVDLY MLPFPASLKPGKITMDIPEEDICPMDYRSVWSAMEECQNLGLTKSIGVSNFSCKKLEELM ATANIPPAVNQVEMSPAFQQKKLREYCNANNILVSAVSILGSNGTPWGSNAVLGSEVLKK

IAMAKGKSVAQVSMRWVYEQGASLVVKSFSEERLRENLNIFDWQLTKEDNEKIGEIPQC RILSAYFLVSPKGPFKSQEELWDDKA* MELQYFSYFQPTSSVVALLLALVSILFSVVVLRKTFSNNYSSPASSTETAVLCHORQOSC | Fonte de planta P. bracfeatum; sequência | SEQ. ID ALPISGLLHVFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNND | de aminoácido de comprimento parcial NO. 13

TAFSNRPIPLAFOQTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIIS QVDTSFNKLYELCKNSEDNQGMVRMDDWLAQLSFNVIGRIVCGFOSDPKTGAPSRVEQ | ,gspu-2015635

FKEVINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDQLTGLTRNMKHCGKKLDLVVESIIKDHROKRR FSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNSPPOQIPIKSIVLDOMIGGGTDTTKLTTIW o

TLSLLLNNPHVLDKAKQEVDAHFRKKRRSTDDAAAAVVDFDDIRNLVYIQAIIKESMRLYP O ASPVVERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMQRDPKVWDDPLVFRPERFLSDEQK 3 MVDVRGONYELLPFGAGRRICPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTATPGL o

MSYKVVPLDILLTHRRIKSCVQLASSERDMESSGVPVITLSSGKVMPVLGMGTFEKVGKG SERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLIESRDELFISSMLWCTDAH PDRVLLALONSLRNLKLEYLDLYMLPFPASLKPGKITMDIPEEDICRMDYRSVWSAMEEC QNLGFTKSIGVSNFSSKKLQELMATANIPPAVNQVEMSPAFQQKKLREYCNANNILVSAV

SILGSNGTPWGSNAVLGSEVLKQIAMAKGKSVAQVSMRWVXKFSAYAIVWSLFFGHRICI TLYSFLIRNVAYICITY* MELQYFSYFQPTSSVVALLLALVSILFSVVVLRKTFSNNYSSPASSTETAVLCHORQOSC | Fonte de planta P. bracfeatum; sequência | SEQ. ID ALPISGLLHVFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNND | de aminoácido de comprimento parcial NO. 14

TAFSNRPIPLAFOQTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIIS QVDTSFNKLYELCKNSEDNQGMVRMDDWLAQLSFNVIGRIVCGFQSDPKTGAPSRVEQ FKEVINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDQLTGLTRNMKHCGKKLDLVVESIIKDHROKRR

FSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNSPPOQIPIKSIVLDOMIGGGTDTTKLTTIW TLSLLLNNPHVLDKAKQEVDAHFRKKRRSTDDAAAAVVDFDDIRNLVYIQAIIKESMRLYP. | >SSDU-2015637

ASPVVERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMQRDPKVWDDPLVFRPERFLSDEQK MVDVRGQNYELLPFGAGRRICPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTATPGL MSYKVVPLDILLTHRRIKSCVQLASSERDMESSGVPVITLSSGKVMPVLGMGTFEKVGKG SERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLIESRDELFISSMLWCTDAH

PDRVLLALQNSLRQVFLMQIRLIYICTYQQVHLNIYFQINEFVLCDMYRNLKLEY LNNYSSSPASSTKTAVLSHORQQSCALPISGLLHIFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFP | Fonte de planta C. majus ; sequência de | SEQ. ID TGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNNDTAFSNRPIPLAFKTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYW | aminoácido de comprimento parcial NO. 15

RELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIISQVDTSFNKLYELCKNSEDNQGNYPTTTTAAGMVRI

DDWLAELSFNVIGRIVCGFOSGPKTGAPSRVEQFKEAINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWI DQLTGLTRNMKHCGKKLDLVVESIINDHRQOKRRFSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQ >chm.CMAST2PF 14984

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KGKSVAQVSMRWVYEQGASLVVKSFSEERLRENLNIFDWELTKEDHEKIGEIPQCRILSA YFLVSPNGPFKSQEELWDDEA* MELQYFSYFQPTSSVVALLLALVSILFSVVVLRKTFSNNYSSPASSTETAVLCHORQQASC DRS-DRR de P. bracteatum SEQ. ID ALPISGLLHVFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNND NO. 16

TAFSNRPIPLAFQTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIIS QVDTSFNKLYELCKNSEDNQGMVRMDDWLAQLSFNVIGRIVCGFAOSDPKTGAPSRVEQ FKEVINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDQLTGLTRNMKHCGKKLDLVVESIIKDHRQKRR FSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNSPPQIPIKSIVLDMIGGGTDTTKLTTIW TLSLLLNNPHVLDKAKQEVDAHFRKKRRSTDDAAAAVVDFDDIRNLVYIQAIIKESMRLYP ASPVVERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMQRDPKVWDDPLVFRPERFLSDEQK MVDVRGQNYELLPFGAGRRICPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTATPGL MSYKVVPLDILLTHRRIKSCVQLASSERDMESSGVPVITLSSGKVMPVLGMGTFEKVGKG SERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEEVLGEAIAEALQLGLIESRDELFISSMLWCTDAH PDRVLLALQNSLRNLKLEYLDLYMLPFPASLKPGKITMDIPEEDICRMDYRSVWSAMEEC QNLGFTKSIGVSNFSCKKLQELMATANIPPAVNQVEMSPAFQQKKLREYCNANNILVSAV

SILGSNGTPWGSNAVLGSEVLKQIAMAKGKSVAQVSMRWVYEQGASLVVKSFSEERLR ENLNIFDWELTKEDNEKIGEIPQCRILTAYFLVSPNGPFKSQEELWDDKA* MELQYFSYFQPTSSVVALLLALVSILFSVVVLRKTFSNNYSSPASSTETAVLCHORQQASC DRS de P. bracteatum SEQ. ID ALPISGLLHVFMNKNGLIHVTLGNMADKYGPIFSFPTGSHRTLVVSSWEMVKECFTGNND NO. 17

TAFSNRPIPLAFQTIFYACGGIDSYGLSSVPYGKYWRELRKVCVHNLLSNQQLLKFRHLIIS

QVDTSFNKLYELCKNSEDNQGMVRMDDWLAQLSFNVIGRIVCGFAOSDPKTGAPSRVEQ FKEVINEASYFMSTSPVSDNVPMLGWIDQLTGLTRNMKHCGKKLDLVVESIIKDHRQKRR “N FSRTKGGDEKDDEQDDFIDICLSIMEQPQLPGNNSPPQIPIKSIVLDMIGGGTDTTKLTTIW 2

TLSLLLNNPHVLDKAKQEVDAHFRKKRRSTDDAAAAVVDFDDIRNLVYIQAIIKESMRLYP S ASPVVERLSGEDCVVGGFHVPAGTRLWANVWKMQRDPKVWDDPLVFRPERFLSDEQK & MVDVRGQNYELLPFGAGRRICPGVSFSLDLMQLVLTRLILEFEMKSPSGKVDMTATPGL

MSYKVVPLDILLTHRRIKSCVOQLASSERD MESSGVPVITLSSGKVMPVLGMGTFEKVGKGSERERLAILKAIEVGYRYFDTAAAYETEE | DRR de P. bracteatum SEQ. ID VLGEAIAEALQLGLIESRDELFISSMLWCTDAHPDRVLLALQNSLRNLKLEYLDLYMLPFPA NO. 18

SLKPGKITMDIPEEDICRMDYRSVWSAMEECQNLGFTKSIGVSNFSCKKLQELMATANIP PAVNQVEMSPAFQQKKLREYCNANNILVSAVSILGSNGTPWGSNAVLGSEVLKQIAMAK

GKSVAQVSMRWVYEQGASLVVKSFSEERLRENLNIFDWELTKEDNEKIGEIPQCRILTAY FLVSPNGPFKSQEELWDDKA* TTCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATA | Promotor TDH3 SEQ. ID GTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCC NO. 19

GTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTG GGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGG CATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAG TTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAA AACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAG GCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTC TCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCC CCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTA TTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCA

AGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAA GAGCGTTGGTTGGTGGATCAAGCCCACGCGTAGGCAATCCTCGAGCAGATCCGCCA | Promotor CYC1 SEQ. ID GGCGTGTATATATAGCGTGGATGGCCAGGCAACTTTAGTGCTGACACATACAGGCAT NO. 20

ATATATATGTGTGCGACGACACATGATCATATGGCATGCATGTGCTCTGTATGTATAT AAAACTCTTGTTTTCTTCTTTTCTCTAAATATTCTTTCCTTATACATTAGGACCTTTGCA vN GCATAAATTACTATACTTCTATAGACACACAAACACAAATACACACACTAAATTAATA Mm CATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCG | Promotor TEF1 SEQ. ID & CATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTCCCCTCTTTCTT NO. 21

CCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCG CCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTITTITTCOT TGAAAATTTTTITTTTTTGATTTTTTTCTCTTTCGATGACCTCCCATTGATATTTAAGTTAA TAAACGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTT

TTACTTCTTGCTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAA ACAGGCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACG | Terminador CYC1 SEQ. ID CCCTCCTCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTA NO. 22

GGTCCCTATTTATTTTTTTTAATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAA TTTTTCTTTTTTTTCTGTACAAACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTG

CTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTG GCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTA | Terminador ADH1 SEQ. ID TACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAACTCT NO. 23

|TreeretaGeTEAGETECTTEreAGET CCTCGCCGCAGTTAATTAMAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGCGTAACTATAACGGTCCTA | pDW10 SEQ. ID AGGTAGCGAATCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACC NO. 24

GCATAGATCGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATT TCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCTCCA CACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAACATTT TCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGCCTTC CAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTTCTGAA TCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGC AGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGGTATTCT

TGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAG CCAAAACATCCTCCTTAAGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCT Ns GAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATT & GTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGC & ACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTA o

CCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATAC TCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTCTTITTTTCGA CCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGGATCAAGATTGTACGTAAGG TGACAAGCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATCTGGCGTCATAACTG CAAAGTACACATATATTACGATGCTGTTCTATTAAATGCTTCCTATATTATATATATAGTA ATGTCGTGATCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCC AGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCG GCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTT CACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTITTATA GGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGC GCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTITAT GTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGA AAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTA TTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAA ATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGGTGAAACAATTCGGCATTAA TACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAG TCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTITTACTTTCTATT TTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAA AAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATITIT TCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAAT AATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTITT TTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGAT GCTGAAGATCAGTTGGGACGCGTAGTCTAGACCAGCCAGGACAGAAATGCCTCGACT TCGCTGCTACCCAAGGTTGCCGGGTGACGCACACCGTGGAAACGGATGAAGGCACGA ACCCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAGCTGTAATGCAAGTAGCGTATGCGCT CACGCAACTGGTCCAGAACCTTGACCGAACGCAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCG R

GTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGGGGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAA S GCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGT o

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AAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAA AGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTT a

TTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAMAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACA S TAAACAAACAAAATGGAACTTCAGTACTTCTCCTATTTTCAACCCACTTCATCTGTCGTA o

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GACCGAGCGCAGCGGCGGCCEGCGCTGEATACCGCCGC CCTCGCCGCAGTTAATTAAMAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGCGTAACTATAACGGTCCT | pDW18 SEQ. ID AAGGTAGCGAATCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACAC NO. 25

CGCATAGATCGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCT ATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCT CCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAAC ATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGC CTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTT CTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTAT GTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGG TATTCTTGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGA CCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAAGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGG AGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCG GGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGA ATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGG ACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTA ATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTT TTCTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGGATCAAGA TTGTACGTAAGGTGACAAGCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATCTG GCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGATGCTGTTCTATTAAATGCTTCCTATA E

TTATATATATAGTAATGTCGTGATCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGC S CGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGG o

CTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGC ATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGT GATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGGATCGCT TGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACT CTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAG AAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAG CGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGA TTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGAC AAGGTGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAG TATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTITITT CTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATT ATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG TGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATG AGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCA ACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTITGCTC ACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGACGCGTAGTCT AGACCAGCCAGGACAGAAATGCCTCGACTTCGCTGCTACCCAAGGTTGCCGGGTGA CGCACACCGTGGAAACGGATGAAGGCACGAACCCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGT TCGTAAGCTGTAATGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAACCTTGAC CGAACGCAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTT TTTTGGGGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGG GTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTA AAACAAAGTTAAACATTATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTAT CAGAGGTAGTTGGCGCCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACAT

TTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTG GTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTT 8

TTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACC S ATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAA o

TTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATC GACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTA GGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGC GCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGC GAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCG CGCCGAAGGATGTCGCTGCCGGCTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCA GCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGC CTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAA GGTAGTCGGCAAATAACCCTCGAGCATTCAAGGCGCCTTGATTATTTGACGTGGTTT GATGGCCTCCACGCACGTTGTGATATGTAGATGAGAGCGTTGGTTGGTGGATCAAGC CCACGCGTAGGCAATCCTCGAGCAGATCCGCCAGGCGTGTATATATAGCGTGGATG GCCAGGCAACTTTAGTGCTGACACATACAGGCATATATATATGTGTGCGACGACACA TGATCATATGGCATGCATGTGCTCTGTATGTATATAAAACTCTTGTTTTCTTCTITITCT CTAAATATTCTTTCCTTATACATTAGGACCTTTGCAGCATAAATTACTATACTTCTATAG ACACACAAACACAAATACACACACTAAATTAATAATGGAACTTCAGTACTTCTCCTATT TTCAACCCACTTCATCTGTCGTAGCCCTACTACTAGCACTAGTGAGTATTTTATTTAGC GTAGTTGTTTTGAGGAAGACTTTCAGTAACAATTACTCCAGCCCCGCGTCAAGTACG GAAACCGCTGTGCTGTGTCATCAGAGGCAACAGAGTTGCGCCCTACCTATCAGCGG CCTTCTTCACGTGTTCATGAATAAGAACGGCCTGATTCATGTCACCTTGGGAAATATG GCTGACAAATATGGCCCTATCTTCAGTTTTCCGACAGGCAGCCACCGTACTTTAGTAG TCAGTTCCTGGGAAATGGTGAAAGAGTGTTTCACCGGTAATAACGACACGGCATTCT CCAACAGACCAATCCCTTTGGCTTTTCAAACCATATTCTACGCCTGTGGCGGCATTGA TTCTTACGGTTTAAGTAGTGTCCCGTATGGTAAATACTGGAGGGAGTTGAGAAAGGT GTGTGTTCACAACCTGCTGAGTAATCAGCAATTGCTGAAGTTCAGACATCTTATAATC

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GATAACGTACCAATGTTGGGATGGATCGACCAATTGACCGGTCTGACGAGGAACATG AAGCATTGTGGGAAGAAGCTTGACTTAGTAGTGGAGTCAATTATCAAGGACCATAGG CAAAAGAGACGTTTTTCACGTACAAAAGGTGGCGATGAGAAGGATGACGAACAGGAC GACTTTATTGATATTTGCTTGAGCATCATGGAGCAGCCACAGTTGCCCGGGAACAATT CTCCCCCTCAAATTCCGATCAAATCTATCGTGCTAGACATGATTGGGGGTGGTACCG ACACTACGAAACTTACAACCATATGGACCCTATCACTTTTGTTGAACAATCCTCACGT GTTAGATAAAGCTAAACAAGAGGTCGACGCTCACTTTCGTAAAAAGAGAAGATCAACA GATGACGCAGCAGCGGCAGTCGTTGATTTTGACGACATAAGAAATTTAGTATACATCC AAGCCATCATTAAAGAAAGTATGAGGCTTTATCCAGCCAGCCCGGTGGTTGAGCGTC TTTCCGGCGAGGATTGCGTTGTTGGAGGTTTTCACGTGCCTGCTGGTACGAGACTAT GGGCTAACGTTTGGAAGATGCAAAGAGATCCCAAAGTTTGGGACGATCCTCTAGTAT TCAGACCTGAAAGGTTTTTGAGCGACGAGCAAAAGATGGTAGACGTTCGTGGCCAAA ACTATGAACTTCTGCCATTCGGCGCAGGAAGAAGAATCTGTCCAGGCGTTTCCTTTA GTCTTGACCTTATGCAACTTGTCCTAACCAGGTTAATCCTAGAGTTCGAAATGAAGTC CCCGTCCEGGCAAGGTAGATATGACCGCAACTCCAGGACTAATGTCTTACAAGGTGGT TCCATTGGACATATTGCTGACTCACCGTCGTATCAAGTCATGCGTTCAATTGGCGTCT TCTGAACGTGATATGGAAAGTTCTGGGGTGCCTGTGATCACATTGTCCTCAGGTAAA GTAATGCCCGTACTGGGCATGGGAACCTTCGAAAAGGTGGGTAAGGGGTCTGAACG TGAGCGTTTAGCCATTCTTAAMAGCGATCGAAGTTGGTTACCGTTACTTTGATACCGCA GCGGCATATGAAACGGAAGAAGTTCTAGGGGAAGCCATTGCTGAAGCTTTACAATTG GGTCTGATAGAGAGCCGTGACGAGCTGTTCATCAGCTCAATGCTTTGGTGCACCGAC GCACATCCAGACCGTGTGCTACTTGCTCTGCAAAACAGTCTGAGAAATCTAAAACTTG AATATCTAGACCTATATATGTTGCCGTTTCCTGCCAGCCTTAAGCCGGGCAAAATTAC GATGGATATTCCTGAGGAGGATATTTGCCGTATGGATTATCGTTCAGTCTGGAGCGC

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GTCGCACAGgatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccettaacgtgagttttegttecactgagegt cagacccegtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttetacgacgtaatctgctgcttgacaaacaaaaaaaccace gcetaccagcggtagtttatttaccggatcaagagctaccaactctttttecgaaggtaactggcttcagcagagegcagatace aaatactgtccttetagtgtagcegtagttaggccaccactticaagaactctgtagcacegectacatacctegcetetgctaatec tattaccagtggctgctgccagtggegataagtcgtgtettaccgggttgagactcaagacgatagttaccggataaggegcag cggtcgggctgaacgagggggttegtacacacagcececagettggagegaacgacctacaccegaactgagatacctacage gtgagctatgagaaagecgccacgceticcegaagggagaaaggceggacagatatceggtaageggcagggtcgagaacag gagagcgcacgagggagcettecagggggaaacgcctagtatctttatagtcctategggtttegecacetetgactigagegte gatttttatgatgctegteaggggggcagagectatagaaaaacgecagcaacgeggcagtagaacg TGCATTATGA

ATTAGTTACGCTAGGGATAACAGGGTAATATAGAACCCGAACGACCGAGCGCAGCG

GCGGCCGCGCTGATACCGCCEGC CCTCGCCGCAGTTAATTAMAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGCGTAACTATAACGGTCCT | pDW21 SEQ. ID oo AAGGTAGCGAATCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACAC NO. 26 Mm

CGCATAGATCGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCT S ATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCT a

CCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAAC ATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGC CTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTT CTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTAT GTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGG TATTCTTGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGA CCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAAGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGG AGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCG GGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGA ATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGG ACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTA ATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCOTT TTCTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGGATCAAGA TTGTACGTAAGGTGACAAGCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATCTG GCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGATGCTGTTCTATTAAATGCTTCCTATA TTATATATATAGTAATGTCGTGATCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGC CGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGG CTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGC ATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGT GATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGGATCGCT TGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACT CTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAG AAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAG CGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGA TTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGAC AAGGTGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAG S

TATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTITITT S CTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATT o

ATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG TGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATG AGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCA ACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTITGCTC ACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGACGCGTAGTCT AGACCAGCCAGGACAGAAATGCCTCGACTTCGCTGCTACCCAAGGTTGCCGGGTGA CGCACACCGTGGAAACGGATGAAGGCACGAACCCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGT TCGTAAGCTGTAATGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAACCTTGAC CGAACGCAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTT TTTTGGGGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGG GTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTA AAACAAAGTTAAACATTATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTAT CAGAGGTAGTTGGCGCCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACAT TTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTG GTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTT TTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACC ATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAA TTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATC GACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTA GGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGC GCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGC GAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCG CGCCGAAGGATGTCGCTGCCGGCTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCA GCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGC CTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAA GGTAGTCGGCAAATAACCCTCGAGCATTCAAGGCGCCTTGATTATTTGACGTGGTTT R

GATGGCCTCCACGCACGTTGTGATATGTAGATGAGAGCGTTGGTTGGTGGATCAAGC S CCACGCGTAGGCAATCCTCGAGCAGATCCGCCAGGCGTGTATATATAGCGTGGATG o

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TTTCCGGCGAGGATTGCGTTGTTGGAGGTTTTCACGTGCCTGCTGGTACGAGACTAT S GGGCTAACGTTTGGAAGATGCAAAGAGATCCCAAAGTTTGGGACGATCCTCTAGTAT o

TCAGACCTGAAAGGTTTTTGAGCGACGAGCAAAAGATGGTAGACGTTCGTGGCCAAA ACTATGAACTTCTGCCATTCGGCGCAGGAAGAAGAATCTGTCCAGGCGTTTCCTTTA GTCTTGACCTTATGCAACTTGTCCTAACCAGGTTAATCCTAGAGTTCGAAATGAAGTC CCCGTCCEGGCAAGGTAGATATGACCGCAACTCCAGGACTAATGTCTTACAAGGTGGT

TCCATTGGACATATTGCTGACTCACCGTCGTATCAAGTCATGCGTTCAATTGGCGTCT TCTGAACGTGATtaaGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAA

AAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTAT TCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTACATAGCTTCAAAAT GTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCEGGACTCCGCGCATCGCCGTACCA CTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTCCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTC GTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCGCCTCGTTTCTITITITT CTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTTTCTTGAAAATTTTITTIT TTTGATTTTTTTCTCTTTCGATGACCTCCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCTTCA ATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGCTCA TTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAATGGAAAGTTCTGGG GTGCCTGTGATCACATTGTCCTCAGGTAAAGTAATGCCCGTACTGGGCATGGGAACC TTCGAAAAGGTGGGTAAGGGGTCTGAACGTGAGCGTTTAGCCATTCTTAAAGCGATC GAAGTTGGTTACCGTTACTTTGATACCGCAGCGGCATATGAAACGGAAGAAGTTCTA GGGGAAGCCATTGCTGAAGCTTTACAATTGGGTCTGATAGAGAGCCGTGACGAGCT GTTCATCAGCTCAATGCTTTGGTGCACCGACGCACATCCAGACCGTGTGCTACTTGC TCTGCAAAACAGTCTGAGAAATCTAAAACTTGAATATCTAGACCTATATATGTTGCCGT TTCCTGCCAGCCTTAAGCCGGGCAAAATTACGATGGATATTCCTGAGGAGGATATTT GCCGTATGGATTATCGTTCAGTCTGGAGCGCCATGGAAGAGTGTCAAAACTTAGGAT TTACTAAAAGTATTGGTGTAAGCAACTTTTCTTGCAAGAAATTACAAGAATTAATGGCC

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TGGGATCAAACGGGACGCCCTGGGGTAGTAATGCTGTTCTTGGAAGCGAAGTTTTGA S AACAGATCGCGATGGCGAAAGGCAAAAGCGTTGCGCAAGTCAGTATGAGGTGGGTC o

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TTTCCGTTCTTCTTCGTCATAACTTAATGTTTTTATTTAMAATACCTCGCGAGTGGCAA CACTGAAAATACCCATGGAGCGGCGTAACCGTCGCACAGgatctaggtgaagatcctttttgataat ctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttegttecactgagegtragacccegtagaaaagatcaaaggatcttetigagate ctttttttetacgcgtaatctgctgcttacaaacaaaaaaaccacegetaccageggtagtttatttaceggatcaagagetacca actctttttrcgaaggtaactggcttrcagcagagegcagataccaaatactgtccttetagtgtagcegtagttaggecaccactt caagaactctgtagcacegcectacatacctegetetgctaatcctattaccagtggctactaccagtggcgataagitcgtatetta cegggttggactcaagacgatagttaccggataaggegcageggtegggctgaacgaggagggttegtacacacageccage ttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagegecacgctticcegaagggagaa aggcggacaggtatceggtaageggcagggteggaacaggagagegcacgagggagetticcagggggaaacgcctag tatctttatagtcctgtegggtttegecaccetetgactigagcgtegatttttataatactegteaggggggeggagectatggaaa aacgccagcaacgceggcagtggaacgaTGCATTATGAATTAGTTACGCTAGGGATAACAGGGTAA

TATAGAACCCGAACGACCGAGCGCAGCGGCGGCCGCGCTGATACCGCCGC CCTCGCCGCAGTTAATTAMAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGCGTAACTATAACGGTCCT | pJL29 SEQ. ID AAGGTAGCGAATCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACAC NO. 27 CGCATAGATCGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCT oo

ATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCT N

CCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAAC S ATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGC a

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GATGGCCTCCACGCACGTTGTGATATGTAGATGATTCAGTTCGAGTTTATCATTATCA ATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTT 8

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CCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCC AGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGC AACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGT GATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCT ATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAA AAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAA AGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACT TTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAMAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACA CATAAACAAACAAAATGGAACTTCAGTACTTCTCCTATTTTCAACCCACTTCATCTGTC GTAGCCCTACTACTAGCACTAGTGAGTATTTTATTTAGCGTAGTTGTTTTGAGGAAGA CTTTCAGTAACAATTACTCCAGCCCCGCGTCAAGTACGGAAACCGCTGTGCTGTGTC ATCAGAGGCAACAGAGTTGCGCCCTACCTATCAGCGGCCTTCTTCACGTGTTCATGA ATAAGAACGGCCTGATTCATGTCACCTTGGGAAATATGGCTGACAAATATGGCCCTAT CTTCAGTTTTCCGACAGGCAGCCACCGTACTTTAGTAGTCAGTTCCTGGGAAATGGT GAAAGAGTGTTTCACCGGTAATAACGACACGGCATTCTCCAACAGACCAATCCCTTT GGCTTTTCAAACCATATTCTACGCCTGTGGCGGCATTGATTCTTACGGTTTAAGTAGT GTCCCGTATGGTAAATACTGGAGGGAGTTGAGAAAGGTGTGTGTTCACAACCTGCTG AGTAATCAGCAATTGCTGAAGTTCAGACATCTTATAATCTCCCAAGTGGATACGTCTT TTAACAAGTTGTATGAGCTGTGTAAGAACTCTGAAGATAATCAAGGTATGGTAAGGAT GGATGATTGGCTAGCTCAACTTTCCTTTAACGTCATCGGTAGGATCGTTTGCGGATTC CAGTCTGACCCAAAGACGGGTGCACCTTCAAGGGTAGAACAGTTTAAGGAAGTCATA AATGAGGCGTCATATTTTATGTCAACAAGTCCAGTCTCCGATAACGTACCAATGTTGG GATGGATCGACCAATTGACCGGTCTGACGAGGAACATGAAGCATTGTGGGAAGAAG CTTGACTTAGTAGTGGAGTCAATTATCAAGGACCATAGGCAAAAGAGACGTTTTTCAC

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ATAACTTAATGTTTTTATTTAMAATACCTCGCGAGTGGCAACACTGAAAATACCCATGG AGCGGCGTAACCGTCGCACAGgatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtga gttttegttecactgagegtcagacceegtagaaaagatcaaaggatcttettgagatectttttttetacgcgtaatctgctactige aaacaaaaaaaccaccgctaccageggtagtttatttaccggatcaagagctaccaactcttttteogaaggtaactggetica gcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagcegtagttaggccaccactticaagaactctgtagcaccgcectacat acctegctetgctaatcctattaccagtggctactaccagtggcgataagtcegtatettaccegggttagactcaagacgatagtta ceggataaggegcageggtegggctgaacggggggtticatacacacageccagettiggagegaacgacctacacegaa ctgagatacctacagcgtgagctatgagaaagegecacgceticcegaagggagaaaggceggacaggtatcceggtaageg gcagggteggaacaggagagegcacgagggagcetteccagggggaaacgcctagtatctttatagtcctategggtttegec acctctgacttgagcgtegatttttataatgctegteaggggggeggagcectatagaaaaacgccagcaacgeggcagigga acgTGCATTATGAATTAGTTACGCTAGGGATAACAGGGTAATATAGAACCCGAACGAC S

CGAGCGCAGCGGCGEGCCGCGCTEATACCGCEGC S CCTCGCCGCAGTTAATTAMAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGCGTAACTATAACGGTCCT | pJL32 SEQ. ID a AAGGTAGCGAATCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACAC NO. 28

CGCATAGATCGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCT ATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCT CCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAAC ATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGC CTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTT CTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTAT GTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGG TATTCTTGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGA CCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAAGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGG AGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCG GGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGA ATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGG ACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTA ATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTT TTCTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGGATCAAGA TTGTACGTAAGGTGACAAGCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATCTG GCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGATGCTGTTCTATTAAATGCTTCCTATA TTATATATATAGTAATGTCGTGATCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGC CGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGG CTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGC ATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGT GATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGGATCGCT TGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACT

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AAGGTGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAG TATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTITITT CTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATT ATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG TGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATG AGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCA ACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTITGCTC ACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGACGCGTAGTCT AGACCAGCCAGGACAGAAATGCCTCGACTTCGCTGCTACCCAAGGTTGCCGGGTGA CGCACACCGTGGAAACGGATGAAGGCACGAACCCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGT TCGTAAGCTGTAATGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAACCTTGAC CGAACGCAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTT TTTTGGGGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGG GTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTA AAACAAAGTTAAACATTATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTAT CAGAGGTAGTTGGCGCCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACAT TTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTG GTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTT TTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACC ATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAA TTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATC GACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTA GGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGC GCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGC GAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCG CGCCGAAGGATGTCGCTGCCGGCTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCA R

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GGTAGTCGGCAAATAACCCTCGAGCATTCAAGGCGCCTTGATTATTTGACGTGGTTT GATGGCCTCCACGCACGTTGTGATATGTAGATGAGAGCGTTGGTTGGTGGATCAAGC CCACGCGTAGGCAATCCTCGAGCAGATCCGCCAGGCGTGTATATATAGCGTGGATG GCCAGGCAACTTTAGTGCTGACACATACAGGCATATATATATGTGTGCGACGACACA TGATCATATGGCATGCATGTGCTCTGTATGTATATAAAACTCTTGTTTTCTTCTITITCT CTAAATATTCTTTCCTTATACATTAGGACCTTTGCAGCATAAATTACTATACTTCTATAG ACACACAAACACAAATACACACACTAAATTAATAATGGAACTTCAGTACTTCTCCTATT TTCAACCCACTTCATCTGTCGTAGCCCTACTACTAGCACTAGTGAGTATTTTATTTAGC GTAGTTGTTTTGAGGAAGACTTTCAGTAACAATTACTCCAGCCCCGCGTCAAGTACG GAAACCGCTGTGCTGTGTCATCAGAGGCAACAGAGTTGCGCCCTACCTATCAGCGG CCTTCTTCACGTGTTCATGAATAAGAACGGCCTGATTCATGTCACCTTGGGAAATATG GCTGACAAATATGGCCCTATCTTCAGTTTTCCGACAGGCAGCCACCGTACTTTAGTAG TCAGTTCCTGGGAAATGGTGAAAGAGTGTTTCACCGGTAATAACGACACGGCATTCT CCAACAGACCAATCCCTTTGGCTTTTCAAACCATATTCTACGCCTGTGGCGGCATTGA TTCTTACGGTTTAAGTAGTGTCCCGTATGGTAAATACTGGAGGGAGTTGAGAAAGGT GTGTGTTCACAACCTGCTGAGTAATCAGCAATTGCTGAAGTTCAGACATCTTATAATC TCCCAAGTGGATACGTCTTTTAACAAGTTGTATGAGCTGTGTAAGAACTCTGAAGATA ATCAAGGTATGGTAAGGATGGATGATTGGCTAGCTCAACTTTCCTTTAACGTCATCGG TAGGATCGTTTGCGGATTCCAGTCTGACCCAAAGACGGGTGCACCTTCAAGGGTAGA ACAGTTTAAGGAAGTCATAAATGAGGCGTCATATTTTATGTCAACAAGTCCAGTCTCC GATAACGTACCAATGTTGGGATGGATCGACCAATTGACCGGTCTGACGAGGAACATG AAGCATTGTGGGAAGAAGCTTGACTTAGTAGTGGAGTCAATTATCAAGGACCATAGG CAAAAGAGACGTTTTTCACGTACAAAAGGTGGCGATGAGAAGGATGACGAACAGGAC GACTTTATTGATATTTGCTTGAGCATCATGGAGCAGCCACAGTTGCCCGGGAACAATT CTCCCCCTCAAATTCCGATCAAATCTATCGTGCTAGACATGATTGGGGGTGGTACCG ACACTACGAAACTTACAACCATATGGACCCTATCACTTTTGTTGAACAATCCTCACGT &

GTTAGATAAAGCTAAACAAGAGGTCGACGCTCACTTTCGTAAAAAGAGAAGATCAACA S GATGACGCAGCAGCGGCAGTCGTTGATTTTGACGACATAAGAAATTTAGTATACATCC o

AAGCCATCATTAAAGAAAGTATGAGGCTTTATCCAGCCAGCCCGGTGGTTGAGCGTC TTTCCGGCGAGGATTGCGTTGTTGGAGGTTTTCACGTGCCTGCTGGTACGAGACTAT GGGCTAACGTTTGGAAGATGCAAAGAGATCCCAAAGTTTGGGACGATCCTCTAGTAT TCAGACCTGAAAGGTTTTTGAGCGACGAGCAAAAGATGGTAGACGTTCGTGGCCAAA ACTATGAACTTCTGCCATTCGGCGCAGGAAGAAGAATCTGTCCAGGCGTTTCCTTTA GTCTTGACCTTATGCAACTTGTCCTAACCAGGTTAATCCTAGAGTTCGAAATGAAGTC CCCGTCCEGGCAAGGTAGATATGACCGCAACTCCAGGACTAATGTCTTACAAGGTGGT

AAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTAT TCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATTCAGTTCGAGTTTA TCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTA ACTTTATTTAGTCAAAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAA TAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTAT TCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAA AAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTC TCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCT CAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACG CATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAA AAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATA AGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTA AATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTASMAACACCAAGAACTTAGTTTCGA ATAAACACACATAAACAAACAAAATGGAAAGTTCTGGGGTGCCTGTGATCACATTGTC CTCAGGTAAAGTAATGCCCGTACTGGGCATGGGAACCTTCGAAAAGGTGGGTAAGG

GGTCTGAACGTGAGCGTTTAGCCATTCTTAAAGCGATCGAAGTTGGTTACCGTTACTT TGATACCGCAGCGGCATATGAAACGGAAGAAGTTCTAGGGGAAGCCATTGCTGAAG 8

CTTTACAATTGGGTCTGATAGAGAGCCGTGACGAGCTGTTCATCAGCTCAATGCTTTG S GTGCACCGACGCACATCCAGACCGTGTGCTACTTGCTCTGCAAAACAGTCTGAGAAA o

TCTAAAACTTGAATATCTAGACCTATATATGTTGCCGTTTCCTGCCAGCCTTAAGCCG GGCAAAATTACGATGGATATTCCTGAGGAGGATATTTGCCGTATGGATTATCGTTCAG TCTGGAGCGCCATGGAAGAGTGTCAAAACTTAGGATTTACTAAAAGTATTGGTGTAAG CAACTTTTCTTGCAAGAAATTACAAGAATTAATGGCCACTGCAAATATCCCGCCCGCG GTAAATCAAGTAGAGATGTCACCAGCTTTCCAACAGAAAAAACTGAGGGAATATTGTA ACGCAAACAACATATTGGTATCCGCAGTAAGCATTCTGGGATCAAACGGGACGCCCT GGGGTAGTAATGCTGTTCTTGGAAGCGAAGTTTTGAAACAGATCGCGATGGCGAAAG GCAAAAGCGTTGCGCAAGTCAGTATGAGGTGGGTCTATGAGCAGGGCGCGTCTTTA GTAGTCAAGAGTTTCTCTGAAGAACGTTTAAGAGAAAACCTGAATATTTTTGACTGGG AGCTTACGAAAGAAGACAATGAGAAGATAGGCGAAATCCCGCAATGTAGAATCCTTA

CTGCGTACTTCCTTGTCTCCCCGAACGGCCCGTTTAAATCTCAGGAAGAGCTTTGGG ATGACAAGGCAtaaACAGGCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCA

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AGCGCAGCGGCGGCCGECGECTGATACCGCEGCE CCTCGCCGCAGTTAATTAMAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGCGTAACTATAACGGTCCT | pJL35 SEQ. ID AAGGTAGCGAATCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACAC NO. 29

CGCATAGATCGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCT ATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCT CCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAAC ATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGC CTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTT CTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTAT GTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGG TATTCTTGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGA CCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAAGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGG AGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCG GGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGA ATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGG ACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTA ATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTT TTCTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGGATCAAGA TTGTACGTAAGGTGACAAGCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATCTG GCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGATGCTGTTCTATTAAATGCTTCCTATA TTATATATATAGTAATGTCGTGATCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGC CGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGG CTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGC ATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGT GATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGGATCGCT &

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CCGAGCGCAGCGGCGGCCGCGCTGATACCGCCGCE

Modificações de Geração de Alcaloide Morfinano

[00143] Alguns métodos, processos e sistemas providos aqui des- crevem a conversão de alcaloides promorfinano em alcaloides morfi- nano. Alguns dos métodos, processos e sistemas descrevem a con- versão de uma base tetracíclica em uma base pentacíclica (FIG. 28). Alguns dos métodos, processos e sistemas podem compreender uma célula hospedeira engenheirada. Em alguns exemplos, a produção de tebaína pentacíclica, ou um alcaloide morfinano, a partir de um precur- sor tetracíclico, ou um alcaloide promorfinano, é descrita. Em alguns exemplos, a conversão de alcaloides promorfinano em tebaína são etapas-chave na conversão de um substrato em uma faixa diversa de alcaloides benzilisoquinolina.

[00144] Em alguns exemplos, o precursor de tetraciclina pode ser salutaridina, salutaridinol ou salutaridinol-7-O-acetato. O precursor de tetraciclina pode ser convertido em tebaína pentacíclica através do fe- chamento de uma ponte óxido entre C-4 e C-5. Em alguns exemplos, o precursor tetracíclico salutaridina pode ser preparado para fechamento de anel através da hidroxilação em etapas e O-acetilação em C-7. Fe- chamento de anel pode ser ativado através da eliminação de um grupo de saída acetato. Em alguns exemplos, a eliminação alílica e fecha- mento de anel óxido que gera tebaína ocorrem espontaneamente. Em outros exemplos, a reação de fechamento de anel que gera tebaína pentacíclica é promovida por fatores tal como pH ou solvente. Em ou- tros exemplos, a reação de fechamento de anel de geração de tabeína é promovida através de contato com uma proteína ou enzima. Essas etapas de conversão são providas na FIG. 14 e representadas geral- mente no Esquema 2. R1, R2 e Ra podem ser H ou CH3. Ra pode ser CH3, CH3CH2, CH;CH2C0H2 ou outro grupo alquila apropriado. Em al- guns casos, R1, R2, Ra e Ra podem ser CH3 como provido na FIG. 14.

Esquema 2 RO A Elminçãode mama er A ME TOO dE e ERES AD A o E. Ro Y Ro % É o Ro" '

[00145] Em alguns exemplos, a primeira enzima que prepara o pre- cursor de tetraciclina é salutaridina redutase (SalR). Em alguns casos, SalR hidroxila o substrato salutaridina na posição C-7 (vide Fórmula II). O produto desta reação pode ser um ou mais epímeros de saluta- ridinol. Em alguns exemplos, o produto é (7S)-salutaridinol. Em alguns exemplos, a salutaridina redutase pode catalisar a reação de redução dentro de uma célula hospedeira, tal como um hospedeiro engenhei- rado, como aqui descrito.

[00146] Em alguns exemplos, a segunda enzima que prepara Oo precursor tetracíclico é salutaridinol 7-O-acetiltransferase (SalAT). Em alguns casos, SalAT transfere a acetila de acetil-CoA para 7-OH de salutaridinol (vide Fórmula IV). Em outros casos, SalAT pode utilizar o cofator novo tal como n-propionil-CoA e transfere a propionila para o 7- OH salutaridinol. Em alguns exemplos, o produto de SalAT é (7S)- salutaridinol-7-O-acetato. Em alguns exemplos, a salutaridinol 7-O- acetiltransferase pode catalisar a reação de transferência de acetila dentro de uma célula hospedeira, tal como um hospedeiro engenhei- rado, como aqui descrito.

[00147] Em alguns exemplos, o precursor tetracíclico de tebaína é (7S)-salutaridino|l-7-O-acetato. Em alguns exemplos, (7S)-salutaridinol- 7-O-acetato é instável e elimina espontaneamente o acetato em C-7 e fecha a ponte óxido entre C-4 e C-5 para formar tebaína (vide Fórmula V). Em alguns exemplos, a taxa de eliminação de grupo de saída ace- tato é promovida pelo pH. Em alguns exemplos, a eliminação alílica e fechamento de ponte óxido é catalisada por uma enzima com atividade de tebaína sintase, ou uma tebaína sintase. Em alguns exemplos, es-

sa enzima é uma proteína de dobra Bet v 1. Em alguns exemplos, es- sa enzima é uma tebaína sintase engenheirada, uma SalAT engenhei- rada, uma proteína dirigente (DIR) ou uma chalcona isomerase (CHI). Em alguns exemplos, a enzima codificando atividade de tebaína sin- tase pode catalisar a reação de fechamento de anel dentro de uma célula hospedeira, tal como um hospedeiro engenheirado, como aqui descrito.

[00148] Em alguns exemplos, a enzima salutaridina redutase pode ser SalR ou uma enzima do tipo SalR de plantas na ordem Ranuncula- les que biossintetiza tebaína, por exemplo, Papaver somniferum. Em outros exemplos, a enzima com atividade de salutaridina redutase po- de ser de mamíferos ou qualquer outro vertebrado ou invertebrado que biossintetize morfina endógena.

[00149] Em alguns exemplos, a enzima salutaridinol 7-O-acetiltrans- ferase pode ser SalAT ou uma enzima do tipo SalAT de plantas na or- dem Ranunculales que biossintetiza tebaína, por exemplo, P. somnife- rum. Em outros exemplos, a enzima com atividade de salutaridinol 7- O-acetilltransferase pode ser de mamíferos ou qualquer outro verte- brado ou invertebrado que biossintetiza morfina endógena.

[00150] Em alguns exemplos, a enzima tebaína sintase pode ser uma proteína de dobra Bet v 1 de plantas na ordem Ranunculales que biossintetiza tebaína, por exemplo, P. somniferum. Em alguns exem- plos, a proteína Bet v 1 inclui os domínios que seguem na ordem do terminal N para o terminal C: um filamento B, uma ou duas hélices a, seis filamentos À e uma ou duas hélices a. A proteína é organizada de modo que ela tem uma dobra Bet v 1 e um sítio ativo que aceita molé- culas hidrofóbicas, grandes, volumosas, tais como alcaloides morfina- no. Esta proteína pode ser qualquer proteína Bet v 1 de planta, proteí- na relacionada à patogênese 10 (por exemplo, se ligando à citocina ou brassinoesteroides), proteína do tipo policetídeo ciclase de planta ou proteína relacionada à norcoclaurina sintase (NCS) que tem uma do- bra Bet v 1. Outros exemplos de não planta da proteína de 1 cobra Bet v são policetídeo ciclase, proteínas homólogo 1 do ativador da Hsp90 ATPase (AHA1), proteínas do tipo SMU440 (por exemplo, de Strepto- coccus mutans), proteínas relacionadas à PA1206 (por exemplo, de Pseudomonas aeruginosa), proteína de resistência à calicheamicina CalC (por exemplo, de Micromonospora echinospora) e a proteína CoxG de monóxido de carbono metabolizando Oligotropha carboxido- vorans. Exemplos adicionais de famílias relacionadas a Bet v 1 inclu- em proteínas de transferência de lipídeo START, proteínas de transfe- rência de fosfatidilinositol e hidroxilases de anel.

[00151] Em alguns exemplos, a enzima tebaína sintase pode ser uma proteína dirigente de plantas na ordem Ranunculales que biossin- tetiza tebaína, por exemplo, P. somniferum. Em outros exemplos, a enzima pode ser qualquer proteína dirigente de plantas.

[00152] Em alguns exemplos, a enzima tebaína sintase pode ser uma proteína chalcona isomerase de plantas na ordem Ranunculales que biossintetiza tebaína, por exemplo, P. somniferum. Em outros exemplos, a enzima pode ser qualquer proteína chalcona isomerase de plantas.

[00153] Em alguns exemplos, a enzima tebaína sintase pode ser uma enzima do tipo SalAT de plantas na ordem Ranunculales que bi- ossintetiza tebaína, por exemplo, P. somniferum. Em outros exemplos, a enzima pode ser qualquer proteína do tipo SalAT de plantas.

[00154] Em alguns exemplos, a enzima com atividade de tebaína sintase pode ser de mamíferos ou qualquer outro vertebrado ou inver- tebrado que biossintetize morfina endógena.

[00155] Em alguns exemplos, qualquer combinação das enzimas acima junto com proteínas acessório adicionais pode funcionar para converter qualquer precursor tetracíclico em tebaína. Em alguns exem-

plos, essas enzimas catalisam a reação dentro de uma célula hospe- deira, tal como um hospedeiro engenheirado, como aqui descrito.

[00156] Exemplos de sequências de aminoácido para atividade de tebaína sintase são mostrados na Tabela 2. Uma sequência de ami- noácido para uma tebaína sintase que é utilizada em um precursor te- tracíclico para tebaína pode ser 75% ou mais idêntica a uma dada se- quência de aminoácido como listado na Tabela 2. Por exemplo, uma sequência de aminoácido para tal tebaína sintase pode compreender uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75% ou mais, 80% ou mais, 81% ou mais, 82% ou mais, 83% ou mais, 84% ou mais, 85% ou mais, 86% ou mais, 87% ou mais, 88% ou mais, 89% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idêntica a uma sequência de aminoácido como provido aqui. Ainda, em certas modalidades, uma sequência de aminoácido "idêntica" con- tém pelo menos 80%-99% de identidade com o nível de aminoácido para a sequência de aminoácido específica. Em alguns casos, uma sequência de aminoácido "idêntica" contém pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e mais em certos casos, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade, no ní- vel de aminoácido. Em alguns casos, a sequência de aminoácido pode ser idêntica, mas a sequência de DNA é alterada de modo a otimizar uso de códon para o organismo hospedeiro, por exemplo.

[00157] Uma célula hospedeira engenheirada pode ser provida, a qual produz uma salutaridina redutase, salutaridinol 7-O-acetiltrans- ferase e tebaína sintase que converte um precursor tetracíclico em te- baína, em que a tebaína sintase compreende uma sequência de ami- noácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 e 37. Em alguns casos, a tebaína sintase pode formar uma proteína de fusão com outras enzimas. As enzimas que são pro-

duzidas dentro da célula hospedeira engenheirada podem ser recupe- radas e purificadas de modo a formar um biocatalisador. Essas uma ou mais enzimas podem também ser usadas para catalisar a conver- são de um precursor promorfinano tetracíclico em tebaína.

[00158] Em outros exemplos, a tebaína sintase compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 e 61.

[00159] Em casos adicionais, a uma ou mais enzimas que são re- cuperadas a partir da célula hospedeira engenheirada podem ser usa- das em um processo para conversão de um precursor promorfinano tetracíclico em uma tebaína. O processo pode incluir contato do pre- cursor promorfinano tetracíclico com as enzimas recuperadas em uma quantidade suficiente para converter o dito precursor promorfinano te- tracíclico em tebaína. Em exemplos, o precursor promorfinano tetrací- clico pode ser contatado com uma quantidade suficiente da uma ou mais enzimas de modo que pelo menos 5% do dito precursor promor- finano tetracíclico são convertidos em tebaína. Em exemplos adicio- nais, o precursor promorfinano tetracíclico pode ser contatado com uma quantidade suficiente da uma ou mais enzimas de modo que pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pe- lo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo me- nos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pe- lo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100% do dito precursor promorfinano tetracíclico são convertidos em tebaína.

[00160] Em alguns exemplos, condições de processo são imple-

mentadas para suportar a formação de tebaína em células hospedei- ras engenheiradas. Em alguns casos, células hospedeiras engenhei- radas são cultivadas em pH 3,3, e uma vez densidade celular alta ten- do sido atingida, o pH é ajustado para pH 8,0 para suportar produção continuada de tebaína em pH maior. Em alguns casos, as células hos- pedeiras engenheiradas produzem enzimas adicionais para converter açúcar e outros precursores simples, tal como tirosina, em tebaína. Em alguns casos, a enzima SalAT foi engenheirada para exibir atividade maior em pH 8,0 e é expressa a partir de um promotor de estágio tar- dio.

[00161] Em alguns exemplos, uma ou mais das enzimas de conver- são de um precursor promorfinano tetracíclico em uma tebaína estão localizadas em compartimentos celulares. Em alguns exemplos, SalR, SalAT e Bet v 1 podem ser modificadas de modo que elas codifiquem sequências-alvo que as localizam na membrana do retículo endoplás- mico da célula hospedeira engenheirada. Em particular, em certos ca- Sos, a célula hospedeira pode ser engenheirada para aumentar a pro- dução de salutaridinol ou tebaína ou produtos para os quais tebaína é precursora a partir de reticulina ou seus precursores através da locali- zação de Bet v 1 e/ou SalR e/ou SalAT em organelas na célula de le- vedura. Bet v 1 e/ou SalR e/ou SalAt podem estar localizadas no retí- culo endoplásmico da levedura a fim de diminuir a distância espacial entre Bet v 1 e/ou SalR e/ou SalAt e CYP2D2 ou CYP2D6 ou SalSyn ou uma enzima citocromo P450 engenheirada que catalisa a conver- são de reticulina em salutaridina. Por produção aumentada quer dizer ambos a produção de alguma quantidade do composto de interesse onde o controle não tem nenhuma produção do composto de interes- se, bem como um aumento de 10% ou mais, tal como 50% ou mais, incluindo 2 vezes ou mais, por exemplo, 5 vezes ou mais, tal como 10 vezes ou mais em situações onde o controle tem alguma produção do composto de interesse.

[00162] Em outros exemplos, SalAT e Bet v 1 podem estar colocali- zados em uma proteína de fusão única. Em alguns exemplos, a fusão é criada entre SalAT e Bet v 1 através de um de vários métodos inclu- indo fusão direta, colocalização em uma organela de levedura ou atra- vés de ferramentas de colocalização de enzima tais como zíperes de leucina, bases de proteína que utilizam domínios adaptadores ou ba- ses de RNA que utilizam aptâmeros. Colocalização da enzima de sín- tese de tebaína pode facilitar canalização de substrato entre os sítios ativos das enzimas e limita a difusão de intermediários instáveis tal como salutaridinol-7-O-acetato.

[00163] Em alguns exemplos, uma enzima salutaridinol 7-O-acetil- transferase (SalAT) engenheirada é usada em conversão de precursor promorfinano tetracíclico em uma tebaína. Em alguns exemplos, uma enzima SalAT é engenheirada para combinar duas funções: (1) a transferência de um grupo acila de acetil-CoA para o 7-OH de salutari- dinol e (2) a eliminação subsequente do grupo acetila e fechamento de uma ponte óxido entre carbonos C4 e C5 para formar tebaína.

[00164] Em alguns exemplos, uma enzima com atividade de saluta- ridinol 7-O-acetiltransferase é fundida a um peptídeo com 1 dobra Bet v. Em alguns exemplos, a enzima salutaridinol 7-O-acetiltransferase e a proteína de dobra Bet v 1 podem ser fundidas em qualquer ordem do terminal N para o terminal C, do terminal C para o terminal N, do terminal N para o terminal N ou do terminal C para o terminal C. Em alguns exemplos, as duas sequências de proteína podem ser fundidas diretamente ou fundidas através de uma região ligante de peptídeo.

[00165] Em alguns exemplos, uma enzima com atividade de saluta- ridinol 7-O-acetiltransferase é fundida a um peptídeo com 1 dobra Bet v através de permutação circular. Em alguns casos, os terminais Ne C de SalAt são fundidos e a sequência de Bet v 1 é então inserida alea-

toriamente nesta sequência. Em alguns casos, a biblioteca de proteína de fusão resultante é avaliada quanto à produção de tebaína. Em ou- tros casos, uma biblioteca de SalAT de permutação circular é primeiro avaliada quanto à atividade na ausência de Bet v 1. Em outros casos, os terminais N e C de SalAT são fundidos e a enzima é digerida e clo- nada na extremidade cega. Em outros casos, essa biblioteca de SalAT circularmente permutada é avaliada quanto à atividade de salutaridino! 7-O-acetiltransferase. Em outros casos, variantes ativas da biblioteca de SalAT circularmente permutada são então usadas para projetar proteínas de fusão com um peptídeo com uma dobra Bet v 1.

[00166] As uma ou mais enzimas que podem ser usadas para con- verter um precursor promorfinano tetracíclico em uma tebaína podem contatar o precursor promorfinano tetracíclico in vitro. Ainda, ou alter- nativamente, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para converter um precursor promorfinano tetracíclico em tebaína podem contatar o precursor promorfinano tetracíclico in vivo. Ainda, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para converter um precursor promorfinano tetracíclico em tebaína podem ser providas a uma célula tendo o precursor promorfinano tetracíclico dentro ou podem ser pro- duzidas dentro de uma célula hospedeira engenheirada.

[00167] Em alguns exemplos, os métodos proveem células hospe- deiras engenheiradas que produzem um produto alcaloide, em que a conversão de um precursor promorfinano tetracíclico em uma tebaína pode compreender uma etapa-chave na produção de um produto alca- loide. Em alguns exemplos, o produto alcaloide é tebaína. Em ainda outras modalidades, o produto alcaloide é derivado de uma tebaína incluindo, por exemplo, alcaloides morfinano a jusante. Em uma outra modalidade, um precursor promorfinano tetracíclico é um intermediário em direção ao produto na célula hospedeira engenheirada. Em ainda outras modalidades, o produto alcaloide é selecionado do grupo con-

sistindo em alcaloides morfinano, nor-opioide ou nal-opioide.

[00168] Em alguns exemplos, o substrato da reação de redução é um composto de Fórmula Ill: "O HO? RO Ji 8 o

[00169]

[00170] ouum saldo mesmo, em que:

[00171] R1, R2 e R3 são independentemente selecionados de hidrogênio e metila.

[00172] Em alguns outros exemplos, R1, R2 e R3 são metila, e a reação de redução é catalisada por uma salutaridina redutase.

[00173] Em alguns exemplos, o substrato da reação de transferên- cia de cadeia de carbono é um composto de Fórmula IV: RO. O Ho , R,

RO oH

[00174] Fórmula IV, ou um sal do mesmo, em que:

[00175] R1, R2 e R3 são independentemente selecionados de hidrogênio e metila.

[00176] Em alguns outros exemplos, R1, R2 e R3 são metila, e a re- ação de transferência de cadeia de carbono é catalisada por uma salu- taridinol 7-O-acetiltransferase.

[00177] Em alguns exemplos, o substrato de tebaína sintase é um composto de Fórmula V:

RO. “S s . o RÃo

[00178] Fórmula V, ou um sal do mesmo, em que:

[00179] R1, R2 e R3 são independentemente selecionados de hidrogênio e metila; e

[00180] Ra é selecionado de metila, etila, propila e outro grupo alquila apropriado.

[00181] Em alguns outros exemplos, R1, R2, Rg e Ra são metila, e a reação de fechamento de anel é catalisada por uma tebaína sintase. Em alguns exemplos, a tebaína sintase é uma proteína Bet v 1.

[00182] Em alguns exemplos, os métodos proveem células hospe- deiras engenheiradas que produzem produtos alcaloides a partir de salutaridina. A conversão de salutaridina em tebaína pode compreen- der uma etapa-chave na produção de diversos produtos alcaloides a partir de um precursor. Em alguns exemplos, o precursor é L-tirosina ou açúcar (por exemplo, glicose). Os produtos alcaloides diversos po- dem incluir, sem limitação, alcaloides morfinano, nor-opioide ou nal- opioides.

[00183] “Qualquer fonte de carbono adequada pode ser usada como um precursor em direção a um alcaloide morfinano pentacíclico. Pre- cursores adequados podem incluir, sem limitação, monossacarídeos (por exemplo, glicose, frutose, galactose, xilose), oligossacarídeos (por exemplo, lactose, sacarose, rafinose), polissacarídeos (por exemplo, amido, celulose) ou uma combinação dos mesmos. Em alguns exem- plos, misturas não purificadas de matérias-primas renováveis podem ser usadas (por exemplo, licor de milho, melaço de beterraba açucarei- ra, malte de cevada, hidrolisado de biomassa). Em ainda outras moda-

lidades, o precursor de carbono pode ser um composto de um carbono (por exemplo, metanol, dióxido de carbono) ou um composto de dois carbonos (por exemplo, etanol). Em ainda outras modalidades, outros compostos contendo carbono podem ser utilizados, por exemplo, meti- lamina, glucosamina e aminoácidos (por exemplo, L-tirosina). Em al- guns exemplos, um alcaloide 1-benzilisoquinolina pode ser adicionado diretamente a uma célula hospedeira engenheirada da invenção inclu- indo, por exemplo, norlaudanosolina, laudanosolina, norreticulina e re- ticulina.

[00184] Em alguns exemplos, o produto alcaloide benzilisoquinoli- na, ou um derivado do mesmo, é recuperado. Em alguns exemplos, o produto alcaloide benzilisoquinolina é recuperado de uma cultura celu- lar. Em alguns exemplos, o produto alcaloide benzilisoquinolina é um alcaloide morfinano, nor-opioide ou nal-opioide.

Tabela 2. Sequências de aminoácido exemplares de enzimas de geração de alcaloide morfinano Nome da | Descrição Sequência SEOQ. ID NO. sequência Br j| P. bracteatum MAPRGVSGLVGKLSTELDVNCDAEKYYNMYKNGEDVQKAVPHLCMDVKVISGDA | SEQ. ID. NO. 30

TRSGCIKEWNVNIDGKTIRSVEETTHNDETKTLRHRVFEGDMMKDYKKFDTIMEV

NPKPDGNGCVVTRSIEYEKVNENSPTPFDYLQFGHQAMEDMNKY P. setigerum MLVGKLSTELEVDCDAEKYYNMYKHGEDVKKALCVDVKVISGDPTRSGCIKEWN | SEQ. ID. NO. 31

VNIDGKTIRSVEETTHNDETKTLRHRVFEGDMMKDFKKFDTIMVVNPKPDGNGCV

VTRSIEYEKTNENSPTPFDYLQFGHQAIEDMNKYL P. setigerum MLVGKLSTELEVDCDAEKYYNMYKHGEDKRQCVDVKVISGDPTRSGCIKEWNVNI | SEQ. ID. NO. 32 DGKTIRSVEETTHNDETKTLRHRVFEGDMMKDFKKFDTIMVVNPKPDGNGCVVT z RSIEYEKTNENSPTPFDYLQFGHQAIEDMNKY o P. setigerum MLVGKLSTELEVDCDAEKYYNMYKHGEDVKKAVPHLCVDVKIISGDPTSSGCIKE | SEOQ. ID. NO. 33 &

WNVNIDGKTIRSVEETTHDDETKTLRHRVFEGDVMKDFKKFDTIMVVNPKPDGNG

CVVTRSIEYEKTNENSPTPFDYLQFGHQAIEDMNKYL P. setigerum MVKIISGDPTSSGCIKEWNVNIDGKTIRSVEETTHDDETKTLRHRVFEGDVMKDFK | SEQ. ID. NO. 34

KFDTIMVVNPKPDGNGCVVTRSIEYEKTNENSPTPFDYLQFGHQAIEDMNKYL P. somniferum MDSINSSIYFCAYFRELIIKLLMAPPGVSGLVGKLSTELEVNCDAEKYYNMYKHGE | SEQ. ID. NO. 35

DVQKAVPHLCVDVKVISGDPTRSGCIKEWNVNIDGKTIRSVEETTHNDETKTLRHR VFEGDVMKDFKKFDTIMVVNPKPDGNGCVVTRSIEYEKTNDNSPTPFDYLQFGHQ

AIEDMNKYLRDSE P. somniferum MNFFIKDHLYICLVGKLSTELEVDCDAEKYYNMYKHGEDVKKAVPHLCVDVKIISG | SEOQ. ID. NO. 36

DPTSSGCIKEWNVNIDGKTIRSVEETTHDDETKTLRHRVFEGDVMKDFKKFDTIMV VNPKPDGNGCVVTRSIEYEKTNENSPTPFDYLQFGHQAIEDMNKYLRDSESN

Nome da | Descrição Sequência SEOQ. ID NO. sequência P. somniferum MAPLGVSGLVGKLSTELEVDCDAEKYYNMYKHGEDVKKAVPHLCVDVKIISGDPT | SEQ. ID. NO. 37

SSGCIKEWNVNIDGKTIRSVEETTHDDETKTLRHRVFEGDVMKDFKKFDTIMVVNP

KPDGNGCVVTRSIEYEKTNENSPTPFDYLQFGHQAIEDMNKYLRDSESN P. somniferum MMKVCVSSREKIKPSRPTPGHLKTHKLSFLDQVAARIYVPLLLYYAGNKENVDTDT | SEQ. ID. NO. 38

RCNIIKKSLAETLTKFYILAGKIVNDEIERFVYNCNDDGVDFCVTKVSNCQLFQVIKRP DIFDQVTLFLPFDPCDNEITASGDFLLSVQVNVFEDCRGMVIGLCINHKVADASSIT TFVNYWATIARGLVLNVDDRQIQDPCFQVOSIFPQKEKGIGFKISSSSIDGTLVTKK

FGFEASKLAELKERCKFAGATEDIRGGYKPNRVEALSTFLWKCFIDIDOAKTKAAA PARVYLASNAVNIRSRIVPQLPTSSFGNMVAITDAIFTVNSNENNGINDPYYPKLVQ = KFRDAVKRVDGEYIEALQSTDLLLNNVTKLFKHILNGQTLSISFTSWCRFPFYDTDL o

LD S P. somniferum MKVQVISKELIKPSTPTPPRLRNFKLSLLDQLLPPFYVPINIFYPANDDHESNNNDOC | SEQ. ID. NO. 39 o

IKANILKKSLSETLTRFYPIAGRIRDKILVECNDEGVHYIEAKVNAVMSDFMSLDVIH QLHPSYITLDDLAEEAQLAVQVTMFDCGGIALSICSSHKIIDGCTSTTFLNSWAATA RAPSNPEIVYPTFDAAAIFPAQPSGVQVSTLESDDRLQGENVVTKRFLFSASKITAL RARIAESRSSNILSKYPSRSEAVSALVWKSFMETSRVKVTREHTFSAEASTKPIVR SIANFVVNLRTRLNPPLPNVSFGNIIMDATAESLIIDNGENTLGFVETLDGLISQLRL

GVTKMDDEYVRKLREDDVEFLKSLDEASHPSNGEGDGNGERV P. setigerum MNDTMKIEVVSKESIKPSYPTPNNLKIHNLSNLDQLIPAFYMDHILYYPSLDSNDSS | SEQ. ID. NO. 40

LGDDEEDKKMIFSASSRHRCDVVKKSLAETLTRYYPLAGRIKDEKSVECNDEGVD YIEARVVGITVSQVIQLASSDIEVMEPFLPYEPYGGTGSAFRRAGIHSNSKPLLKIQ VNVFDCGGMVICLSGSHKVIDATSILNFVYNDWAATARGGFDTHDDELKVAVVDKP CYIFSSMFPPTSFGNQEEKDTADQAQLVPDRIEIVTKRFVFKDSSIAKLKKKCIHVN

Nome da | Descrição Sequência SEOQ. ID NO. sequência

TNNGSDHQVDKQEHNMQQMPSRIEALTSLIWMCFMDVDRRFRVKQIDDAVSPVN TVNEVSLPKQVQYVAGFAINLRTRTIQPLPTNSFGNMTDTAIAEVTLNLTGSDHFN NEKGIRDOSQNYPELVSKIKDSIKLVDNKHIEAMKRNLAISCNNIKMHQMMKESTF DQNTRELLMFSSWCRFPIYEADFGWGKPSWASITKLLYKNCVMFLDTSSGDGIEA

WVSLKEEDMVEFERHEELVALAS P. somniferum MKVOQVISKEIIKPSSPTPPHLRNFKLSLLDQILPPFYVPIVMFYPAGDDYVTNNNIHD | SEQ. ID. NO. 41

QSSKSEFLKKSLSETLTRFYPIAGRIKDNILIDOCNNEGVDYIEAKVNGIMSDFMSVD VVHQLHPSHIMLDDVAKEAQLAVQVNLFDCGGIAISISMSHKIVDACTAITFINGWA

ATARAAPKQEIVCPTFDSAAIFPALPPGVQVSSLESDDSVQGVNVVTKMFAFTAPK IASLRARIAELRSSSDGLSKYPTRTEALSALVWKSFIRTSRVKAARKYSLSPASTKP a VIKSVANYAVNLRTRLNPPLPQVSFGNILMDATAESTTTIDDDDSHEFADTLAGLIG 3 QLRLGVSRINGDYIRKLQEGDLAFLKSLDEASHDSNGEKVQICWISSLCRFPFYEA - DFGWGKPSWVALNTNAEYKNSLFLMDTKCGTGIEAWVSLEEDDMAIFEEDQDLL &S

QCVKSIN P. setigerum MENMKVEVVLKQTIKPSTQTPLHSKTFNLSFLDQHLGPPIYIPFTLYYESGDVNNK | SEOQ. ID. NO. 42

NNHCDGYKNNLEEACEHRVSVIKQOSLSETLARYYPLAGRMKEDNLAVECNDEGYV EYFETRVSDVRLSQVIKRSPNHNSVLRKFLPPCISSCDNSMSIPFDYGFKSKTLLAI QVNIFECGGIVIGMCMAHRLADASTMFTFITOWAATARGAIEDIKGPSFDFSYTLFP QKDVINNFKPFDPMLTREEDLVTKYFVFPASKIVELKRRNVNNIVCQODTSQQNTSP CTRVEAVTSFMWKRYMDSVRAKNQTQATSVEKYGALYTVNLRSRITPPLPANSF GNIYTFTIALSTPSDENDIDDGLRKDVSSPNDLNLVGKVRDAIKKIDDKYTRKLOSS EDELVNDVKPLTSGEAIFLGFSSWCRFPIYEADFGWGKPTWVSIGTMALRNTVFL

MDTKSGDGIEAFVNMAKEDMDNFEVKLLADOQ [esse — | vENvKVEVVLETIKPSTOTPLASKTFNCSFLDGRALGPPIVIPETLYYESGOVNNK | SEG. 1D. NO. 48 |

Nome da | Descrição Sequência SEOQ. ID NO. sequência

NNHCDGYKNNLEEVCEHRVSVIKOSLSETLARYYPLAGRMKEDNLAVECNDEGYV EYFETRVSDVRLSQVIKRSPNHNSVLRKFLPPCISSCDNSMSIPFDYGFKSKTLLAI QVNIFECGGIVIGMCMAHRLADASTMFTFITOWAATARGAIEDIKGPSFDFSYTLFP QKDVINNFKPFDPMLTREEDLVTKYFVFPASKIVELKRRNVNNIVCQODTSQQNTSP CTRVEAVTSFMWKRYMDSVRAKNQTQATSVEKYGALYTVNLRSRITPPLPANSF GNIYTFTIALSTPSDENDIDDGLRKDVSSPNDLNLVGKVRDAIKKIDDKYTRKLOSS EDELVNDVKPLTSGEAIFLGFSSWCRFPIYEADFGWGKPTWVSIGTMALRNTVFL

MDTKSGDGIEAFVNMAKEDMDNFEVKLLADQLLHVHPTV P. setigerum MSSTVEVISKQTIKPSTPTPIQRKNHSLSLIDQHFAPIYIPIVLFYPAAAVNDTGNVOQ | SEQ. ID. NO. 44 HGDNTCVLKRSLSETLVHFYPLAGRMKDNIVVDCNDQGVEFTEVKVSGTMCDFL a MKPDEQLSGLLPSEAVCMNFVREAQVMIQVNTFDCGSKAISLCVSHKIADASTITT -- FSRCWAETTIAVSKSTSAVTPIVSSKFHPTFDAASLFPPIKQLISPSGVTPALPELIP - SEESKFGKIISKRFLFSATTINSVREKLSALMADKLKYRRLTRVEVVSALIWNSFDKL &S

ATTGSVAVMVKHAVNLRKRIDPPLPDVSFGNILEFTKAVVGEAAANTTTOGTVGSS SKLLEELSEFAGQLREPVSKMNKGDHDFDMENTDYEERDLWMSSWCNYGLYDI DFGCGKPVWVTTVATMYPYSDGFFMNDTRCGQGIEVWGNLVEEDMANFQLNLS

ELLDRI P. somniferum MMKVCVSSREKIKPSRPTPGHLKTHKLSFLDQVAARIYVPLLLYYAGNKENVDTDT | SEQ. ID. NO. 45

RCNIIKKSLAETLTKFYILAGKIVNDEIERFVYNCNDDGVDFCVTKVSNCQLFQVIKRP DIFDQVTLFLPFDPCDNEITASGDFLLSVQVNVFEDCRGMVIGLCINHKVADASSIT TFVNYWATIARGLVLNVDDRQIQDPCFQVOSIFPQKEKGIGFKISSSSIDGTLVTKK FGFEASKLAELKERCKFTTEPEDGYKPTRVEALSAFLWKCFIDIDQOAKLKGVARTK VYLATNAVNMRSRMVPQLPTSSFGNIISITDAVFSINNDDSTGINDPYYPKLVRKFR DAIKKIDRDYIEALRSTDLLLNNMMKLIEHVLSGHTLSIYFSSWCRFPLYETDFGWG

Nome da | Descrição Sequência SEOQ. ID NO. sequência [| |xPMWvsTETIPaKNVVLMDSNSSADGIEAYVTLAKEDMGELERAEETTAS — Proteínas dirigentes P. somniferum MGAMKFFSFLAVAMVLSLAHIQOAQQGNWGDETVPYTMGPEKITKLRFYFHDIVTG | SEQ. ID. NO. 46

NNPTAVQIAQATGTNSSSTLFGALFMIDDPLTEGPDPDSRLVGRAQGFYGSAGQN EAALILGMSLVFTGNEKFNGSTISVLSRNPVTHTEREFAIVGGTGYFQFARGFISAK TYSLVGPNAVVEYNCTIVHPSSVSESGKSNSSPGKSDSNSGSQISLGSNLVFVSVI

AYVTIILSL P. setigerum MVLSMSHSQAQEGNWGDESVPYTMGPEKMTKLRFYFHDIITGNSPTAVQIAQATG | SEQ. ID. NO. 47 TNTSATMFGALMMIDDPLTEGPDPNSRLVGRAQGFYGSAGQNELALILGMSLVFT = GNEKFNGSTISVLSRNPVMHTEREFAIVGGTGYFQFARGFISAKTYSLVGPNAVVE Ss

YNCTIVHPSSVSESGKSDSSSGKSDSSSGSQISLGTNLVFLSVIAFVTIIVSPQHFSW S Chalcona o isomerase P. somniferum MTKTVLVDDIPFPQNITTVTTEKQLPLLGQGITDMEIHFLOQIKFTAIGTAIGVYLEPEI | SEQ. ID. NO. 48

ASHLQOQWKGKTGAELSQDDEFFAAVVSASVEKYVRVVVIKEIKGSQYMLQLESW VRDELAAADKYEDEEEESLDKVIEFFOSKYLKQLSFIPSHFSATTPAVAEIGLEIEG

QKDLKIKVENGNVIEMIQKWYLGGTRGVSPSTTOSLATSL P. somniferum MPFLKAIEIEGCKFRPFVTPPGSTQILFLAGSGVKEEFGDSKSMKYSSCAIYLQPTC | SEQ. ID. NO. 49

ILYLAKAWAQKSVVDITAOSLNFFMDIATGPFEKYCRITMLETAKGEDYAAMITKNCE EMLTNSKRYSETAKAALTKFSEAFNGRTLASGSSIHVTVSTSNSVTLAFTEDGSTP

KQGDVTLDCKEVGEAFLMSTISLHTTIRESMGSRISGLYK [ eseigerm — | vAPWAQLSEIVEGFVFPPTMTPPSSTESLFLGGAGVRGLOIADRFIKFTAIGVYL | SEG. 1D. NO. 50

Nome da | Descrição Sequência SEOQ. ID NO. sequência

AEEAIPSLSPKWKSKSPEELTDDVEFFMDIVTGPFEKFVKITMILPLTGDQYAEKVT o ANCOISOWIDAENGVERTIEROEMERASSLETPABBLVE P. rhoeas MVYLEPEIATHLKQOWKGKTGAELSQDDDFFSAVVSAPVEKYVRVVVIKEIKGSQY | SEQ. ID. NO. 51

MLQLESWVRDELAAADKYEDEEEESLDKVIEFFOSKYLKQHSVIITFHFSATTPAV

AEIGLEIEGQKDLKIKVENGNVVEMIQKWYLGGTRGVSPSTTOQSLATSL P. bracteatum MTKMVLVDDIPFPQNITTATTAKQLPLLGQGITDMEIHFLQIKFTAIGVYLEPEIASHL | SEQ. ID. NO. 52

KQWKGKTGAELSQDDEFFSAIVSAPVEKYVRVVVIKEIKGSQYMLQLESWVRDEL AAADKYEDEEEESLEKVIEFFOSKYLKQHSVIPFHFSATTPAVAEIGLEIEGHKDLK

MKVENGNVVEMIQKWYLAGTRGVSPSTTQSLATSL P. bracteatum MAPMAQLSEIQVEQFVFPPTMTPPSSTESLFLGGAGVRGLOQIQDRFIKFTAIGVYL | SEQ. ID. NO. 53 = AEEAIPSLSPKWKSKTPEELTNDVEFFMDIVTGPFEKFVKITMILPLTGDQYAEKVT 8

ENCVEYLKSKDLYTDAEAKAVERFIEIFKNEMFPPASSILFTISPTGSLTVGFSKDTS S IPEARNAVIENKALSESILESIIGKNGVSPAAKQSLAERISELLK o ps TIO o P. ginseng MGLTGKLICOTGIKSDGDVFHELFGTRPHHVPNITPANIQOGCDLHEGEFGKVGSVV | SEQ. ID. NO. 54

IWNYSIDGNAMIAKEEIVAIDEEDKSVTFKVVEGHLFEEFKSIVFSVHVDTKGEDNL

VTWSIDYEKLNESVKDPTSYLDFLLSVTRDIEAHHLPK A. hypogaea MGVFTFEDEITSTVPPAKLYNAMKDADSITPKIIDDVKSVEIVEGNGGPGTIKKLTIV | SEQ. ID. NO. 55

EDGETKFILHKVESIDEANYAYNYSVVGGVALPPTAEKITFETKLVEGPNGGSIGKL

TLKYHTKGDAKPDEEELKKGKAKGEGLFRAIEGYVLANPTQY H. perforatum MGIDPFTMAAYTIVKEEESPIAPHRLFKALVLERHQVLVKAQPHVFKSGEIIEGDGG | SEQ. ID. NO. 56

VGTVTKITFVDGHPLTYMLHKFDEIDAANFYCKYTLFEGDVLRDNIEKVVYEVKLEA VGGGSKGKITVTYHPKPGCTVNEEEVKIGEKKAYEFYKQVEEYLAANPEVFA

Nome da | Descrição Sequência SEOQ. ID NO. sequência L. luteus MGVFTFQDEYTSTIAPAKLYKALVTDADIIIPKAVETIQSVEIVEGNGGPGTIKKLTFI | SEQ. ID. NO. 57

EGGESKYVLHKIEAIDEANLGYNYSIVGGVGLPDTIEKISFETKLVEGANGGSIGKV

TIKETKGDAQPNEEEGKAAKARGDAFFKAIESYLSAHPDYN Morango (Fragaria x | MAGVFTYETEFTSVIPPPRLFKAFILDADNLIPKIAPQAVKCAEI!IEGDGGVGTIKKIT | SEQ. ID. NO. 58 ananassa) FGEGSQFGSVTHKIDGIDKENFVYSYSLIEGDALSDKIEKISYETKLVSSSDGGSIIK

STSNYHTKGDVEIKEEHVKAGKEKFSHLFKLVEGYLLANPNEYC A. deliciosa MDLSGKMVKQVEILSDGIVFYEIFRYRLYLISEMSPVNIQGVDLLEGNWGTVGSVIF | SEQ. ID. NO. 59

FKYTIDGKEKTAKDIVEAIDEETKSVTFKIVEGDLMELYKTFIIIVQOVDTKGEHNSVT

WTFHYEKLKEDVEEPNTLMNFCIEITKDIETYHLK T. flavum MGIINQVSTVTKVIHHELEVAASADDIWTVYSWPGLAKHLPDLLPGAFEKLEIIGDG | SEQ. ID. NO. 60 S GVGTILDMTFVPGEFPHEYKEKFILVDNEHRLKKVQMIEGGYLDLGVTYYMDTIHV 2 VPTGKDSCVIKSSTEYHVKPEFVKIVEPLITTGPLAAMADAISKLVLEHKS & V. radiata MVKEFNTOQTELSVRLEALWAVLSKDFITVVPKVLPHIVKDVQLIEGDGGVGTILIFNF | SEQ. ID. NO. 61 ?

LPEVSPSYQREEITEFDESSHEIGLQVIEGGYLSQGLSYYKTTFKLSEIEEDKTLVN VKISYDHDSDIEEKVTPTKTSQSTLMYLRRLERYLSNGSA

Modificações de Geração de bisBIA

[00185] Alguns métodos, processos e sistemas providos aqui des- crevem a produção aumentada de alcaloides bisbenzilisoquinolina (bisBIAs) através da utilização de duas enzimas epimerase separadas derivadas de uma enzima epimerase parental quando comparado com a produção de bisBIAs através da utilização de uma enzima fundida correspondente. Em exemplos, uma enzima fundida correspondente compreende uma epimerase fundida tendo regiões oxidase e redutase correspondentes para as duas enzimas epimerases separadas. Em exemplos, as duas enzimas epimerase separadas podem compreen- der uma oxidase e uma redutase. bisBIAs são moléculas diméricas que podem ser formadas através de reações de acoplamento entre dois monômeros de BIA. Em exemplos, bisBIAs podem ser formadas através de reações de acoplamento carbono-oxigênio. Em outros exemplos, bisBIAs podem ser formadas por reações de acoplamento carbono-carbono. Em alguns exemplos, a molécula dimérica bisBIA é um homodímero, compreendendo dois monômeros de BIA idênticos. Em exemplos, uma célula hospedeira engenheirada pode produzir um monômero de BIA. Nesses exemplos, os monômeros de BIA podem formar homodímeros quando contatados com uma ou mais enzimas de acoplamento. Em outros exemplos, a molécula dimérica de bisbilha é um heterodímero compreendendo dois monômeros de BIA diferen- tes. Por exemplo, uma bisBIA pode ser um heterodímero que compre- ende monômeros de BIA que são enantiômeros um do outro. Nesses exemplos, os monômeros de BIA podem formar homodímeros e hete- rodímeros quando contatados com uma ou mais enzimas de acopla- mento.

[00186] Alguns desses métodos, processos e sistemas que descre- vem a produção de bisBIAs podem compreender uma célula hospedei- ra engenheirada. Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei-

rada pode ser engenheirada para produzir monômeros de BIA que, por sua vez, podem ser usados como moléculas de bloco de formação pa- ra formação de bisBIAs. Exemplos de monômeros de BIA que podem ser usados para formar bisBIA incluem coclaurina, N-metilcoclaurina, laudanina, norcoclaurina, norlaudanosolina, 6-O-metil-norlaudanoso- lina, 3'-hidróxi-N-metilcoclaurina, 3'-hidroxicoclaurina, reticulina, norre- ticulina, norlaudanina, laudanosina e papaverina. Em particular, células hospedeiras engenheiradas podem sintetizar monômeros de BIA a partir de norcoclaurina ou norlaudanosolina através da expressão de enzimas heterólogas incluindo O-metiltransferases, N-metiltransfera- ses e 3--hidroxilases. Examplos de O-metiltransferases podem incluir norcoclaurina 6-O-metiltransferase (SOMT). Exemplos adicionais de O- metiltransferases podem incluir catecol O-metiltransferase (COMT). Exemplos adicionais de N-metiltransferases podem incluir coclaurina N-metiltransferase (CNMT). Exemplos de 3'-hidroxilases podem incluir N-metilcoclaurina 3'-hidroxilase (CYP80B1).

[00187] As células hospedeiras engenheiradas podem produzir enantiômeros ou (S) ou (R) de qualquer dado monômero de BIA. Adi- cionalmente ou alternativamente, as células hospedeiras engenheira- das podem produzir uma mistura de ambos os enantiômeros. A razão de enantiômeros (S) e (R) pode ser determinada através das especifi- cidades de substrato e produto da uma ou mais enzimas que sinteti- zam os monômeros de BIA. Alternativamente, a quantidade de cada enantiômero presente pode ser modificada pela expressão e envolvi- mento de duas enzimas oxidase e redutase separadas da epimerase engenheirada que realiza a epimerização de um estereoisômero em outro. Em alguns casos, a quantidade de cada enantiômero presente pode ser modificada pela expressão e envolvimento da epimerase fundida engenheirada que realiza a epimerização de um estereoisôme- ro em outro.

[00188] Esses monômeros de BIA podem ser fundidos em uma ba- se de bisBIA dimérica. Em particular, os monômeros de BIA podem ser fundidos em uma base de bisBIA dimérica utilizando uma ou mais en- zimas que são produzidas pela célula hospedeira engenheirada. Adici- onalmente ou alternativamente, os monômeros de BIA podem ser fun- didos em uma base de bisBIA dimérica utilizando uma ou mais enzi- mas que são providas aos monômeros de BIA através de uma fonte que é externa à célula hospedeira engenheirada. A uma ou mais en- zimas podem ser usadas para formar reações de acoplamento de car- bono-oxigênio e carbono/carbono para fundir dois monômeros de BIA em uma, duas ou três posições. Em alguns exemplos, dois monôme- ros de BIA podem ser ligados por uma ponte de éter. Em alguns exemplos, uma ligação carbono-carbono direta pode ser usada para conectar os dois monômeros de BIA. Em alguns exemplos, uma bis- BIA que é formada fundindo dois monômeros de BIA, pode compreen- der uma ligação difenil éter. Em alguns exemplos, dois monômeros de BIA podem ser fundidos para formar uma bisBIA que compreende du- as ligações difenil éter. Em alguns exemplos, uma bisBIA que é forma- da a partir de dois monômeros de BIA pode compreender três ligações difenil éter. Em alguns exemplos, a bisBIA pode compreender uma |i- gação difenil éter e uma ligação benzil fenil éter. Em alguns casos, a bisBIA pode compreender uma ligação benzil fenil éter e duas ligações difenil éter.

[00189] Em exemplos, os monômeros de BIA podem ser contatados com uma quantidade suficiente da uma ou mais enzimas que podem ser usadas para formar reações de acoplamento para fundir dois mo- nômeros de BIA de modo que pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pe- lo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos

75%, pelo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo me- nos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pe- lo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100% dos ditos monômeros de BIA são convertidos em bisBIAs. A uma ou mais enzimas que po- dem ser usadas para dimerizar os monômeros de BIA em bisBIAs po- dem contatar os monômeros de BIA in vitro. Adicionalmente, ou alter- nativamente, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para di- merizar os monômeros de BIA em bisBIAs podem contatar os monô- meros de BIA in vivo. Adicionalmente, a uma ou mais enzimas de di- merização de bisBIA pode ser expressa em uma célula hospedeira que produz monômeros de BIA. Alternativamente, os monômeros de BIA podem ser providos à célula hospedeira engenheirada que ex- pressa em enzima de dimerização de bisBIA. Alternativamente, a uma ou mais enzimas de dimerização de bisBIA podem ser providas a uma célula tendo monômeros de BIA dentro.

[00190] Em alguns exemplos, o alcaloide bisbenzilisoquinolina é um composto de qualquer uma das Fórmulas Va-Vu: Rã Ro Rã Rã OR*º RO. OR? RO. RN C ORº Ro O NR? R2N Cc OR R&%O O NR? Ré Ro Ra Ro Rep Re Co O Am Rº Rº R& R&b Fórmula Va , Fórmula Vb , Rã Ro Rã R& OR RO. OR R7%O. - KL Xe O O R ' oR* o No R " oRº R* Rê R Re Re O O Cx ADO ORTº R7%O ORTº REQ R& Red Rã o. Rº Fórmula Vc , Fórmula Vd ,

Rã Rad Rº Rº? Ma Ra

OR RO O OR RO Õ R2º*N NR? R?-N O O NR? 'ORSº o o. R5ºo RI Ro Ré Ro - Ox SO 8a E . ; 8h Rº córmulaVi ; FórmulaVj Vaave R ; da 3d À OR? o. À o q ( O E SãO R?2ºN NR? 2 E) ORº/ R5%O RN 5a/ Rb NR Ré R*» Ré OR' RO RP O Re O Reb OR o O xX O sa 8d R ó R a sb Fórmula k ; RR Fórmula VI R ; R&e o Rº ua /RAb ORA RO O OR? /R$O. O R22N NR? RN O 5a | geb, O NR?» o Ro Rn OR RºO Rio Ré R» Re Rº Coxa O Com a sa EM Rºº Fórmulavn R* RE R , Fórmula Vn , Rº nº ORA RO. OR o R2N O O NR? RAN O O NR? OR o OR” R*%O Ré Ro Re R xa O Cox O oRT o ORTº o E 8d E E) R Formula Vk R ,; R Formula VI R ,; Rea nº Rã Ro OR*º R%O OR - RN & Orsa o O NR? RN O o O NR? Re RR Ru R» Rea R& - ORTº o $ C OR? RMAQ O 8a E) 8a so R Formula V]m R ,; R Formula Vn R ,

Ra R& Ra Re oR* o. oR* o. e AL al e AL al) Re Ré R* Rºº OSSOS Ce eo DO o. Ro OR? ROO Rº Fórmulavs — Rº ,; nº Fórmula Vt RR ,; Rã nº Rã Rã O AL Õ o Ro. . DO OO e “qe 7 » o ? R OR* RR» R R AS O" xa O o. Ro oR* o Res no R&º R& Fórmula Vu ; Vormuh Vr ; -. Rã OR*º RO. RN O O NR? Ré o o R xa O OR o Rº Formula Vs Rº ,; Ra Ro Rã Re o o. OR o 2a OC É RD RN ( ;a, O R2ºN o) N-R' Roo 'OR Re Roe cH. Ro Rº 2 6b Re o. 2 ' CMÁRO" Q O oiro OR Oo CH, Ro Re Fórmulavo — RO e “ Fórmula Vp ;

[00191] ouum saldo mesmo, em que: Ra, R1b, R2º e R?? são independentemente selecionados de hidrogênio e C1-Ca alquila; R$, Ro, R&, R6º, R&º e Rº são independentemente selecio- nados de Fórmuava hidróxi, flúor, cloro, E Fórmuiavr — oxaldeído, C1-Ca acila, C1-Ca alquila e C1-Ca alcóxi; R%*º e R%ºº são independentemente selecionados de hidrogênio e C1-Ca alquila ou R*º e Rº juntos formam uma ponte metileno; Rº*º e Rºº são independentemente selecionados de hidrogênio e C1-Ca alquila ou R*? e Rºº juntos formam uma ponte metileno; e

R'º, R'º e Rºº são independentemente selecionados de hidrogênio e C1-Ca alquila.

[00192] Em alguns exemplos, R'º e R'"” são cada um hidrogênio; R?º e R?? são, cada um, metila; Rºº e Rºº são cada um hidrogênio; R*º e R% são independentemente hidrogênio ou metila; Rº*º e Rºº são in- dependentemente hidrogênio ou metila ou Rº*º* e Rºº juntos formam uma ponte metileno; R6º, Rº, R&º e Rº? são cada um hidrogênio; e R”º, R?” e Rºº são independentemente hidrogênio ou metila.

[00193] Como ilustrado acima, os compostos bisBIA de Fórmulas Va, Vb e Vd são formados fundindo dois monômeros de BIA usando uma reação de acoplamento carbono-oxigênio. Adicionalmente, os compostos de bisBIA de Fórmulas Vc, Vf e Vh são formados fundindo dois monômeros de BIA usando ambas a reação de acoplamento de carbono-oxigênio e uma reação de acoplamento carbono-carbono. Ainda, os compostos de bisBIA de Fórmulas Ve, Vg, Vi, Vj, Vk, VI, Vm, Vo, Vp e Vq são formados fundindo dois monômeros de BIA usando duas reações de acoplamento carbono-oxigênio. O composto de bis- BIA de Fórmula Vn é formado fundindo dois monômeros de BIA usan- do duas reações de acoplamento de carbono-oxigênio e uma reação de acoplamento carbono-carbono. Adicionalmente, o composto bisBIA de Fórmula Vr é formado fundindo dois monômeros de BIA usando três reações de acoplamento carbono-oxigênio.

[00194] Auma ou mais enzimas que podem ser usadas para formar as reações de acoplamento podem incluir citocromo P450s conhecidas tal como Berberis stolonifera CYP80A1 ou enzimas citocroma P450 similares de outras plantas que sintetizam esses compostos natural- mente. Alternativamente, a reação de acoplamento pode ser realizada por uma enzima que não é um citocromo P450. A uma ou mais enzi- mas que podem ser usadas para formar as reações de acoplamento podem ser engenheiradas para aceitar substratos não nativos. Conse-

quentemente, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para formar as reações de acoplamento podem ser usadas para gerar mo- léculas de bisBIA não naturais. Em exemplos, a uma ou mais enzimas podem fundir um monômero de BIA natural com um monômero de BIA não natural para produzir uma molécula de bisBIA não natural. Em ou- tros exemplos, a uma ou mais enzimas podem fundir dois monômeros de BIA não naturais para produzir uma molécula de bisBIA não natural. Estratégias de engenharia de enzima podem ser usadas para identifi- car uma ou mais enzimas que podem ser usadas para formar as rea- ções de acoplamento que fundem monômeros de BIA para produzir bisBIAs. Em exemplos, estratégias de engenharia de enzima podem incluir mutagênese direcionada a sítio, mutagênese aleatória e avalia- ção, embaralhamento de DNA e avaliação.

[00195] Uma vez bisBIAs sendo formadas, as bisBIAs podem ser derivatizadas ou modificadas mais. Os bisBIAs podem ser derivatiza- dos ou modificados utilizando uma ou mais enzimas que são produzi- das pela célula hospedeira engenheirada. Em particular, as bisBIAs podem ser derivatizadas ou modificadas contatando as bisBIAs com uma ou mais enzimas que são produzidas pela célula hospedeira en- genheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a bisBIAs pode ser derivatizada ou modificada contatando a bisBIAs com uma ou mais enzimas que são providas à bisBIAs a partir de uma fonte que é exter- na à célula hospedeira engenheirada. A uma ou mais enzimas que po- dem ser usadas para derivatizar ou modificar a bisBIAs podem ser usadas para realizar reações de ajuste. Exemplos de reações de ajus- te incluem oxidação, redução, O-metilação, N-metilação, O-desme- tilação, acetilação, formação de ponte metilenodióxi e O, O-desmetila- ção. Uma bisBIA pode ser derivatizada ou modificada usando uma ou mais reações de ajuste.

[00196] Exemplos de reações de ajuste são providos na Tabela 9.

Em alguns exemplos, enzimas de ajuste podem ser usadas para cata- lisar reações de acoplamento carbono-carbono realizadas em uma bisBIA ou um derivado da mesma. Exemplos de enzimas de ajuste que podem ser usadas para catalisar reações de acoplamento carbo- no-carbono incluem uma enzima de formação de ponte Berberine (BBE) de Papaver somniferum, Eschscholzia californica, Coptis japoni- ca, Berberis stolonifer, Thalictrum flavum ou uma outra espécie; Salu- taridine sintase (SalSyn) de Papaver somniferum ou uma outra espé- cie; e Corytuberine synthase (CorSyn) de Coptis japonica ou outra es- pécie. Exemplos não limitantes de reações que podem ser catalisadas por enzimas de ajuste são mostrados no Esquema 3, em que Rº, Rº, Rº e R$ são independentemente selecionados de hidrogênio, hidróxi, flúor, cloro, bromo, carboxaldeído, C1-Ca acila, C1-Ca alquila e C1-Ca alcóxi. Em alguns exemplos, Rº, Rº e os átomos de carbono aos quais eles estão ligados formam opcionalmente um carbociclo ou heteroci- clo. Em alguns exemplos, Rº, Rº e os átomos de carbono aos quais eles estão ligados formam opcionalmente um carbociclo ou heteroci- clo. Esquema 3 Ra Ra RP (O NMe BBE Rº (O N —. O Rº Õ Rº Rº Rº CorSyn | SalSyn Ra Rº R» < NMe Ré o e O Se Rº Rº o

[00197] Em alguns exemplos, enzimas de ajuste podem ser usadas para catalisar reações de oxidação realizadas em uma bisBIA ou um derivado da mesma. Exemplos de enzimas de ajuste que podem ser usadas para catalisar reações de oxidação incluem uma Tetra-hidro- protoberberina oxidase (STOX) de Coptis japonica, Argemone mexica- na, Berberis wilsonae ou uma outra espécie; Di-hdrobenzofenantridina oxidase (DBOX) de Papaver somniferum ou uma outra espécie; Meti- lestilopina hidroxilase (MSH) de Papaver somniferum ou uma outra espécie; e Protopina 6-hidroxilase (P6GH) de Papaver somniferum, Es- chscholzia californica ou uma outra espécie.

[00198] Enzimas de ajuste podem ser também usadas para catali- sar reações de formação de ponte metilenodióxi realizadas em uma bisBIA ou um derivado da mesma. Exemplos de enzimas de ajuste que podem ser usadas para catalisar reações de formação de ponte metilenodióxi incluem uma Estilopina sintase (StySyn) de Papaver somniferum, Eschscholzia californica, Argemone mexicana ou uma outra espécie; Queilantifolina sintase (CheSyn) de Papaver somnife- rum, Eschscholzia californica, Argemone mexicana ou uma outra es- pécie; e Canadina sintase (CAS) de Thalictrum flavum, Coptis chinen- sis ou uma outra espécie.

[00199] Em outros exemplos, enzimas de ajuste podem ser usadas para catalisar reações de O-metilação realizadas em uma bisBIA ou um derivado da mesma. Exemplos de enzimas de ajuste que podem ser usadas para catalisar reações de O-metilação incluem uma Norco- claurina 6-O-metiltransferase (SOMT) de Papaver somniferum, Thalic- trum flavum, Coptis japonica, Papaver bracteatum ou uma outra espé- cie; 3'hidróxi-N-metilcoclaurina 4'-O-metiltransferase (4' OMT) de Pa- paver somniferum, Thalictrum flavum, Coptis japonica, Coptis chinen- sis ou uma outra espécie; Reticulina 7-O-metiltransferase (7TOMT) de Papaver somniferum, Eschscholzia californica ou uma outra espécie; e Escoulerina 9-O-metiltransferase (9OMT) de Papaver somniferum,

Thalictrum flavum, Coptis japonica, Coptis chinensis ou uma outra es- pécie.

[00200] Ainda, enzimas de ajuste podem ser usadas para catalisar reações de N-metilação realizadas em uma bisBIA ou um derivado da mesma. Exemplos de enzimas de ajuste que podem ser usadas para catalisar reações de N-metilação incluem Coclaurine N-metiltrans- ferase (CNMT) de Papaver somniferum, Thalictrum flavum, Coptis ja- pônica ou uma outra espécie; Tetra-hidroprotoberberina N-metiltrans- ferase (TNMT) de Papaver somniferum, Eschscholzia californica, Pa- paver bracteatum ou uma outra espécie.

[00201] Ainda, enzimas de ajuste podem ser usadas para catalisar reações de O-desmetilação realizadas em uma bisBIA ou um derivado da mesma. Exemplos de enzimas de ajuste que podem ser usadas para catalisar reações de O-desmetilação incluem Tebaína desmetila- se (T6ODM) de Papaver somniferum ou uma outra espécie; e Codeína desmetilase (CODM) de Papaver somniferum ou uma outra espécie.

[00202] Enzimas de ajuste podem ser também usadas para catali- sar reações de redução realizadas em uma bisBIA ou um derivado da mesma. Exemplos de enzimas de ajuste que podem ser usados para catalisar reações de redução incluem Salutaridina redutase (SalR) de Papaver somniferum, Papaver bracteatum ou uma outra espécie; Co- deinona redutase (COR) de Papaver somniferum ou uma outra espé- cie; e Sanguinarina redutase (SanR) de Eschscholzia californica ou uma outra espécie. Em outros exemplos, enzimas de ajuste podem ser usadas para catalisar reações de acetilação realizadas em uma bisBIA ou um derivado da mesma. Um exemplo de enzima de ajuste que pode ser usado para catalisar reações de acetilação inclui Salutaridina aceti- Itransferase (SalAT) de Papaver somniferum ou uma outra espécie. Modificações de O-Desmetilação

[00203] Alguns métodos, processos e sistemas providos aqui des-

crevem a conversão de um primeiro alcaloide benzilisoquinolina em um segundo alcaloide benzilisoquinolina através da remoção de um grupo metila O-ligado. Alguns desses métodos, processos e sistemas podem compreender uma célula hospedeira engenheirada. Em alguns exemplos, a conversão de um primeiro alcaloide benzilisoquinolina em um segundo alcaloide benzilisoquinolina é uma etapa-chave na con- versão de um substrato em um nor-opioide ou nal-opioide. Em alguns exemplos, a conversão de um primeiro alcaloide em um segundo alca- loide compreende uma reação de desmetilase.

[00204] AFIG.6ilustra uma enzima tendo atividade de opioide 3-O- desmetilase (ODM), de acordo com modalidades da invenção. Especi- ficamente, a enzima pode agir sobre qualquer estrutura de alcaloide morfinano para remover o grupo metila do oxigênio ligado a carbono 3.

[00205] “Exemplos de sequências de aminoácido de enzimas ODM são mostrados na Tabela 4. Uma sequência de aminoácido para uma ODM que é utilizada na conversão de um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide pode ser 75% ou mais idêntica a uma dada se- quência de aminoácido como listado na Tabela 4. Por exemplo, uma sequência de aminoácido para tal epimerase pode compreender uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75% ou mais, 80% ou mais, 81% ou mais, 82% ou mais, 83% ou mais, 84% ou mais, 85% ou mais, 86% ou mais, 87% ou mais, 88% ou mais, 89% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idên- tica a uma sequência de aminoácido como provido aqui. Adicionalmen- te, em certas modalidades, uma sequência de aminoácido "idêntica" contém pelo menos 80%-99% de identidade no nível de aminoácido com a sequência de aminoácido específica. Em alguns casos, uma sequência de aminoácido "idêntica" contém pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e mais em certos casos, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade, no ní- vel de aminoácido. Em alguns casos, a sequência de aminoácido pode ser idêntica, mas a sequência de DNA é alterada tal como para otimi- zar uso de códon para o organismo hospedeiro, por exemplo.

[00206] Uma célula hospedeira engenheirada pode ser provida, a qual produz uma ODM que converte um primeiro alcaloide em um se- gundo alcaloide, em que a ODM compreende uma dada sequência de aminoácido como listado na Tabela 4. Uma célula hospedeira enge- nheirada pode ser provida, a qual produz uma ou mais enzimas ODM. A ODM que é produzida dentro da célula hospedeira engenheirada pode ser recuperada e purificada de modo a formar um biocatalisador. O processo pode incluir contato do primeiro alcaloide com uma ODM em uma quantidade suficiente para converter o dito primeiro alcaloide em um segundo alcaloide. Em exemplos, o primeiro alcaloide pode ser contatado com uma quantidade suficiente da uma ou mais enzimas de modo que pelo menos 5% do dito primeiro alcaloide são convertidos em um segundo alcaloide. Em exemplos adicionais, o primeiro alcaloi- de pode ser contatado com uma quantidade suficiente da uma ou mais enzimas de modo que pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo me- nos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100% do dito primeiro alcaloide são convertidos em um segundo alcaloide.

[00207] A uma ou mais enzimas que podem ser usadas para con- verter um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide podem contatar o primeiro alcaloide in vitro. Adicionalmente, ou alternativamente, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para converter um pri- meiro alcaloide em um segundo alcaloide podem contatar o primeiro alcaloide in vivo. Em alguns exemplos, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para converter um primeiro alcaloide em um se- gundo alcaloide podem ser providas a uma célula tendo o primeiro al- caloide dentro. Em alguns exemplos, a uma ou mais enzimas que po- dem ser usadas para converter um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide podem ser produzidas dentro de uma célula hospedeira en- genheirada.

[00208] Em alguns exemplos, o alcaloide substrato é um opioide selecionado do grupo consistindo em codeína, oxicodona, tebaína, hi- drocodona, di-hidrocodeína, 14-hidroxicodeína, codeinona e 14-hidro- xicodeinona. Modificações de N-Desmetilação

[00209] — Alguns métodos, processos e sistemas providos aqui des- crevem a conversão de um primeiro alcaloide em um segundo alcaloi- de através da remoção de um grupo metila N-ligado. Alguns desses métodos, processos e sistemas podem compreender uma célula hos- pedeira engenheirada. Em alguns exemplos, a conversão de um pri- meiro alcaloide em um segundo alcaloide é uma etapa-chave na con- versão de um substrato em um nor-opioide ou nal-opioide. Em alguns exemplos, a conversão de um primeiro alcaloide em um segundo alca- loide compreende uma reação desmetilase.

[00210] A Fig.7 ilustra uma enzima tendo atividade N-desmetilase opioide, de acordo com modalidades da invenção. Especificamente, a enzima pode agir sobre qualquer estrutura alcaloide morfinano para remover o grupo metila do nitrogênio.

[00211] Exemplos de uma sequência de aminoácido de uma enzi- ma N-desmetilase (NDM) que pode ser usada para realizar a conver-

são de um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide são providos na Tabela 5. Uma sequência de aminoácido para um NDM que é utili- zada em conversão de um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide pode ser 75% ou mais idêntica a uma dada sequência de aminoácido como listado na Tabela 5. Por exemplo, uma sequência de aminoácido para tal epimerase pode compreender uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75% ou mais, 80% ou mais, 81% ou mais, 82% ou mais, 83% ou mais, 84% ou mais, 85% ou mais, 86% ou mais, 87% ou mais, 88% ou mais, 89% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idêntica a uma sequência de ami- noácido como provido aqui. Adicionalmente, em certas modalidades, uma sequência de aminoácido "idêntica" contém pelo menos 80%-99% de identidade no nível de aminoácido com a sequência de aminoácido específica. Em alguns casos, uma sequência de aminoácido "idêntica" contém pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e mais em certos casos, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade, no nível de aminoácido. Em alguns casos, a sequência de aminoácido pode ser idêntica, mas a sequência de DNA é alterada de modo a otimizar uso de códon para o organismo hospe- deiro, por exemplo.

[00212] Uma célula hospedeira engenheirada pode ser provida, a qual produz uma NDM que converte um primeiro alcaloide em um se- gundo alcaloide, em que a NDM compreende uma sequência de ami- noácido como listado na Tabela 5. Uma célula hospedeira engenheira- da pode ser provida, a qual produz uma ou mais enzimas NDM. A NDM que é produzida dentro da célula hospedeira engenheirada pode ser recuperada e purificada de modo a formar um biocatalisador. O processo pode incluir contato do primeiro alcaloide com uma NDM em uma quantidade suficiente para converter o dito primeiro alcaloide em um segundo alcaloide. Em exemplos, o primeiro alcaloide pode ser contatado com uma quantidade suficiente da uma ou mais enzimas de modo que pelo menos 5% do dito primeiro alcaloide são convertidos em um segundo alcaloide. Em exemplos adicionais, o primeiro alcaloi- de pode ser contatado com uma quantidade suficiente da uma ou mais enzimas de modo que pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo me- nos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100% do dito primeiro alcaloide são convertidos em um segundo alcaloide.

[00213] A uma ou mais enzimas que podem ser usadas para con- verter um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide podem contatar o primeiro alcaloide in vitro. Adicionalmente, ou alternativamente, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para converter um pri- meiro alcaloide em um segundo alcaloide podem contatar o primeiro alcaloide in vivo. Em alguns exemplos, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para converter um primeiro alcaloide em um se- gundo alcaloide podem ser providas a uma célula tendo o primeiro al- caloide dentro. Em alguns exemplos, a uma ou mais enzimas que po- dem ser usadas para converter um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide podem ser produzidas dentro de uma célula hospedeira en- genheirada.

[00214] Em alguns exemplos, os métodos proveem células hospe- deiras engenheiradas que produzem um produto alcaloide, em que a N-desmetilação de um substrato em um produto pode compreender uma etapa-chave na produção de um produto alcaloide. Em alguns exemplos, o alcaloide produzido é um nor-opioide ou nal-opioide. Em ainda outras modalidades, o alcaloide produzido é derivado de um nor- opioide ou um nal-opioide. Em uma outra modalidade, um primeiro al- caloide é um intermediário em relação ao produto da célula hospedeira engenheirada. Em ainda outras modalidades, o produto alcaloide é selecionado do grupo consistindo em norcodeína, noroxicodona, nor- tebaína, nor-hidrocodona, nordi-hidro-codeína, nor-14-hidróxi-codeína, norcodeinona, nor-14-hidróxi-codeinona, normorfina, noroximorfona, nororipavina, nor-hidromorfona, nor-di-hidro-morfina, nor-14-hidróxi- morfina, normorfina e nor-14-hidróxi-morfinona.

[00215] Em alguns exemplos, o alcaloide substrato é um opioide selecionado do grupo consistindo em codeína, oxicodona, tebaína, hi- drocodona, di-hidrocodeína, 14-hidroxicodeína, codeinona, 14-hidroxi- codeinona, morfina, oximorfona, oripavina, hidromorfona, di-hidromor- fina, 14-hidróxi-morfina, morfinona, e 14-hidróxi-morfinona. Modificações de N-Metiltransferase

[00216] Alguns métodos, processos e sistemas providos aqui des- crevem a conversão de um primeiro alcaloide em um segundo alcaloi- de através da adição de um grupo de cadeia lateral N-ligado. Alguns métodos, processos e sistemas providos aqui descrevem a conversão de um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide através da transfe- rência de um grupo de cadeia lateral a partir de um cossubstrato para o primeiro alcaloide. Alguns desses métodos, processos e sistemas podem compreender uma célula hospedeira engenheirada. Em alguns exemplos, a conversão de um primeiro alcaloide em um segundo alca- loide é uma etapa-chave na conversão de um substrato em um nal- opioide. Em alguns exemplos, a conversão de um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide compreende uma reação de metiltransfera- se.

[00217] A FIG.38 ilustra uma enzima tendo atividade de N-metil- transferase (NMT), de acordo com modalidades da invenção. Especifi- camente, a enzima pode agir sobre qualquer estrutura de alcaloide morfinano para adicionar um grupo metila ou outra porção carbono ao nitrogênio. S-Adenosil metionina (SAM) pode agir como o doador do grupo funcional (metila, alila, ciclopropilmetila, ou outro).

[00218] Exemplos de sequências de aminoácido de enzimas NMT são mostrados na Tabela 6. Uma sequência de aminoácido para uma NMT que é utilizada em conversão de um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide pode ser 75% ou mais idêntica a uma dada se- quência de aminoácido como listado na Tabela 6. Por exemplo, uma sequência de aminoácido para tal epimerase pode compreender uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75% ou mais, 80% ou mais, 81% ou mais, 82% ou mais, 83% ou mais, 84% ou mais, 85% ou mais, 86% ou mais, 87% ou mais, 88% ou mais, 89% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idên- tica a uma sequência de aminoácido como provido aqui. Adicionalmen- te, em certas modalidades, uma sequência de aminoácido "idêntica" contém pelo menos 89%-99% de identidade no nível de aminoácido com a sequência de aminoácido específica. Em alguns casos, uma sequência de aminoácido "idêntica" contém pelo menos 80%-99% de identidade no nível de aminoácido com a sequência de aminoácido específica. Em alguns casos, uma sequência de aminoácido "idêntica" contém pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% e mais em certos casos, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade, no nível de aminoácido. Em alguns casos, a sequência de aminoácido pode ser idêntica, mas a sequência de DNA é alterada de modo a otimizar uso de códon para o organismo hospe- deiro, por exemplo.

[00219] “Uma célula hospedeira engenheirada pode ser provida, a qual produz uma NMT que converte um primeiro alcaloide em um se- gundo alcaloide, em que a NMT compreende uma sequência de ami- noácido como provido na Tabela 6. Uma célula hospedeira engenhei- rada pode ser provida, a qual produz uma ou mais enzimas NMT. A NMT que é produzida dentro da célula hospedeira engenheirada pode ser recuperada e purificada de modo a formar um biocatalisador. O processo pode incluir contato do primeiro alcaloide com uma NMT em uma quantidade suficiente para converter o dito primeiro alcaloide em um segundo alcaloide. Em exemplos, o primeiro alcaloide pode ser contatado com uma quantidade suficiente da uma ou mais enzimas de modo que pelo menos 5% do dito primeiro alcaloide são convertidos em um segundo alcaloide. Em exemplos adicionais, o primeiro alcaloi- de pode ser contatado com uma quantidade suficiente da uma ou mais enzimas de modo que pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo me- nos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,7% ou 100% do dito primeiro alcaloide são convertidos em um segundo alcaloide.

[00220] A uma ou mais enzimas que podem ser usadas para con- verter um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide podem contatar o primeiro alcaloide in vitro. Adicionalmente, ou alternativamente, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para converter um pri- meiro alcaloide em um segundo alcaloide podem contatar o primeiro alcaloide in vivo. Em alguns exemplos, a uma ou mais enzimas que podem ser usadas para converter um primeiro alcaloide em um se- gundo alcaloide podem ser providas a uma célula tendo o primeiro al- caloide dentro. Em alguns exemplos, a uma ou mais enzimas que po- dem ser usadas para converter um primeiro alcaloide em um segundo alcaloide podem ser produzidas dentro de uma célula hospedeira en- genheirada.

[00221] Em alguns exemplos, os métodos proveem células hospe- deiras engenheiradas que produzem um produto alcaloide, em que a N-metiltransferase de um substrato em um produto pode compreender uma etapa-chave na produção de um produto alcaloide. Em alguns exemplos, o alcaloide produzido é um nal-opioide. Em ainda outras modalidades, o alcaloide produzido é derivado de um nor-opioide ou um nal-opioide. Em uma outra modalidade, um primeiro alcaloide é um intermediário em relação ao produto da célula hospedeira engenheira- da. Em ainda outras modalidades, o produto alcaloide é selecionado do grupo incluindo naloxona, naltrexona e nalmefeno.

[00222] Em alguns exemplos, o alcaloide substrato é um opioide selecionado do grupo consistindo em norcodeína, noroxicodona, nor- tebaína, nor-hidrocodona, nor-di-hidro-codeína, nor-14-hidróxi-codeína, norcodeinone, nor-14-hidróxi-codeinone, normorfina, noroximorfona, no- roripavina, nor-hidro-morfona, nor-di-hidro-morfina, nor-14-hidróxi-mor- fina, normorfina e nor-14-hidróxi-morfinona. Em alguns exemplos, o cossubstrato é S-adenosilmetionina, alil-S-adenosilmetionina ou ciclo- propilmetil-S-adenosilmetionina. Sequências de Codificação Heterólogas

[00223] Em alguns casos, as células hospedeiras engenheiradas carregam uma ou mais sequências de codificação heterólogas (tais como duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais) que codificam atividade(s) que permite(m) que as células hospedeiras en- genheiradas produzam enzimas desejadas de interesse e/ou BIAs de interesse, por exemplo, como descrito aqui. Como usado aqui, o termo "sequência de codificação heteróloga" é usado para indicar qualquer polinucleotídeo que codifique, ou fundamentalmente codifique, um peptídeo ou proteína ou sua sequência de aminoácido equivalente, por exemplo, uma enzima, que não está normalmente presente no orga- nismo hospedeiro e que pode ser expressa na célula hospedeira sob condições apropriadas. Sendo assim, "sequências de codificação hete- rólogas" incluem cópias múltiplas de sequências de codificação que estão normalmente presentes na célula hospedeira, de modo que a célula está expressando cópias adicionais de uma sequência de codi- ficação que estão normalmente presentes nas células. As sequências de codificação heterólogas podem ser RNA ou qualquer tipo do mes- mo, por exemplo, mRNA, DNA ou qualquer tipo dos mesmos, por exemplo, cDNA, ou um híbrido de RNA/DNA. Sequências de codifica- ção de interesse incluem, mas não estão limitadas a, unidades de transcrição de comprimento integral que incluem elementos tais como a sequência de codificação, íntrons, regiões promotoras, 3-UTRs e regiões aumentadoras.

[00224] Em exemplos, as células hospedeiras engenheiradas po- dem compreender uma pluralidade de sequências de codificação hete- rólogas, cada uma codificando uma enzima, tal como uma enzima lis- tada na Tabela 3. Em alguns exemplos, a pluralidade de enzimas codi- ficadas pela pluralidade de sequências de codificação heterólogas po- de ser distinta uma da outra. Em alguns exemplos, algumas da plurali- dade de enzimas codificadas pela pluralidade de sequências de codifi- cação heterólogas podem ser distintas umas das outras e algumas da pluralidade de enzimas codificadas pela pluralidade de sequências de codificação heterólogas podem ser cópias duplicadas.

[00225] Em alguns exemplos, as sequências de codificação heteró- logas podem ser conectadas operavelmente. Sequências de codifica-

ção heterólogas que estão operavelmente conectadas podem estar dentro da mesma via de produção de um produto de alcaloide benzili- soquinolina particular e/ou produto de epimerase. Em alguns exem- plos, as sequências de codificação heterólogas operavelmente conec- tadas podem ser diretamente sequenciais ao longo da via de produção de um produto de alcaloide benzilisoquinolina particular e/ou um pro- duto de epimerase. Em alguns exemplos, as sequências de codifica- ção heterólogas operavelmente conectadas podem ter uma ou mais enzimas nativas entre uma ou mais das enzimas codificadas pela plu- ralidade de sequências de codificação heterólogas. Em alguns exem- plos, as sequências de codificação heterólogas podem ter uma ou mais enzimas não nativas entre uma ou mais das enzimas codificadas pela pluralidade de sequências de codificação heterólogas.

[00226] As células hospedeiras engenheiradas podem ser também modificadas para possuir uma ou mais alterações genéticas para aco- modar as sequências de codificação heterólogas. Alterações do ge- noma hospedeiro nativo incluem, mas não estão limitadas a, modifica- ção do genoma para reduzir ou remover expressão de uma proteína específica que pode interferir com a via desejada. A presença de tais proteínas nativas pode converter rapidamente um dos intermediários ou produtos finais da via em um metabolito ou outro composto que não é útil na via desejada. Portanto, se a atividade da enzima nativa esti- vesse reduzida ou completamente ausente, os intermediários produzi- dos estariam mais prontamente disponíveis para incorporação no pro- duto desejado.

[00227] —Sequências de codificação heterólogas incluem, mas não estão limitadas às, sequências que codificam enzimas, sequências ou do tipo selvagem ou equivalentes, que são normalmente responsáveis pela produção de BIAs de interesse em plantas. Em alguns casos, as enzimas para as quais as sequências heterólogas codificam podem ser qualquer uma das enzimas na via de alcaloide 1-benzilisoquinolina, e podem ser de qualquer fonte conveniente. A escolha e número de enzimas codificadas pelas sequências de codificação heterólogas para a via sintética particular podem ser selecionados com base no produto desejado. Em certas modalidades, as células hospedeiras da invenção podem incluir 1 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais ou até mesmo 15 ou mais sequências de codificação heterólogas, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 sequências de codificação heterólogas.

[00228] “Como aqui usado, o termo "sequências de codificação hete- rólogas" também inclui a porção de codificação do peptídeo ou enzi- ma, isto é, a sequência de cDNA ou mRNA, ou o peptídeo ou enzima, bem como a porção de codificação da unidade transcripcional de com- primento integral, isto é, o gene incluindo íntrons e exons, bem como sequências "com códon otimizado", sequências truncadas ou outras formas de sequências alteradas que codificam a enzima ou codificam sua sequência de aminoácido equivalente, contanto que a sequência de aminoácido equivalente produza uma proteína funcional. Tais se- quências de aminoácido equivalentes podem ter uma deleção de um ou mais aminoácidos, com a deleção sendo N-terminal, C-terminal ou interna. Formas truncadas são previstas contanto que elas tenham a capacidade catalítica indicada aqui. Fusões de duas ou mais enzimas são também previstas para facilitar a transferência de metabolitos na via, contanto que as atividades catalíticas sejam mantidas.

[00229] “Fragmentos, mutantes ou formas truncadas operáveis po- dem ser identificados através da modelagem e/ou avaliação. Em al- guns casos, isso é obtido através da deleção de, por exemplo, regiões N-terminais, C-terminais ou internas da proteína de uma maneira em etapas, seguido pela análise do derivado resultante com relação à sua atividade para a reação desejada comparado com a sequência origi- nal. Se o derivado em questão operar nesta capacidade, ele é consi- derado constituir um derivado equivalente da enzima apropriado.

[00230] Em exemplos, algumas proteínas heterólogas podem mos- trar ocorrências onde elas são incorretamente processadas quando expressas em um hospedeiro recombinante. Por exemplo, proteínas de planta tais como enzimas citocromo P450 expressas em hospedei- ros de produção microbianos podem ter ocorrências de processamen- to incorreto. Em particular, salutaridina sintase pode sofrer glicosilação N-ligada quando expressa heterologamente em levedura. Essa glicosi- lação N-ligada pode não ser observada em plantas, o que pode ser indicativo de classificação N-terminal incorreta do transcrito SalSyn nascente de modo a reduzir a atividade da enzima no hospedeiro mi- crobiano heterólogo. Em tais exemplos, engenharia de proteína direci- onada à correção de classificação N-terminal do transcrito nascente de modo a remover o padrão de glicosilação N-ligado pode resultar em atividade aperfeiçoada da enzima salutaridina sintase no hospedeiro de produção recombinante.

[00231] — Aspectos da invenção também se referem a sequências de codificação heterólogas que codificam sequências de aminoácido que são equivalentes às sequências de aminoácido nativas para as várias enzimas. Uma sequência de aminoácido que é "equivalente" é definida como uma sequência de aminoácido que não é idêntica à sequência de aminoácido específica, mas ao contrário, contém pelo menos algu- mas mudanças de aminoácido (deleções, substituições, inversões, in- serções, etc.) que não afetam essencialmente a atividade biológica da proteína comparado com uma atividade similar da sequência de ami- noácido específica, quando usada para um propósito desejado. A ati- vidade biológica se refere à, no exemplo de uma epimerase, sua ativi- dade catalítica. Sequências equivalentes pretendem também incluir aquelas que foram engenheiradas e/ou desenvolvidas para ter propri- edades diferentes da sequência de aminoácido original. Propriedades mutáveis de interesse incluem atividade catalítica, especificidade de substrato, seletividade, estabilidade, solubilidade, localização, etc.

[00232] Em alguns casos, a expressão de cada tipo de enzima é aumentada através de cópias de gene adicionais (isto é, cópias múlti- plas), o que aumenta acúmulo de intermediário e/ou produção de BIA de interesse. Modalidades da invenção incluem BIA aumentada de produção de interesse em uma célula hospedeira através de expres- são simultânea de variantes de espécie múltiplas de uma enzima única ou múltiplas enzimas. Em alguns casos, cópias de gene adicionais de uma enzima única ou múltiplas enzimas estão incluídas na célula hos- pedeira. Quaisquer métodos convenientes podem ser utilizados, inclu- indo cópias múltiplas de uma sequência de codificação heteróloga pa- ra uma enzima na célula hospedeira.

[00233] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenheirada inclui cópias múltiplas de uma sequência de codificação heteróloga para uma enzima, tal como 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais ou até mesmo 10 ou mais cópias. Em certas modalidades, a célula hospedeira engenheirada inclui cópias múltiplas de sequências de co- dificação heterólogas para uma ou mais enzimas, tais como cópias múltiplas de duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, etc. Em al- guns casos, as cópias múltiplas da sequência de codificação heterólo- ga para uma enzima são derivadas de dois ou mais organismos-fonte diferentes comparado com a célula hospedeira. Por exemplo, a célula hospedeira engenheirada pode incluir cópias múltiplas de uma se- quência de codificação heteróloga, onde cada uma das cópias é deri- vada de um organismo-fonte diferente. Desta maneira, cada cópia po- de incluir algumas variações em sequências explícitas com base em diferenças interespécie da enzima de interesse que é codificada pela sequência de codificação heteróloga.

[00234] Em certas modalidades, a célula hospedeira engenheirada inclui cópias múltiplas de sequências de codificação heterólogas para uma ou mais enzimas, tais como cópias múltiplas de duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, etc. Em alguns casos, as cópias múlti- plas da sequência de codificação heteróloga para uma enzima são de- rivadas de dois ou mais organismos-fonte diferentes comparado com a célula hospedeira. Por exemplo, a célula hospedeira engenheirada po- de incluir cópias múltiplas de uma sequência de codificação heterólo- ga, em que cada uma das cópias é derivada de um organismo-fonte diferente. Sendo assim, cada cópia pode incluir alguma variação em sequências explícitas com base em diferenças interespécie da enzima de interesse que é codificada pela sequência de codificação heterólo- ga.

[00235] O meio de célula hospedeira engenheirada pode ser amos- trado e monitorado quanto à produção de BIAs de interesse. As BIAs de interesse podem ser observadas e medidas usando quaisquer mé- todos convenientes. Métodos de interesse incluem, mas não estão |li- mitados a, Métodos LC-MS (por exemplo, como descrito aqui) em que uma amostra de interesse é analisada através de comparação com uma quantidade conhecida de um composto-padrão. Adicionalmente, há outras maneiras que BIAs de interesse podem ser observadas e/ou medidas. Exemplos de maneiras alternativas de observação e/ou me- dição de BIAs incluem GC-MS, espectroscopia de UV-vis, NMR, LC- NMR, LC-UV, TLC, eletroforese capilar, dentre outras. Identidade pode ser confirmada, por exemplo, através de padrões de fragmentação m/z e MS/MS, transições MRM e quantitação ou medição do composto po- de ser obtida através de picos de traço de LC de tempo de retenção conhecido e/ou análise de pico de EIC MS através de referência à análise LC-MS correspondente de uma quantidade conhecida de um padrão do composto. Em alguns casos, identidade pode ser confirma- da através de monitoramento de reação múltiplo usando espectrome- tria de massa.

[00236] Adicionalmente, uma cultura da célula hospedeira enge- nheirada pode ser amostrada e monitorada quanto à produção de en- zimas de interesse, tal como uma enzima DRS-DRR. As enzimas de interesse podem ser observadas e medidas usando quaisquer méto- dos convenientes. Métodos de interesse incluem ensaios de atividade de enzima, eletroforese em gel de poliacrilamida, espectroscopia de monóxido de carbono e análise Western blot.

MÉTODOS Métodos para cultura de Células Hospedeiras para produção de BIA

[00237] “Como sumarizado acima, alguns aspectos da invenção in- cluem métodos de preparação de alcaloides benzilisoquinolina (BIAs) de interesse. Adicionalmente, alguns aspectos da invenção incluem métodos de preparação de enzimas de interesse. Sendo assim, alguns aspectos da invenção incluem cultura de uma célula hospedeira enge- nheirada sob condições em que a uma ou mais modificações de célula hospedeira (por exemplo, como descrito aqui) são funcionalmente ex- pressas de modo que a célula converte compostos de partida de inte- resse em enzimas de produto e/ou BIAs de interesse. São também providos métodos que incluem cultura de uma célula hospedeira en- genheirada sob condições adequadas para produção de proteína de modo que uma ou mais sequências de codificação heterólogas são funcionalmente expressas e convertem compostos de partida de inte- resse em enzimas de produto ou BIAs de interesse. Em exemplos, o método é um método de preparação de um alcaloide benzilisoquinoli- na (BIA) que inclui cultura de uma célula hospedeira engenheirada (por exemplo, como descrito aqui); adição de um composto de partida à cultura celular; e recuperação da BIA a partir da cultura celular. Em alguns exemplos, o método é um método de preparação de uma en- zima que inclui cultura de uma célula hospedeira engenheirada (por exemplo, como descrito aqui); adição de um composto de partida à cultura celular; e recuperação da enzima a partir da cultura celular.

[00238] “Meios de fermentação podem conter substratos de carbono adequados. A fonte de carbono adequada para realizar os métodos da presente descrição pode compreender uma ampla variedade de subs- tratos contendo carbono. Substratos adequados podem incluir, sem limitação, monossacarídeos (por exemplo, glicose, frutose, galactose, xilose), oligossacarídeos (por exemplo, lactose, sacarose, rafinose), polissacarídeos (por exemplo, amido, celulose) ou uma combinação dos mesmos. Em alguns casos, misturas não purificadas de matérias- primas renováveis podem ser usadas (por exemplo, licor de milho, me- laço de beterraba-açucareira, malte de cevada. Em alguns casos, o substrato de carbono pode ser um substrato com um carbono (por exemplo, metanol, dióxido de carbono) ou um substrato com dois car- bonos (por exemplo, etanol). Em outros casos, outros compostos con- tendo carbono podem ser utilizados, por exemplo, metilamina, gluco- samina e aminoácidos.

[00239] “Quaisquer métodos convenientes de cultura de células hospedeiras engenheiradas podem ser empregados para produção das enzimas e/ou BIAs de interesse. O protocolo particular que é em- pregado pode variar, por exemplo, dependendo da célula hospedeira engenheirada, das sequências de codificação heterólogas, das enzi- mas de interesse, da BIA de interesse, etc. As células podem estar presentes em qualquer ambiente conveniente, tal como um ambiente em que as células são capazes de expressar uma ou mais enzimas heterólogas funcionais. Em algumas modalidades, as células são cul- turadas sob condições que são condutoras para expressão de enzima e com substratos apropriados disponíveis para permitir produção de enzimas e/ou BIAs de interesse in vivo. Em algumas modalidades, as enzimas funcionais são extraídas do hospedeiro engenheirado para produção de enzimas e/ou BIAs de interesse sob condições in vitro. Em alguns casos, as células hospedeiras engenheiradas são postas de volta em um organismo hospedeiro multicelular. As células hospe- deiras engenheiradas estão em qualquer fase de crescimento, incluin- do, mas não limitado a, fase estacionária e fase de crescimento log, etc. Ainda, as culturas em si podem ser culturas contínuas ou elas po- dem ser culturas em batelada.

[00240] As células podem ser cultivadas em um meio de fermenta- ção apropriado em uma temperatura entre 14-40ºC. As células podem ser culturadas com agitação em qualquer velocidade conveniente (por exemplo, 200 rpm). As células podem ser cultivadas em um pH ade- quado. Faixas de pH adequadas para a fermentação podem ser entre pH 5-9. Fermentações podem ser realizadas sob condições aeróbicas, anaeróbicas ou microaeróbicas. Qualquer meio de crescimento ade- quado pode ser usado. Meios de crescimento adequados podem inclu- ir, sem limitação, meios comercialmente preparados comuns tal como meio mínimo definido sintético (SD) ou meio rico em extrato de levedu- ra peptona dextrose (YEPD). Qualquer outro meio de crescimento rico, definido ou sintético apropriado para o micro-organismo pode ser usa- do.

[00241] As células podem ser culturadas em um recipiente de es- sencialmente qualquer tamanho e formato. Exemplos de recipientes adequados para realizar os métodos da presente descrição podem in- cluir, sem limitação, placas de agitação de múltiplos poços, tubos de teste, frascos (com defletor e sem defletor) e biorreatores. O voluma da cultura pode variar de a partir de 10 microlitros a mais de 10.000 litros.

[00242] A adição de agentes ao meio de crescimento que são co-

nhecidos modular metabolismo de uma maneira desejável para a pro- dução de alcaloides pode ser incluída. Em um exemplo não limitante, 2'3'-monofosfato cíclico de adenosina pode ser adicionado ao meio de crescimento para modular repressão de catabolito.

[00243] “Quaisquer condições de cultura celular convenientes para um tipo de célula particular podem ser utilizadas. Em certas modalida- des, as células hospedeiras que incluem uma ou mais modificações são culturadas sob condições padrão ou prontamente otimizadas, com meio de cultura celular e suplementos. Como um exemplo, meio de crescimento padrão quando pressão seletiva para manutenção de plasmídeo não é requerida pode conter 20 g/L de extrato de levedura, g/L de peptona e 20 g/L de dextrose (YPD). Células hospedeiras contendo plasmídeos são culturadas em meio completo sintético (SC) contendo 1,7 g/L de base de nitrogênio de levedura, 5 g/L de sulfato de amônio e 20 g/L de dextrose suplementada com os aminoácidos apropriados requeridos para crescimento e seleção. Fontes de carbo- no alternativas que podem ser úteis para expressão de enzima induzí- vel incluem, mas não estão limitadas a, sacarose, rafinose e galactose. As células são cultivadas em qualquer temperatura conveniente (por exemplo, 30ºC) com agitação em qualquer taxa conveniente (por exemplo, 200 rpm) em um recipiente, por exemplo, em tubos ou fras- cos de teste em volumes variando de 1-1000 mL, ou mais, no laborató- rio.

[00244] Volumes de cultura podem ser aumentados para cultivo em recipientes de fermentação maiores, por exemplo, como parte de um processo industrial. O processo de fermentação industrial pode ser re- alizado sob condições de bateada fechada, batelada alimentada ou quimiostáticas contínuas ou qualquer modo de fermentação adequado. Em alguns casos, as células podem ser imobilizadas sobre um subs- trato como catalisadores de célula integral e submetidas a condições de fermentação para produção de alcaloide.

[00245] “Uma fermentação em batelada é um sistema fechado, em que a composição do meio é ajustada no início da fermentação e não é alterada durante o processo de fermentação. O(s) organismo(s) de- sejado(s) é/são inoculados no meio no início da fermentação. Em al- guns casos, a fermentação da batelada é realizada com alterações feitas no sistema para controlar fatores tal como pH e concentração de oxigênio (mas não carbono). Nesse tipo de sistema de fermentação, a biomassa e composições de metabolito do sistema mudam continua- mente durante o curso da fermentação. As células tipicamente prosse- guem através de uma fase lag, então para uma fase log (taxa de cres- cimento alta), então para uma fase estacionária (taxa de crescimento reduzida ou parada) e eventualmente para uma fase de morte (se dei- xadas sem tratamento). Em casos adicionais, o sistema de fermenta- ção em batelada pode ser aberto em certos momentos para adicionar mais substratos para fermentação do organismo desejado. Em particu- lar, em alguns casos, um sistema de fermentação pode incluir um rea- tor de batelada alimentada.

[00246] Uma fermentação contínua é um sistema aberto, em que um meio de fermentação definido é adicionado continuamente ao bior- reator e uma quantidade igual de meio de fermentação é continuada- mente removida do recipiente para processamento. Sistemas de fer- mentação contínua são geralmente operados para manter as condi- ções de crescimento em estado estável, de modo que perda celular devido a meio sendo removido deve ser equilibrada pela taxa de cres- cimento na fermentação. Fermentações contínuas são geralmente operadas em condições onde as células estão em uma densidade de célula alta constante. Fermentações contínuas permitem a modulação de um ou mais fatores que afetam a concentração de produto alvo e/ou crescimento de célula.

[00247] O meio líquido pode incluir, mas não está limitado a, um meio definido rico ou sintético tendo um componente aditivo descrito acima. Componentes do meio podem ser dissolvidos em água e esteri- lizados através de calor, pressão, filtragem, radiação, agentes quími- cos ou qualquer combinação dos mesmos. Vários componentes do meio podem ser preparados separadamente e esterilizados, e então combinados no recipiente de fermentação. O meio de cultura pode ser tamponado para auxiliar na manutenção de um pH constante durante a fermentação.

[00248] “Parâmetros de processo incluindo temperatura, oxigênio dissolvido, pH, agitação, taxa de aeração e densidade celular podem ser monitorados ou controlados durante o curso da fermentação. Por exemplo, a temperatura do processo de fermentação pode ser monito- rada por uma sonda de temperatura imersa no meio de cultura. A tem- peratura da cultura pode ser controlada no ponto de ajuste ao regular a temperatura do revestimento. Água pode ser esfriada em um arrefe- cedor externo e então fluida para a torre de controle do biorreator e circulada para o revestimento na temperatura requerida para manter a temperatura do ponto de ajuste no recipiente.

[00249] — Adicionalmente, um parâmetro de fluxo de gás pode ser monitorado em um processo de fermentação. Por exemplo, gases po- dem ser fluidos no meio através de um aspersor. Gases adequados para os métodos da presente descrição podem incluir ar comprimido, oxigênio e nitrogênio. Fluxo de gás pode estar em uma taxa fixa ou regulado para manter um ponto de ajuste de oxigênio dissolvido.

[00250] O pH de um meio de cultura também pode ser monitorado. Em exemplos, o pH pode ser monitorado por uma sonda de pH que é imersa no meio de cultura dentro do recipiente. Se o controle do pH estiver em efeito, o pH pode ser ajustado por bombas de ácido e base que adicionam cada solução ao meio na taxa requerida. As soluções ácidas usadas para controle do pH podem ser ácido sulfúrico ou ácido clorídrico. As soluções de base usadas para controlar o pH podem ser hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou hidróxido de amônio.

[00251] Ainda, oxigênio dissolvido pode ser monitorado em um meio de cultura por uma sonda de oxigênio dissolvido imersa no meio de cultura. Se regulagem de oxigênio dissolvido estiver em efeito, o nível de oxigênio pode ser ajustado aumentando ou diminuindo a velo- cidade de agitação. O nível de oxigênio dissolvido pode ser também ajustado ao aumentar ou diminuir a taxa de fluxo de gás. O gás pode ser ar comprimido, oxigênio ou nitrogênio.

[00252] Velocidade de agitação pode ser também monitorada em um processo de fermentação. Em exemplos, o motor agitador pode acionar um agitador. A velocidade do agitador pode ser ajustada em uma rpm consistente durante a fermentação ou pode ser regulada di- namicamente para manter um nível de oxigênio dissolvido ajustado.

[00253] — Adicionalmente, turbidez pode ser monitorada em um pro- cesso de fermentação. Em exemplos, densidade celular pode ser me- dida usando uma sonda de turbidez. Alternativamente, densidade celu- lar pode ser medida obtendo amostras do biorreator e analisando-as em um espectrômetro. Ainda, amostras podem ser removidas do bior- reator em intervalos de tempo através de um aparelho de amostragem estéril. As amostras podem ser analisadas quanto a alcaloides produ- zidos pelas células hospedeiras. As amostras também podem ser ana- lisadas quanto a outros metabolitos e açúcares, a depleção de compo- nentes do meio de cultura ou a densidade das células.

[00254] Em um outro exemplo, um parâmetro de matéria-prima po- de ser monitorado durante um processo de fermentação. Em particu- lar, matérias-primas incluem açúcares e outras fontes de carbono, nu- trientes e cofatores que podem ser adicionados à fermentação usando uma bomba externa. Outros componentes podem também ser adicio-

nados durante a fermentação incluindo, sem limitação, antiespuman- tes, sais, agentes de quelação, tensoativos e líquidos orgânicos.

[00255] “Quaisquer técnicas de otimização de códon convenientes para otimização da expressão de polinucleotídeos heterólogos em cé- lulas hospedeiras podem ser adaptadas para uso nas células hospe- deiras e métodos objeto, vide, por exemplo, Gustafsson, C. e outros (2004) Trends Biotechnol, 22, 346-353, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[00256] O método objeto pode também incluir adicionar um com- posto de partida à cultura celular. Quaisquer métodos convenientes de adição podem ser adaptados para uso nos métodos objeto. A cultura celular pode ser suplementada com uma quantidade suficiente dos materiais de partida de interesse (por exemplo, como descrito aqui), por exemplo, uma quantidade de mM a uM, tal como entre cerca de 1- mM de um composto de partida. É compreendido que a quantidade de material de partida adicionada, o momento e a taxa de adição, a forma de material adicionado, etc., podem variar de acordo com uma variedade de fatores. O material de partida pode ser adicionado puro ou pré-dissolvido em um solvente adequado (por exemplo, meio de cultura celular, água ou um solvente orgânico). O material de partida pode ser adicionado em forma concentrada (por exemplo, concentra- ção desejada de mais de 10x) para minimizar diluição do meio de cul- tura celular quando da adição. O material de partida pode ser adicio- nado em uma ou mais bateladas ou através da adição contínua duran- te um período de tempo prolongado (por exemplo, horas ou dias). Métodos para Isolamento de Produtos a partir do Meio de Fermenta- ção

[00257] Os métodos objeto podem também incluir recuperação das enzimas e/ou BIAs de interesse a partir da cultura celular. Quaisquer métodos convenientes de separação e isolamento (por exemplo, mé-

todos de cromatografia ou métodos de precipitação) podem ser adap- tados para uso nos métodos objeto para recuperara as enzimas e/ou BIAs de interesse a partir da cultura celular. Métodos de filtragem po- dem ser usados para separar frações solúveis e insolúveis da cultura celular. Em alguns casos, métodos de cromatografia líquida (por exemplo, HPLC de fase reversa, exclusão de tamanho, cromatografia de fase normal) podem ser usados para separar a BIA de interesse de outros componentes solúveis da cultura celular. Em alguns casos, mé- todos de extração (por exemplo, extração líquida, purificação baseada no pH, extração de fase sólida, cromatografia de afinidade, troca iôni- ca, etc.) podem ser usados para separar as enzimas e/ou BIAs de inte- resse de outros componentes da cultura celular.

[00258] Os alcaloides produzidos podem ser isolados do meio de fermentação usando métodos conhecidos na técnica. Várias etapas de recuperação podem ser realizadas imediatamente após (ou em alguns casos, durante) a fermentação para recuperação inicial do produto de- sejado. Através dessas etapas, os alcaloides (por exemplo, BIAs) po- dem ser separados das células, restos celulares e refugo, e outros nu- trientes, açúcares e moléculas orgânicas que permanecem no meio de cultura usado. Esse processo pode ser usado para prover um produto enriquecido em BIA.

[00259] Em um exemplo, uma corrente de produto tendo um produ- to de alcaloide benzilisoquinolina (BIA) é formada através da provisão de células de levedura engenheiradas e uma matéria-prima incluindo nutrientes e água a um reator em batelada. Em particular, as células de levedura engenheiradas podem ser submetidas à fermentação através de incubação as células de levedura engenheiradas por um período de tempo de pelo menos cerca de 5 minutos para produzir uma solução compreendendo o produto de BIA e material celular. Uma vez as células de levedura engenheiradas tendo sido submetidas à fermentação, pelo menos uma unidade de separação pode ser usada para separar o produto de BIA do material celular para prover a corren- te de produto compreendendo o produto de BIA. Em particular, a cor- rente de produto pode incluir o produto de BIA bem como componen- tes adicionais, tal como meio de cultura de levedura clarificado. Adici- onalmente, um produto de BIA pode compreender uma ou mais BIAs de interesse, tais como um ou mais compostos de BIA.

[00260] Métodos diferentes podem ser usados para remover células de um meio de biorreator que incluem uma enzima e/ou BIA de inte- resse. Em exemplos, as células podem ser removidas através de se- dimentação com o tempo. Esse processo de sedimentação pode ser acelerado através de resfriamento ou pela adição de agentes de refi- namento tal como sílica. O meio de cultura usado pode então ser sifo- nado a partir da parte superior do reator ou as células podem ser de- cantadas a partir da base do reator. Alternativamente, as células po- dem ser removidas através de filtragem em um filtro, uma membrana ou outro material poroso. As células também podem ser removidas através de centrifugação, por exemplo, através de centrifugação de fluxo contínuo ou usando um extrator contínuo.

[00261] Se algumas enzimas e/ou BIAs de interesse valiosos esti- verem presentes dentro das células, as células podem ser permeabili- zadas ou lisadas e os restos de célula podem ser removidos através de qualquer um dos métodos descritos acima. Agentes usados para permeabilizar as células podem incluir, sem limitação, solventes orgâà- nicos (por exemplo, DMSO) ou sais (por exemplo, acetato de lítio). Mé- todos para lisar as células podem incluir a adição de tensoativos tal como dodecil sulfato de sódio ou rompimento mecânico através de moagem com esfera ou sonificação.

[00262] Enzimas e/ou BIAs de interesse podem ser extraídas do meio de cultura usado clarificado através de extração líquido-líquido pela adição de um líquido orgânico que é não miscível com o meio de cultura aquoso. Em exemplos, o uso de extração líquido-líquido pode ser feito em adição a outras etapas de processamento. Exemplos de líquidos orgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, mi- ristato de isopropila, acetato de etila, clorofórmio, acetato de butila, metilisobutil cetona, oleato de metila, tolueno, álcool de oleíla, butirato de etila. O líquido orgânico pode ser adicionado em um mínimo de 10% ou máximo de 100% do meio aquoso. O líquido orgânico pode ser um mínimo de 10%, pode ser 100%, pode ser 200%, pode ser 300%, pode ser 400%, pode ser 500%, pode ser 600%, pode ser 700%, pode ser 800%, pode ser 900%, pode ser 1000%, pode ser mais de 1000% ou pode ser uma porcentagem entre essas listadas aqui do volume do líquido aquoso.

[00263] Em alguns casos, o líquido orgânico pode ser adicionado no início da fermentação ou a qualquer momento durante a fermenta- ção. Esse processo de fermentação extrativa pode aumentar o rendi- mento de enzimas e/ou BIAs de interesse a partir das células hospe- deiras ao remover continuamente enzimas e/ou BIAs para a fase or- gânica.

[00264] —Agitação pode fazer com que a fase orgânica forme uma emulsão com o meio de cultura aquoso. Métodos para encorajar a se- paração das duas fases em camadas distintas podem incluir, sem limi- tação, a adição de um demulsificador ou um agente de nucleação ou um ajuste do pH. A emulsão pode também ser centrifugada para sepa- rar as duas fases, por exemplo, através de centrifugação em placa cô- nica contínua.

[00265] —Alternativamente, a fase orgânica pode ser isolada do meio de cultura aquoso de modo que ela possa ser fisicamente removida após extração. Por exemplo, o solvente pode ser encapsulado em uma membrana.

[00266] Em exemplos, enzimas e/ou BIAs de interesse podem ser extraídas de um meio de fermentação usando métodos de adsorção. Em exemplos, BIAs de interesse podem ser extraídas de meio de cul- tura usado clarificado através da adição de uma resina tal como Am- berlite? XAD4 ou um outro agente que remova BIAs através de adsor- ção. As BIAs de interesse podem então ser liberadas da resina usando um solvente orgânico. Exemplos de solventes orgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, metanol, etanol, acetato de etila ou acetona.

[00267] BIAs de interesse também podem ser extraídas de um meio de fermentação usando filtragem. Em pH alto, as BIAs de interesse podem formar um precipitado do tipo cristalino no biorreator. Esse pre- cipitado pode ser removido diretamente através de filtragem em um filtro, membrana ou outro material poroso. O precipitado pode ser tam- bém coletado através de centrifugação ou decantação.

[00268] Os métodos de extração descritos acima podem ser reali- zados ou in situ (no biorreator) ou ex situ (por exemplo, em uma alça externa através da qual meio flui para fora do biorreator e contata o agente de extração, então é recirculado de volta para o recipiente). Alternativamente, os métodos de extração podem ser realizados após a fermentação ser terminada usando o meio clarificado removido do recipiente do biorreator. Métodos para Purificação de Produtos a partir de Soluções Enriqueci- das em Alcaloide

[00269] Etapas de purificação subsequentes podem envolver trata- mento da solução pós-fermentação enriquecida com produto(s) de Bl- As de interesse usando métodos conhecidos na técnica para recuperar espécies de produto individuais de interesse

[00270] Em um exemplo, BIAs de interesse extraídas em uma fase orgânica podem ser transferidas para uma solução aquosa. Em alguns casos, o solvente orgânico pode ser evaporado através de calor e/ou vácuo, e o pó resultante pode ser dissolvido em uma solução aquosa de pH adequado. Em um exemplo adicional, as BIAs de interesse po- dem ser extraídas da fase orgânica através da adição de uma solução aquosa em um pH adequado que promove extração das BIAs de inte- resse na fase aquosa. A fase aquosa pode ser então removida através de decantação, centrifugação ou um outro método.

[00271] A solução contendo BIA pode ser tratada mais para remo- ver metais, por exemplo, através de tratamento com um agente de quelação adequado. A solução contendo BIA de interesse pode ser ainda tratada para remover outras impurezas, tais como proteínas e DNA, através de precipitação. Em um exemplo, a solução contendo BIA de interesse é tratada com um agente de precipitação apropriado tal como etanol, metanol, acetona ou isopropanol. Em um exemplo al- ternativo, DNA e proteína podem ser removidos através de diálise ou através de outros métodos de exclusão por tamanho que separam os alcaloides menores de macromoléculas biológicas contaminantes.

[00272] Em exemplos adicionais, a solução contendo BIAs de inte- resse pode ser extraída para alta pureza através de filtragem de fluxo cruzado contínua usando métodos conhecidos na técnica.

[00273] Sea solução contiver uma mistura de BIA de interesse, ela pode ser submetida a tratamento com ácido-base para fornecer BIA individual de espécie de interesse usando métodos conhecidos na téc- nica. Nesse processo, o pH da solução aquosa é ajustado para preci- pitar BIAs individuais.

[00274] Para preparações de pequena escala, alta pureza, as BIAS podem ser purificadas em uma etapa única através de cromatografia líquida. Método de Espectrometria de Massa Cromatografia Líquida (LCMS)

[00275] Os compostos BIA de interesse, incluindo alcaloides 1-

benzilisoquinolina, alcaloides bisbenzilisoquinolina, alcaloides promor- finano, alcaloides morfinano, nal-opioides e nor-opioides, podem ser separados usando cromatografia líquida, e detectados e quantificados usando espectrometria de massa. Identidade do composto pode ser confirmada através de tempo de eluição, razão de massa-para-carga (m/z) e padrões de fragmentação característicos (MS/MS). Quantifica- ção pode ser realizada comparando uma área de pico de composto com uma curva padrão de um composto padrão de referência conhe- cido. Adicionalmente, BIAs de interesse podem ser detectadas através de métodos alternativos tais como GC-MS, espectrometria UVW-vis, NMR, LC-NMR, LC-UV, TLC e eletroforese capilar. Método de Ensaio Purpald

[00276] Para avaliação de alto rendimento de reações de desmeti- lação um ensaio purpald pode ser usado. por exemplo, desmetilação catalisada por dioxigenase dependente de 2-oxoglutarato produz for- maldeído a como produto como mostrado na equação química genera- lizada: [substrato] + 2 oxoglutarato + Or = [produto] + formaldeído + succinato + CO>2. Reagente purpald em condições alcalinas sofre uma mudança de cor na presença de formaldeído que pode ser quantifica- do para concentrações tão baixas quanto 1 nM com um espectrofotô- metro a 510 nm. APIs de Alcaloide Derivado de Planta Versus APIs Derivados de Planta

[00277] O meio de cultura de levedura clarificado (CYCM) pode conter uma pluralidade de impurezas. O meio de cultura de levedura clarificado pode ser desidratado através de vácuo e/ou calor para pro- ver um pó rico em alcaloide. Esse produto é análogo ao concentrado de palha de papoula (CPS) ou ópio, que é exportado de países culti- vadores de papoula e comprado pelos fabricantes de API. Para o pro- pósito da presente invenção, CPS é um exemplo representativo de qualquer tipo de extrato de planta purificado a partir do qual o(s) pro-

duto(s) alcaloide(s) desejado(s) pode(m) ser por fim purificado(s). À Tabela 10 e a Tabela 11 destacam as impurezas nesses dois produtos que podem ser específicas ou para C(YCM ou CPS ou podem estar presentes em ambos. Embora algumas BIAs possam ter um pigmento como uma impureza, outras BIAs podem ser categorizadas como os próprios pigmentos. Portanto, essas BIAs podem ser avaliadas quanto a impurezas com base em impurezas não pigmento. Através da análi- se de um produto de origem desconhecida quanto a um subconjunto dessas impurezas, um versado de habilidade na técnica poderia de- terminar se o produto se originou de um hospedeiro de produção leve- dura ou planta.

[00278] Ingredientes farmacêuticos de grau API são moléculas al- tamente purificadas. Sendo assim, impurezas que poderiam indicar a origem de planta ou levedura de um API (tais como aqueles listados na Tabela 10 e na Tabela 11) podem não estar presentes no estágio de API do produto. Na verdade, muitos dos produtos de API derivados de cepas de levedura da presente invenção podem ser amplamente indistinguíveis dos APIs derivados de planta tradicionais. Em alguns casos, no entanto, compostos alcaloides convencionais podem ser submetidos à modificação química usando abordagens de síntese química, que podem aparecer como impurezas químicas em produtos à base de planta que requerem tais modificações químicas. Por exem- plo, derivatização química pode frequentemente resultar em um con- junto de impurezas relacionadas a processos de síntese química. Em certas situações, essas modificações podem ser realizadas biologica- mente na plataforma de produção de levedura, desta maneira evitando que algumas das impurezas associadas com derivação química este- jam presentes no produto derivado de levedura. Em particular, essas impurezas do produto de derivação química podem estar presentes em um produto de API que é produzido usando processos de síntese química, mas podem estar ausentes de um produto de API que é pro- duzido usando um produto derivado de levedura. Alternativamente, se um produto derivado de levedura for misturado com um produto quimi- camente derivado, as impurezas resultantes podem estar presentes, mas em uma quantidade menor do que seria esperado em um API que contém apenas ou principalmente produtos quimicamente derivados. Neste exemplo, através da análise do produto de API quanto a um subconjunto dessas impurezas, um versado de habilidade comum na técnica poderia determinar se o produto se originou de um hospedeiro de produção de levedura ou da via de derivatização química tradicional.

[00279] Exemplos não limitantes de impurezas que podem estar presentes em APIs morfinano quimicamente derivatizados, mas não em APIs biossintetizados, incluem uma impureza codeína-O(6)-metil éter em API codeína; 8,14-di-hidróxi-7,8-di-hidrocodeinona em um API oxicodona; e tetra-hidrotebaína em API hidrocodona. O codeína-O(6)- metil éter pode ser formado através de metilação química excessiva de morfina. A 8,14-di-hidróxi-7,8-di-hidrocodeinona em API oxicodona po- de ser formada através de oxidação química em excesso de tebaína. Adicionalmente, a tetra-hidrotebaína em API hidrocodona pode ser formada através de redução química em excesso de tebaína.

[00280] No entanto, no caso onde o composto derivado de levedura e o composto derivado de planta são ambos submetidos à modificação química através de abordagens de síntese química, as mesmas impu- rezas associadas com o processo de síntese química podem ser espe- radas nos produtos. Em tal situação, o material de partida (por exem- plo, CYCM ou CPS) pode ser analisado como acima descrito. Nal-opioides Derivados de Célula Hospedeira vs Nal-opioides Quimi- camente Derivados

[00281] —Nal-opioides produzidos através de síntese química podem conter uma pluralidade de impurezas. Essas impurezas podem se ori-

ginar de muitas causas diferentes, por exemplo, materiais de partida não reagidos, reações incompletas, a formação de subprodutos, per- sistência de intermediários, dimerização ou degradação. Um exemplo de um material de partida não reagido poderia ser oximorfona restan- tes em uma preparação de naltrexona. Um exemplo de uma impureza tendo origem a partir de uma reação incompleta poderia ser 3-O- Metilbuprenorfina resultante da 3-O-desmetilação de tebaína incomple- ta. Modificação química pode resultar na adição ou remoção de grupos funcionais em sítios fora do alvo. Por exemplo, a oxidação de C10 pa- ra criar 10-hidroxinaltresona e 10-cetonaltrexona durante síntese de naltrexona ou a remoção do grupo 6-O-metila para prover 6-O-desme- tilbuprenorfina durante síntese de buprenorfina. Impurezas podem se originar da persistência de intermediários de reação, por exemplo, a persistência de N-óxidos tal como N-óxido de oximorfona formado du- rante o processo de N-desmetilação. Uma outra fonte de impurezas é dimerização, a conjugação de duas moléculas opioides, por exemplo, duas moléculas de buprenorfina (2,2'-bisbuprenorfina), duas moléculas de naltrexona (2,2'-bisnaltrexona) ou duas moléculas de naloxona (2,2'-bisnaloxona). Impurezas podem se originar da degradação de materiais de partida, intermediários de reação ou produtos de reação. As condições físicas extremas usadas em sínteses químicas podem tornar a presença de degradação mais provável. Um exemplo de uma impureza que pode se originar de degradação é desidrobuprenorfina produzida através de condições de oxidação durante síntese de buprenorfina.

[00282] —Nal-opioides produzidos pela catálise de enzima em uma célula hospedeira podem conter impurezas diferentes de nal-opioides produzidos através de síntese química. Nal-opioides produzidos atra- vés de catálise de enzima em uma célula hospedeira podem conter menos impurezas do que nal-opioides produzidos através de síntese química. Nal-opioides produzidos através de catálise de enzima em uma célula hospedeira podem não ter certas impurezas que são en- contradas em nal-opioides produzidos através de síntese química. Em exemplo, elementos-chave de síntese de enzima podem incluir (1) en- zimas que se direcionam a um substrato e resíduo específico com alta fidelidade; (2) enzimas realizam reações nas condições fisiológicas suaves dentro da célula que não comprometem a estabilidade das mo- léculas; e (3) enzimas são engenheiradas para serem catalisadores eficientes que conduzem reações para o final.

[00283] A Tabela 12 destaca algumas das impurezas que podem ser específicas para nal-opioides quimicamente produzidos. Dessa maneira, nal-opioides podem ser avaliados quanto a impurezas para determinar a presença ou ausência de qualquer impureza da Tabela

12. Ao analisar um produto de origem desconhecida quanto a um sub- conjunto dessas impurezas, um versado na técnica poderia determinar se o produto se originou de uma síntese química ou enzimática. Métodos de Engenharia de Células Hospedeiras

[00284] São também incluídos métodos de engenharia de células hospedeiras para o propósito de produção de enzimas e/ou BIAs de interesse. Inserção de DNA em células hospedeiras pode ser conse- guida usando quaisquer métodos convenientes. Os métodos são usa- dos para inserir as sequências de codificação heterólogas nas células hospedeiras engenheiradas de modo que as células hospedeiras ex- pressem funcionalmente as enzimas e convertam os compostos de partida de interesse em enzimas de produto e/ou BIAs de interesse.

[00285] “Quaisquer promotores convenientes podem ser utilizados nas células hospedeiras engenheiradas e métodos objeto. Os promo- tores que conduzem a expressão das sequências de codificação hete- rólogas podem ser promotores constitutivos ou promotores induzíveis, contanto que os promotores sejam ativos nas células hospedeiras en-

genheiradas.

As sequências de codificação heterólogas podem ser expressas a partir de seus promotores nativos ou promotores não nati- vos podem ser usados.

Tais promotores podem ser de resistência bai- xa a alta no hospedeiro em que eles são usados.

Promotores podem ser regulados ou constitutivos.

Em certas modalidades, promotores que não são reprimidos por glicose, ou apenas reprimidos levemente pela presença de glicose no meio de cultura, são usados.

Promotores de interesse incluem, mas não estão limitados a, promotores de genes glicolíticos tal como o promotor do gene tsr de B. subtilis (codificando a região de promotor do gene frutose bifosfato aldolase) ou o promotor de gene de S. cerevisiae de levedura codificando gliceraldeído 3-fosfato de- sidrogenase (GPD, GAPDH ou TDH3), o promotor ADH1 de levedura de padeiro, os promotores induzidos por carência de fosfato tal como o promotor PHOS5 de levedura, o promotor de fosfatase alcalina de B. licheniformis, promotores induzíveis por levedura tais como Gal1-10, Gal1, GalL, GalS, promotor repressível Met25, tetO e promotores constitutivos tais como promotor gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GPD), promotor álcool desidrogenase (ADH), promotor de alonga- mento de tradução de fator-1-a (TEF), promotor de citocromo c- oxidase (CYC1), promotor MRP7, etc.

Em alguns casos vetores de ex- pressão de levedura de replicação autônoma contendo promotores induzíveis por hormônios tais como glucocorticoides, esteroides e hormônios da tireoide são também conhecidos e incluem, mas não es- tão limitados a, elemento responsivo a glucocorticoide (GRE) e ele- mento responsivo a hormônio da tireoide (TRE). Esses e outros exem- plos são descritos na Pat.

U.S.

No. 7.045.290, que é aqui incorporada a título de referência, incluindo as referências citadas na mesma.

Veto- res adicionais contendo promotores constitutivos ou induzíveis tais como fator a, álcool oxidase e PGH podem ser usados.

Ainda, qual- quer combinação de promotor/intensificador (de acordo com o Eu-

karyotic Promoter Data Base EPDB) poderia ser também usada para dirigir a expressão de genes de interesse. Quaisquer promotores con- venientes apropriados podem ser selecionados para a célula hospe- deira, por exemplo, E. coli. Seleção de promotor pode ser usada para otimizar transcrição e, portanto, níveis de enzima para maximizar a produção enquanto minimizando recursos energéticos.

[00286] Quaisquer vetores convenientes podem ser utilizados nas células hospedeiras engenheiradas e métodos objeto. Vetores de inte- resse incluem vetores para uso em células de levedura e outras. Os tipos de vetores de levedura podem ser separados em 4 categorias gerais: vetores integrativos (Ylp), vetores de número de cópia alto de replicação autônoma (YEp ou plasmídeos de 24), vetores de número de cópia baixo de replicação autônoma (YCp ou plasmídeos centromé- rico) e vetores para clonagem de fragmentos grandes (YACs). DNA de vetor é introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através de quaisquer técnicas de transformação ou transfecção convenientes. DNA de uma outra fonte (por exemplo, produto de DNA de filamento duplo gerado por PCR ou oligonucleotídeos de filamento duplo ou fi- lamento simples sintetizados) pode ser usado para engenheirar a le- vedura através de integração no genoma. Qualquer evento de trans- formação único pode incluir um ou vários ácidos nucleicos (vetores, fragmentos de DNA de filamento duplo ou filamento simples) para mo- dificar geneticamente a célula hospedeira. A FIG. 11 ilustra exemplos de vetores convenientes. Ainda, a Tabela 8 provê exemplos de se- quências de plasmídeo de base a partir das quais porções de sequên- cias representadas na FIG. 11 podem ser derivadas. Em algumas mo- dalidades, sequências de plasmídeo na Tabela 8 podem ser utilizadas em aspectos integrantes de modalidades reveladas aqui.

UTILIDADE

[00287] As células hospedeiras engenheiradas e métodos da inven-

ção, por exemplo, como descrito acima, encontram uso em uma varie- dade de aplicações. Aplicações de interesse incluem, mas não estão limitadas a: aplicações de pesquisa e aplicações terapêuticas. Os mé- todos da invenção encontram uso em uma variedade de aplicações diferentes incluindo qualquer aplicação conveniente onde a produção de enzimas e/ou BIAs é de interesse.

[00288] As células hospedeiras engenheiradas e métodos objeto encontram uso em uma variedade de aplicações terapêuticas. Aplica- ções terapêuticas de interesse incluem aquelas aplicações em que a preparação de produtos farmacêuticos que incluem BIAs é de interes- se. As células hospedeiras engenheiradas descritas aqui produzem BIAs de interesse e enzimas de interesse. Reticulina é um intermediá- rio de ponto de ramificação principal de interesse na síntese de BIAs incluindo esforços de engenharia para produzir produtos finais tais como produtos opioides. As células hospedeiras objeto podem ser uti- lizadas para produzir BIAs de interesse a partir de materiais de partida simples e econômicos que podem encontrar uso na produção de BIAs de interesse, incluindo reticulina, e produtos de finais de BIA. Desta maneira, as células hospedeiro objeto encontram uso no fornecimento de BIAs terapeuticamente ativas de interesse.

[00289] Em alguns casos, as células hospedeiras engenheiradas e métodos encontram uso na produção de quantidades em escala co- mercial de BIAs das mesmas onde síntese química desses compostos é de rendimento baixo e não um meio disponível para produção em grande escala. Em certos casos, as células hospedeiras e métodos são utilizados em uma instalação de fermentação que incluiria biorrea- tores (fermentadores) de, por exemplo, capacidade de 5.000-200.000 litros permitindo a produção rápida de BIAs de interesse das mesmas para produtos terapêuticos. Tais aplicações podem incluir a produção em escala industrial de BIAs de interesse a partir de fontes de carbono fermentáveis tais como celulose, amido e açúcares livres.

[00290] As células hospedeiras engenheiradas e métodos objeto encontram uso em uma variedade de aplicações de pesquisa. As célu- las hospedeiras e métodos objeto podem ser usados para analisar os efeitos de uma variedade de enzimas sobre as vias biossintéticas de uma variedade de enzimas e/ou BIAs de interesse. Ainda, as células hospedeiras engenheiradas podem ser engenheiradas para produzir enzimas e/ou BIAs de interesse que encontram uso em teste de bioati- vidade de interesse em funções terapêuticas ainda não provadas. Em alguns casos, a engenharia de células hospedeiras para incluir uma variedade de sequências de codificação heterólogas que codificam uma variedade de enzimas elucida as vias biossintéticas de rendimen- to alto em direção a enzimas e/ou BIAs de interesse. Em certos casos, aplicações de pesquisa incluem a produção de enzimas e/ou BIAs de interesse para moléculas terapêuticas de interesse que podem então ser quimicamente modificadas ou derivatizadas para produtos deseja- dos ou para avaliação quanto a atividades terapêuticas de interesse. Em alguns casos, cepas de células hospedeiras são usadas para ava- liar atividades de enzima que são de interesse em tais vias, que po- dem levar ao encontro de enzima através de conversão de metabolitos de BIA produzidos nessas cepas.

[00291] As células hospedeiras engenheiradas e métodos objeto podem ser usados como uma plataforma de produção para metaboli- tos especializados de planta. As células hospedeiras e métodos objeto podem ser usados como uma plataforma para desenvolvimento de bi- blioteca de fármaco bem como encontro de enzima de planta. Por exemplo, as células hospedeiras engenheiradas e métodos objeto po- dem encontrar uso no desenvolvimento de bibliotecas de fármaco ba- seadas em produto natural obtendo cepas de levedura produzindo mo- léculas de base interessantes, tal como guategaumerina, e ainda fun-

cionalizando a estrutura do composto através de biossíntese combina- torial ou através de meios químicos. Ao produzir bibliotecas de fárma- co desta maneira, quaisquer êxitos de fármaco potenciais já estão as- sociados com um hospedeiro de produção que é condescendente à cultura e produção em larga escala. Como um outro exemplo, essas células hospedeiras engenheiradas e métodos objeto podem encontrar uso em encontro de enzima de planta. As células hospedeiras objeto proveem uma base clara de metabolitos definidos para expressar bi- bliotecas de EST de planta para identificar novas atividades de enzi- ma. As células hospedeiras e métodos objeto proveem métodos de expressão e condições de cultura para a expressão funcional e ativi- dade aumentada de enzimas de planta em levedura.

ESTOJOS E SISTEMAS

[00292] Aspectos da invenção incluem ainda estojos e sistemas, onde os estojos e sistemas podem incluir um ou mais componentes empregados em métodos da invenção, por exemplo, células hospedei- ras engenheiradas, compostos de partida, sequências de codificação heterólogas, vetores, meio de cultura, etc., como descrito aqui. Em al- gumas modalidades, o estojo objeto inclui uma célula hospedeira en- genheirada (por exemplo, como descrito aqui), e um ou mais compo- nentes selecionados do que segue: compostos de partida, uma se- quência de codificação heteróloga e/ou um vetor incluído a mesma, vetores, matéria-prima de cultivo, componentes adequados para uso em sistemas de expressão (por exemplo, células, vetores de clona- gem, sítios de clonagem múltiplos (MCS), promotores bidirecionais, um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES), etc.) e um meio de cultu- ra.

[00293] “Qualquer um dos componentes descritos aqui pode ser provido nos estojos, por exemplo, células hospedeiras incluindo uma ou mais modificações, compostos de partida, meio de cultura, etc.

Uma variedade de componentes adequados para uso na fabricação e uso de sequências de codificação heterólogas, vetores de clonagem e sistemas de expressão podem encontrar uso nos estojos objeto. Os estojos podem também incluir tubos, tampões, etc., e instruções para uso. Os vários componentes reagentes dos estojos podem estar pre- sentes em recipientes separados ou alguns ou todos deles podem ser pré-combinados em uma mistura reagente em um recipiente único, conforme desejado.

[00294] São também providos sistemas para produção de enzimas e/ou BIAs de interesse, onde os sistemas podem incluir células hospe- deiras engenheiradas incluindo uma ou mais modificações (por exem- plo, como descrito aqui), compostos de partida, meio de cultura, um fermentador e equipamento de fermentação, por exemplo, um apare- lho adequado para manutenção das condições de crescimento para as células hospedeiras, equipamento e componentes de amostragem e monitoramento e similar. Uma variedade de componentes adequados para uso em fermentação em larga escala de células de levedura pode encontrar uso nos sistemas objeto.

[00295] Em alguns casos, o sistema inclui componentes para a fer- mentação em larga escala de células hospedeiras engenheiradas, e o monitoramento e purificação de enzimas e/ou compostos BIA produzi- dos pelas células hospedeiras fermentadas. Em certas modalidades, um ou mais compostos de partida (por exemplo, como descrito aqui) são adicionados ao sistema, sob condições através das quais as célu- las hospedeiras engenheiradas no fermentador produzem um ou mais produtos de BIA de interesse desejados. Em alguns casos, as células hospedeiras produzem uma BIA de interesse (por exemplo, como des- crito aqui). Em certos casos, os produtos de BIA de interesse são pro- dutos opioides, tais como tebaína, codeína, neopina, morfina, neomor- fina, hidrocodona, oxicodona, hidromorfona, di-hidrocodeína, 14-hidro-

xicodeína, di-hidromorfina e oximorfona. Em alguns casos, os produtos de BIA de interesse são nal-opioides tais como naltrexona, naloxona, nalmefeno, nalorfina, nalodeína, naldemedina, naloxegol, 6B-naltrexol, naltrindol, metilnaltrexona, metilsamidorfano, alvimopam, alvimopam, axelopram, bevenpran, dinicotinato, levalorfano, samidorfano, bupre- norfina, dezocina, eptazocina, butorfanol, levorfanol, nalbufina, pen- tazocina, fenazocina, norbitaltorfimina e diprenorfina. Em alguns ca- sos, os produtos de BIA de interesse são nor-opioides, tais como nor- codeína, noroxicodona, nortebaína, nor-hidrocodona, nor-di-hidro- codeína, nor-14-hidróxi-codeína, norcodeinona, nor-14-hidróxi-codei- nona, normorfina, noroximorfona, nororipavina, nor-hidro-morfona, nor- di-hidro-morfina, nor-14-hidróxi-morfina, normorfina e nor-14-hidróxi- morfinona. Em alguns casos, os produtos de BIA são produtos de bis- benzilisoquinolina, tais como berbamunina, guategaumerina, dauricina e liensinina.

[00296] Em alguns casos, o sistema inclui processos para monito- ramento e/ou análise de uma ou mais enzimas e/ou BIAs de compos- tos de interesse produzidas pelas células hospedeiro objeto. Por exemplo, um sistema de análise LC-MS como aqui descrito, um siste- ma de cromatografia ou qualquer sistema conveniente onde a amostra possa ser analisada e comparado com um padrão, por exemplo, como descrito aqui. O meio de fermentação pode ser monitorado em qual- quer momento conveniente antes e duração fermentação através da amostragem e análise. Quando a conversão de compostos de partida em enzimas e/ou produtos de BIA de interesse está completa, a fer- mentação pode ser parada e purificação dos produtos de BIA pode ser feita. Sendo assim, em alguns casos, o sistema objeto inclui um com- ponente de purificação adequado para purificação das enzimas e/ou produtos de BIA de interesse a partir do meio de célula hospedeira no qual eles são produzidos. O componente de purificação pode incluir quaisquer meios convenientes que possam ser usados para purificar as enzimas e/ou produtos de BIA de interesse produzidos através de fermentação, incluindo, mas não limitado a, cromatografia de sílica, cromatografia de fase reversa, cromatografia de troca iônica, cromato- grafia HIC, cromatografia de exclusão de tamanho, extração líquida e métodos de extração de pH. Em alguns casos, o sistema objeto provê a produção e isolamento de enzima e/ou produtos de fermentação de BIA de interesse seguindo a entrada de um ou mais compostos de par- tida no sistema.

[00297] Os exemplos que seguem são mostrados de modo a prover aqueles de habilidade comum na técnica com revelação e descrição completas de como fazer e usar a presente invenção, e não preten- dem limitar o escopo do que os inventores consideram como sua in- venção nem pretendem representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Foram feitos esforços pa- ra assegurar precisão com relação a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experi- mentais devem ser considerados. A menos que de outro modo indica- do, partes são partes em peso, peso molecular é peso molecular pon- deral médio, temperatura é em graus Centígrados e pressão é na ou próximo da atmosférica. Discussão de Lista de Enzima

[00298] As células hospedeiras podem ser engenheiradas para in- cluir uma ou mais modificações (tais como duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou até mesmo mais modificações) que proveem a produção de BIAs de interesse e/ou enzimas de interesse. A Tabela 3 provê uma lista de genes exemplares que podem ser afe- tados por uma ou mais modificações de modo a prover a produção de BIAs de interesse e/ou enzimas de interesse em uma célula hospedei- ra engenheirada.

[00299] “Modificações de genes como provido na Tabela 3 podem ser usadas para produzir BIAs de interesse a partir de células hospe- deiras engenheiradas que são fornecidas com um meio contendo os nutrientes mínimos requeridos para crescimento. Esse meio mínimo pode conter uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, aminoáci- dos, vitaminas e sais. Por exemplo, modificações de genes como pro- vido na Tabela 3 podem ser usadas para produzir BIAs de interesse a partir de células hospedeiras engenheiradas que são alimentadas com açúcar. Adicionalmente, modificações de um ou mais genes como pro- vido na Tabela 3 podem ser usadas para aumentar os processos bios- sintéticos de células hospedeiras que podem ser engenheiradas para produção de fármaco.

[00300] — Adicionalmente, o uso dessas modificações para prover a produção de BIAs de interesse e/ou enzimas de interesse em células hospedeiras engenheiradas não é prontamente aparente a partir de mera identificação de enzimas que podem ser produzidas pelos genes. Em particular, vias sintéticas que foram reconstruídas em células hos- pedeiras, tais como células de levedura, como aqui descrito compre- endem uma variedade de enzimas que não agem juntas na natureza dentro de um único organismo. Adicionalmente, algumas das enzimas discutidas aqui não agem para biossíntese de BIA em seu contexto natural. Ainda, algumas das enzimas descritas aqui não são desenvol- vidas para funcionar em células hospedeiras particulares, tais como células de levedura, e não são desenvolvidas para funcionar juntas. Nesses casos, não seria óbvio que as enzimas exibissem atividade suficiente no contexto da via de BIA sintética em uma célula hospedei- ra, tal como levedura, para ter fluxo suficiente através da via para pro- duzir produtos finais de BIA a jusante.

[00301] Por exemplo, enzimas de planta são frequentemente difí- ceis de expressar funcionalmente em hospedeiros microbianos heteró-

logos, tal como levedura. Em muitos casos, as enzimas podem ser do- bradas erroneamente, não localizadas corretamente dentro da célula hospedeira e/ou incorretamente processadas. As diferenças em tradu- ção e processamento de proteína entre levedura e plantas pode levar a essas enzimas exibindo atividades substancialmente reduzidas e nenhuma detectáveis no hospedeiro levedura. Esses desafios surgem comumente para enzimas localizadas na endomembrana, tais como citocromo P450s, que são fortemente representadas nas vias de BIA. Mesmo atividades de enzima reduzidas podem impor um desafio subs- tancial à engenharia de levedura para produzir BIAS complexas, que requer atividade suficiente em cada etapa para assegurar acúmulo em nível alto dos produtos de BIA desejados.

[00302] Adicionalmente, há enzimas/vias endógenas em algumas células hospedeiras, tal como levedura, que podem agir sobre muitos dos precursores iniciais na via de BIA (isto é, intermediários de tirosina para norcoclaurina), e então pode não ser prontamente aparente que houvesse fluxo suficiente através da via heteróloga para obter produ- ção de BIA substancial dadas essas vias endógenas competidoras. Por exemplo, a via Erlich (Hazelwood e outros, 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74: 2259-66; Larroy, e outros, 2003. Chem. Biol. Interact. 143-144: 229-38; Larroy e outros, 2002. Eur. J. Biochem. 269: 5738- 45) em leveduras é a via endógena principal que agiria para converter muitos dos intermediários na via de BIA inicial em produtos indesejá- veis e desviar fluxo da via sintética.

[00303] Ainda, muitas das enzimas como aqui discutido, e como provido na Tabela 3, podem funcionar sob estratégias de regulação muito específicas, incluindo regulagem espacial, nos hospedeiros plan- ta nativos, que pode ser perdida quando da transferência para o hos- pedeiro levedura heterólogo. Ainda, as plantas apresentam ambientes bioquímicos muito diferentes das células de levedura sob os quais as enzimas são desenvolvidas para funcionar, incluindo pH, estado redox e disponibilidades de substrato, cossubstrato, coenzima e cofator. Da- das as diferenças em ambientes bioquímicos e estratégias reguladoras entre os hospedeiros nativos e os hospedeiros levedura heterólogos, não é óbvio que as enzimas exibissem atividades substanciais quando no contexto do ambiente de levedura e ainda não óbvio que elas traba- lhassem juntas para direcionar precursores simples tal como açúcar para compostos de BIA complexos. Manutenção das atividades das enzimas no hospedeiro levedura é particularmente importante uma vez que muitas das vias têm muitas etapas de reação (>10), de modo que se essas etapas não forem eficientes, então não seria esperado acú- mulo de produtos a jusante desejados.

[00304] Ainda, nos hospedeiros planta nativos, os metabolitos as- sociados nessas vias podem estar localizados em tipos e célula e teci- do diferentes. Em vários exemplos, há tipos de célula que podem ser especializados para biossíntese e tipos de célula que podem ser sinte- tizados para acúmulo de metabolito. Esse tipo de especialização de célula pode ser perdido quando expressando as vias dentro de um hospedeiro levedura heterólogo, e pode desempenhar um papel impor- tante em controle da toxidez desses metabolitos nas células. Portanto, não é óbvio que levedura pudesse ser engenheirada com sucesso pa- ra biossintetizar e acumular esses metabolitos sem ser prejudicada pela toxidez desses compostos.

[00305] Como um exemplo, nos hospedeiros planta nativos, a en- zima BBE é reportada ter localização subcelular dinâmica. Em particu- lar, a enzima BBE inicialmente começa no RE e então é fixada no va- cúolo (Bird e Facchini. 2001. Planta. 213: 888-97). Foi sugerido que a associação ao RE de BBE em plantas (Alcantara, e outros, 2005. Plant Physiol. 138: 173-83) proveja o pH básico ótimo (pH —8,8) para ativi- dade de BBE (Ziegler e Facchini. 2008. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 735-

69). Como um outro exemplo, há evidência que biossíntese de sangui- narina ocorra em vesículas especializadas dentro das células de plan- ta (Amann e outros, 1986. Planta. 167: 310-20), mas apenas alguns dos intermediários acumulam nas vesículas. Isso pode ocorrer de mo- do a sequestra-los de outras atividades de enzima e/ou efeitos tóxicos.

[00306] Como um outro exemplo, as enzimas biossintéticas na ra- mificação da via de morfina estão todas localizadas no floema, que é parte do tecido vascular em plantas. No floema, as enzimas da via po- dem ser divididas mais entre dois tipos de células: os elementos de peneira comuns a todas as plantas e os laticíferos que é um tipo de célula especializado presente apenas em certas plantas que fazem metabolitos secundários especializados. As enzimas a montante (isto é, de NCS até SalAT) estão predominantemente nos elementos de peneira, e as enzimas a jusante (isto é, TS6ODM, COR, CODM) estão principalmente no laticífero (Onoyovwe e outros, 2013. Plant Cell. 25: 4110-22). Adicionalmente, foi constatado que as etapas finais na via biossinte tica de noscapina acontecem no laticífero (Chen e Facchini. 2014, Plant J. 77: 173-84). Essa compartimentalização é pensada ser muito importante para regulagem de biossíntese através do isolamento ou tráfego de intermediários, provendo pH ótimo, aumentando o forne- cimento de cofatores, embora a natureza do microambiente laticífero de papoula ainda esteja sob investigação (Ziegler e Facchini. 2008. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 735-69). Ainda, é previsto que várias das enzimas possam funcionar como complexos de múltiplas enzimas ou canais metabólicos comuns para metabolismo de planta secundário (Kempe e outros, 2009. Phytochemistry. 70: 579-89; Allen, e outros,

2004. Nat. Biotechnol. 22: 1559-66). Quando enzimas biossintéticas são combinadas a partir de hospedeiros diferentes e/ou expressas re- combinantemente em uma célula de levedura heteróloga, não está cla- ro que esses complexos ou canais se formarão como se formariam no hospedeiro nativo. Em um exemplo adicional, em Coptis japonica, ber- berina é biossintetizada em tecidos de raiz e então acumulada dentro do rizoma através da ação de proteínas de transporte de cassete de ligação a ATP (Shitan e outros, 2013. Phytochemistry. 91: 109-16). Em papoula de ópio, alcaloides morfinano são acumulados dentro do látex (citoplasma de células de laticífero) (Martin e outros, 1967. Biochemis- try. 6: 2355-63).

[00307] Ainda, mesmo sem essas considerações, é também o caso que as enzimas de planta para várias das etapas nas vias de planta descritas aqui não foram ainda caracterizadas. Por exemplo, a conver- são de tirosina na base de alcaloide benzilisoquinolina inicial norco- claurina não foi ainda caracterizada. Portanto, para várias das etapas nas vias descritas aqui, esquemas biossintéticos alternativos foram produzidos ao reunir atividades de enzima que não ocorrem normal- mente juntas na natureza para a biossíntese de BIAs ou identificação de novas atividades de enzima a partir de informação de sequência de genoma para usar nas vias reconstruídas.

[00308] Por exemplo, a conversão de duas etapas de tirosina em dopamina pode ser obtida combinando pelo menos 5 enzimas de ma- mífero e 1 enzima bacteriana, que não ocorrem naturalmente juntas e não foram desenvolvidas para funcionar no contexto desta via ou com enzimas de planta. Nesses casos, pode não ser óbvio utilizar essas enzimas para a biossíntese de compostos elas não foram desenvolvi- das na natureza e que elas funcionariam efetivamente no contexto de um hospedeiro microbiano heterólogo e desta via.

[00309] Como um outro exemplo, até poucos anos a enzima res- ponsável pela conversão de (S)-reticulina em (R)-reticulina era desco- nhecida. Mesmo quando uma enzima epimerase fundida foi encontra- da, análise evolucionária sugeriu que papoulas produtoras de morfina desenvolveram uma enzima de fusão entre a oxidase e redutase para uma reação de epimerase, que estava em contraste com papoulas não produtoras de morfina onde as enzimas epimerases eram não fundi- das. Com base nessa análise, alguns estudiosos acreditaram que a fusão das porções oxidase e redutase era necessária para catalisar eficientemente a conversão de (S)-reticulina em (R)-reticulina. Méto- dos novos de uso de epimerases divididas engenheiradas como discu- tido aqui podem realizar essa reação de epimerização em levedura e no contexto de via de BIA sintética, e podem realizar essa epimeriza- ção com maior eficiência do que realizando uma epimerização com uma epimerase do tipo selvagem.

[00310] “Exemplos dos genes que são o objeto de modificações de modo a produzir BIA de interesse e/ou enzimas de interesse são dis- cutidos abaixo. Adicionalmente, os genes são discutidos no contexto de uma série de Figuras que ilustra vias que são usadas em geração de BIAs de interesse e/ou enzimas de interesse.

[00311] [TKL1] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima transcetolase. Transceto- lase é codificada pelo gene TKL1. Em exemplos, transcetolase catalisa a reação de frutose-6-fosfato + gliceraldeído-3-fosfato — xilulose-5- fosfato + eritrose-4-fosfato, como referido na FIG. 2. Uma célula hos- pedeira engenheirada pode ser modificada para incluir superexpressão constitutiva do gene TKL1 na célula hospedeira engenheirada. Adicio- nalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene TKL1 na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira modificada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias ou cópias adicionais do gene TKL1. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificara para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene TKL1 dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene TKL1 pode ser derivado de Saccharomyces cerevisiae ou uma outra espé- cie. Em alguns exemplos, o gene TKL1 pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00312] [ZWF1] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima glicose-6-fosfato de- sidrogenase. Glicose-6-fosfato desidrogenase é codificada pelo gene ZWF1. Em exemplos, glicose-6-fosfato desidrogenase catalisa a rea- ção de glicose-6-fosfato > 6-fosfogluconolactona, como referido na FIG. 2. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para deletar a região de codificação do gene ZWF1 na célula hospedeira engenheirada. Alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para desabilitar a funcionalidade do gene ZWF1, tal como através da introdução de uma mutação de inativação.

[00313] [ARO4] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima 3-desóxi-D-arabino- heptulosonato-7-fosfato (DAHP) sintase. DAHP sintase é codificada pelo gene ARO4. Em exemplos, DAHP sintase catalisa a reação de eritrose-4-fosfato + ácido fosfoenolpirúvico > DAHP, como referido na FIG. 2. Uma célula hospedeira engenheirada pode modificar o gene AROA4 para incorporar uma ou mais mutações de abrandamento de inibição de feedback. Em particular, uma mutação de abrandamento de inibição de feedback (por exemplo, ARO4F8R) pode ser incorporada como uma mutação direta a um gene ARO4 nativo no locus original; como uma cópia adicional introduzida como uma integração genética em um locus separado; ou como uma cópia adicional em um vetor epissomal tal como um plasmídeo 2 um ou centromérico. O identi- ficador "FBR" na mutação AROFER se refere a mutantes e mutações resistentes a feedback. A cópia com feedback inibido da enzima sin- tase DAHP pode estar sob uma regulagem transcripcional de levedura nativa, tal como quando a célula hospedeira engenheirada é uma célu-

la de levedura. Alternativamente, a cópia com com feedback inibido da enzima sintase DAHP pode ser introduzida na célula hospedeira en- genheirada com regulagem constitutiva ou dinâmica engenheirada de expressão de proteina pondo-a sob o controle de um promotor sintéti- co. Em alguns casos, o gene ARO4 pode ser derivado de Saccha- romyces cerevisiae. Em alguns casos, o gene RO4 pode ser 100% si- milar ao gene de ocorrência natural. Exemplos de modificações para o gene ARO4 incluem uma mutação resistente à inibição de feedback, K229L ou Q166K.

[00314] [ARO7] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima corismato mutase. Corismato mutase é codificada pelo gene ARO7. Em exemplos, coris- mato mutase catalisa a reação de corismato > prefenato, como referi- do na FIG. 2. Uma célula hospedeira engenheirada pode modificar o gene ARO7 para incorporar uma ou mais mutações de abrandamento de inibição de feedback. Em particular, uma mutação de abrandamen- to de inibição de feedback (por exemplo, AROFBR) pode ser incorpo- rada como uma mutação direcionada em um gene ARO7 nativo no lo- cus original; como uma cópia adicional introduzida como uma integra- ção genética em um /ocus separado; ou como uma cópia adicional em um vetor epissomal tal como um plasmídeo 2-um ou centromérico. O identificador "FBR" na mutação ARO7FBR se refere a mutantes e mu- tações resistentes a feedback. A cópia com feedback inibido da enzi- ma corismato mutase pode estar sob uma regulagem transcripcional de levedura natuva, tal como quando a célula hospedeira engenheira- da é uma célula de levedura. Alternativamente, a cópia com feedback inibido da enzima corismato mutase pode ser introduzida na célula hospedeira engenheirada com regulagem constitutiva ou dinâmica en- genheirada de expressão de proteína ao pô-la sob o controle de um promotor sintético. Em alguns casos, o gene ARO7 pode ser derivado de Saccharomyces cerevisiae. Em alguns casos, o gene ARO7 pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural. Exemplos de modifi- cações para o gene ARO7 incluem uma mutação resistente à inibição de feedback ou T226I.

[00315] [ARO10] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima fenilpiruvato descar- boxilase. Fenilpiruvato descarboxilase é codificada pelo gene ARO10. Em exemplos, fenilpiruvato descarboxilase catalisa a reação de hidro- xifenilpiruvato > 4-hidroxifenilacetato (4HPA), como referido na FIG. 2. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir superexpressão constitutiva do geen ARO10 na célula hospedeira en- genheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a ex- pressão do gene ARO10 na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias ou, cópias adicionais, do gene ARO10. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene ARO10 dentro da célu- la hospedeira engenheirada. O gene ARO10 pode ser derivado de Saccharomyces cerevisiae ou uma outra espécie. Em alguns exem- plos, o gene ARO10 pode ser 100% similar ao gene de ocorrência na- tural.

[00316] [ADH2-7, SFA1] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode modificar a expressão de enzimas álcool desidro- genase. Enzimas álcool desidrogenase podem ser codificadas por um ou mais dos genes ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7 e SFA1. Em exemplos, álcool desidrogenase catalisa a reação de 4HPA > tiro- sol. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para deletar a região de codificação de um ou mais dos genes ADH?2,

ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7 e SFA1 na célula hospedeira en- genheirada. Alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para desabilitar a funcionalidade de um ou mais dos genes ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7 e SFA1, tal como através da introdução de uma mutação de inativação.

[00317] [ALD2-6] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão de enzimas aldeído oxidase. En- zimas aldeído oxidase podem ser codificadas por um ou mais dos ge- nes ALD2, ALD3, ALDA4, ALD5 e ALD6. Em exemplos, aldeído oxidase catalisa a reação de 4 HPA > ácido hidroxifenilacético. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para deletar a região de codificação de um ou mais dos genes ALD2, ALD3, ALDA4, ALD5 e ALD6 na célula hospedeira engenheirada. Alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para desabilitar a funci- onalidade de um ou mais dos genes ALD2, ALD3, ALDA4, ALD5 e ALDSG6, tal como através da introdução de uma mutação de inativação.

[00318] [AAD4], [AADG6], [AAD10]], [AAD14], [AAD15], [AAD16] Em alguns exemplos, a célula hospedeira modificada pode modificar a expressão de enzimas aril-álcool desidrogenase. Enzimas aril-álcool desidrogenases podem ser codificadas por um ou mais de genes AADA4, AAD6, AAD10, AAD14, AAD15 e AAD16. Em exemplos, aril- álcool desidrogenase catalisa a reação de aldeído aromático + NAD* —> álcool aromatico + NADH.

[00319] [ARO9] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima aminotransferase aromática. Aminotransferase aromática é codificada pelo gene ARO9. Em exemplos, aminotransferase aromática catalisa a reação de hidro- xifenilpiruvato + L-alanina <— tirosina + piruvato, como referido na FIG.

2. Uma célula hospedeira modificada pode ser modificada para incluir superexpressão constitutiva do gene ARO9 na célula hospedeira en-

genheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a ex- pressão do gene ARO9 na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene ARO9. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene AROS9 dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene AROS9 pode ser derivado de Sac- charomyces cerevisiae ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene AROS pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00320] [ARO8] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima aminotransferase aromática. Aminotransferase aromática é codificada pelo gene AROB8. Em exemplos, aminotransferase aromática catalisa a reação de hidro- xifenilpiruvato + glutamato — tirosina + alfa-cetogluterato, como referi- do na FIG. 2. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modifica- da para incluir superexpressão constitutiva do gene ARO8 na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célu- la hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteti- camente a expressão do gene aRO8 na célula hospedeira engenhei- rada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modi- ficada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do ge- ne AROB8. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene AROB8 dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene AROB8 pode ser derivado de Saccharomyces cerevisiae ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene ARO8 pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00321] [TYR1] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima prefenato desidroge- nase. Prefenato desidrogenase é codificada pelo gene TYR1. Em exemplos, prefenato desidrogenase catalisa a reação de prefenato + NADP* > 4-hidroxifenilpiruvato + CO2 + NADPH, como referido na FIG. 2. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir superexpressão constitutiva do gene TYR1 na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedei- ra engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene TYR1 na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene TYR1. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene TYR1 dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene TYR1 pode ser derivado de Sac- charomyces cerevisiae ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene TYR1 pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00322] [TYR] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima tirosinase. Tirosinase é codificada pelo gene TYR. Em exemplos, tirosinases catalisam a rea- ção de tirosina — L-DOPA, como referido nas FIGURAS 2, 12 e 13. Em outros exemplos, tirosina catalisa a reação de L-DOPA > dopa- quinona. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene TYR na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedei- ra engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene TYR na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene TYR. Adi-

cionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene TYR dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene TYR pode ser derivado de Ralstonia solanacearum, Agaricus bisporus ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene TYR pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00323] [TyrH] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima tirosina hidroxilase. Tirosi- na hidroxilase é codificada pelo gene TyrH. Em exemplos, tirosina hi- droxilase catalisa a reação de tirosina > L-DOPA, como referido nas FIGURAS 2, 12 e 13. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do geen TyrH na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célu- la hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteti- camente a expressão do gene TyrH na célula hospedeira engenheira- da. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene TyrH. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um ele- mento promotor forte para a superexpressão do gene TyrH dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene TyrH pode ser derivado de Homo sapiens, Rattus norvegicus, Mus musculus ou uma outra espé- cie. Em alguns exemplos, o gene TyrH pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00324] [DODC] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima L-DOPA descarboxi- lase. L-DOPA descarboxilase é codificada pelo gene DODC. Em exemplos, L-DOPA descarboxilase catalisa a reação de L-DOPA > dopamina, como referido nas FIGURAS 2, 12 e 13. Uma célula hospe-

deira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão consti- tutiva do gene DODC na célula hospedeira engenheirada. Adicional- mente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene DODC na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene DODC. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene DODC dentro da célula hospedeira enge- nheirada. O gene DODC pode ser derivado de Pseudomonas putida, Rattus norvegicus ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene DODC pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00325] [TYDC] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima tirosina/DOPA des- carboxilase. Tirosina/DOPA descarboxilase é codificada pelo gene TYDC. Em exemplos, tirosina/DOPA descarboxilase catalisa a reação de L-DOPA > dopamina, como referido nas FIGURAS 2, 12 e 13. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene TYDC na célula hospedeira engenhei- rada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene TYDC na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene TYDC. Adicional- mente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene TYDC dentro da célula hospedei- ra engenheirada. O gene TYDC pode ser derivado de Papaver somni- ferum ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene TYDC pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00326] [MAO] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima monoamina oxidase. Mo- noamina oxidase é codificada pelo gene MAO. Em exemplos, monoa- mina oxidase catalisa a reação de dopamina > 3,4-DHPA, como refe- rido nas FIGURAS 2 e 13. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene MAO na cé- lula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sin- teticamente a expressão do gene MAO na célula hospedeira engenhei- rada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modi- ficada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do ge- ne MAO. Adicionamente ou alternativamente, a célula hospedeira en- genheira pode ser modificada para incorporar a introdução de um ele- mento promotor forte para a superexpressão do gene MAO dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene MAO pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisi- ae. O gene MAO pode ser derivado de Escherichia coli, Homo sapi- ens, Milcrococcus luteus ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene MAO pode ser 77% similar ao gene de ocorrência natural.

[00327] [NCS] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima norcoclaurina sintase. Norcoclaurina sintase é codificada pelo gene NCS. Em exemplos, nor- coclaurina sintase catalisa a reação de 4HPA + dopamina > (S)- norcoclaurina, como referido nas FIGURAS 12 e 13. Em particular, a FIG. 12 ilustra um esquema biossinte tico para conversão de L-tirosina em reticulina através de norcoclaurina, de acordo com modalidades da invenção. A FIG. 12 provê o uso das enzimas TyrH, tirosina hidroxila- se; DODC, DOPA descarboxilase; NCS; norcoclaurina sintase, como discutido aqui; 8OMT, 6-O-metiltransferase; CNMT, coclaurina N-metil-

transferase; CYP80B1, citocromo P450 80B1; CPR, citocromo P450 NADPH redutase; 4'OMT, 3'hidróxi-N-metilcoclaurina 4'-O-metiltrans- ferase. L-DOPA, L-3,4-di-hidroxifenilalanina; e 4-HPA, 4-hidroxifenila- cetilaldeído. Das enzimas que são ilustradas na FIG. 12, 4-HPA e L- tirosina são naturalmente sintetizadas em levedura. Todos os outros metabolitos listados não são produzidos naturalmente em levedura. Adicionalmente, embora TyrH possa catalisar a conversão de L-tiro- sina em L-DOPA, outras enzimas podem ser também usadas para rea- lizar essa etapa como descrito no relatório. Por exemplo, tirosinas po- dem ser também usadas para realizar a conversão de L-tirosina em L- DOPA. Ainda, outras enzimas tal como citocromo P450 oxidase po- dem ser também usadas para realizar a conversão de L-tirosina em L- DOPA. Tais enzimas podem exibir atividade de oxidase sobre compos- tos precursores de BIA relacionados incluindo L-DOPA e L-tirosina.

[00328] — Adicionalmente, norcoclaurina sintase catalisa a reação de 3,4-DHPA + dopamina > (S)-norlaudanosolina, como referido na FIG.

13. Em particular, a FIG. 13 ilustra um esquema biossintético para conversão de L-tirosina em reticulina através de norlaudanosolina, de acordo com modalidades da invenção. A FIG. 13 provê o uso de enzi- mas TyrH, tirosina hidroxilase; DODC, DOPA decarboxilase; maoA, monoamina oxidase; NCS, norcoclaurina sintase; GSOMT; 6-O-metil- transferase; CNMT, coclaurina, N-metiltransferase; 4' OMT, 3-hidróxi-N- metilcoclaurina 4'-O-metiltransferase. L-DOPA, L-3,4-di-hidroxifenilala- nina; e 3,4-DHPA, 3,4-di-hidroxifenilacetaldeído. Das enzimas que são ilustradas na FIG. 13, L-tirosina é naturalmente sintetizada em levedu- ra. Outros metabolitos que são mostrados na FIG. 13 não são produzi- dos naturalmente em levedura.

[00329] “Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene NCS na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedei-

ra engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene NCS na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada apode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene NCS. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene NCS dentro da célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente, a norcoclaurina sintase po- de ter uma truncamento N-terminal. Em alguns casos, o gene NCS pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces ce- revisiae. O gene NCS pode ser derivado de Coptis japonica, Papaver somniferum, Papver bracteatum, Thalicitum flavum, Corydalis saxicola ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene NCS pode ser 80% similar ao gene de ocorrência natural.

[00330] [60MT] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima norcoclaurina 6-O- metiltransferase. Norcoclaurina 6-O-metiltransferase é codificada pelo gene 6OMT. Em alguns exemplos, norcoclaurina 6-O-metiltransferase catalisa a reação de norcoclaurina > coclaurina, como referido na FIG.

12. Em outros exemplos, norcoclaurina 6-O-metiltransferase catalisa a reação de norlaudanosolina > 3'-hidroxicoclaurina, bem como outras reações detalhadas aqui, tais como aquelas providas na FIG. 13. Adi- cionalmente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene SOMT na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedei- ra engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene 6OMT na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene 6OMT. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene 6OMT dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene 6OMT pode ser derivado de P. somniferum, T. flavum, Coptis japonica ou uma outra espécie. Em al- guns exemplos, o gene 6OMT pode ser 100% similar ao gene de ocor- rência natural.

[00331] [CNMT] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima coclaurina-N- metiltransferase. Coclaurina-N-metiltransferase é codificada pelo gene CNMT. Em alguns exemplos, coclaurina-N-metiltransferase catalisa a reação de coclaurina > N-metilcoclaurina, como referido na FIG. 12. Em outros exemplos, a enzima coclaurina-N-metiltransferase pode ca- talisar a reação de 3'hidroxicoclaurina > 3'hidróxi-N-metilcoclaurina. Em outros exemplos, coclaurina-N-metiltransferase pode catalisar ou- tras reaçoes detalhadas aqui, tais como aquelas providas na FIG. 13. Adicionalmente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifica- da para incluir expresão constitutiva do gene CNMT na célula hospe- deira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hos- pedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene CNMT na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene CNMT. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene CNMT dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene CNMT pode ser derivado de P. somniferum, T. flavum, Coptis japonica ou uma outra espécie. Em al- guns exemplos, o gene CNMT pode ser 100% similar ao gene de ocor- rência natural.

[00332] [42'OMT] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge-

nheirada pode modificar a expressão da enzima 4'-O-metiltransferase. 4'-O-metiltransferase é codificada pelo gene 4º OMT. Em alguns exem- plos, 4'-O-metiltransferase catalisa a reação de 3'-hidróxi-N-metilcocla- urina > reticulina, como referido na FIG. 12. Em outros exemplos, 4- O-metiltransferase catalisa outras reações detalhadas aqui, tais como aquelas providas na FIG. 13. Adicionalmente, a célula hospedeira en- genheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene 4'OMT na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para regular sinteticamente a expressão do gene 4'OMT na célu- la hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene 4'OMT. Adicionalmente ou alternativamen- te, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incor- porar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpres- são do gene 4'OMT dentro da célula hospedeira engenheirada. O ge- ne 4' OMT pode ser derivado de P. somniferum, T. flavum, Coptis japo- nica ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene 4' OMT pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00333] [CYP80B1] Em alguns exemplos, a célula hospedeira en- genheirada pode modificar a expressão da enzima citocromo P450 80B1. Citocromo P450 80B1 é codificada pelo gene CYP80B1. Em exemplos, citocromo P450 80B1 catalisa a reação de N-metilcoclau- rina > 3'-hidróxi-N-metilcoclaurina, como referido na FIG. 12. Uma cé- lula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expres- são constitutiva do gene citocromo P450 80B1 na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedei- ra engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene citocromo P450 80B1 na “célula hospedeira enge- nheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene citocromo P450 80B1. Adicionalmente ou alternativamente, a cé- lula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene citocromo P450 80B1 dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene CYP80B1 pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae. O gene citocromo P450 80B1 pode ser derivado de P. somniferum, E. californica, T. flavum ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene P450 80B1 pode ser 77% similar ao gene de ocorrência natural.

[00334] [FOL2] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima GTP cicloidrolase. GTP cicloidrolase é codificada pelo gene FOL2. Em alguns exemplos, GTP cicloidrolase catalisa a reação de GTP > trifosfato de di- hidroneopteridina, como referido na FIG. 1. A célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incluir superexpressão constitutiva do gene FOL2 na célula hospedeira engenheirada. A célula hospedei- ra engenheirada pode ser também modificada para incluir regulagem nativa. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene FOL2 na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene FOL2. Adicionalmen- te ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor for- te para a superexpressão do gene FOL?2 dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene FOL2 pode ser derivado de Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens, Mus musculus ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene FOL2 pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00335] [PTPS] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima 6-piruvoil tetra- hidrobiopterina (PTP) sintase. Piruvoil tetra-hidrobiopterina sintase é codificada pelo gene PTPS. Em alguns exemplos, 6-piruvoil tetra- hidrobiopterina sintase catalisa a reação de trifosfato de di-hidrone- opterina > PTP, como referido na FIG. 1. A célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene PTPS na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para regular sinteticamente a expressão do gene PTPS na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene PTPS. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene PTPS dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns ca- sos, o gene PTPS pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae. O gene PTPS pode ser derivado de Rattus norvegicus, Homo sapiens, Mus musculus ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene PTPS pode ser 80% similar ao gene de ocor- rência natural.

[00336] [SepR] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima sepiapterina redutase. Sepiapterina redutase é codificada pelo gene SepR. Em alguns exem- plos, sepiapterina redutase catalisa a reação de PTP > BH, como referido na FIG. 1. A célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para incluir expressão constitutiva do gene SepR na célula hos- pedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sintetica- mente a expressão do gene SepR na célula hospedeira engenheirada.

Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene SepR. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um ele- mento promotor forte para a superexpressão do gene SepR dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene SepR pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisi- ae. O gene SepR pode ser derivado de Rattus norvegicus, Homo sapi- ens, Mus musculus ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o ge- ne SepR pode ser 72% similar ao gene de ocorrência natural.

[00337] [PCD] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima 4a-hidroxitetra-hidrobi- opterina (pterina-4a-carbinolamina) deidratase. 4a-hidroxitetra-hidrobi- opterina deidratase é codificada pelo gene PCD. Em alguns exemplos, 4a-hidroxitetra-hidrobiopterina deidratase catalisa a reação de 4a- hidroxitetra-hidrobiopterina > H2O + quinonoide di-hidropteridina, co- mo referido na FIG. 1. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene PCD na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célu- la hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteti- camente a expressão do gene PCD na célula hospedeira engenheira- da. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene PCD. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um ele- mento promotor forte para a superexpressão do gene PCD dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene PCD pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisi- ae. O PCD pode ser derivado de Rattus norvegicus, Homo sapiens, Mus musculus, ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene

PCD pode ser 79% similar ao gene de ocorrência natural.

[00338] [QDHPR] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima quinonoide di-hi- dropteridina redutase. Quinonoide di-hidropteridina redutase é codifi- cada pelo gene QDHPR. Em alguns exemplos, quinonoide di-hidropte- ridina redutase catalisa a reação de quinonoide di-hidropteridina > BH, como referido na FIG. 1. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene QDHPR na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene QDHPR na célula hospedeira en- genheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene QDHPR. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedei- ra engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene QDHPR dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene QDHPR pode ser otimizado no códon para expressão em Saccha- romyces cerevisiae. O gene SepR pode ser derivado de Rattus nor- vegicus, Homo sapiens, Mus musculus ou uma outra espécie. Em al- guns exemplos, o gene QDHPR pode ser 75% similar ao gene de ocorrência natural.

[00339] [DHFR] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima di-hidrofolato redu- tase. Di-hidrofolato redutase é codificada pelo gene DHFR. Em alguns exemplos, di-hidrofolato redutase catalisa a reação de 7,8-di-hidrobi- opterina (BH2) > 5,6,7,8-tetra-hidrobiopterina (BH4), como referido na FIG. 1. A reação pode ser útil na recuperação de BH, como um cos- substrato para a conversão de tirosina em L-DOPA, como ilustrado na FIG. 12. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene DHFR na célula hospedeira en- genheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a ex- pressão do gene DHFR na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene DHFR. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene DHFR dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene DHFR pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae. O gene DHFR pode ser derivado de Rattus norvegicus, Homo sapiens ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene DHFR pode ser 77% similar ao gene de ocorrência natural.

[00340] [DRS-DRR] Como discutido acima com relação à epimeri- zação de 1-BIAs, a célula hospedeira engenheirada pode modificar a expressão de uma BIA epimerase. A BIA epimerase é codificada pelo gene DRS-DRR. Em alguns exemplos, DRS-DRR pode ser também referido como CYP-COR. Em alguns exemplos, uma versão dividida, ou uma versão fundida engenheirada, de uma BIA epimerase catalisa a conversão de (S)-1-BIA > (R) 1-BIA, como referido na FIG. 14. Em particular, a FIG. 14 ilustra um esquema biossintético para conversão de L-tirosina em alcaloides morfinano, de acordo com modalidades da invenção. A FIG. 14 provê o uso das enzimas CPR, citocromo P450 redutase; DRS-DRR, deidrorreticulina sintase e deidrorreticulina redu- tase; SalSyn, salutaridina sintase; SalR, salutaridina redutase; SalAT, salutaridinol 7-O-acetiltransferase; TBODM, tebaína 6-O-desmetilase. COR, codeinona redutase; e CODM, codeina-O-desmetilase.

[00341] A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada pa- ra incluir expressão constitutiva do gene DRS-DRR engenheirado na célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene DRS-DRR engenheirado pode codificar uma epimerase de fusão engenheirada. Em alguns casos, o gene DRS-DRR engenheirado pode codificar uma epimerase dividida engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene DRS-DRR na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicio- nais, do gene DRS-DRR. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a intro- dução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene DRS-DRR dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene DRS- DRR pode ser derivado de Papaver bracteatum, Papaver somniferum, Papaver setigerum, Chelidonium majus ou uma outra espécie. Em al- guns exemplos, o gene DRS-DRR pode ser 77% similar ao gene de ocorrência natural.

[00342] [CPR] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima citocromo P450 redutase. A citocromo P450 redutase é codificada pelo gene CPR. Em alguns exemplos, a citocromo P450 redutase catalisa a reação de (R)- reticulina > salutaridina, como referido na FIG. 14. Adicionalmente, a citocromo P450 redutase catalisa outras reações tais como aquelas descritas nas FIGURAS por todo o pedido. A célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene CPR na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmetne ou al- ternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene CPR na célula hos- pedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheira- da pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene CPR. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a intro- dução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene CPR dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene CPR pode ser derivado de E. californica, P. somniferum, H. sapiens, S. cerevisiae, A. thaliana, ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene CPR po- de ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00343] [SalSyn] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima salutaridina sintase. À salutaridina sintase é codificada pelo gene SalSyn. Em alguns exem- plos, a salutaridina sintase catalisa a reação de (R)-reticulina > saluta- ridina, como referido na FIG. 14. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene Sal- Syn na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternati- vamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene SalSyn na célula hospe- deira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adi- cionais, do gene SalSyn. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a intro- dução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene SalSyn dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene SalSyn po- de ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevi- siae. Em alguns exemplos, o gene SalSyn pode ser modificado no terminal N. o gene SalSyn pode ser derivado de Papaver somniferum, Papaver spp, Chelidonium majus ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene SalSyn pode ser 78% similar ao gene de ocorrência natural.

[00344] [SalR] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima salutaridina redutase. À salutaridina redutase é codificada pelo gene SalR. Em alguns exem-

plos, a salutaridina redutase catalisa reversivelmente a reação de salu- taridinol > salutaridina, como referido na FIG. 14. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene SalR na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para regular sinteticamente a expressão do gene SalR na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene SalR. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene SalSyn dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene SalR pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces ce- revisiae. Em alguns exemplos, o gene SalSyn pode ser modificado no terminal N. O gene SalR pode ser derivado de Papaver somniferum, Papaver bracteatum, Papaver spp., Chelidonium majus ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene SalR pode ser 80-100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00345] [SalT] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima acetil-CoA-salutaridinol 7- O-acetiltransferase. Acetil-CoA:salutaridinol 7-O-acetiltransferase é codificada pelo gene SalAT. Em alguns exemplos, acetil-CoA:salutari- dinol 7-O-acetiltransferase catalisa a reação de acetil-CoA + salutaridi- nol > CoA + 7-O-acetilsalutaridinol, como referido na FIG. 14. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene SalAT na célula hospedeira engenheirada. Adici- onalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada po- de ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene SalAT na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene SalAT. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene SalAT dentro da célula hospedeira enge- nheirada. O gene SalAT pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae. O gene SalAT pode ser derivado de Papaver somniferum, Papaver bracteatum, Papaver orientale, Papaver Spp. ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene SalAT pode ser 77-80% similar ao gene de ocorrência natural.

[00346] [TS] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenheira- da pode modificar a expressão da enzima tebaína sintase. Tebaína sintase é codificada pelo gene TS. Em alguns exemplos, uma tebaína sintase ou uma tebaína sintase engenheirada catalisa a reação de 7- O-acetilsalutaridinol > tebaína + acetato, como referido na FIG. 14. Em alguns exemplos, a reação de 7-O-acetilsalutaridinol > tebaína + acetato ocorre espontaneamente, mas tebaína sintase catalisa alguma porção desta reação. Em particular, a FIG. 14 ilustra um esquema bi- ossintético para conversão de L-tirosina em alcaloides morfinano, de acordo com modalidades da invenção. A FIG. 14 provê o uso das en- zimas CPR, citocromo P450 redutase; DRS-DRR, deidrorreticulina sin- tase e deidrorreticulina redutase; SalSyn, salutaridina sintase; SalR, salutaridina redutase; SalAT, salutaridinol 7-O-acetiltransferase; TS, tebaína sintase; TGODM, tebaína 6-O-desmetilase; COR, codeinona redutase; e CODM, codeína-O-desmetilase.

[00347] A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada pa- ra incluir expressão constitutiva do gene TS ou o gene TS de engenha- ria na célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene TS engenheirado pode codificar uma enzima de fusão engenheirada. Adi- cionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene

TS na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospe- deira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene TS. Adicionalmente ou alternati- vamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a supe- rexpressão do gene TS dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene TS pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae. O gene TS pode ser derivado de Pa- paver somniferum, Papaver bracteatum, Papaver orientale, Papaver Spp. ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene TS pode ser 75-80% similar ao gene de ocorrência natural.

[00348] [T6ODM] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima tebaína 6-O- desmetilase. Tebaína 6-O-desmetilase é codificada pelo gene T6ODM. Em alguns exemplos, tebaína 6-O-desmetilase catalisa a reação de tebaína > neopinona, como referido na FIG. 14. Uma vez a neopinona tendo sido produzida, a neopinona pode ser convertida em codeinona. A conversão de neopinona > codeinona pode ocorrer espontanea- mente. Alternativamente, a conversão de neopinona > codeinona po- de ocorrer como um resultado de uma reação catalisada. Em outros exemplos, a enzima TSODM pode catalisar a O-desmetilação de subs- tratos que não tebaína. Por exemplo, T6ODM pode O-desmetilar ori- pavina para produzir morfinona. Alternativamente, T6ODM pode catali- sar a O-desmetilação de BIAs dentro das classes 1-benzilisoquinolina, protoberberina ou protopina tais como papaverina, canadina e alocrip- topina, respectivamente. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene T6ODM na cé- lula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sin- teticamente a expressão do gene T6ODM na célula hospedeira enge-

nheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene T6ODM. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedei- ra engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene T6ODM dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene T6ODM pode ser otimizado no códon para expressão em Saccha- romyces cerevisiae. O gene TSGODM pode ser derivado de Papaver somniferum ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene T6ODM pode ser 76,2% similar ao gene de ocorrência natural.

[00349] [COR] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima codeinona redutase. Co- deinona redutase é codificada pelo gene COR. Em alguns exemplos, codeinona redutase catalisa a reação de codeinona em codeína, como referido na FIG. 14. Em alguns casos, codeinona redutase pode catali- sar a reação de neopinona em neopina. Em outros exemplos, COR pode catalisar a redução de outros morfinanos incluindo hidrocodona > di-hidrocodeína, 14-hidroxicodeinona > hidroxicodeína e hidromor- fona > di-hdiromorfona. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene COR na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célu- la hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteti- camente a expressão do gene COR na célula hospedeira engenheira- da. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene COR. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um ele- mento promotor forte para a superexpressão do gene COR dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene COR pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisi-

ae. Adicionalmente ou alternativamente, o gene COR pode ser modifi- cado com a adição de sequências de direcionamento para mitocôn- dria, vacúolo, retículo endoplásmico ou uma combinação dos mesmos. O gene COR pode ser derivado de Papaver somniferum ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene COR pode ser 76,8%, 77,0%, 77,3% ou 77,7% similar ao gene de ocorrência natural.

[00350] [CODM] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima codeína O-desme- tilase. Codeína O-desmetilase é codificada pelo gene CODM. Em al- guns exemplos, codeína O-desmetilase catalisa a reação de codeína em morfina, como referido na FIG. 14. Codeína O-desmetilase pode também catalisar a reação de neopina em neomorfina. Codeína O- desmetilase pode também catalisar a reação e tebaína em oripavina. Em outros exemplos, CODM pode catalisar a O-desmetilação de BIAs dentro das classes 1-benzilisoquinolina, aporfina e protoberberina tais como reticulina, isocoridina e escoulerina, respectivamente. Em outros exemplos, a enzima CODM pode catalisar uma reação de O,O- desmetilenação para clivar as estruturas em ponte de metilenodióxi em protopinas. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada pa- ra incluir expressão constitutiva do gene CODM na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedei- ra engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene CODM na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene CODM. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene CODM dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene CODM pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae.

Adicionalmente ou alternativamente, o gene CODM pode ser modifica- do com a adição de sequências de direcionamento para mitocôndria. O gene CODM pode ser derivado de Papaver somniferum, Papaver Spp. ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene CODM pode ser 75,2% similar ao gene de ocorrência natural.

[00351] [BBE] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima em ponte berberina. A en- zima em ponte berberina é codificada pelo gene BBE. Em alguns exemplos, a enzima em ponte berberina catalisa a reação de (S)- reticulina > (S)-escoulerina. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene BBE na cé- lula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sin- teticamente a expressão do gene BBE na célula hospedeira engenhei- rada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modi- ficada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do ge- ne BBE. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira en- genheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene BBE dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene BBE pode ser derivado de Papaver somniferum, Argemone mexicana, Eschscholzia californica, Berberis stolonifera, Thalictrum flavum subsp. glaucum, Coptis japoni- ca,Papaver spp. ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene BBE pode ser 99% similar ao gene de ocorrência natural.

[00352] [CYP2D6] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão do citocromo P450, família 2, subfamília D, polipeptídeo 6. Esse citocromo P450 particular é codifi- cado pelo gene CYP2D6. Essa enzima citocromo P450 particular pode ser caracterizada como uma oxidase promíscua. Em alguns exemplos, essa enzima citocromo P450 particular pode catalisar a reação de (R)-

reticulina + NADPH + H* + O2 — salutaridina + NADP* + 2 H2O, dentre outras reações.

[00353] [S90MT] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima S-adenosil-L-metio- nina:(S)-escoulerina 9-O-metiltransferase. S-adenosil-L-metionina:(S)- escoulerina 9-O-metiltransferase é codificada pelo gene S9OMT. Em alguns exemplos, S-adenosil-L-metionina:(S)-escoulerina / 9-O-metil- transferase catalisa a reação de S-adenosil-L-metionina + (S)-escou- lerirca > S-adenosil-L-homocisteína + (S)-tetra-hidroclumbamina. À célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir ex- pressão constitutiva do gene S9OMT na célula hospedeira engenhei- rada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene S9OMT na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicioais, do gene S9OMT. Adicional- mente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene S9OMT dentro da célula hospe- deira engenheirada. Em alguns casos, o gene S9OMT pode ser otimi- zado no códon para expressão em Thalictrum flavum subsp. glaucum, Coptis japonica, Coptis chinensis, Papaver somniferum, Thalictrum Spp., Coptis spp., Papaver spp. ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene S9OMT pode ser 100% similar ao gene de ocorrên- cia natural. Em exemplos, o gene S9OMT pode ser 80% similar ao ge- ne de ocorrência natural.

[00354] [CAS] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima (S)-canadina sintase. (S)- canadina sintase é codificada pelo gene CAS. Em alguns exemplos, (S)-canadina sintase catalisa a reação de (S)-tetra-hidrocolumbamina

—> (S)-canadina. A célula hospedeira engenheirada pode ser modifica- da para expressar o gene CAS na célula hospedeira engenheirada. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir ex- pressão constitutiva do gene CAS na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene CAS na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hos- pedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene CAS. Adicionalmente ou alterna- tivamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a supe- rexpressão do gene CAS dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene CAS pode ser derivado de Thalictrum flavum subsp. glaucum, Coptis japonica, Thalictrum spp., Coptis spp. ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene CAS pode ser 100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00355] [STOX] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima (S)-tetra-hidroproto- berberina oxidase. (S)-tetra-hidroprotoberberina oxidase é codificada pelo gene STOX. Em alguns exemplos, (S)-tetra-hidroprotoberberina oxidase catalisa a reação de (S)-tetra-hidroberberina + 2 Or > berbe- rina + 2 H2O>2. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene STOX na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedei- ra engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene STOX na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene STOX. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene STOX dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene STOX pode ser modificado no terminal N. Em alguns casos, o gene STOX pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae. O gene STOX pode ser derivado de Berberis wilsonae, Coptis japonica, Berberis spp., Coptis spp. ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene STOX pode ser 78% similar ao gene de ocorrência natural.

[00356] [TNMT] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima tetra-hidroprotober- berina-N-metiltransferase. Tetra-hidroprotoberberina-N-metiltransfera- se é codificada pelo gene TNMT. Em alguns exemplos, tetra-hidropro- toberberina-N-metiltransferase catalisa a reação de canadina > N- metilcanadina.

[00357] Em outros exemplos, tetra-hidroprotoberberina-N-metil- transferase catalisa a reação de estilopina > cis-N-metiestilopina. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir ex- pressão constitutiva do gene TNMT na célula hospedeira engenheira- da. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenhei- rada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene TNMT na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célu- la hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene TNMT. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene TNMT dentro da célula hospedeira enge- nheirada. Em alguns casos, o gene TNMT pode ser modificado no terminal N. Em alguns casos, o gene STOX pode ser otimizado no có- don para expressão em Saccharomyces cerevisiae. O gene TNMT po- de ser derivado de Papaver somniferum, Eschscholzia californica, Pa- paver bracteatum, Argemone mexicana ou uma outra espécie. Em al-

guns exemplos, o gene TNMT pode ser 100% similar ao gene de ocor- rência natural. Em exemplos, o gene TNMT pode ser 81% similar ao gene de ocorrência natural.

[00358] [CFS] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima queilantifolina sintase. Queilantifolina sintase é codificada pelo gene CFS. Em exemplos, queilantifolina sintase catalisa a reação de escoulerina > queilantifoli- na. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene CFS na célula hospedeira enge- nheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira en- genheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expres- são do gene CFS na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene CFS. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modi- ficada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte pa- ra a superexpressão do gene CFS dentro da célula hospedeira enge- nheirada. O gene STOX pode ser derivado de P. somniferum, E. cali- fornica, A. mexicana ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene CFS pode ser 77%, 78% ou 79% similar ao gene de ocorrência natural. Adicionalmente, o gene CFS pode ser otimizado no códon pa- ra expressão em Saccharomyces cerevisiae.

[00359] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode modificar a expressão da enzima estilopina sintase. Estilopina sintase é codificada pelo gene STS. Em exemplos, a estilopina sintase catalisa a reação de queilantifolina > estilopina. Uma célula hospedei- ra modificada pode incluir expressão constitutiva do gene STS na célu- la hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sin- teticamente a expressão do gene STS na célula hospedeira engenhei-

rada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modi- ficada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do ge- ne STS. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira en- genheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene STS dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene STS pode ser derivado de P. somniferum, E. californica, A. mexicana ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene STS pode ser 76%, 78% ou 79% similar ao gene de ocorrência natural. Adicionalmente, o gene STS pode ser oti- mizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae.

[00360] [STS] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima estilopina sintase. Estilo- pina sintase é codificada pelo gene STS. Em exemplos, a estilopina sintase catalisa a reação de queilantifolina > estilopina, dentre outras reações. Uma célula hospedeira modificada pode incluir expressão constitutiva do gene STS na célula hospedeira engenheirada. Adicio- nalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene STS na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene STS. Adicionalmente ou alternativamen- te, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incor- porar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpres- são do gene STS dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene STS pode ser derivado de P. somniferum, E. californica, A. mexicana ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene STS pode ser 76%, 78% ou 79% similar ao gene de ocorrência natural. Adicional- mente, o gene STS pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae.

[00361] [MSH] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei-

rada pode modificar a expressão da enzima cis-N-metilestilopina 14- hidroxilase. Cis-N-metilestilopina 14-hidroxilase é codificada pelo gene MSH. Em exemplos, cis-N-metilestilopina 14-hidroxilase catalisa a rea- ção de cis-N-metilestilopina > protopina. Uma célula hospedeira modi- ficada pode incluir expressão constitutiva do gene MSH na célula hos- pedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sintetica- mente a expressão do gene MSH na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene MSH. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um ele- mento promotor forte para a superexpressão do gene MSH dentro da célula hospedeira engenheirada. O gene MSH pode ser derivado de P. somniferum ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene MSH pode ser 79% similar ao gene de ocorrência natural. Adicionalmente, o gene MSH pode ser otimizado no códon para expressão em Saccha- romyces cerevisiae.

[00362] [P6H] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima protopina-6-hidroxilase. Protopina-6-hidroxilase é codificada pelo gene P6H. Em exemplos, protopina-6-hidroxilase catalisa a reação de Protopina > 6-hidroxipro- topina. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene P6H na célula hospedeira enge- nheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira en- genheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expres- são do gene P6H na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene P6H. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modi-

ficada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte pa- ra a superexpressão do gene P6H dentro da célula hospedeira enge- nheirada. O gene P6H pode ser derivado de P. somniferum, E. califor- nica ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene P6H pode ser 79% similar ao gene de ocorrência natural. Adicionalmente, o gene P6H pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae.

[00363] [DBOX] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima di-hidrobenzofe- nantridina oxidase. Di-hidrobenzofenantridina oxidase é codificada pe- lo gene DBOX. Em exemplos, a di-hidrobenzofenantridina oxidase ca- talisa a reação de di-hidrosanguinarina > sanguinarina. Uma célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene DBOX na célula hospedeira engenheirada. Adici- onalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada po- de ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene DBOX na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene DBOX. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene DBOX dentro da célula hospedeira enge- nheirada. O gene DBOX pode ser derivado de P. somniferum ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene DBOX pode ser 100% si- milar ao gene de ocorrência natural. Adicionalmente, o gene DBOX pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces ce- revisiae.

[00364] [morA] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima morfina desidroge- nase. Morfina desidrogenase é codificada pelo gene morA. Em alguns exemplos, morfina desidrogenase catalisa a reação de morfina > mor- fina, como referido na FIG. 15. Em outros exemplos, morfina desidro- genase catalisa a reação de codeinona > codeína, também como re- ferido na Figura 15. A Figura 15 ilustra um esquema biossintético para produção de opioides semissintéticos, de acordo com modalidades da invenção. Em particular, a Figura 15 ilustra transformações estendidas de tebaína em levedura através da incorporação de morA, morfina de- sidrogenase; e morB, morfina redutase.

[00365] A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada pa- ra incluir expressão constitutiva do gene morA na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedei- ra engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene morA na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene morA. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene morA dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene morA pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae. O gene morA pode ser derivado de Pseudomonas putida ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene morA pode ser 73,7% similar ao gene de ocorrência natural.

[00366] [morB] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima morfina redutase. Morfina redutase é codificada pelo gene morB. Em alguns exemplos, morfina redutase catalisa a reação de codeinona > hidrocodona, co- mo referido na Figura 15. Em outros exemplos, morfina redutase cata- lisa a reação de morfina > hidromorfona, também como referiod na Figura 15. Em outros exemplos, morfina redutase catalisa a reação 14-

hidroxicodeinona > oxicodona. A célula hospedeira engenheirada po- de ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene morB na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene morB na célula hospedeira enge- nheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene morB. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene morB dentro da célula hospedeira engenheirada. Em alguns casos, o gene morB pode ser otimizado no códon para expressão em Saccharomyces ce- revisiae. O gene morB pode ser derivado de Pseudomonas putida ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene morB pode ser 67,2% similar ao gene de ocorrência natural.

[00367] [CYP80A1] Em alguns exemplos, a célula hospedeira en- genheirada pode expressar a enzima berbamunina sintase. Berbamu- nina sintase é codificada pelo gene para enzima citocromo P450 80A1 (CYP80A1). Em alguns exemplos, CYP80A1 catalisa a reação (S)-N- metilcoclaurina + (R)-N-metilcoclaurina > berbamunina, como referido na Figura 17. Em outros exemplos, CYP80A1 catalisa a reação (R)-N- metilcoclaurina + (R)-N-metilcoclaurina > guategaumerina, como refe- rido na Figura 17. Em outros exemplos, CYP80A1 catalisa a reação (R)-N-metilcoclaurina + (S)-coclaurina > 2'norberbamurina. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constitutiva do gene CYP80A1 na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene CYP80A1 na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene CYP80A1. Adicionalmen- te ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor for- te para a superexpressão do gene CYP80A1 dentro da célula hospe- deira engenheirada. Em alguns casos, o gene CYP80A1 pode ser oti- mizado no códon para expressão em Saccharomyces cerevisiae. O gene CYP80A1 pode ser derivado de Berberis stolonifera ou uma ou- tra espécie. Em alguns exemplos, o gene CYP80A1 pode ser 76% si- milar ao gene de ocorrência natural.

[00368] [PODA] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode expressar a enzima protopina O-desalquilase. Protopi- na O-desalquilase é codificada pelo gene PODA. Em alguns exemplos, PODA catalisa a O, O-desmetilação de protoberberinas e protopina tais como canadina, estilopina, berberina, criptopina, alocriptopina e proto- pina. Em alguns exemplos, PODA catalisa a O-desmetilação de BIA incluindo tetra-hidropapaverina, tetra-hidropalmatina e criptopina. A célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incluir ex- pressão constitutiva do gene PODA na célula hospedeira engenheira- da. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenhei- rada pode ser modificada para regular sinteticamente a expressão do gene PODA na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célu- la hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene PODA. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modifi- cada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene PODA dentro da célula hospedeira enge- nheirada. Em alguns casos, o gene PODA pode ser otimizado no có- don para expressão em Saccharomyces cerevisiae. O gene PODA po- de ser derivado de Papaver somniferum ou uma outra espécie. Em alguns exemplos, o gene PODA pode ser 70-100% similar ao gene de ocorrência natural.

[00369] [RNMT] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima Reticulina N-metil- transferase. Reticulina N-metiltransferase é codificada pelo gene RNMT. Em alguns exemplos, Reticulina N-metiltransferase pode cata- lisar reações tal como reticulina — tembetarina, dentre outras reações.

[00370] [P7OMT] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima Papaverina 7-O- desmetilase. Papaverina 7-O-desmetilase é codificada pelo gene P7OMT. Em alguns exemplos, Papaverina 7-O-desmetilase pode cata- lisar reações tal como papaverina—pacodina, dentre outras reações.

[00371] [3ODM] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima 3-O-desmetilase. 3-O- desmetilase é codificada pelo gene 32O0DM. Em alguns exemplos, 3-O- desmetilase pode catalisar reações tais como oxicodona—oximorfona; hidrocodona—hidromorfona; di-hidrocodeína—di-hidromorfina; 14-hi- droxicodeína— 14-hidroximorfina; codeinona—-morfinona; e 14-hidroxi- codeinona—14-hidroximorfinona, dentre outras reações.

[00372] [NDM] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima N-desmetilase. N-des- metilase é codificada pelo gene NDM. Em alguns exemplos, N-des- metilase pode catalisar reações tais como Codeina—Norcodeína; Mor- fina-Normorfina; Oxicodona—Noroxicodona; Oximorfona—Noroxi- morfona; Tebaina—Nortebaína; Oripavine—-Nororipavina; Hidrocodo- na—-Nor-hidrocodona; Hidromorfona—Norhidromorfona; Di-hidrocodeí- na—-Nordi-hidrocodeína; Di-hidromorfina—Nordi-hidromorfina; 14-hi- droxicodeína—Nor-14-hidroxicodeína; — 14-hidroximorfina—Nor-14-hi- droximorfina; Codeinona—Norcodeinona; Morfinona—Normorfina; 14- hidroxicodeinona—Nor-14-hidroxicodeinona; e 14-hidroximorfinona> Nor-14-hidroximorfinona, dentre outras reações.

[00373] [NMT] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima N-metiltransferase. N- metiltransferase é codificada pelo gene NMT. Em alguns exemplos, N- metiltransferase pode catalisar reações, tais como Norcodeína— code- ína; Normorfina-morfina; Noroxicodona—oxicodona; Noroximorfo- na—>noroximorfona; Nortebaina-tebaína; Nororipavina—oripavine; Nor-hidrocodona—hidrocodona; — Norhidromorfona> . Hidromorfona; Nordi-hidrocodeína> Di-hidrocodeína; Nordi-hidromorfina> Di-hidro- morfina; Nor-14-hidroxicodeína» 14-hidroxicodeína; Nor-14-hidroxi- morfina> 14-hidroximorfina; Norcodeinona> Codeinona; Normorfi- na> Morfinona; Nor-14-hidroxi-codeinona> 14-hidroxicodeinona; Nor- 14-hidroxi-morfinona— 14-hidroximorfinona.

[00374] [NAT] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode modificar a expressão da enzima N-aliltransferase. N- aliltransferase é codificada pelo gene NAT. Em alguns exemplos, N- aliltransferase pode catalisar reações tais como Norcodeína—N-alil- norcodeína; Normorfina—N-alil-normorfina; Noroxicodona—N-alil-noro- xicodona; Noroximorfona—HN-alil-nornoroximorfona; Nortebaína>-N- alil-nortebaína; Nororipavina—|N-alil-nororipavina; Nor-hidrocodona> N-alil-nor-hidrocodona; Nor-hidromorfona>y N-alil-nor-hidromorfona; Nordi-hidrocodeína> N-alil-nordi-hidrocodeína; Nordi-hidromorfina> N-alil-nordi-hidromorfina; Nor-14-hidroxicodeína» N-alil-nor-14-hidro- xicodeína; Nor-14-hidroximorfina> N-alil-nor-14-hidroximorfina; Nor- codeinona— N-alil-norcodeinona; Normorfina> N-alil-normorfina; Nor- 14-hidroxi-codeinona— N-alil-nor-14-hidroxicodeinona; Nor-14-hidroxi- morfinona— N-alil-nor-14-hidroximorfinona, dentre outras reações.

[00375] [CPMT] Em alguns exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode modificar a expressão da enzima N-ciclopropilmetil- transferase. N-ciclopropilmetiltransferase é codificada pelo gene CPMT. Em alguns exemplos, N-ciclopropilmetiltransferase pode catali-

sador reações tais como Norcodeína—Ní(ciclopropilmetil)norcodeína; Normorfina—N(ciclopropilmetil)normorfina; Noroxicodona—Ní(ciclopro- pilmetil)noroxicodona; Noroximorfona—N(ciclopropilmetil)nornoroxi- morfona; Nortebaína—N(ciclopropilmetil)nortebaína; Nororipavina> N(ciclopropilmetil)nororipavina; — Nor-hidrocodona—Ní(ciclopropilmetil) nor-hidrocodona; Nor-hidromorfona» N(ciclopropilmetil)nor-hidromor- fona; Nor-di-hidrocodeína»> — N(ciclopropilmetil)nor-di-hidrocodeína; Nor-di-hidromorfina> Ní(ciclopropilmetil)nor-di-hidromorfina; Nor-14- hidroxicodeína» N(ciclopropilmetil)nor-14-hidroxicodeína; Nor-14-hi- droximorfina»> Ní(ciclopropilmetil)nor-14-hidroximorfina; Norcodeino- na N(ciclopropilmetil)norcodeinona; Normorfina— Ní(ciclopropilmetil) normorfina; Nor-14-hidroxi-codeinona—> N(ciclopropilmetil)nor-14-hidro- xicodeinona; e Nor-14-hidroxi-morfinona» Ní(ciclopropilmetil)nor-14- hidroximorfinona, dentre outras reações.

[00376] [BM3] Em alguns exemplos, a célula hospedeira engenhei- rada pode expressar a enzima BM3. BM3 é uma citocromo P450 de Bacillus megaterium envolvida em mono-oxigenação de ácido graxo em seu hospedeiro nativo. Em alguns casos, BM3 N-desmetila um opioide para produzir um nor-opioide, como referido na Figura 9. Em alguns casos, a célula hospedeira é modificada para expressar BM3 em adição a outras enzimas heterólogas para a produção de um nal- opioide ou nor-opioide, como referido na Figura 10. A célula hospedei- ra engenheirada pode ser modificada para incluir expressão constituti- va do gene BM3 na célula hospedeira engenheirada. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modi- ficada para regular sinteticamente a expressão do gene BM3 na célula hospedeira engenheirada. Em exemplos, a célula hospedeira enge- nheirada pode ser modificada para incorporar uma cópia, cópias, ou cópias adicionais, do gene BM3. Adicionalmente ou alternativamente, a célula hospedeira engenheirada pode ser modificada para incorporar a introdução de um elemento promotor forte para a superexpressão do gene BM3 dentro da célula hospedeira engenheirada. BM3 tem várias vantagens como uma enzima biossintética incluindo que é insolúvel, vem com uma proteína companheira redutase fundida e pode ser prontamente engenheirado para aceitar novos substratos. Adicional- mente, a Tabela 7 ilustra variantes de BM3 N-desmetilase.

[00377] Exemplos dos genes mencionados acima pode ser expres- sa a partir de várias plataformas diferentes na célula hospedeira, inclu- indo plasmídeo (21, ARS/CEN), YAC ou genoma. Ainda, exemplos das sequências de gene mencionadas acima podem ser ou nativos ou oti- mizados no códon para expressão no hospedeiro heterólogo desejado (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae).

[00378] EXEMPLOS

[00379] Os exemplos que seguem são dados para o propósito de ilustração das várias modalidades da invenção e não pretendem limitar a invenção de modo algum. Onde indicado, construtos de expressão são compreendidos incorporar um promotor, gene e terminado ade- quado, mesmo se a sequência terminadora exata usada não for espe- cificada. Os presentes exemplos, junto com os métodos descritos aqui, são aqui representativos de modalidades preferidas, são exemplares, e não pretendem ser limitações do escopo da invenção. Mudanças ne- les e outros usos que são compreendidos no espírito da invenção co- mo definido pelo escopo das reivindicações ocorrerão àqueles versa- dos na técnica.

[00380] Exemplo 1. Atividade intracelular de DRS e DRR separa- damente expressos é substancialmente maior do que a enzima fundi- da, parental

[00381] A sequência de aminoácido de DRS-DRR de P. bracteatum (Farrow e outros, 2015; GenBank: AKO60179.1) foi otimizada no có- don (vide, por exemplo, SEQ ID NO: 16) para expressão em S. cerevi-

siae (algoritmo de otimização de códon da IDT) e clonada em vetores com resistências de promotor diferentes para permitir engenharia da proteína e melhoria da enzima. Os plasmídeos resultantes, pDW10 e pPDW38 (vide Figura 11), carregavam DSR-DRR sob controle do promo- tor TDH3 de S. cerevisiae para expressão forte e o promotor CYC1 para expressão fraca, respectivamente, e esses foram usados como construtos de linha basal para futuros esforços de engenharia de en- zima. A cepa de avaliação nesse exemplo foi um derivado de YA106, uma cepa Cen.PK de S. cerevisiae engenheirada expressando enzi- mas na via de BIA até, mas não incluindo DRS-DRR. Devido a limita- ções na diferenciação de alto rendimento de (S)-versus (R)-reticulina usando métodos LCMS, uma cepa expressando P. bracteatum SalSyn em níveis altos foi construída para avaliar enzimas DRS-DRR melho- radas com base na quantidade de salutaridina produzida. Atividade de SalSyn foi determinada empiricamente ser substancialmente maior do que atividade de DRS-DRR baseada em plasmídeo, o que permitiu que aumentos na conversão de (S)- em (R)-reticulina fossem detecta- dos pela quantidade de salutaridina produzida. Desse modo, melhorias em DRS-DRR (ou DRS sozinho) através de engenharia de proteína foram medidas através da concentração relativa de salutaridina no meio de cultura. Para assegurar que plasmídeos não integraram ao cromossomo quando da transformação na cepa de avaliação, o locus TRP1 foi inativado através da integração de URA3 para prover DW24, a cepa repórter usada neste e em exemplos subsequentes.

[00382] Para propagação de cepas de levedura carregando enzi- mas DRS-DRR engenheiradas (ou DRS e DRR) separadas, a cepa repórter foi transformada com plasmídeos de expressão usando técni- cas de biologia molecular padrão, e colônias simples de levedura fo- ram isoladas de placas de meio de ágar sólido sob condições seletivas (tal como dextrose 2% completa sintética sem triptofano). As colônias foram inoculadas em meio de cultura líquido e cultivadas por 2 dias a 30ºC. As culturas foram então subculturadas em meio fresco da mes- ma composição, ou em alguns casos em meio líquido completo sintéti- co contendo 8% de maltodextrina. Para liberar monossacarídeo do po- límero de maltodextrina, amiloglucosidase de A. niger (Sigma) foi adi- cionada em uma concentração de aproximadamente 3 U/L. Cepas de levedura foram cultivadas por mais 3 ou 4 dias a 30ºC, as culturas fo- ram separadas através de centrifugação e concentração de salutaridi- na foi medida diretamente no sobrenadante através de LC-MS. Plasmídeos e Cepas YA1I06 S. cerevisiae Cen.PK, via de BIA = NCS, CNMT, 6OMT, Ea outros, 2015) YA5S1I1 S. cerevisiae Cen.PK, via de BIA = NCS, CNMT, 6OMT, CYP80B1, CPR, 4OMT, DRR, SalSyn, SalR, SalAT (genótipo o EEE

[00383] Diferente das plantas de papoula de produção de alcaloide morfinano, que provavelmente têm tipos de célula altamente especiali- zadas para a síntese de metabolitos diferentes na via de BIA (Ono- yovwe e outros, 2013), S. cerevisiae tem apenas um único tipo de cé- lula, e a produção heteróloga de compostos valiosos a partir dessa via requer que todas as enzimas, cofatores e maquinário celular funcio- nem juntos na mesma célula. Para examinar como as atividades codi-

ficadas na enzima de fusão do tipo selvagem DRS-DRR funcionam como enzimas separadas em um sistema heterólogo tal como levedu- ra, os domínios de citocromo P450 (DRS) e a aldo-ceto redutase (DRR) da enzima fundida foram divididos em duas enzimas separadas e expressos sob promotores diferentes. Usando pDW18 como um mo- delo, o domínio deidrorreticulina sintase (DRS) e o domínio deidrorreti- culina redutase (DRR) de DRS-DRR foram clonados separadamente sob os promotores CYC1 e TEF1 para prover plasmídeo pDW21, usando técnicas de biologia molecular padrão. O plasmídeo pDW21 e o plasmídeo controle carregando a enzima DRS-DRR fundida parental (PDW18) foram separadamente transformados na cepa repórter. As células foram culturadas e produção de salutaridina foi medida direta- mente no sobrenadante através de análise LC-MS. A Figura 18 mostra que em transformantes independentes, os níveis de salutaridina (bar- ras cinzas) produzida a partir de transformantes carregando pDW21 são quase 4 vezes maiores do que aqueles de transformantes carre- gando o pDW18 controle. As cepas carregando pDW21 exibem ainda uma redução modesta em reticulina total (ambos S- e R-), e substan- cialmente menos deidrorreticulina, em comparação com o controle.

[00384] Exemplo 2. Níveis de BIA totais são aumentados em cepas expressando DRS e DRR separadamente em comparação com a en- zima fundida, parental

[00385] Análise LC-MS detalhada foi realizada para examinar ao efeito da expressão independente de enzimas DRS e DRR derivadas de DRS-DRR sobre os níveis de intermediários de via de BIA múlti- plos. Para detecção de intermediário de BIA, um plasmídeo carregan- do a enzima DRS separada de DRS-DRR sob o controle do promotor TDH3 e a enzima DRR separada sob o controle do promotor TEF1 (pJL29) foi construído para comparação com a enzima fundida, paren- tal, expressa a partir do plasmídeo pDW10. Com base na resistência do promotor, esse plasmídeo provê a aproximação maior de expres- são equivalente entre as enzimas separadas e fundidas. Os plasmí- deos foram separadamente transformados na cepa repórter de S. ce- revisiae descrita no Exemplo 1. As cepas foram culturadas como des- crito no Exemplo 1 e metabolitos de BIA foram medidos diretamente no sobrenadante através de análise LC-MS. Como é mostrado na Fi- gura 19, os níveis de quase todos os intermediários de via de BIA são aumentados na cepa de levedura carregando pJL29 em comparação com a cepa carregando o plasmídeo controle pDW10. Intermediários da via a montante, em particular coclaurina e N-metil-coclaurina, foram aumentados na cepa expressando as enzimas DRS e DRR separadas em relação à cepa expressando a enzima DRS-DRR fundida, que indi- ca capacidade de via total maior em células que expressam DRS e DRR separadamente. Os níveis de reticulina nesse experimento foram aproximadamente iguais, embora o Exemplo 3 indique que a maioria da reticulina nesse experimento estava provável na configuração R. É possível que a conversão eficiente de S- em R-reticulina, e conversão subsequente em salutaridina, permita que enzimas a montante funcio- nam melhor devido à inibição de produto diminuída (a partir de S- reticulina, por exemplo) de sua atividade. Similar aos resultados mos- trados na Figura 18, células expressando enzimas DRS e DRR sepa- radas produziram quantidades maiores de salutaridina em comparação com células expressando a enzima DRS-DRR parental.

Exemplo 3. Separação Quiral — Cepas expressando DRS e DRR pro- duzem separadamente substancialmente mais R-reticulina do que a enzima fundida, parental

[00386] Duas cepas de vias de BIA de levedura, derivadas de YA106 descrita no Exemplo 1, expressando ou as enzimas DRS-DRR fundidas, parentais, ou DRS e DRR separadas, foram analisadas quanto à sua habilidade em produzir S- e R-reticulina. Reticulina foi concentrada a partir de meio de levedura através de peletização de 12,5 mL de cultura de levedura e adição de 30 mg de resina XAD-4 por mL de sobrenadante, incubando em um rotor de um dia para o ou- tro em temperatura ambiente e eluindo com 100 uL de metanol por mL de sobrenadante. As amostras foram secas e ressuspensas em 100 uL de água. As amostras foram fracionadas através de HPLC de fase reversa (Pursuit XRs-C18, 50 mm x 10 mm, 5 um) com metanol 15% isocrático.

[00387] As frações foram agrupadas, secas e ressuspensas em isopropanol. As amostras foram separadas em uma coluna quiral (Phenomenex Lux celulose — 1, 150 mm x 2 mm, 3 um) com N-hexano 72% isocrático, isopropanol 28%, dietilamina 0,1% com uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min e detecção por MS foi realizada com um espec- trômetro de massa Agilent 6320 lon Trap. O tempo de retenção de pi- cos de reticulina foi comparado com aquele de padrões de (S)- reticulina e (R)-reticulina autênticos. A cepa que expressou enzimas DRS e DRR separadas produziu mais de 87% de reticulina total como (R)-reticulina, enquanto a cepa que expressou a enzima parental, fun- dida, produziu aproximadamente 50% de cada estereoisômero como mostrado na Figura 20. Exemplo 4. Construção e análise de um modelo estrutural de DRS

[00388] Para compreender melhor como a enzima DRS separada se dobra e se comporta mecanisticamente, e construir uma estrutura principal para esforços de engenharia de proteína, modelos de homo- logia estrutural de DRS foram construídos usando o algoritmo SWISS- MODEL livremente disponível (https://swissmodel.expasy.org/). Dois modelos estruturais, baseados em enzimas CYP17 diferentes (PDBs A4NKX e 4R20), foram construídos e analisados em detalhes. Os mode- los estruturais baseados nesses dois CYPs diferentes eram compatibi- lidades quase idênticas um com o outro, indicando homologia estrutu-

ral ampla entre esses tipos de moléculas de citocromo P450. Ainda, ambos os modelos mapearam o motivo EXXR conservado e resíduo cisteína C-terminal (comum para todos P450s) de DRS no local idênti- co na estrutura parental, sugerindo que as estruturas de núcleo dessas moléculas são similares. As FIGS. 22 e 23 mostram o modelo estrutu- ral de DRS com base em 4NKX. O domínio âncora ER N-terminal resi- dual pode ser visto na parte inferior esquerda da figura, bem como a localização aproximada da região de ligação heme (modelada a partir de 4R20), que é próximo do sítio ativo da enzima. A face do modelo mostrado é a região de ligação geral proposta para citocromo P450 redutase (CPR) onde transferência de elétron ocorre, e o lado traseiro do modelo como mostrado nas FIGs. 22 e 23 é proposto ser próximo à membrana microssomal. O modelo de homologia de DRS permite que papéis funcionais potenciais sejam atribuídos a quaisquer melhorias de engenharia de proteína, com base na posição de resíduos e nas mudanças de aminoácido que são identificadas.

Exemplo 5. Atividade de DRS intracelular é limitante de taxa em com- paração com atividade de DRR

[00389] Experimentos adicionais foram realizados na expressão se- parada de enzimas DRS e DRR para determinar qual atividade era li- mitante em uma célula heteróloga. Para compreender melhor qual ati- vidade de enzima, aquela ou de DRS ou DRR, era limitante de taxa, uma série de vetores expressando ambas as enzimas sob resistências de promotor diferentes foi construída. Usando pDW21 como um cons- truto parental, o promotor TDH3, que é mais forte do que o promotor TEF1 original, foi inserido e usado para acionar a expressão de DRR, resultando em plasmídeo pJL32. Também usando pDW21 como um construto parental, o promotor TDH3 foi inserido e usado para acionar DRS, resultando em plasmídeo pJL29. Usando pJL29 como um cons- truto parental, o promotor CYC1, que é substancialmente mais fraco do que TEF1, foi inserido e usado para acionar DRR, resultando em plasmídeo pJL35. Esses plasmídeos foram separadamente transfor- mados na cepa de levedura repórter descrita no Exemplo 1. As cepas foram culturadas como descrito no Exemplo 1 e metabolitos de BIA foram medidos diretamente no sobrenadante através de análise LC- MS. A Figura 21 mostra que quando expressão de DRS é baixa (pro- motor CYC1), e expressão de DRR é alta (ou TDH3 ou TEF1), em tor- no de 10 uM de salutaridina são produzidos a partir das cepas de le- vedura. No entanto, quando expressão de DRS é alta (promotor TDH3), pode não importar se expressão de DRR é baixa (CYC1) ou em níveis intermediários (TEF1), e ambos os construtos resultam em torno de 20 uM de salutaridina produzidos a partir das cepas de leve- dura, quase o dobro daqueles observados a partir de cepas em que DRS é expressa em níveis baixos. Os resultados indicam que em rela- ção a DRR, a atividade intracelular de DRS é limitante, e que esforços de engenharia de proteína adicionais podem ser aplicados à enzima DRS para melhorar mais sua atividade.

Exemplo 6. Mutagênese e identificação de variantes de DRS melhora- das

[00390] “Foram realizadas estratégias de engenharia de enzima à base de mutagênese para avaliar bibliotecas de DRS e identificar vari- antes de enzima DRS melhoradas. A estrutura de leitura aberta de DRS em pDW21 foi submetida à PCR propensa a erro usando o estojo de mutagênese aleatória GeneMorph II (Agilent), de acordo com o pro- tocolo recomendado pelo fabricante. Produtos de PCR mutagenizado, de comprimento integral, de DRS foram então ou usados como pri- mers para reamplificar e regenerar diretamente plasmídeos pDW21 ou recombinados diretamente com pDW21 linearizado usando o estojo Gibson Assembly (NEB), de acordo com o protocolo recomendado pe- lo fabricante. Plasmídeos resultantes foram então transformados em E.

coli e grupos mutagenizado de plasmídeos purificados foram purifica- dos e subsequentemente transformados em cepa repórter de S. cere- visiae descrita no Exemplo 1. Colônias individuais foram pegas e cultu- radas, e níveis de salutaridina foram medidos diretamente no sobrena- dante através de análise LC-MS. Aproximadamente 5.000 variantes independentes foram avaliadas através de LC-MS quanto à produção aumentada de salutaridina.

[00391] Em comparação com cepas controle expressando DRS pa- rental, não mutagenizada, do tipo selvagem (DW24 carregando PDW21), cepas expressando variantes de DRS que mostraram produ- ção melhorada de salutaridina foram escolhidas para avaliação secun- dária e estudo adicional. O desempenho relativo de cada variante foi determinado dividindo salutaridina produzida pela concentração de sa- lutaridina média de seis réplicas independentes da DRS parental ex- pressa na cepa repórter. 25 variantes que mostraram uma mudança em razão de vezes de 1,2X ou mais do que a parental foram prosse- guidas. Embaralhamento de DNA das variantes melhoradas e avalia- ção adicional foram então usados para isolar mutações que tinham um efeito positivo sobre atividade daquelas que não. Para embaralhamen- to de DNA, o método NExT (Mueller e outros, 2005) foi usado como descrito, exceto que DNA foi digerido com Endonuclease IV (NEB) e polimerase Phusion (NEB) foi usada para amplificação de DNA após remontagem. Variantes embaralhadas foram clonadas na estrutura principal de pDW21 e testadas quanto à produção de salutaridina em DW24 como acima descrito.

[00392] Variantes embaralhadas com atividade melhorada com re- lação à sequência parental de DRS foram sequenciadas (Quintara Biosciences) e mutações que mostraram a contribuição maior para de- sempenho melhorado foram identificadas. A Tabela 13 lista todas as variantes embaralhadas que exibiram desempenho melhorado. Todas as mutações presentes na Tabela 13 resultam potencialmente em ati- vidade aumentada de DRS em relação à sequência parental, mas mu- tações que foram identificadas em múltiplas variantes embaralhadas melhoradas ou em múltiplos grupos embaralhados foram determina- das mais provavelmente resultar em melhorias diretas no desempenho de DRS. Os seis sítios satisfazendo essas condições eram nas posi- ções 16, 17, 69, 110, 115 e 293.

[00393] “Quando mapeadas no modelo de homologia estrutura de DRS com base em CYP17A1 (número PDB 4NKX), as posições 16, 17 e 69 estão todas localizadas no domínio de localização ER N-terminal que é responsável pela ancoragem dessa classe de enzimas P450 na membrana microssomal. Sem ser limitado pela teoria, é possível que mudanças nesses resíduos afetem não apenas como DRS interage com e é incrustada no RE, mas também a atividade geral de DRS, uma vez que localização na membrana e orientação são críticas para funcionamento da enzima. A posição 110 é um resíduo exposto à su- perfície no modelo de homologia, e está localizado na face da enzima que é proposta interagir com citocromo P450 redutase (CPR), um do- ador redox essencial para atividade de P450. Mudanças nessa posi- ção podem influenciar positivamente como DRS interage com CPR, através da facilitação de transferência de elétrons entre as duas enzi- mas, por exemplo. A posição 155 é também um resíduo exposto à su- perfície que pode desempenhar um papel em como DRS interage com CPR, e mudanças nessa posição poderiam afetar a atividade positi- vamente. A posição 293 é um outro resíduo exposto à superfície que está na face oposta da molécula da posição 110, e está localizada próximo a canais no modelo estrutural que poderia permitir acessibili- dade a substrato ou produto. Mudanças em resíduo nessa posição po- deriam influenciar como substrato se liga e como produto é liberado. Adicionalmente, essa face da enzima está próxima da superfície de membrana do RE, e mudanças aqui poderiam impactar como a enzi- ma faz interface com o microssoma. Exemplo 7. A posição do aminoácido na qual PADRS-DRR pode ser truncado para formar enzimas DRS e DRR separadas

[00394] Um alinhamento da sequência de aminoácido primária de PPbDRS-DRR versus deidrorreticulina sintase (DRS) e deidrorreticulina redutase (DRR) de P. rhoeas foi gerado usando o Clustal Omega (http://www .ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) como mostrado na Figura 24. Com base no alinhamento com DRR de P. rhoeas, foi identificado um ponto de truncamento no qual separar PODRS-DRR em enzimas DRS e DRR, onde um resíduo metionina conservado na posição M569 é encontrado (SEQ ID 16). Esse resíduo corresponde à posição 1 de SEQ ID 18. A seta preta, entre os resíduos D568 e M569, representa o sítio no qual PODRS-DRR foi truncado. A enzima DRS separada base- ada em PDbDRS-DRR foi projetada para terminar na posição D568. À seta pontilhada aponta para uma região de PODRS-DRR que é não conservada com ou homóloga ou a DRS ou DRR de P. rhoeas. Trun- camentos após cada um desses resíduos não conservativos, a se- quência iniciando em K557 e terminando em D568 dentro da caixa preta, foram gerados, e a atividade de cada truncamento sucessivo de DRS foi ensaiada em uma estrutura principal de vetor idêntica a PDW21 (com DRR sob o controle do promotor TEF1). Esses plasmí- deos foram separadamente transformados na cepa de levedura repór- ter descrita no Exemplo 1. As cepas foram culturadas como descrito no Exemplo 1 salutaridina foi medida diretamente no sobrenadante através de LC-MS. Exemplo 8. Identificação de variantes de DRS que melhoram a produ- ção do alcaloide morfinano tebaína

[00395] “Mutações em 30 resíduos únicos foram identificadas na en- zima DRS que melhorou a atividade de epimerase em levedura e re-

sultou em títulos de salutaridina maiores, um alcaloide promorfinano (vide Exemplo 6). O impacto de várias dessas mutações sobre ativida- de de DRS e produção de tebaína foi verificado através de clonagem de mutações por ponto selecionadas em DRS em plasmídeos. As mu- tações por ponto selecionadas para análise foram V16A, A17T, ASOT, H69Q, V70I, M110I e R160R (mudança de códon). Esses plasmídeos foram transformados na cepa de avaliação yA511. yA511 é engenhei- rada com uma via biossintética completa para tebaína, mas não tem uma enzima DRS funcional. Colônias transformadas foram pegas em meios de crescimento de pré-cultura e cultivadas de um dia para o ou- tro como descrito no Exemplo 1. As células foram retrodiluídas nos meios de produção. Após dois dias de crescimento de produção, so- brenadantes das culturas foram isolados e medidos usando análise LC-MS/MS. Células expressando as variantes de mutante de DRS acumularam até 1,4 vez mais tebaína no meio de cultura comparado com a cepa controle expressando DRS do tipo selvagem (WT) (Figura 25).

Exemplo 9. Cepas de levedura de plataforma engenheiradas para pro- duzir (S)-reticulina a partir de glicose e fontes de nitrogênio simples

[00396] Uma cepa de levedura de plataforma que produz o inter- mediário de BIA de ponto de ramificação-chave (S)-reticulina a partir de L-tirosina foi construída (Figura 12). Especificamente, quatro cons- trutos de expressão de múltiplos genes foram integrados ao genoma de uma cepa de levedura. A composição dos quatro construtos é indi- cada na Figura 26. Cada construto é compreendido de 4 ou 5 genes expressos a partir de promotores de levedura. Os genes são posicio- nados em cada locus como cassetes de expressão completos com- preendendo um promotor, estrutura de leitura aberta de gene e termi- nador como especificado nas anotações acima do esquema. O es- quema mostra a orientação de cada cassete de expressão através da direção das setas representando um dado gene. Marcadores selecio- náveis estão em itálico na anotação e representados por setas cinzas no esquema. Cada marcador de seleção é flanqueado por sítios loxP para permitir remoção do marcador do locus. Adicionalmente, cada construto tem um marcador selecionável flanqueado por sítios loxP de modo que ele pode ser removido através de Cre recombinase.

[00397] No primeiro construto de integração, quatro genes heteró- logos de Rattus norvegicus são integrados ao locus YBR197C junto com um marcador de seleção G418 (KanMX). RnPTPS, RnSepR, RnPCD e RNQDHPR são necessários para sintetizar e regenerar tetra- hidrobiopterina (BH) da via de síntese de folato endógeno de levedura como indicado na Figura 1. Cada gene é otimizado no códon para ex- pressão em levedura.

[00398] “No segundo construto de integração, quatro genes heteró- logos são integrados ao locus HIS3 junto com o marcador de seleção HIS5. Tirosina hidroxilase de Rattus norvegicus (RnTyrH) converte ti- rosina em L-DOPA usando o cossubstrato BH4 gerado pelo construto de integração precedente. O RnTyrH pode ser qualquer um dos mu- tantes do tipo selvagem ou melhorados que conferem atividade au- mentada (por exemplo, W166Y, R37E e R38E). Um segundo gene de Rattus norvegicus, RnDHFR, codifica uma enzima que reduz di- hidrobiopterina (um produto de oxidação de BHa) em BH, desta ma- neira aumentando a biodisponibilidade desse cossubstrato. Também incluído no terceiro construto está PODODC de Pseudomonas putida, uma enzima que converte L-DOPA em dopamina. A quarta enzima é CjNCS de Coptis japonica, que condensa 4-HPA e dopamina para fa- zer norcoclaurina. Cada gene é otimizado no códon para expressão em levedura.

[00399] No terceiro construto de integração, cinco genes heterólo- gos de plantas e o marcador de seleção LEUZ2 são integrados ao locus

YDR514C. PS6OMT, PSs4'OMT e PSCNMT são metiltransferases de Papaver somniferum e são expressas como sequências de nucleotí- deo de planta nativos. Um quarto gene de P. somniferum, yPSCPRv2, é otimizado no códon para levedura e codifica uma redutase que su- porta a atividade de um citocromo P450 de Eschscholzia californica, ECcCYP80AT1. As enzimas codificadas nesse construto realizam duas O-metilações, uma N-metilação e uma hidroxilação para produzir reti- culina a partir da norcoclaurina produzida pelo construto de integração precedente. Cada gene é otimizado no códon para expressão em le- vedura.

[00400] — No construto de integração final, cópias adicionais de genes endógenos de Saccharomyces cerevisiae ARO4 QNI6K, AROQ7 1228, TYR1 e ARO10 são integrados ao locus ARO4 junto com um marcador de seleção de resistência à higromicina. ARO4 9º%%K é ARO7 1º?! são mutantes resistentes a feedback de ARO4 e AROT1O que codificam, cada um, uma substituição de par de base único em relação à se- quência do tipo selvagem. TYR1 e ARO10 são idênticos aos genes de levedura nativos, mas são expressos atrás de promotores fortes. Aro4p e Aro7p são enzimas na biossíntese de aminoácidos aromáticos incluindo tirosina. Remoção de inibição de feedback dessas enzimas resulta em suprarregulagem de biossíntese de tirosina endógena. Su- perexpressão de Tyrip suprarregula biossíntese de tirosina e então produção de tirosina. Superexpressão de Aro 10p aumenta a produção de 4-HPA.

[00401] Cepas de levedura de plataforma podem ser construídas com qualquer número de quatro cassetes de expressão. Especifica- mente, cepas de levedura de plataforma foram construídas com cons- trutos de integração 104 e construtos de integração 1-3. Na última ce- pa em que o construto de superprodução de tirosina (construto 4) é excluído, tirosina adicional pode ser fornecida no meio de cultura para suportar a biossíntese de reticulina. Modificações genéticas adicionais podem ser incorporadas às cepas de plataforma para suportar produ- ção de BIAs a jusante e fluxo aumentado para biossíntese de BIA.

[00402] As cepas de levedura foram cultivadas em meios completos sintéticos com a solução de supressão de aminoácido apropriado a 30ºC. Metabolitos de BIA no sobrenadante de meios foram analisados após 48 e 96 horas de cultivo através de análise LC-MS/MS. Exemplo 10. Cepas de levedura de plataforma engenheiradas para produzir tebaína a partir de glicose e fontes de nitrogênio simples

[00403] Cepas de levedura podem ser engenheiradas para a pro- dução de alcaloide morfinano tebaína a partir de precursores iniciais tal como tirosina. Como um exemplo, as cepas de levedura de plata- forma descritas no Exemplo 9 podem ser engenheiradas mais para produzir os produtos alcaloide morfinano a partir de L-tirosina (Figura 14).

[00404] A cepa de levedura de plataforma produzindo (S)-reticulina a partir de L-tirosina (vide descrição no Exemplo 9) foi engenheirada mais para incorporar uma epimerase dividida engenheirada DRS e DRR, uma salutaridina sintase engenheirada, salutaridina redutase, salutaridinol acetiltransferase e tebaína sintase para converter a (S)- reticulina biossintetizada no primeiro alcaloide morfinano tebaína (Fi- gura 14). Três cassetes de expressão (Prox3-yEcCCFST26-yPhSS3-%, Pren-yPbSalR, PreFi-yPSSalAT) foram montados em um construto de integração com um marcador seletivo bleR e integrados no locus TRP1 na cepa de levedura de plataforma. Três cassetes de expressão adicionais (Prou3s-yPbDRS, PreF-yYPBbDRR, Prex1-yPSTS) foram monta- dos em um construto de integração com um marcador seletivo URA3 e integrados no locus YPL250CA na cepa de levedura de plataforma. À composição dos dois construtos é indicada na Figura 27.

[00405] As cepas de levedura carregando os cassetes integrados foram cultivadas em meios completos sintéticos com a solução de su- pressão apropriada a 30ºC. Após 96 horas de cultivo, os meios foram analisados quanto a metabolitos de BIA através de análise LC-MS/MS. Exemplo 11. Produção de tebaína a partir de glicose e fontes de nitro- gênio simples através de cepas de levedura engenheiradas

[00406] Cepas de levedura foram engenheiradas como descrito nos Exemplos 9 e 10 para produzir o alcaloide morfinano pentacíclico teba- ína diretamente a partir de açúcares simples (por exemplo, glicose) e fontes de nitrogênio presentes em meios de crescimento padrão. Es- pecificamente, uma cepa CEN.PK de Saccharomyces cerevisiae foi engenheirada para expressar as enzimas heterólogas que seguem através de integração ao cromossoma de levedura: TyrH, DODC, PTPS, SepR, PCD, QDHPR, NCS, 6OMT, CNMT, CYP80B1, CPR, 4OMT, DRS, DRR, SalSyn, SalR, SalAT e TS. Neste exemplo, a enzi- ma SalSyn é engenheirada para ter sua sequência líder substituída com 83 aminoácidos a partir do terminal N de quelantiofolina sintase de Eschscholzia californica (ECCFS). Modificações adicionais foram feitas na cepa para aumentar acúmulo de precursor de BIA, incluindo: superexpressão de ARO10, superexpressão de TYR1, expressão de um ARO resistente a feedback (ARO4º66K) e expressão de um resis- tente a feedback ARO7 (ARO7T228!). Cepas de levedura engenheiradas separadas foram feitas como descrito, carregando variantes diferentes de enzimas codificando atividade de tebaína sintase (TS), incluindo SEQ ID NOs. 35 (isto é, TS1), 37 (isto é, TS2) e uma variante de 35 com um truncamento N-terminal dos 22 primeiros aminoácidos (isto é, tTS1), e nenhuma enzima tebaína sintase (YA397). As sequências das variantes de enzima são providas na Tabela 2.

[00407] As cepas de levedura descritas foram inoculadas em 2 ml de meio completo sintético (base de nitrogênio e aminoácidos de leve- dura) com 2% de glicose e cultivadas por aproximadamente 4 horas a

30ºC. Então, 10 uL de cada cultura foram transferidos para 400 ul de meios frescos em uma placa de 96 cavidades em réplicas de 4 e culti- vados por mais 48 horas a 30ºC. O meio de produção contém 1x de caldo de nitrogênio de levedura e aminoácidos, ácido ascórbico 20 mM, 300 mg/L de tirosina, 40 g/L de maltodextrina e 2 unidades/L de amilase. A amilase é usada para imitar um processo de batelada ali- mentada e libera gradualmente glicose a partir de polímero de malto- dextrina de modo que a levedura pode usá-la como uma fonte de car- bono. As células foram separadas do meio através de centrifugação e concentração de tebaína foi medida diretamente no sobrenadante através de análise LC-MS/MS. Todas as cepas de levedura engenhei- radas produziram tebaína a partir de glicose e fontes de nitrogênio simples presentes no meio de crescimento (FIGs. 29 e 30). Cepas car- regando uma atividade de tebaína sintase produziram níveis maiores de tebaína com relação a cepas não carregando essa atividade sob as condições de fermentação descritas. Exemplo 12. Cepas de levedura engenheiradas para produzir alcaloi- des morfinano a jusante a partir de glicose e fontes de nitrogênio sim- ples

[00408] Cepas de levedura podem ser engenheiradas para a pro- dução dos alcaloides morfinano a jusante a partir de precursores inici- ais tal como tirosina. Como um exemplo, as cepas de levedura de pla- taforma descritas no Exemplo 10 podem ser engenheiradas mais para produzir os produtos alcaloide morfinano a jusante a partir de L-tirosina (Figura 14).

[00409] A cepa de levedura de plataforma produzindo tebaína a partir de L-tirosina (vide descrição no Exemplo 10) foi engenheirada mais para incorporar tebaína 6-O-desmetilase, codeinona redutase e codeinona-O-desmetilase para converter a tebaína biossintetizada nos alcaloides morfinano a jusante incluindo morfina (Figura 14). Três cas-

setes de expressão (PapHi-T6ODM-TapH1, Prxt7-COR-TrekKi, Pref CODM-Tcryc1) foram diretamente montados com um marcador seletivo TRP1 e integrados no locus trp1 na cepa de levedura de plataforma de tebaína (Thodey e outros, 2014).

[00410] As cepas de levedura carregando os cassetes integrados foram cultivadas em meio completo sintético com a solução de supres- são apropriada a 30ºC. Após 96 horas de cultivo, o meio foi analisado quanto a metabolitos de BIA através de análise LC-MS/MS. Exemplo 13. Cepa de levedura engenheiradas para produzir opioides semissintéticos a partir de glicose e fontes de nitrogênio simples

[00411] Cepas de levedura podem ser engenheiradas para a pro- dução dos alcaloides morfinano a jusante a partir de precursores inici- ais tal como tirosina. Como um exemplo, as cepas de levedura descri- as nos Exemplos 9 e 10 podem ser engenheiradas mais para produzir os produtos opioides semissintéticos a partir de L-tirosina (Figura 15).

[00412] As cepas de levedura produzindo alcaloides morfinano a jusante a partir de L-tirosina (vide descrição no Exemplo 10) foram en- genheiradas mais para incorporar morfina desidrogenase e morfinona redutase para converter a tebaína biossintetizada nos alcaloides mor- finano a jusante incluindo morfina (Figura 15). Dois cassetes de ex- pressão (PePpn-morA-Tcvycs, Prek1-morB-T pros) foram diretamente mon- tados com um marcador seletivo KanMX e integrados ao locus HO nas cepas de levedura produzindo alcaloides morfinano a jusante (Thodey e outros, 2014).

[00413] As cepas de levedura carregando os cassetes integrados foram cultivadas em meio completo sintético com a solução de supres- são adequada a 30ºC. Após 96 horas de crescimento, o meio foi anali- sado quanto a metabolitos de BIA através de análise LC-MS/MS. Exemplo 14. Cepas microbianas engenheiradas para produzir compos- tos opioides O-desmetilados a partir de glicose e fontes de nitrogênio simples

[00414] Enzimas listadas na Tabela 4 que exibiram atividade O- desmetilase sobre alcaloides morfinano foram incorporadas a uma ce- pa microbiana (ou Saccharomyces cerevisiae ou Escherichia coli) que biossintetiza alcaloides morfinano de novo (como descrito no Exemplo 10). A via biossintética de BIA completa usa L-tirosina produzida pela célula hospedeira e/ou suplementada no meio de cultura. Duas molé- culas de tirosina são modificadas e condensadas para formar a primei- ra estrutura benzilisoquinolina, que pode ser ou norcoclaurina ou nor- laudanosolina. A benzilisoquinolina é modificada mais para formar (S)- reticulina e então estereoquimicamente invertida pela atividade de uma enzima epimerase dividida engenheirada para prover (R)-reticulina. (R)-reticulina sofre uma reação de acoplamento carbono-carbono para formar o primeiro promorfinano, salutaridina, e é modificada mais an- tes de sofrer uma reação de acoplamento oxigênio-carbono catalisada por uma tebaína sintase para se chegar à primeira estrutura de alca- loide morfinano, tebaína (vide Figura 14). A Tabela 3 lista enzimas e atividades na via completa.

[00415] A Figura 10 ilustra um esquema de biossíntese em uma cé- lula microbiana, de acordo com modalidades da invenção. Tirosina produzida endogenamente pela célula e/ou fornecida no meio de cultu- ra é convertida em oxicodona (setas interrompidas representam eta- pas enzimáticas múltiplas). A oxicodona é então 3-O-desmetilada em oximorfona e N-desmetilada para noroximorfona. Finalmente, uma N- metiltransferase aceita porções alil e ciclopropilmetil carbono a partir de análogos de SAM para produzir naloxona e naltrexona, respectiva- mente.

[00416] Para detectar atividade de O-desmetilase em cepas produ- zindo moléculas de alcaloide morfinano, células expressando enzimas candidatas, ou a partir de vetores de plasmídeo ou casses cromosso-

malmente integrados, foram propagadas através de fermentação e so- brenadantes celulares foram coletados para analisar o perfil de opioide total (como descrito acima). O-desmetilação de moléculas de opioide em cepas carregando a via de BIA completa foi detectada através de LC-MS (como descrito acima). Especificamente, a conversão de oxi- codona em oximorfona foi detectada. Para detectar atividade de O- desmetilação através de biocatálise, as cepas foram culturadas em meio seletivo e então lisadas por rompimento de esfera de vidro. Lisa- tos de célula foram fornecidos endogenamente com substratos de opi- oides (vide Figura 6), e outros cofatores necessários para funciona- mento de enzima. O-desmetilação de moléculas opioides foi detectada através de LC-MS.

Exemplo 15. Cepas microbianas engenheiradas para produzir compos- tos opioides N-desmetilados a partir de glicose e fontes de nitrogênio simples

[00417] Enzimas listadas na Tabela 5, que exibiram atividade de N- desmetilase ou alcaloides morfinano, foram incorporadas a uma cepa microbiana (ou Saccharomyces cerevisiae ou Escherichia coli) que bi- ossintetiza alcaloides morfinano de novo (como descrito no Exemplo 10). A via biossintética de BIA completa usa L-tirosina produzida pela célula hospedeira e/ou suplementada no meio de cultura. Duas molé- culas de tirosina são modificadas e condensadas para formar a primei- ra estrutura de benzilisoquinolina que pode ser ou norcoclaurina ou norlaudanosolina. A benzilisoquinolina é modificada mais para formar (S)-reticulina e então invertida estereoquimicamente pela atividade de uma enzima epimerase dividida engenheirada para prover (R)- reticulina. (R)-reticulina sofre uma reação de acoplamento carbono- carbono para formar o primeiro promorfinano, salutaridina e é modifi- cada mais antes de sofrer uma reação de acoplamento oxigênio- carbono catalisada por uma tebaína sintase para chegar à primeira estrutura alcaloide morfinano, tebaína (vide Figura 14). A Tabela 3 lista enzimas e atividades na via completa.

[00418] Para detectar atividade de N-desmetilase em cepas produ- zindo moléculas alcaloides morfinano, células expressando enzimas candidatas, ou de vetores de plasmídeo ou cassetes cromossomal- mente integrados, foram propagadas através de fermentação e sobre- nadantes celulares foram coletados para analisar a perfil de opioide total (como descrito acima). N-desmetilação de moléculas de opioide em cepas carregando a via de BIA completa foi detectada através de LC-MS (como acima descrito). Especificamente, a conversão de oxi- morfona em noroximorfona foi detectada. Para detectar atividade de N- desmetilação através de biocatálise, as cepas foram culturadas em meio seletivo e então lisadas através de rompimento de esfera de vi- dro. Lisatos de célula foram fornecidos exogenamente com substratos de opioide (vide Figura 7) e outros cofatores necessários para funcio- namento da enzima. N-desmetilação de moléculas de opioide foi de- tectada através de LC-MS. Exemplo 16. Cepas microbianas engenheiradas para produzir compos- tos nal-opioides a partir de glicose e fontes de nitrogênio simples

[00419] Enzimas listadas na Tabela 6, que exibiram atividade de N- metilase sobre alcaloides morfinano, foram incorporadas a uma cepa microbiana (ou Saccharomyces cerevisiae ou Escherichia coli) que bi- ossintetiza alcaloides morfinano de novo (como descrito no Exemplo 10). A Figura 10 mostra um exemplo do esquema de reação completo a partir da molecula precursora tebaína para os compostos nal- opioides finais naloxona e naltrexona. As cepas expressam ainda en- zimas dos Exemplos 14 e 15 e Tabela 3, que são responsáveis pela geração de compostos nor-opioide a partir da via de BIA completa. Enzimas N-metilase foram também expressas em uma cepa microbia- na (ou Cen.PK2 para S. cerevisiae ou BL21 para E. coli, por exemplo)

sem a via biossintética, para gerar uma cepa que é capaz de biocatáli- se de várias moléculas de substrato exogenamente fornecidas diferen- tes. A via biossintética de BIA completa usa tirosina produzida pela célula hospedeira e/ou suplementada no meio de cultura. Duas molé- culas de tirosina são modificadas e condensadas para formar a primei- ra estrutura de benzilisoquinolina que pode ser ou norcoclaurina ou norlaudanosolina. A benzilisoquinolina é ainda modificada para formar (S)-reticulina e então estereoquimicamente invertida pela atividade de uma enzima epimerase dividida engenheirada para prover (R)- reticulina. (R)-reticulina sofre uma reação de acoplamento carbono- carbono para formar o primeiro promorfinano, salutaridina, e é modifi- cada mais antes de sofrer uma reação de acoplamento oxigênio- carbono catalisada por uma tebaína sintase para chegar à primeira estrutura de alcaloide morfinano, tebaína (vide Figura 14). A Tabela 3 lista enzimas e atividades na via completa.

[00420] Para detectar atividade de modificação de N em cepas com a via de BIA completa para nor-opioides (vide Figura 10), células ex- pressando enzimas candidatas foram propagadas através de fermen- tação (como descrito acima) e incubadas com SAM ou análogos de SAM, tais como aqueles listados na Figura 8. Modificação enzimática de nor-opioide ou outras moléculas de BIA em cepas carregando a via de BIA completa foi detectada em sobrenadantes através de LC-MS (como acima descrito). Para detectar atividade de modificação de N através de biocatálise, cepas foram culturadas em meio seletivo e en- tão lisadas por rompimento de esfera de vidro. Lisatos de célula foram fornecidos exogenamente com SAM ou análogos de SAM ou outros cofatores necessários para funcionamento de enzima. Especificamen- te, a conversão de noroximorfona em naloxona e naltrexona (usando os análogos de SAM alil-SAM ou ciclopropano-SAM, como mostrado na Figura 8) foi detectada. Modificação de nor-opioide ou outras molé-

culas de BIA foi detectada através de LC-MS.

Para detectar atividade de modificação de N através de biocatálise em uma cepa que não tem via de BIA completa, cepas de Cen.PK2 expressando as enzimas he- terólogas descritas foram cultivadas em meio seletivo e lisadas por rompimento de esferas de vidro.

Lisatos de célula foram fornecidos exogenamente com SAM ou análogos de SAM, cofatores necessários para funcionamento de enzima e moléculas nor-opioides tais como aquelas listadas na Figura 8 e na Tabela 3. Modificação desses com- postos foi detectada através de LC-MS.

Tabela 3. Lista de enzimas Enama — abrev — Reaçõescataisadas — Jórganiemetonte o [enbankf ranscetolase KL1 Tutose-6-fosfato —+ gliceraldeído-3-Saccharomyces cerevisiae INP 015399.1 fosfato — xilulose-5-fosfato + eritrose- 4-fosfato (EC 2.2.1.1) IGlicose-6-fosfato desidroge-ZWF1 Iglucose-6-fosfato = 6-ISaccharomyces cerevisiae ICAA96146.1 hase fosfonogluconolactona (EC 1.1.1.49) |Prefenato desidrogenase YR1 bprefenato + NADP* > 4-hidroxifenil-Saccharomyces cerevisiae ICAAB5127.1 Jpiruvato + CO2 + NADPH (EC 1.3.1.13) |I3-desoxi-d-arabinose- ARO4, DAHPÍleritrose-4-fosfato + PEP — DAHP (EClSaccharomyces cerevisiae ICAAB5212.1 lheptulosonato-7-fosfato sintase sintase .5.1.54) *

14.1.1.80) 8 Álcool desidrogenase ADH2-7, SFA1 MHPA — tirosol (EC 1.1.1.90) Saccharomyces cerevisiae INP 014032.1, AAT93007.1, o INP 011258.2, NP 009703.3, S INP 014051.3, NP 010030.1, INP 0101131 Aldeído oxidase ALD2-6 MHPA — ácido hidroxifenilacético (EC|ISaccharomyces cerevisiae INP 013893.1, NP 013892.1,

1.2.1.39) INP 015019.1, NP 010996.2, INP 015264.1 Aril-álcool desidrogenase AAD4, 6, 10 Aldeído aromático + NAD* — álcooliSaccharomyces cerevisiae IGAX67600, GAX72034, 14-16 aromático + NADH (EC 1.1.1.90) AAT93180, AASS6234, INP 012689, GAX69843, INP 014477, AASS6127 Aminotransferase aromática A lhidroxifenilpiruvato + L-alanina — tiro-Saccharomyces cerevisiae AEC14313.1 Ilsina + piruvato (EC 2.6.1.58) Aminotransferase aromática ARO8 lhidroxifenilpiruvato + glutamato — tiro-Saccharomyces cerevisiae KZV11027.1 [sina + alfa-cetogluterato(EC 2.6.1.5)

Emma — Jaorev — Reaçõescatalsadas — Jorganismofonte — Jentankf [O ainona EC 114189) cus bispos irosina hidroxilase yrH irosina — L-DOPA (EC 1.14.16.2) |Homo sapiens, INM 012740, NM 000240 IRattus norvegicus, Mus musculus Inorvegicus irosina/DOPA decarboxilase |TYDC |-DOPA — dopamina ( EC 4.1.1.28) |Papaver somniferum AAA97535 Ps a es ma ameeatias) o 1 | |coceus luteus (EC 4.2.1.78) Iiferum, Papaver bracteatum,ACI45396.1, AC O090258.1, [3,4-DHPA + dopamina — S- norlauda-Thalicitum flavum, CorydalisACO90247.1, AEB71889.1 NM hosoline Isaxicola & |INorcoclaurina 6-O0- metiltrans-BSOMT INorcoclaurina — coclaurine Norlauda-P. somniferum AY268894 AY610507 D29811 8 erase hosolina — — 3'hidroxicoclaurina — ECIT. flavum o .1.1.128 Coptis japonica* |Coclaurina-N- metiltransferase JCNMT |Coclaurina — N-metilcoclaurina 3'hidro-P. somniferum AY217336 AY610508 ABO61863 icoclaurina — 3'-hidroxi-N- - metilco-IT. flavum claurina Coptis japonica* |EC 2.1.1.140 4'-O-metiltransferase 4' OMT I3'-hidroxi-N- IP. somniferum AY217333, AY217334 AY610510) Imetilcoclaurina— Reticulina ECJT. fflavum D29812 .1.1.116 Coptis japonica* ICitocromo P450 80B1 ICYP80B1 IN-metilcoclaurina— 3'-hidroxi-N-IP. somniferum, AAF61400.1 Imetilcoclaurina E. californica, AAC39453.1 (EC 1.14.13.71) T. flavum AAUZ20767.1 (EC 3.5.4.16) |Homo sapiens,

Emma — Jaorev — Reaçõescatalisadas — Jorganismofonte — fBentankf O uu ms NOME | B-piruvoil tetra-hidrobiopterinaPTPS rifosfato de di-hidroneopterina—» PTPIRattus norvegicus, AAH59140.1, (PTP) sintase (EC 4.2.3.12) |Homo sapiens, BAAO4224.1, Mus musculus AAH29013.1 ISepiapterina redutase SepR |PTP — BH4 (EC 1.1.1.153) IRattus norvegicus, INP 062054.1, |Homo sapiens, INP 003115.1, Mus musculus INP 035597.2 Ma-hidroxitetra-hidrobiopterin — PCD Ma-hidroxitetra-hidrobiopterina — H2ORattus norvegicus, INP 001007602.1, l(pterina-4a-carbinolamina) It quinoide di-hidropteridihna (EC|Homo sapiens, AAB25581.1, desidratase 4.2.1.96) Mus musculus INP. 079549.1 IQuinoide di-hidropteridina redu-QDHPR quinoid di-hidropteridihna — BH4 (EC|Rattus norvegicus, AAH72536.1, lase 1.5.1.34) |Homo sapiens, INP 000311.2, Mus musculus AAHO2107.1 NR |Di-hidrofolato redutase DHFR I7, 8-Di-hidrobiopterina — 5,6,7,8-Tetra-Rattus norvegicus, AF318150.1 PP lhidrobiopterina (BH4) |Homo sapiens & EC 1.5.1.3 o 1-benzilisoquinolina — alcaloideDRS-DRR I(S)-reticulina -> (R)-reticulina IPapaver bracteatum, PapaverPODKI7.1, AKOG60175.1, epimerase (citocromo P450(CYP-COR) — |(S)-1-benzilisoquinolina->(R)-1- Isomniferum, Papaver setige-AKO60180.1, AKO60179.1, I82Y 2-codeinona redutase; desi benzilisoquinolina rum, Chelidonium majus AKO60175.1 drorreticulina sintasedehydrore-) iculine redutase) EC 1.5.1.27 I(R)-reticulina NADPH:oxigênio [(SalSyn I((R)-reticulina + NADPH + H+ + O2 —|Papaver somniferum, PapavenEF451150 oxidorredutase —=(C-C fenol- Isalutaridina + NADP+ + 2 H2O0 spp (Ref PMID 22424601) lacoplamento), também conhe- EC 1.14.21.4 Chelidonium majus cida como salutaridina sintase Isalutaridinol:NADP+ 7- SalR Isalutaridinol + NADP+ — salutaridina +Papaver somniferum, PapavenDQ316261, EF184229 oxidorredutase, também co- INADPH + H+ Ibracteatum, Papaver spp (Ref PMID 22424601) hhecida como salutaridina re- EC 1.1.1.248 Chelidonium majus dutase

Emma — fbrev — Reaçõescatalsadas — Jorganismofonte — fentankf lacetil-CoA:salutaridinol 7-O-SalAT lacetil-CoA + salutaridinol — CoA + 7-Papaver somniferum, PapaverAF339913, FJ200355, FJ200358, lacetiltransferase |O- acetilsalutaridinol Ibbracteatum, Papaver orientale,FJ200356, JO659008 EC 2.3.1.150 |Papaver spp tebaína sintase Ss |7-O-acetilsalutaridinol — tebaína +|IPapaver somniferum, PapaverAWQ63979, AWQ63980 lacetato Ibracteatum, Papaver orientale,

A O RA ISpp. |ICodeinona redutase COR lcodeinona—> codeína EC 1.1.1.247, |IPapaver somniferium, PapaverAF108432.1 AF108433.1 Ieopinona— neopina ISPpp. AF108434.1 AF108435.1 |ICodeína O-desmetilase ICODM |Icodeína— morfina EC 1.14.11.32, |Papaver somniferium, PapaverGQ500141.1 heopina— neomorfina SPP. IMorfina desidrogenase morA Imorfina — morfinona EC 1.1.1.218, |IPPseudomonas putida M94775.1 NM |lcodeinona — codeína EC 1.1.1.247 & ê Imorfinona — hidromorfona EC 1.3.1.- ow INADPH:hemoproteína — oxidor-ATR1, CPR INADPH + H+ + hemoproteína n oxida-Arabidopsis thaliana, E. califor-NM118585, CABS58576.1, redutase, também conhecida| da — NADP+ + Ihnica, P. somniferum, H. sapidCABS58575.1,AAC05021.1, Ensamaáeo Eesenieeaeea Figomis iiURMEl A ate e tum, Papaver spp., all plants — |PMID 19931102) lCitocromo —P450, família 2/CYP2D6 |Oxidase promíscua, pode realizar |Homo sapiens BCO067432 Isubfamília D, polipeptídeo 6 I((R)-reticulina + NADPH + H+ + 02 —| [salutaridina + NADP+ + 2 H2O dentre outras reações |EC 1.14.14.1 |S-adenosil-L-metionina:(S)- S9OMT |S-adenosil-L-metionina + (S)-IThalictrum flavum subsp. glau-AY610512, D29809, EUS980450, escoulerina 9-O0- metiltransfe- escoulerina = S- adenosil-L-cum, VUN185323 rase Ilhomocisteína + (S)- tetra-Papaver somniferum, Copti: lhidrocolumbamina japonica, Coptis chinensis,

Emma — Jabrev — Reaçõescatalsadas — Jorganismofonte — Jentankf EC 2.1.1.117 Thalictrtum spp, Coptis spp, o E ReRems etra-hidroprotoberberina-N- NMT EEstilopina — cis-N-metilestilopina ECP. somniferum DQ028579 EU8S82977 EU8S82994) Imetiltransferase .1.1.122 IE. californica HQ116698 |Canadina — N-metilcanadina |P. bracteatum A. mexicana IQueilantifolina sintase CFS IQueilantifolina — estilopina IP. somniferum IGU325749 AB434654 EF451152 EC 1.14.21.1 IE. californica |P. bracteatum A. mexicana IEstilopina sintase STS IEstilopina — cis-N-metilestilopina IP. somniferum IGU325750 AB126257 EF451151 |EC 2.1.1.122 IE. californica |P. bracteatum NM A. mexicana &s ICis-N-metilestilopina 14-MSH ICis-N-metilestilopina —protopina IP. somniferum IKC154003 S hidroxilase EC 1.14.13.37 IE. californica o |P. bracteatum A. mexicana |IProtopina-6-hidroxilase P6H |Protopina — 6-hidroxiprotopina E. californica AB598834 AGC92397 EC 1.14.13.55 |P. somniferum |P. bracteatum A. mexicana |Di-hidrobenzofenantridina — oxi-DBOX |Di-hidrosanguinarina — sanguinarina |P. somniferum AGL44336, AGL44335, AGL44334)| dase |EC 1.5.3.12 IE. californica |P. bracteatum A. mexicana I(S)-tetra-hidroprotoberberina — STOX |(S)-tetra-hidroberberina + 2 O2 — ber-Berberis wilsonae, Coptis japo-HQ116697, ABS64543 oxidase lberina + 2 H202 Ihica, Berberis spp, Coptis spp

Emma — Jaorev — Reaçõescatalisadas — Jorganismofonte — fentank LO Aee aa OO I(S)-tetra-hidrocolumbamina, ICAS |(S)-tetra-hidrocolumbamina + NADPH|Thalictrum flavum subsp. glau-AY610513, ABO26122, AB374407, INADPH:oxigênio — oxidorredu- |+t H+ + O2 — (S)-canadina + NADP+ +lcum, Coptis japonica, Thalic-AB374408 tlase (formação de ponte meti- H20 ltrum spp, Coptis spp lenodióxi), também conhecida EC 1.14.21.5 |como (S)- canadina sintase I(S)-reticulina:oxigênio — oxidor-BBE |(S)-reticulina + O2 — (S)-escoulerina +Papaver somniferum, Argemo-AFO25430, EU881889, EU8S81890, redutase (formação de pontel IH202 ne mexicana, EschscholziaS65550 AFOOS655, AFO49347, metileneo), também conhecidal IEC 1.21.3.3 lcalifornica, Berberis stolonifera,AY610511, AB747097 |como enzima berberina Thalictrum flavum subsp. glau- lcum, Coptis japonica, Papave! Ispp, Eschscholzia spp, Berbe- ris spp, Thalictrum spp |BBerbamunina sintase ICYP80A1 I(S)-N-metilcoclaurina+ (R)-N-|Berberis stolonifera, CapsicumAACA48987, PHU28278, W Imetilcoclaurina-> berbamunina lchinense, Quercus suber POFO05239 ND |EC 1.14.21.3 & o Alcaloide 1-benzilisoquinolina + 1- alca-| |loide benzilisoquinolina -> akcakiudel bbis-benzilisoquinolina |Protopina O-desalquilase PODA |O, O-desmetilação de canadina, estilo-P. somniferum, IGQ500140.1 Jina e berberina |IPapaver spp.

ISpp.

ISpp. [3-O-desmetilase BODM loxicodona—oximorfona |Papaver somniferum, Papave! lhidrocodona—hidromorfona Ibbracteatum, Papaver rhoeas,

Emma — Jaorev — Reaçõescatalisadas — Jorganismofonte — fentank di-hidrocodeína—di-hidromorfina Papaver spp. 14-hidroxicodeína— 14-hidroximorfina |codeinona—morfinona 14-hidroxicodeinona—14- lhidroximorfinona

IN-desmetilase (em alguns ca- |ICodeína—Norcodeína Bacillus —megaterium, Homo

|Isos a atividade de NDM é codi-| IMorfina—Normorfina Isapiens, Papaver somniferum,

icada em BM3 ou uma varian- |lOxicodona—Noroxicodona Papaver spp, Chelidoniu te engenheirada de BM3) lOximorfona—Noroximorfona Imajus, Stylophorum diphyllum, ebaina—Nortebaína WNigella sativa, Hydrastis cana |Oripavina—Nororipavina densis, Glaucium flavum, Es ; ; lchscholzia californica, Menis- |Hidrocodona—Nor-hidrocodona NM IHidromorfona—Norhidromorfona racteat canadense, Papave & 1a 1a racteatum = Di-hidrocodeíina—Nordi-hidrocodeína S Di-hidromorfina—Nordi-hidromorfina ow 14-hidroxicodeína—Nor-14- lhidroxicodeína 14-hidroximorfina—Nor-14- lhidroximorfina |Codeinona—Norcodeinona IMorfinona—Normorfina 14-hidroxicodeinona—Nor-14- lhidroxicodeinona 14-hidroximorfinona—Nor-14- lhidroximorfinona

IN-metiltransferase INMT INorcodeina—codeína Papaver spp, Chelidoniu INormorfina—morfina Imajus, Thalictrum flavum, Cop- [Noroxicodona—oxicodona lis japonica, Papaver somnife.

Enimaá = = = = =jabrev —— Reações catalisadas Organismo fonte IGenbank f INoroximorfona—noroximorfona rum, Eschscholzia californica, INortebaina—tebaína IPPapaver bracteatum, Argeno- INororipavina—oripavina me — mexicana —Glaucium| INor-hidrocodona—hidrocodona favum, Sanguinaria canaden INorhidromorfona— Hidromorfona e Corais ehelanthíaia INordi-hidrocodeína Di-hidrocodeína [1989 saúda — enersonia INordi-hidl rfi Di-hid ri diphylla, Berberis thunbergii, 'orai-nidromo! nao Tnidromortina - Wahonia —aquifolium, —Menis Nor-14-hidroxicodeina> 1-permum canadense, Tinosporal pidroxicodeína lcordifolia, Cissampelos mucro- INor-14-hidroximorfina> 14-hata, Cocculus trilobus lhidroximorfina INorcodeinona— Codeinona INormorfina— Morfinona NM INor-14-hidroxi-codeinona— 14 & lhidroxicodeinona - INor-14-hidroxi-morfinona> 14) Ss lhidroximorfinona |N-alilltransferase NAT INorcodeína—N-alil-norcodeína Papaver spp, Chelidoniu

INormorfina—N-alil-normorfina imajus, Thalictrum flavum, Cop: INoroxicodona—N-alil-noroxicodona — lis japonica, Papaver somnife- INoroximorfona—N-alil- rum, Eschscholzia californica, Ihornoroximorfona IPapaver bracteatum, Argeno- INortebaína—N-alil-nortebaína me mexicana —Glaucium INororipavina—|N-alil-nororipavina Pavum, Sanguinaria canaden

. s Isis, Corydalis chelanthifolia, INor-hidrocodona—N-alil-nor- : 1 : . WNigela sativa, Jeffersonia) lhidrocodona : B 7; Norhid rf N-alil diphylla, Berberis thunbergii, 'ornidromoriona—> “ali-Mahonia aquifolium, —Menis- Ihorhidromorfona À permum canadense, Tinospora

Emma — abrev — Reaçõescatalsadas — — Jorganismofonte — Jentankf INordi-hidrocodeína» N-alil-nordi-lcordifolia, Cissampelos mucro- lhidrocodeína Inata, Cocculus trilobus INordi-hidromorfina> N-alil-nordi- lhidromorfina INor-14-hidroxicodeína» N-alil-nor-14- lhidroxicodeína INor-14-hidroximorfina»> — N-alil-nor-14- lhidroximorfina INorcodeinona— N-alil-norcodeinona INormorfina— N-alil-normorfina INor-14-hidroxi-codeinona— N-alil-nor- 14-hidroxicodeinona INor-14-hidroxi-morfinona»y — N-alil-nor- NM 14-hidroximorfinona E

-

IN-ciclopropilmetiltransferase — JCPMT INorcodeí- Papaver spp, Chelidoniu 8 Ina—Ní(ciclopropilmetil)norcodeína Imajus, Thalictrum flavum, Cop- INormorfi- lis japonica, Papaver somnife.

Ia—Ní(ciclopropilmetil)normorfina rum, Eschscholzia californica, INoroxicodo- IPapaver bracteatum, Argeno- Ia—Ní(ciclopropilmetil)noroxicodona — me mexicana, Glaucium INoroximorfo- flavum, Sanguinaria canaden ha—Ní(ciclopropilmetil)nornoroximorfon Sis, “Corydalis chelanthifolia, a WNigela sativa, Jeffersonia, Nortebaí- diphylla, Berberis thunbergii, ha—Ní(ciclopropilmetil)nortebaína Mahonia — aquifolium, — Menis Nororipavi- permum canadense, Tinosporal Ina—Ní(ciclopropilmetil)nororipavina cordifolia, Cissampelos muecro

Inata, Cocculus trilobus |Nor-

Emma — aorev — Reaçõescatalsadas — — Jorganismofonte — Jentankf lhidrocodona—Ní(ciclopropilmetil)nor-

lhidrocodona

INor-hidromorfona>

IN(ciclopropilmetil)nor-hidromorfona

INor-di-hidrocodeína>

IN(ciclopropilmetil)nor-di-hidrocodeína

INor-di-hidromorfina—>

IN(ciclopropilmetil)nor-di-hidromorfina

INor-14-hidroxicodeína—

IN(ciclopropilmetil)nor-14-

lhidroxicodeína

INor-14-hidroximorfina>

IN(ciclopropilmetil)nor-14-hidroximorfina

INorcodeinona> NR

IN(ciclopropilmetil)norcodeinona = 3 oo

INormorfina— o

IN(ciclopropilmetil)normorfina a

INor-14-hidroxi-codeinona—

IN(ciclopropilmetil)nor-14-

lhidroxicodeinona

|INor-14-hidroxi-morfinona>

IN(ciclopropilmetil)nor-14-

lhidroximorfinona

Tabela 4. Enzimas candidatas à O-desmetilase

RR THERE T6ODM MEKAKLMKLGNGMEIPSVQELAKLTLAEIPSRYVCANENLLLPMGASVINDHETIPVIDIENLLSPEPIIGKLELD

RLHFACKEWGFFQVVNHGVDASLVDSVKSEIQGFFNLSMDEKTKYEQEDGDVEGFGQGFIESEDQTLDWADIFMMFTLPL HLRKPHLFSKLPVPLRETIESYSSEMKKLSMVLFNKMEKALQVQAAEIKGMSEVFIDGTQAMRMNYYPPCPQPNLAIGLTSH SDFGGLTILLQINEVEGLQIKREGTWISVKPLPNAFVVNVGDILEIMTNGIYHSVDHRAVVNSTNERLSIATFHDPSLESVIGPIS SLITPETPALFKSGSTYGDLVEECKTRKLDGKSFLDSMRI CODM METPILIKLGNGLSIPSVQELAKLTLAEIPSRYTCTGESPLNNIGASVTDDETVPVIDLONLLSPEPVVGKLELDKLHSACKEW GFFQLVNHGVDALLMDNIKSEIKGFFNLPMNEKTKYGQQDGDFEGFGQPYIESEDQRLDWTEVFSMLSLPLHLRKPHLFPE LPLPFRETLESYLSKMKKLSTVVFEMLEKSLQLVEIKGMTDLFEDGLOTMRMNYYPPCPRPELVLGLTSHSDFSGLTILLOLN NR

EVEGLQIRKEERWISIKPLPDAFIVNVGDILEIMTNGIYRSVEHRAVVNSTKERLSIATFHDSKLESEIGPISSLVTPETPALFKR S GRYEDILKENLSRKLDGKSFLDYMRM & PsP7ODM MEKAKLMKLGNGLSIPSVQELAELTFAEVPSRYVCTNDENLLLMTMGASEIDDETVPVIDLONLLSPEPAIGKSELDWLHYSC

KEWGFFQLVNHGVDALLVDHVKSEIHSFFNLPLNEKTKYGQRDGDVEGFGQAFLVSENQKLDWADMFFINTLPLHLRKPHL FPNLPLPLRETIESYSSEMKKLSMVLFEMMGKAIEVIDIKEAITEMFEDGMQSMRMNYYPPCPQPERVIGITPHSDFDGLTILL QLNEVEGLOIRKEDKWISIKPLPDAFIVNVGDIWEIMTNGVHRSVDHRGVINSTKERLSIATFHSPKLELEIGPISSLIRPETPAV

FKSAGRFEDLLKEGLSRKLDGKSFLDCMRM PsoDIOX1 MEKAKLMKLGNGMEIPSVQELAKLTLAEIPSRYVCANENLLLPMGASVINDHETIPVIDIENLLSPEPIIGKLELDRLHFACKEW

GFFQVVNHGVDASLVDSVKSEIQGFFNLSMDEKTKYEQEDGDVEGFGQGFIESEDQTLDWADIFMMFTLPLHLRKPHLFSK LPVPLRETIESYSSEMKKLSMVLFNKMEKALQVQAAEIKGMSEVFIDGTQAMRMNYYPPCPQPNLAIGLTSHSDFGGLTILLO INEVEGLOQIKREGTWISVKPLPNAFVVNVGDILEIMTNGIYHSVD

E TERRE PsoDIOX2 METAKLMKLGNGMSIPSVQELAKLTLAEIPSRYICTVENLQLPVGASVIDDHETVPVIDIENLISSEPVTEKLELDRLHSACKEW

GFFQVVNHGVDTSLVDNVKSDIQGFFNLSMNEKIKYGQKDGDVEGFGQAFVASEDQTLDWADIFMILTLPLHLRKPHLFSKL PLPLRETIESYSSEMKKLSMVLFEKMEKALQVQAVEIKEISEVFKDMTQVMRMNYYPPCPQPELAIGLTPHSDFGGLTILLQOL NEVEGLOQIKNEGRWISVKPLPNAFVVNVGDVLEIMTNGMYRSVDHRAVVNSTKERLSIATFHDPNLESEIGPISSLITPNTPAL

FRSGSTYGELVEEFHSRKLDGKSFLDSMRM PbrDIOX2 METPKSIKLGGSLLVPSVQELAQQOSFAEVPARYVRDDLEPLTDLSGVSMIDQTIPVIDLAKLOASPVPIIRELESEKLHSACKEW

GFFQVVNHGVDILLVEKTKSEIKDFFNLPMDEKKKFWQEEGDIQOGFGQAFVAOSEDQKLDWADIFLMVTLPRHTRNPRLFPKL PLPLRNTMDSYSSKLSKLASTLIEMMGKALHMETSVLAELFEDGRQTMRINYYPPCPQPKDVIGLTPHSDGGGLTILLOLNEV

DGLQIRKEKIWIPIKPLPNAFVVNIGNILEIMTNGIYRSVEHRATIHSTKERLSVAAFHNPKVGVEIGPIVSMITPESPALFRTIEY NM DDYGKKYFSRKLDGKSSLDFMRIGEGDEENKAT & PbrDIOX3 METPKLIKLGGSLLVPSVLELTKQSPAEVPARYIRNDLEPMTDLSSASLTDQTIPVIDLONLLSPEPELELEKLHSGCKEWGFF &S

QVMNHGVDILLVEKVKSEIQGFFNLPIDEKNKFWQEEGDLEGYGKAFVHSEDEKLDWADMFFILTAQPQYMRKPRVFPKLPL RLRETIESYSLELSKLGLTLLDLMGKALQIETGVMSELFEDGRQOTMRMNYYPPCPQPEHVIGLTPHSDGGALTILLOLNQVD GLQIRKEEIWVPIKPLPNAFVVNIGDILEIMSNGVYRSVEHRATINSSKERLSVAIFOSPKHGTEIGPILSMITPEAPALFKTIPYE

DYLRKFFSRKLGGKSFVDSMRIGESDEDNNTA PbrDIOX4 METQKQENFGASLSVPNVQELAKQSPEQVPDRYIRSDQDSSTNISCPSMTDQIPVIDLOSLLSPDPIIGELELERLHSACKEW

GFFQVVNHGVDNLLVEKVKSEIQOGFFNLPMDEKKKFWQEEGDFEGFGQAFVFSEDQKLDWGDVFFILTAPQHMRKPRLFP KLPLPFRKTIESYSLETNKLSMTLLELMEKALKIETGVMTELFEGGIQORMRMTYYPPCPQPKHVIGLTPHSDPDALTILLQLNE VDGLQIRKEKIWVPIKPLSNAFVVNIGDILEIMSNGIYRSVEHRATVNSTKERLSVATFHSPRKDTEIGPILITPETPALFRTSGF EDYFRKFFAHKLNGKSFLSSIRIGETDEGNNAT

FR TERRE E PbrDIOX5 MEAPKLIMLGGSLFVPSVQELAKQSLAEVPVRYVRDDQDTLGNNINITPMSMIDOSIPVIDLEKLLSPEPIVGELELERLHSAC

KEWGFFQVVNHGVDSLLVEKVKSEIEGFFKLPMDEKTKFWQEEGDIEGFGQVFVHSQDQAKLDWGDMFLMQTLPRHTRKP RLFPNLPLPLROQTIESYSSELSKLVLTLVDLMGKALQMESGVLTELFENGIQORMRMNYYPPCPQPEQVIGLTPHSDVGGLTIL LQLNEVDGLQIKKDKVWVPIKPLANAFVVNVGDALEIMSNGIYRSVEHRATINSTKERLSIATFHNPRADREIGPIPSMISPETP

ALFKTTGYEEYFKKFFSRKLEGKSFLDSLRIREGDEHCGRLDVKGPCN PbrDIOX6 MEIPNPIKIGSSLLVPSVQELAKQSFAEVPARYIRNDVDPLITKLSDVSLIDQTVPVIDLOKLLSPEPIVGELELERLHSACKEW

GFFQVVNHGVDNLLVEKVKSEIQOGFFNLPMEEKKKFWQEEGDFEGFGQMFVQSEEQKLDWGDMFFILTAPQHMRKPRLF SKLPLPLRETIESYSLELIKLGLTIIKLMEKALQIDAGVMAELFEDGIHTMRMNYYPPCPQPEHVIGLTPHSDGGGLTILLQLNE

VDGLOQIRRENIWVPIKPLPNAFVVNIGDILEILSNGIYRSVEHRSTVNATKERLSVATFQNPKQESVIGPNMITPERPALFRKIVY NM KDYMKKLFSRKLDGKSFLDSLRIGEGDERP x PbrDIOX8 METLKTVKPGGSLFIPNGQELAKQSLEEVYVGNDQDTMLLIGQTIPVIDLOKLLSPEPITGDMELDKLHSACKEWGFFQVVN &S

HGVDILLVEKVKSEVHDFFNIPMDEKKPFWQEEGDLEGFGQVFITSEDQQLDWGDMFFMVTLPKHMRKPRLFLKLPLPLRE TIESYSLKLSKLGVTLVELMGKALQMEDRIMSELFDDGRQTMRMNYYPPCPQPEQVIGLTPHSDPGGLTILLELNEVNGLIRK ENIWVPIIPLPNAFIVNIGDILEIMSNGIYHSVEHRATINSTKERLSVAMFNSPKVDTEIGPIHSMITPETPALFRTIGYDEYLKIFF

SRKLDGKSLLESMKI PbrDIOX10 MEAPKLIMLGGSLFVPSVQELAKQSLAEVPVRYVRDDQDTLGNNINITPMSMIDOSIPVIDLEKLLSPEPIVGELELERLHSAC

KEWGFFQVVNHGVDSLLVEKVKSEIEGFFELPVDEKKKFWQEEGDIEGFGQIFVHSEDQKLDWADMFYMLTLPPNMRKPR LFPNLPLPLROQTIDSYSSELSKLVLTLVDLMGKALQMESGVLTELFENGIQORMRMNYYPPCPQPEQVIGLTPHSDVGGLTILL QLNEVDGLQIKKDKIWVPIKPLRNAFVVNVGDALEIMSNGIYRSVEHRATINSTKERLSIATFHNPRADREIGPIPSMISPETPA LFKTTGYEEYFKKFFSRKLEGKSFLDSLRIGEGDEHCGRLXVKGXCN

FE RR PbrDIOX11 METPKLMKLGGSLFVPSVQELAKQSLAEVPARYVRDDRDMVGNIINVTPMSMIDOSIPVIDLEKLLSPDLIVGELELERLHSA

CKEWGFFQVVNHGVDSLLVEKVKSEIEGFFELPMDEKKKFWQEEGDAEGFAQFFVOSEDQKLDYSGDMFFMLNLPQHMR KPRLFLKLPLPLRETIESYSLKLSKLGVTLVELMGKALQMEDRIMSELFDDGRQTMRMNYYPPCPQPEQVIGLTPHSDPGGL TILLELNEVNGLIRKENIWVPIIPLPNAFIVNIGDILEIMSNGIYHSVEHRATINSTKERLSVAMFNSPKVDTEIGPIHSMITPETPA

LFRTIGYDEYLKIFFSRKLDGKSLLESMKI PbrDIOX13 METPKLRDFGSFLPVPSVQELAKQVLTEIPPRYIRTDLEALNKLSCASNTDQTVPIIDMQCLLSAEPEMELEKLHSACKEWGF

FRVVNHGVDNLESVKSEIESFLNLPVNAKNKYGQKQGDDQGFGSRFVLSEEQKLDWGDFFYMVTRPLYLRKPHLFPELPLP LRETIESYSSEVSKLAMALFEMMGKALKIETGVMTEIFEGGMQAMRMNYYPPCPRPDLVIGLNAHSDFGGLTILLOLNEVEG

LEIRNKGEWVSVKPLANAFVVNVGDVMEILTNGIYHSVEHRATINSSKERLSVATFHYPKLETGIGPLPCMITPKTPALFGRIE NM RYELLLRKYYARKLNGKSTLDCMRIGNGFEDDNTA & PbrDIOX18 MEAPKLIMLGGSLFVPSVQELAKQSLAEVPARYVRDDQDTLGNNINITPMSMIDOSIPVIDLEKLLSPEPIVGELELERLHSAC &S

KEWGFFQVVNHGVDSLLVEKVKSEIEGFFELPVDEKKKFWQEEGDIEGFGQIFVHSEDQKLDWADMFYMLTLPPNMRKPR LFPNLPLPLROQTIDSYSSELSKLVLTLVDLMGKALQMESGVLTELFENGIQORMRMNYYPPCPQPEQVIGLTPHSEVGGLTILL QLNEVDGLQIRKEKIWVPIKPLSNAFIVNIGDILEIMSNGIYRSVEHRATVNSTKERLSVATFHSPRKDTEIGPILITPETPALFRT

SGFEDYFRKFFAHKLNGKSFLSSIRIGETDEGNNAT PbrDIOX19 MSMIDOQSIPVIDLEKLLSPEPIVGELELERLHSACKEWGFFQVVNHGVDSLLVEKVKSEIEGFFELPVDEKKKFWQEEGDIEG

FGQIFVHSEDQKLDWADMFYMLTLPPNMRKPRLFPNLPLPLROTIDSYSSELSKLVLTLVDLMGKALQMESGVLTELFENGI QRMRMNYYPPCPQPEQVIGLTPHSDVGGLTILLOLNEVDGLOQIRKEKIWVPIKPLSNAFIVNIGDILEIMSNGIYHSVEHRATIN STKERLSVAMFNSPKVDTEIGPIHSMITPETPALFRTIGYDEYLKIFFSRKLDGKSLLESMKI

Fa TERRE

GFFQVVNHGVDNLVMEKIKTEIOGFFNLSLDEKQKFWKKEGDAEGFGQNFIESEDQKLDWGDTFGMFTLPIHMRNPRLFPE LPLPLRETIESYSLDVRKLALALIGLMEKALKIKTSAMSELFEDGGQAMRMNYYPPCPQPEHVIGLTPHSDAGGLTILLOLNEV DGLQIKKDKIWVPIKPLPNAFVVNIGDILEIMTNGIYRSVEHRATINSSKERLSVAAFHSPKGDTLIGPMVSLITPETPALFRTIG

YQDYMKKFMSRKLDGKSLVNSMRIGEGDEDK PbrDIOX- METPTLMKLGNGLSVPSVQELAKATLAEIPSRYICTDENLLTMGASTTDNETVPVIDLONLLSPEPVIGMLELDRLHSACKEW ZSNV- GFFQLVNHGVDALLVDNEVOQGFFNLPMDEKTKYGQKDGDDEGFGQFFVISEDQKLDWADVFYMSTLPLHSRKPHLFPELP 2004018 LPLRETMESYSSEMKKLSMVLFDMMGKALQVVEIKGITELFEDGAQQIRMNYYPPCPQPELVFGLTSHSDFDGLTILLOLGE

VEGLOQIKKEERWISIKPLPDAFIVNVGDILEIMTNGIYRSVDHRAVVNSIKERLTIATFHDPRLEAEIGPISSLITPETPALFKRGV

FEDLLKEMFLRKLDGKSFLDCMRM NM PrhDIOX- GNGLSVPSVQELAKQTLAEIPSRYICTDENPLITGASVVDDETVPVINLONLLSPEPVIGKLELDKLHSACKEWGFFQVVNHG &s MVTX- VNDSLVDSVKSEIEGFFNLPANEKLKYGQKDGDVEGFGQHFVVSEDQKLDWADVFYMVTLPVRLRKPHLFPELPLPLRDTL &S 2001522 DSYSSELNKLSMVLLEMMEKALKLVECKGITDFFEDGFQQMRMNYYPPCPRPELVTGLTSHSDFGGLTILLQLNDVEGLOQIK

KEERWISIKPLPNAFIVNIGDVLEIMSNGIYRSVDHRAVINSTKVRMSVATFHDPRLEAVIGPISSLITPETPALFKRGVFEDLLK

EMFLRKLDGKSFLDCMRI PseDIOX- LMKLANGMSVPIVQELAKLTVGEIPSRYICTDGNLLTMGASVIDYETVPVIDLONLOSREPVIEKLELDRLHSACKEWGFFQLL JSVC- NHGVDASLMDNVRSEIRGFFNLPISDKMKYGQKDGDEEGFGQHFIVSEDQKLDWVDAFMMFTLPLHSRNPRLTPEFPQPL 2005842 RETVESYSSEMKKLSVLLFELMEKALQVKGITEMFEDGLQOSIRMNYYPPCPRPELAIGLTSHSDFDGLTILLQLNEVEGLOIKK

EERWISIKPLPNAFIVNVGDVLEVMTNGIYRSVDHRAVVNSTKERLSIATFHDPELESEIGPIASLITPETPALFKRGRFKDLLK ENLSTKLDGKSFLDCIRM

RE TREE CYP2D6 MGLEALVPLAVIVAIFLLLVDLMHRRORWAARYSPGPLPLPGLGNLLHVDFOQNTPYCFDOQLRRRFGDVFSLQLAWTPVVVL

NGLAAVREALVTHGEDTADRPPVPITQILGFGPRSQGVFLARYGPAWREQRRFSVSTLRNLGLGKKSLEQWVTEEAACLCA AFANHSGRPFRPNGLLDKAVSNVIASLTCGRRFEYDDPRFLRLLDLAQEGLKEESGFLREVLNAVPVLLHIPALAGKVLRFQ KAFLTQLDELLTEHRMTWDPAQPPRDLTEAFLAEMEKAKGNPESSFNDENLRIVVADLFSAGMVTTSTTLAWGLLLMILHPD VORRVOQEIDDVIGAVRRPEMGDQAHMPYTTAVIHEVORFGDIVPLGVTHMTSRDIEVOGFRIPKGTTLITNLSSVLKDEAV WEKPFRFHPEHFLDAQGHFVKPEAFLPFSAGRRACLGEPLARMELFLFFTSLLQHFSFSVPTGQPRPSHHGVFAFLVTPSP

YELCAVPR Tabela 5. Enzimas candidatas à N-desmetilase are TREE MTIKEMPQPKTFGELKNLPLLNTDKPVQALMKIADELGEIFKFEAPGRVTRYLSSQRLIKEACDESRFDKNLSQAAKFARDF 3 AGDGLVTSWTHEKNWKKAHNILLPSFSQQAMKGYHAMMVDIAVQLVQKWERLNADEHIEVSEDMTRLTLDTIGLCGFNY &

RFNSFYRDQPHPFIISMVRAADEVMNKLQRANPDDPAYDENKRQFQEDIKVMNDLVDKIIADRKARGEQSDDLLTQMLNG KDPETGEPLDDGNIRYQIITFLIAGHETTSGLLSFALYFLVKNPHVLQKVAEEAARVLVDPVPSYKQVKQLKYVGMVLNEAL RLWPTAPAFSLYAKEDTVLGGEYPLEKGDEVMVLIPQLHRDKTVWGDDVEEFRPERFENPSAIPQHAFKPFGNGOQRACIG QQFALHEATLVLGMMLKHFDFEDHTNYELDIKETLTLKPKGFVVKAKSKKIPLGGIPSPSTEQSAKKVRKKAENAHNTPLLV LYGSNMGTAEGTARDLADIAMSKGFAPQVATLDSHAGNLPREGAVLIVTASYNGHPPDNAKQFVDWLDQASADEVKGVR YSVFGCGDKNWATTYQKVPAFIDETLAAKGAENIADRGEADASDDFEGTYEEWREHMWSDVAAYFNLDIENSEDNKSTL SLQFVDSAADMPLAKMHGAFSTNVVASKELQQPGSARSTRHLEIELPKEASYQEGDHLGVIPRNYEGIVNRVTARFGLDA SQQIRLEAEEEKLAHLPLAKTVSVEELLQYVELQDPVTRTQLRAMAAKTVCPPHKVELEALLEKQAYKEQVLAKRLTMLEL

LEKYPACEMKFSEFIALLPSIRPRYYSISSSPRVDEKQASITVSVVSGEAWSGYGEYKGIASNYLAELQEGDTITCFISTPOS are TERRE ss

EFTLPKDPETPLIMVGPGTGVAPFRGFVQARKQLKEQGQSLGEAHLYFGCRSPHEDYLYQEELENAQSEGIITLHTAFSR MPNQPKTYVQHVMEQDGKKLIELLDQGAHFYICGDGSQMAPAVEATLMKSYADVHQVSEADARLWLQQLEEKGRYAKD

VWAG CYP3A4-1 MALIPDLAMETWLLLAVSLVLLYLYGTHSHGLFKKLGIPGPTPLPFLGNILSYHKGFCMFDMECHKKYGKVWGFYDGQQP

VLAITDPDMIKTVLVKECYSVFTNRRPFGPVGFMKSAISIAEDEEWKRLRSLLSPTFTSGKLKEMVPIIAQYGDVLVRNLRRE AETGKPVTLKDVFGAYSMDVITSTSFGVNIDSLNNPQDPFVENTKKLLRFDFLDPFFLSITVFPFLIPILEVLNICVFPREVTN FLRKSVKRMKESRLEDTQKHRVDFLQLMIDSQNSKETESHKALSDLELVAQSIIFIFAGYETTSSVLSFIMYELATHPDVOQ KLQEEIDAVLPNKAPPTYDTVLQMEYLDMVVNETLRLFPIAMRLERVCKKDVEINGMFIPKGVVVMIPSYALHRDPKYWTE

PEKFLPERFSKKNKDNIDPYIYTPFGSGPRNCIGMRFALMNMKLALIRVLONFSFKPCKETQIPLKLSLGGLLQPEKPVVLK N VESRDGTVSGA & CYP3A4-2 MALIPDLAMETWLLLAVSLVLLYLYGTHSHGLFKKLGIPGPTPLPFLGNILSYHKGFCMFDMECHKKYGKVWGFYDGQQP &S

VLAITDPDMIKTVLVKECYSVFTNRRPFGPVGFMKSAISIAEDEEWKRLRSLLSPTFTSGKLKEMVPIIAQYGDVLVRNLRRE AETGKPVTLKDVFGAYSMDVITSTSFGVNIDSLNNPQDPFVENTKKLLRFDFLDPFFLSIIFPFLIPILEVLNICVFPREVTNFL RKSVKRMKESRLEDTQKHRVDFLQLMIDSQNSKETESHKALSDLELVAQSIIFIFAGYETTSSVLSFIMYELATHPDVQQKL QEEIDAVLPNKAPPTYDTVLQMEYLDMVVNETLRLFPIAMRLERVCKKDVEINGMFIPKGVVVMIPSYALHRDPKYWTEPE KFLPERFSKKNKDNIDPYIYTPFGSGPRNCIGMRFALMNMKLALIRVLONFSFKPCKETQIPLKLSLGGLLQPEKPVVLKVE

SRDGTVSGA McaCYP82-4 | MIMMFIDYYSSWLPQTLLLOSILLAVSLVIFINLFLTRRRSYSSKSHTNIIHPPKAAGALPVIGHLYTLFRGLSAGVPLYRQLDA

MADRYGPAFIIHLGVYPTLVVTCRELAKECFTTNDQTFATRPSTCAGKYIGYNYAFFGFAPYGPYWREARKIATVELLSNY

RLDSLRHVREAEVGRNVDELYALHASSSTNKQNMMKIDMKQWFDQVTLNVILMMVVGKRCVTTGGNEEEVRVVKVLHEF a TERRE

FKHLGTLSVSDVVPYVEWMDLDGNIGRMKSTAKELDCILGRWLEEHRRERRSDFMDAMLAMVEGIKIPYYDSDTVIKAICL NLLNAGSDTLGITMTWALSLLLNNRHVLKKVKDELDVHVGKNRQVEELDVKNLVYLHAVVKETLRLFPPAPLGVPHEAME DCVVGGFHVAKGTRLVVNVWKLHRDPSVWSDPLAFKPERFLDNNTVDVRGQHFQLLPFGSGRRGCPGITFALQVAHLTL

ARLLHGFEWDTPDGAPVDMSEVSVLTTAKKNPVEVLFTPRLPAEVYTOQN NsaCYP82-4- | MLSIHDSTMVFLQLQAICGIFGFIFIIIWWTRWKSSNKMKAPEVAGAWPVIGHLHLLGGGRPLYQLLGDMSDKYGPAFTLR

MGIQKALVVSSWEVAKECLTTNDRALATRPSSAGGKYMGYNNALIPFSPYGPYWRDMRKIATLELLSNHRLEELKHVREM EINTCISDMYKLCQVEDGVEIKPISVDLSQWFADLTFNVVVMMITGKRYIGSTDAGDMNEIRHFQAALVKFMRLLRISLLVDV FPVLOWINYGGFKGVMKSTARDIDSVLENWLQEHORKRLSPDFNGNHDFIDVMISTLEGTEFSDYDHNTIIKAISMAMVVG GTDTTTTTLIWAISLLLNNPNAMKKVQEELEIHVGKERNVDGSDIQHLVYLQAVVKETLRLYPPVPLSVMHQAMEDCVIGSY NM

NIQAGTRVLFNLWKLHRDSSVWSDPLEFRPERFLTSHVDVDVRGQHFELIPFEGSGRRSCPGISFALQVIHLTIARLFHGFNL S TTPGNSSVDMSEISGATLSKVTPLEVLVTPRLSSKLYN &S HcaCYP82-10 | MDSLLQLQIIGALAALIFTYKLLKVICRSPMTDGMEAPEPPGAWPIIGHLHLLGGQDPIARTLGVMTDKYGPILKLRLGVHTG

LVVSNWELAKECFTTNDRVLASRPMGAAGKYLGYNYAIFGLAPHGPYWSEVRKIVLRELLSNQSLEKLKHVRISEINTCLK NLFSLNNGNTPIKVDMKQWFERPMFNVVTMMIAGKRYFSMENDNEAMNFRKVATEFMYLTGVFVVSDALPYLEWLDLOG HVSAMKRTAKELDIHVGKWLEEHRRAKLLGETKNEDDFVDVLLTILPEDLKDNQTYIHDRDTIIKATALALFLAASDTTAITLT WALSLILNNPDVLKRAQDELDKHVGKEKLVKESDIINLVYLQAIIKETLRLYPAAPLLLPHEAMEDCTVGGYHVPKGTRIFVNI WKLORDPRVWFDPNEFRPERFLTTHANVDFKGQHFEYIPFSSGRRVCPGITFSTQIMHLTLAHLLHEFNIVTPTKSNAGDM

TESLGITMPKATPLEVLLTPRLPSNLYNQYRD EcaCYP82-7 MNLLIFFQFLLQFQVLVGLSVLLAFSYYLWVSKNPKINKFKGKGALLAPQAAGAWPIVGHLPQLVGPKPLFRILGAMADNY [TT | sprronErSSNImECrTORAASTPSNSOMENALEGFALTCSSTRONATIELSARE,

Fa RE

LLKHVPYTEIDTCIKQLHRLWTKNNKNQNNPELKVEMNQFFTDLTMNVILKLVVGKRFFNVDDAADHEKEEARKIQOGTIFEF FKLTEGSVSAGALPLLNWLDLNGQKRAMKRTAKKMDSIAEKLLDEHRQKRLSKEGVKGTHDHNDFMDVLLSILDADOGD YSHHPFNYSRDHVIKATTLSMILSSMSISVSLSWALSLLLNNRHVLKKAQDELDMNVGKDRQVEEGDIKNLVYLQAIVKETF RMYPANPLLLPHEAIEDCKIGGFNVPAGTRVVVNAWKLQHDPRVWSNPSEFKPERFLNDQAAKVVDVRGOQNFEYLPFGS

GRRVCPGISFSLQTIHMSLARLVQAFELGTPSNERIDMTEGSGLTMPKTTPLHVLLNPRLPLPLYE GfICYP82-8 MELINSLEIQPITISILALLTVSILLYKIIWNHGSRKNNKSNKNNRKTSSSAGVVEIPGAWPIIGHLHLFNGSEQMFHKLGSLAD

QYGPAPFFIRFGSRKYVVVSNWELVKTCFTAQSQIFVYSRPPMLAMNILFFPKDSLSYIQHGDHWRELRKISSTKLLSSHRV ETQKHLIASEVDYCFKQLYKLSNNGEFTLVRLNTWCEDMALNVHVRMIAGMKNYVAAPGSGEYGGQARRYRKALEEALD

LLNQFTITDOVWVPWLGWLDHFRDVVGRMKRCGAELDSIFATWVEEHRVKRASGKGGDVEPDFIDLCWESMEQLPGNDPAT NM VIKLMCKEHIFNGSGTSSLTLAWILSLIMNNPYVIKKAREELEKHVGNHRQVEESDLPNLLYIQAIIKEGMRLYTPGPFIDRNT 3 TEDYEINGVHIPAGTCLYVNLWKIHRDPNVYEDPLEFKPERFLKNNSDLDLKGQNYQLLPFGAGRRICPGVSLALPLMYLT & VSRLIHGFDMKLPKGVEKADMTAHGGVINQRAYPLEVLLKPRLTFOQA º SdiCYP82-3 MTIGALALLSFIYFLRVSVIKRTKYTNTAVTATNKLENDEDEANHSKRVVAPPEVAGAWPILGHLPQLVGLKQPLFRVLGDMA

DKYGPIFIVRFGMYPTLVVSSWEMAKECFTTNDRVLASRPASASGKYLTYNYAMFGFTNGPYWREIRKISMLELLSHRRVEL LKHVPSTEIDSSIKQLYHLWVENQNQNKQGDHQOVKVDMSQLLRDLTLNIVLKLVVGKRLFNNNDMDHEQDEAARKLQKTMV ELIKVAGASVASDALPFLGWLDVDGLKRTMKRIAKEIDVIAERWLQEHRQKKLTSNDKGGSNNIQGGGGDNDFMDVMLSILD DDSNFFINYNRDTVIKATSLTMILAGSDTTTLSLTWALTLLATNPGALRKAQDELDTKVGRDRQVDERDIKNLVYLQAIVKETL RMYPAAPLAIPHEATQDCIVGGYHVTAGTRVWVNLWKLQRDPHAWPNPSEFRPERFLAVENDCKQQGTCDGEAANMDFR

GQHFEYMPFGSGRRMCPGINFAIQIIHMTLARLLHSFELRVPEEEVIDMAEDSGLTISKVTPLELLLTPRLPLPLYI ora TERRE

FGMYPTLVVSSWEMAKECFTTNDRFLASRPASAAGKYLTYDFAMLSFSFYGPYWREIRKISMLELLSHRRVELLKHVPSTEI DSSIKQLYHLWVENQNQNKQGDHQOVKVDMSQLLRDLTLNIVLKLVWGKRLFNNNDMDHEQDEAARKLQKTMVELIKVAGA SVASDALPFLGWLDVDGLKRTMKRIAKEIDVIAERWLQEHRQKKLTSNDKGGSNNIQGGGGDNDFMDVMLSILDDDSNFFI NYNRDTVIKATSLTMILAGSDTTTLSLTWALTLLATYPLCALRKAQDELDTKVGRDRQVDERDIKNLVYLQAIVKETLRMYPAA PLAIPHEATQDCIVGGYHVTAGTRVWVNLWKLORDPHAWPNPSEFRPERFLAVENDCKQQGTCDGEAANMDFRGQHFEY

MPFGSGRRMCPGINFAIQIIHMTLARLLHSFELRVPEEEVIDMAEDSGLTISKVTPLELLLTPRLPLPLYI CmaCYP82-6 | MDLFIFESRFQYIVGLLAFLTFFYYLWRVSITGTRIKTNQNIMNGTNMMAPEAAGAWPIVGHLPQLVGPQPLFKILGDMADKY

GSIFMVRFGMHPTLVVSSWEMAKECFTTNDKFLASRPTSAGGKYLTYDFAMFGFSFYGPYWREIRKISTLELLSHRRVELLK

HVPYTEIGGSIKQLYKLWMETAONQNKQRDDHQVKVDMSQVFGYLTLNTVLKLVVGKGLFNNNDMNHEQEEGRKLHETVLE NM FFKLAGVSVASDALPFLGWLDVDGQKRSMKRIAKEMDLIAERWLQEHRQKRLTSNNKASSGHDDFMSVLLSILDDDSNFFN 2 YNRDTVIKATSLNLILAASDTTSVSLTWVLSLLVTNPGALKKVQDELDTKVGRNRHVEERDIEKLVYLQATVKETLRMYPAGP & LSVPHEATQDCTVGGYQVTAGTRLVVNVWKLORDPRVWPNPSEFKPERFLPDGCEVGCGEAANMDFRGQHFEYIPFGSG º

RRMCPGIDFAIQIIHMTLACLLHAFEFQVPSSLDKHLVPAVIDMSEGSGLTMPKVTPLEVLLNPRLPLPLYEL EcaCYP82-5 MEKPILLQLQPGILGLLALMCFLYYVIKVSLSTRNCNQLVRHPPEAAGSWPIVGHLPQLVGSGKPLFRVLGDMADKFGPIF

MVRFGVHPTLVVSSWEMAKECFTSNDKFLASRPPSAASIYMAYDHAMLGFSSYGPYWREIRKISTLHLLSHRRLELLKHV PHLEIHNFIKGLYGIWKDHAOKQAQQQPTARDDQDSVMLEMSQLFGYLTLNIVLSLVVGKRVCNYHADGHLDDGEEAGQOGQ KLHQTITDFFKLSGVSVASDALPFLGLFDLDGQKKIMKRVAKEMDFVAERWLQDKKSSLLLSSKSNNKQNEAGEGDVDDF MDVLMSTLPDDDDSFFTKYSRDTVIKANSLSMVVAGSDTTSVSLTWALSLLLNNIQVLRKAQDELDTKVGRDRHVEEKDID NLVYLQAIVKETLRMYPAGPLSVPHEAIEDCNVGGYHIKTGTRLLVNIWKLORDPRVWSNPSEFRPERFLDNQSNGTLLDF RGQHFEYIPFGSGRRMCPGVNLATPILHMTLARLLOSFDLTTPSSSPVDMTEGSGLTMPKVTPLKVLLTPRLPLPLYDY

E TERRE PbrCYP82-5 MDVAIIVDHHYLQPFVSIAGLLALLSFFYCIWVFIIRPRIIKSNLDERKLSPSSPPEVAGAWPIVGHLPQLIGSTPLFKILADMS

NKYGPIFMVRFGMYPTLVVSSWEMSKECFTTNDRLFATRPPSAAGKYLTKALFAFSVYGPYWREIRKISTIHLLSLRRLELL KHGRYLEIDKCMKRLFEYWMEHHKNIISTTSSVKVNMSQVFAELSLNVVLKIIVGKTLFIKNGNEDYTKEEEEGQKLHKTILK FMELAGVSVASDVLPFLGWLDVDGQAQKKQMKRVYKEMNLIASKWLGEHRERKRLQIIQOKRGAARGSNYDDGNDFMDVLM SILDEENDDLFFGYSRDTVIKSTCLQLIVAASDTTSLAMTWALSLLLTNPNVLQOKAQDELDTKVGRDRIIEEHDIECLVYLQA! VKETLRLYPPAPLSLPHEAMEDCTVGGYQVKAGTRLVVNLWKLORDPRVWSNPLEFKPERFLPOSDGGFGGEEARMDF

RGQHFEYTPFGSGRRICPGIDFFLOTVHMALARLLQAFDFNTAGGLVIDMVEGPGLTMPKVTPLEVHLNPRLPVTLY PbrCYP82-6 MQVDWPNILQKYYPIITCESLLTLLSFYYIWVSITKPSRNSKTKLPPPEVAGSWPIVGHLPQLVGSTPLFKILANMSDKYGPIF

MVRFGMHPTLVVSSWEMSKECFTTNDKFLASRPPSASAKYLGYDNAMFVFSDYGPYWREIRKISTLQLLTHKRLDSLKNI NM PYLEINSCVKTLYTRWAKTOSQIKQNVGGAADDFVKVDMTEMFGHLNLNVVLRLVVGKPIFIOKDNADEDYTKDGHNKEE 8 LGQKLHKTIIEFFELAGASVASDVLPYLGWLDVDGQKKRMKKIAMEMDLFAQKWLEEHRQKGINHDNENDFMAVLISVLG & EGKDDHIFGYSRDTVIKATCLTLIVAATDTTLVSLTWALSLLLTNPRVLSKAQDELDTVVGKERNVEDRDVNHLVYLQAVIKE º

TLRLYPPSPLAVPHEAIENCNVGGYEVKARTRLLVNLWKIHRDPRVWSNPLEFKPERFLPKLDGGTGEASKLDFKGQDFV

YTPFGSGRRMCPGINFASQTLHMTLARLLHAFDFDIESNGLVIDMTEGSGLTMPKVTPLQVHLRPRLPATLY McaCYP82-4 | MIMMFIDYYSSWLPQTLLLOSILLAVSLVIFINLFLTRRRSYSSKSHTNIIHPPKAAGALPVIGHLYTLFRGLSAGVPLYRQLDA

MADRYGPAFIIHLGVYPTLVVTCRELAKECFTTNDQTFATRPSTCAGKYIGYNYAFFGFAPYGPYWREARKIATVELLSNY RLDSLRHVREAEVGRNVDELYALHASSSTNKQNMMKIDMKQWFDQVTLNVILMMVVGKRCVTTGGNEEEVRVVKVLHEF FKHLGTLSVSDVVPYVEWMDLDGNIGRMKSTAKELDCILGRWLEEHRRERRSDFMDAMLAMVEGIKIPYYDSDTVIKAICL NLLNAGSDTLGITMTWALSLLLNNRHVLKKVKDELDVHVGKNRQVEELDVKNLVYLHAVVKETLRLFPPAPLGVPHEAME DCVVGGFHVAKGTRLVVNVWKLHRDPSVWSDPLAFKPERFLDNNTVDVRGQHFQLLPFGSGRRGCPGITFALQVAHLTL

Fa BRR EL FESTA mr NsaCYP82-4 | MLSIHDSTMVFLQLOQAICGIFGFIFIIIWWTRWKSSNKMKAPEVAGAWPVIGHLHLLGGGRPLYQLLGDMSDKYGPAFTLR

MGIQKALVVSSWEVAKECLTTNDRALATRPSSAGGKYMGYNNALIPFSPYGPYWRDMRKIATLELLSNHRLEELKHVREM EINTCISDMYKLCQVEDGVEIKPISVDLSQWFADLTFNVVVMMITGKRYIGSTDAGDMNEIRHFQAALVKFMRLLRISLLVDV FPVLOWINYGGFKGVMKSTARDIDSVLENWLQEHORKRLSPDFNGNHDFIDVMISTLEGTEFSDYDHNTIIKAISMAMVVG GTDTTTTTLIWAISLLLNNPNAMKKVQEELEIHVGKERNVDGSDIQHLVYLQAVVKETLRLYPPVPLSVMHQAMEDCVIGSY NIQAGTRVLFNLWKLHRDSSVWSDPLEFRPERFLTSHVDVDVRGQHFELIPFEGSGRRSCPGISFALQVIHLTIARLFHGFNL

TTPGNSSVDMSEISGATLSKVTPLEVLVTPRLSSKLYN HcaCYP82-10 | MDSLLQLQIIGALAALIFTYKLLKVICRSPMTDGMEAPEPPGAWPIIGHLHLLGGQDPIARTLGVMTDKYGPILKLRLGVHTG NM LVVSNWELAKECFTTNDRVLASRPMGAAGKYLGYNYAIFGLAPHGPYWSEVRKIVLRELLSNQSLEKLKHVRISEINTCLK & NLFSLNNGNTPIKVDMKQWFERPMFNVVTMMIAGKRYFSMENDNEAMNFRKVATEFMYLTGVFVVSDALPYLEWLDLOG &S

HVSAMKRTAKELDIHVGKWLEEHRRAKLLGETKNEDDFVDVLLTILPEDLKDNQTYIHDRDTIIKATALALFLAASDTTAITLT WALSLILNNPDVLKRAQDELDKHVGKEKLVKESDIINLVYLQAIIKETLRLYPAAPLLLPHEAMEDCTVGGYHVPKGTRIFVNI WKLORDPRVWFDPNEFRPERFLTTHANVDFKGQHFEYIPFSSGRRVCPGITFSTQIMHLTLAHLLHEFNIVTPTKSNAGVD

MTESLGITMPKATPLEVLLTPRLPSNLYNQYRD EcaCYP82-7 MNLLIFFQFLLQFQVLVGLSVLLAFSYYLWVSKNPKINKFKGKGALLAPQAAGAWPIVGHLPQLVGPKPLFRILGAMADNY

GPIFMLRFGVHPTVVVSSWEMTKECFTTNDRHLASRPSNAASQYLIYEVYALFGFSLYGSSYWRDARKIATLELLSHRRLE LLKHVPYTEIDTCIKQLHRLWTKNNKNQNNPELKVEMNQFFTDLTMNVILKLVVGKRFFNVDDAADHEKEEARKIQOGTIFEF FKLTEGSVSAGALPLLNWLDLNGQKRAMKRTAKKMDSIAEKLLDEHRQKRLSKEGVKGTHDHNDFMDVLLSILDADOGD

YSHHPFNYSRDHVIKATTLSMILSSMSISVSLSWALSLLLNNRHVLKKAQDELDMNVGKDRQVEEGDIKNLVYLQAIVKETF ra TERRE

RMYPANPLLLPHEAIEDCKIGGFNVPAGTRVVVNAWKLQHDPRVWSNPSEFKPERFLNDQAAKVVDVRGOQNFEYLPFGS [nermágã= 22005 SLaTI9ISLA VOMELSTPSNERDITEGCLTMPATTPIUMNTRAAE GfICYP82-8 MELINSLEIQPITISILALLTVSILLYKIIWNHGSRKNNKSNKNNRKTSSSAGVVEIPGAWPIIGHLHLFNGSEQMFHKLGSLAD

QYGPAPFFIRFGSRKYVVVSNWELVKTCFTAQSQIFVYSRPPMLAMNILFFPKDSLSYIQHGDHWRELRKISSTKLLSSHRV ETQKHLIASEVDYCFKQLYKLSNNGEFTLVRLNTWCEDMALNVHVRMIAGMKNYVAAPGSGEYGGQARRYRKALEEALD LLNQFTITDOVWVPWLGWLDHFRDVVGRMKRCGAELDSIFATWVEEHRVKRASGKGGDVEPDFIDLCWESMEQLPGNDPAT VIKLMCKEHIFNGSGTSSLTLAWILSLIMNNPYVIKKAREELEKHVGNHRQVEESDLPNLLYIQAIIKEGMRLYTPGPFIDRNT TEDYEINGVHIPAGTCLYVNLWKIHRDPNVYEDPLEFKPERFLKNNSDLDLKGQNYQLLPFGAGRRICPGVSLALPLMYLT

VSRLIHGFDMKLPKGVEKADMTAHGGVINQRAYPLEVLLKPRLTFOQA NM SdicYP82-3 MTIGALALLSFIYFLRVSVIKRTKYTNTAVTATNKLENDEDEANHSKRVVAPPEVAGAWPILGHLPQLVGLKQPLFRVLGDMA R DKYGPIFIVRFGMYPTLVVSSWEMAKECFTTNDRVLASRPASASGKYLTYNYAMFGFTNGPYWREIRKISMLELLSHRRVEL &S

LKHVPSTEIDSSIKQLYHLWVENQNQNKQGDHQOVKVDMSQLLRDLTLNIVLKLVVGKRLFNNNDMDHEQDEAARKLQKTMV ELIKVAGASVASDALPFLGWLDVDGLKRTMKRIAKEIDVIAERWLQEHRQKKLTSNDKGGSNNIQGGGGDNDFMDVMLSILD DDSNFFINYNRDTVIKATSLTMILAGSDTTTLSLTWALTLLATNPGALRKAQDELDTKVGRDRQVDERDIKNLVYLQAIVKETL RMYPAAPLAIPHEATQDCIVGGYHVTAGTRVWVNLWKLQRDPHAWPNPSEFRPERFLAVENDCKQQGTCDGEAANMDFR

GQHFEYMPFGSGRRMCPGINFAIQIIHMTLARLLHSFELRVPEEEVIDMAEDSGLTISKVTPLELLLTPRLPLPLYI SdiCcYP82-6 FCQFQOGIVGILLAFLTFLYYLWRASITGLRTKPKHNDFKVTKAAPEADGAWPIVGHFAQFIGPRPLFRILGDMADKYGSIFM

VRFGMYPTLVVSSWEMAKECFTTNDRFLASRPASAAGKYLTYDFAMLSFSFYGPYWREIRKISMLELLSHRRVELLKHVP STEIDSSIKQLYHLWVENQNQNKQGDHQVKVDMSQLLRDLTLNIVLKLVVGKRLFNNNDMDHEQDEAARKLQKTMVELIK VAGASVASDALPFLGWLDVDGLKRTMKRIAKEIDVIAERWLQEHRQKKLTSNDKGGSNNIQGGGGDNDFMDVMLSILDD

Fa TERRE

DSNFFINYNRDTVIKATSLTMILAGSDTTTLSLTWALTLLATYPLCALRKAQDELDTKVGRDRQVDERDIKNLVYLQAIVKET LRMYPAAPLAIPHEATQDCIVGGYHVTAGTRVWVNLWKLQRDPHAWPNPSEFRPERFLAVENDCKQQGTCDGEAANMD

FRGQHFEYMPFGSGRRMCPGINFAIQIIHMTLARLLHSFELRVPEEEVIDMAEDSGLTISKVTPLELLLTPRLPLPLYI CmaCYP82-6 | MDLFIFFESRFQYIVGLLAFLTFFYYLWRVSITGTRIKTNQNIMNGTNMMAPEAAGAWPIVGHLPQLVGPQPLFKILGDMADK

YGSIFMVRFGMHPTLVVSSWEMAKECFTTNDKFLASRPTSAGGKYLTYDFAMFGFSFYGPYWREIRKISTLELLSHRRVE LLKHVPYTEIGGSIKQLYKLWMETQNQNKQRDDHQVKVDMSQVFGYLTLNTVLKLVVGKGLFNNNDMNHEQEEGRKLHE TVLEFFKLAGVSVASDALPFLGWLDVDGQKRSMKRIAKEMDLIAERWLQEHRQKRLTSNNKASSGHDDFMSVLLSILDDD SNFFNYNRDTVIKATSLNLILAASDTTSVSLTWVLSLLVTNPGALKKVQDELDTKVGRNRHVEERDIEKLVYLQATVKETLR

MYPAGPLSVPHEATQDCTVGGYQVTAGTRLVVNVWKLORDPRVWPNPSEFKPERFLPDGCEVGCGEAANMDFRGQHF NM EYIPFGSGRRMCPGIDFAIQIIHMTLACLLHAFEFQVPSSLDKHLVPAVIDMSEGSGLTMPKVTPLEVLLNPRLPLPLYEL a EcaCYP82-5" | MEKPILLOLQPGILGLLALMCFLYYVIKVSLSTRNCNQLVRHPPEAAGSWPIVGHLPQLVGSGKPLFRVLGDMADKFGPIF &S

MVRFGVHPTLVVSSWEMAKECFTSNDKFLASRPPSAASIYMAYDHAMLGFSSYGPYWREIRKISTLHLLSHRRLELLKHV PHLEIHNFIKGLYGIWKDHAOKQAQQQPTARDDQDSVMLEMSQLFGYLTLNIVLSLVVGKRVCNYHADGHLDDGEEAGQOGQ KLHQTITDFFKLSGVSVASDALPFLGLFDLDGQKKIMKRVAKEMDFVAERWLQDKKSSLLLSSKSNNKQNEAGEGDVDDF MDVLMSTLPDDDDSFFTKYSRDTVIKANSLSMVVAGSDTTSVSLTWALSLLLNNIQVLRKAQDELDTKVGRDRHVEEKDID NLVYLQAIVKETLRMYPAGPLSVPHEAIEDCNVGGYHIKTGTRLLVNIWKLORDPRVWSNPSEFRPERFLDNQSNGTLLDF

RGQHFEYIPFGSGRRMCPGVNLATPILHMTLARLLOSFDLTTPSSSPVDMTEGSGLTMPKVTPLKVLLTPRLPLPLYDY PbrCYP82-5 MDVAIIVDHHYLQPFVSIAGLLALLSFFYCIWVFIIRPRIIKSNLDERKLSPSSPPEVAGAWPIVGHLPQLIGSTPLFKILADMS

NKYGPIFMVRFGMYPTLVVSSWEMSKECFTTNDRLFATRPPSAAGKYLTKALFAFSVYGPYWREIRKISTIHLLSLRRLELL

KHGRYLEIDKCMKRLFEYWMEHHKNIISTTSSVKVNMSQVFAELSLNVVLKIIVGKTLFIKNGNEDYTKEEEEGQKLHKTILK a TERRE

FMELAGVSVASDVLPFLGWLDVDGQAQKKQMKRVYKEMNLIASKWLGEHRERKRLQIIQOKRGAARGSNYDDGNDFMDVLM SILDEENDDLFFGYSRDTVIKSTCLQLIVAASDTTSLAMTWALSLLLTNPNVLOKAQDELDTKVGRDRIIEEHDIECLVYLQOAI VKETLRLYPPAPLSLPHEAMEDCTVGGYQVKAGTRLVVNLWKLORDPRVWSNPLEFKPERFLPOSDGGFGGEEARMDF

RGQHFEYTPFGSGRRICPGIDFFLOAOTVHMALARLLQAFDFNTAGGLVIDMVEGPGLTMPKVTPLEVHLNPRLPVTLY PbrCYP82-6 MQVDWPNILQKYYPIITCESLLTLLSFYYIWVSITKPSRNSKTKLPPPEVAGSWPIVGHLPQLVGSTPLFKILANMSDKYGPIF

MVRFGMHPTLVVSSWEMSKECFTTNDKFLASRPPSASAKYLGYDNAMFVFSDYGPYWREIRKISTLQLLTHKRLDSLKNI PYLEINSCVKTLYTRWAKTOSQIKQNVGGAADDFVKVDMTEMFGHLNLNVVLRLVVGKPIFIOKDNADEDYTKDGHNKEE LGQKLHKTIIEFFELAGASVASDVLPYLGWLDVDGQKKRMKKIAMEMDLFAQKWLEEHRQKGINHDNENDFMAVLISVLG

EGKDDHIFGYSRDTVIKATCLTLIVAATDTTLVSLTWALSLLLTNPRVLSKAQDELDTVVGKERNVEDRDVNHLVYLQAVIKE NM TLRLYPPSPLAVPHEAIENCNVGGYEVKARTRLLVNLWKIHRDPRVWSNPLEFKPERFLPKLDGGTGEASKLDFKGQDFV s YTPFGSGRRMCPGINFASQTLHMTLARLLHAFDFDIESNGLVIDMTEGSGLTMPKVTPLQVHLRPRLPATLY & PbrCYP82-7 MMDLAMFIDQYFSLAKIAGLLALLSFFYYLWISTLWSPRNPKLSSVSPPEVAGAWPILGHLPQLLGSRPLFKILADMSDNYG º

PIFMVRFGMHPTLVVSSWEMAKECFTTNDRFLAGRPSGAANKYLTFALFGFSTYGPYWREIRKIATLHLLSHRRLELLKHV PDLEVTNCMKHLHRRWIDSQNQIKQNDAAAGSVKVDMGRVFGELTLNVVLKLVAGKSIFFKNDNTRQYDSKDGHNKEEE EGKKLHKTIIDFYSLAGASVASDVLPFLGWLDVDGQKKRMKRVAKDMDFIAAKWLEEHRHQKRQTVLSSSATLGSSNHDD AKDFMDVLMSILDGENDDLFFGYSRDTVIKTTCLQLIASAADTTSVTMTWALALLITNPTILRKAQDELDTKVGKDRNIEERD INDLVYLQAIVKETLRMYPAGPLNVPHEAIADCNIGGYEVRAGTRLLVNLWKMHRDPRVWSNPSEFKPERFLPQLDGGSG GEAANLDFRGQDFEYLPFSAGRRMCPGIDFSLQTLHMTLARLLHGFDFNNDSAGIIIDMEEGSGLTMPKLTPLEIYLCPRLP AKLY

Tabela 6. Enzimas candidatas à N-metiltransferase e modificação de N [Nome Benea |

TICNMT MAVEGKQVAPKKAIIVELLKKLELGLVPDDEIKKLIRIQLGRRLOWGCKSTYEEQIAQLVNLTHSLRQMKIATEVETLDDQMYEVPIDFLKIMNG SNLKGSCCYFKNDSTTLDEAEIAMLELYCERAQIKDGHSVLDLGCGQGALTLYVAQKYKNSRVTAVTNSVSQKEFIEEESRKRNLSNVEVLL ADITTHKMPDTYDRILVVELFEHMKNYELLLRKIKEWMAKDGLLFVEHICHKTFAYHYEPIDEDDWFTEYVFPAGTMIIPSASFFLYFQDDVSV

VNHWTLSGKHFSRTNEEWLKRLDANVELIKPMFVTITGQCRQEAMKLINYWRGFCLSGMEMFGYNNGEEWMASHVLFKKK CjCNMT MAVEAKQTKKAAIVELLKQLELGLVPYDDIKQLIRRELARRLOWGYKPTYEEQIAEIQONLTHSLRQMKIATEVETLDSQLYEIPIEFLKIMNGSN

LKGSCCYFKEDSTTLDEAEIAMLDLYCERAQIQDGASVLDLGCGAGALTLHVAQKYKNCRVTAVTNSVSQKEYIEEESRRRNLLNVEVKLAD ITTHEMAETYDRILVIELFEHMKNYELLLRKISEWISKDGLLFLEHICHKTFAYHYEPLDDDDWFTEYVFPAGTMIIPSASFFLYFQDDVSVVNH WTLSGKHFSRTNEEWLKRLDANLDVIKPMFETLMGNEEEAVKLINYWRGFCLSGMEMFGYNNGEEWMASHVLFKKK PSCNMT MOQLKAKEELLRNMELGLIPDQEIRQLIRVELEKRLQOWGYKETHEEQLSQLLDLVHSLKGMKMATEMENLDLKLYEAPMEFLKIQHGSNMKQOS AGYYTDESTTLDEAEIAMLDLYMERAQIKDGQSVLDLGCGLGAVALFGANKFKKCQFTGVTSSVEQKDYIEGKCKELKLTNVKVLLADITTYE NS

TEERFDRIFAVELIEHMKNYQLLLKKISEWMKDDGLLFVEHVCHKTLAYHYEPVDAEDWYTNYIFPAGTLTLSSASMLLYFQDDVSVVNQWT N LSGKHYSRSHEEWLKNMDKNIVEFKEIMRSITKTEKEAIKLLNFWRIFCMCGAELFGYKNGEEWMLTHLLFKKK Fx o

PSTNMT MGSIDEVKKESAGETLGRLLKGEIKDEELKKLIKFQFEKRLQWGYKSSHQEQLSFNLDFIKSLKKMEMSGEIETMNKETYELPSEFLEAVFGK TVKQSMCYFTHESATIDEAEEAAHELYCERAQIKDGQTVLDIGCGAGGLVLYIAQKYKNCHVTGLTNSKAQVNYLLKQAEKLGLTNVDAILAD VTQYESDKTYDRLLMIEAIEHMKNLQLFMKKLSTWMTKESLLFVDHVCHKTFAHFFEAVDEDDW YSGFIFPPGCATILAANSLLYFQDDVSVV DHWVVNGMHMARSVDIWRKALDKNMEAAKEILLPGLGGSHETVNGVVTHIRTFCMGGYEQFSMNNGDEWMVAQLLFKKK ECTNMT MGSSAGEIMGRLMKGEIEDEELKKLIRHOWDRRIEWGYKPTHEKQLAFNLDFIKGLKEMVMSGEIDTMNKETYELPTAFLEAVFGKTVKQOSC CYFKDENSTIDEAEEAAHELYCERAQIKDGQTVLDIGCGAGGELVLYIAEKYKNCHVTGLTNSKAQANYIEQQAEKLELTNVDVIFADVTKFDT DKTYDRILVVETIEHMKNIQLFMKKLSTWMTEDSLLFVDHISHKTFNHNFEALDEDDWYSGFIFPKGCVTILSSSTLLYFQDDVSALDHWVVN GMHMARSVEAWRKKLDETIEAAREILEPGLGSKEAVNQVITHIRTFCIGGYEQFSYNNGEEWMITQILFKKK PSRNMT MSTTMETTKISQQDDLWKNMELGQISDEEVRRLMKIGIEKRIKWGTKPTQQEQLAQLLDFNKSLRGMKMATEIDTLENHKIYETPESFNQIIG GKESAGLFTDETTTTMEEANTKMMDLYCERAGLKDGHTILDLGCGAGLLVLHLAKKYKKSKITGITNTSSHKEYILKQCKNLNLSNVEIILADV TKVDIESTFDRVFVIGLIEHMKNFELFLRKISKWMKDDGLLLLEHLCHKSFSDHWEPLSEDDWYAKNFFPSGTLVIPSATCLLYFQEDVTVIDH WILSGNNFARSNEVILKRIDGKIEEVKDIFMSFYGIGREEAVKLINWWRLLCITANELFKYNNGEEWLISQLLFKKKLMTCI

Momo Jena oo

TIPNMT METKQTKKEAVANLIKRIEHGEVSDEEIRGMMKIQVAKRLKWGYKPTHEQQLAQLVTFAQSLKGMEMAEEVDTLDAELYEIPLPFLHIMCGK TLKFSPGYFKDESTTLDESEVYMMDLYCERAQIKDGQSILDLGCGHGSLTLHVAQKYRGCKVTGITNSVSQKEFIMDQCKKLDLSNVEIILED VTKFETEITYDRIFAVALIEHMKNYELFLKKVSTWIAQYGLLFVEHHCHKVFAYQYEPLDEDDWYTEYIFPSGTLVMSSSSILLYFQEDVSVVN

HWTLSGKHPSLGFKQWLKRLDDNIDEVKEIFESFYGSKEKAMKFITYWRVFCIAHSQMYSTNNGEEWMLSQVLFKKK PbrTNMT1 MGSIDEVKKESAGETLGRLLKGEIKDEELKKLIKFQFEKRLQOWGYKSSHQEQLSFNLDFIKSLKKMEMSGEIETMNKETYELPSEFLEAVFGK

TVKQSMCYFKHESATIDEAEEAAHELYCERAQIKDGQTVLDIGCGAGGLVLYIARKYKKCHVTGLTNSKAQVNYLLKQAEKLGLTNVDAILAD VTQOYESDKTYDRLLMIEAIEHMKNLQLFMKKLSTWMTEESLLFVDHVCHKTFAHFFEAVDEDDWYSGFIFPPGCATILAANSLLYFQDDVSVV

DHWVVNGMHMARSVDIWRKALDKNMEAAKEILLPGLGGSHEAVNGVVTHIRTFCMGGYEQFSMNDGDEWMVAQLLFKKK PbrTNMT2 MGSIEEVKKESAEETLGRLLRGEINDEELKKLIKYQLEKRLOWGYKSSHQEQLSFNLDFINSLKKMGMSGQVEAFTNEVYELPTECFEAAYG

KSMKLSGCYFKHESSTIDEAEEASHELYCERAQIKDGQTVLDIGCGAGGLVLYVAQKYKNCHVTGLTNSKEQVNYILKQAEKLGLRNVDVIL ADVTQYESDKTYDRILVIGVVEHMKNMQLFIKKLSTWMAEDSLLFVYDHSCHKTFNHFFEALDEDDWYSGYIFPPGCATFLSADSLLYFQDDV Nm SVVDHWVVNGMHFARTVDAWRKKLDKNMEAVKEILLPGLGGNHEAVNGVITHIRTCCVGGYVQAFSLNDGDEWMNAQLLFKKK 3 AmeNMT1 MCLFFAEKMGLMAEANNQQQLKKEDLLKNMELGLIPDEEIRKLIRVQLEKRLNWGYKSTHEQQLSQALLHLVHSLKKMKIATEMENLDLKLYE 8 APFSFVQIQHGSTIKESSGLFKDESTTLDEAEI!AMLDLYTKRAKIEDGOQSVLDLGCGLGAVTLYVAQKFKNCYVTGITSSVEQKDFIEGRCKEL o

KLSNVKVILADITTYETEEKYNRIFAVELIEHMKNYELLLRKISEWMKQDGLLFIEHVCHKTLAYHYEPLDEEDWYTNYIFPAGTLTLSSATLLLY

FQDDVAVVDQWTLSGKHYSRSHEEWLKRIDGNIEEVKEIMKSITKSEEEAKKLLNFWRIFCMCGAELFGYKNGEEWMMTHILFKKK GfINMT1 MDLMATSKQVKKKEELLKNMELGLVPDEEIRRLIRIELEKRLKWGYKPTHQQQLAQLLDLVHSLKKMKIATEMESLDLKLYEAPFSFVQIKHG STIKESSSYFKDESMTLDEAEI!AMLDLYVERAQIEDGQOSVLDLGCGLGAVTLHVAKKYKNCHVTGLTNSVEQKDFIEGKCKELNLSNVKVILA

DVTSHEMEDKFDRIFAVELIEHMKNYELLLRRISKWMKDDGLLFIEHVCHKTFAYHYEPIDEDDWYTEYIFPAGTLTLSSASLLLYFQDDVSVV

NHWTLSGKHYSRSHEEWLKRIDGNMDAVKEIMKSITKTEEEAVKLINFWRIFCMCGAELFGYKDGEEWMMSHVLFKKKQLLQOQC EcaNMT1 MVDLKVEKEELLKSMELGLVPDEDIRKHIRSQLEKRLKWGYKPNHEQQLAQLLDVIHSLKKMKISKEYESFDLRLYEAPFDFHKIQLGTHLKE

SCSYYKDESTTLDEAEGAMLDLYTQKAKIEDGQSILDLGCGVGAVTLFVANKYKNCKVTGITSCQWQKDFIENKCKELNLTNVRVIIGDVTAY EMEETFDRIFAIELIEHMKNYELLLRKISKWMKDDGLLFIEHVCHKILAYPYEPIDEEDWFTEYIFPGGTLTLSSASLLLYFQDDVSVVEHSSLN

GKHYSRSHGEWLKNIDANIDEVKGIMRSITKTEEEAVRLVNFWRIFCMCGIELFGYNNGEEWMVSHILLKKK EcaNMT2 MAADLVVKKWNNKKELIDEMELGLVGDEEIRELIRNDLEKRLKWGYKSNHEQQLAQLLHFVHSLRGMKIAADEVESFNIKVYEAPFSFNKIQL

[Name Temêneia

GSSLKESSCYYKHDETTLDEGEIAMMELYTEKAQIKDGQOSVLDLGCGLGSLTLYVANKYPNCKVTGTTASLWHKDFIESKCKEQELTNVKIVL GDATTHEMEERFDRILAIGLIEHLKNYGLLLGRISKWLKDDGFLFIQHVCHKTLAYPLVPVDEEDWIGEYIFPGGTLTMPSASLLLYFQDELSV

VDHSTLNGKHFSRTHEEWLKNIDAKIDEVKEILKSVTKTEEEVVRLTNFWRIFCMFGVEMFGYNEGEEWMLSQILFKKK CmaNMT4 MASGKVVDLLKRLDSGLVSDEELRRVIRFELERRLKWGYKPTHEQQLAELLNLAHATKQMEIATKIDTLNSTMYEVPNSFLEIQLGSTLKESC LYFKDESTTVDEAEI!AMMDLYLERAQIKDGQ!IILDLGCGLGALAFHIAQKYTNCNVTSVTNSVKQKEFIEEKCKILNVSNVKVILTDICTLEMEAT

FDRIFAIGLIEHMKNYELLLRKFSAWMKQDGLLFIEHLCHKTLGYHNEPIDEDDWYTAYFFPAGTLTFIPSSFLLYFQDDVSVVNHWTLSGKHF

SRSNEEWLKRMDNKIDEVKEIYKAAASETKDDDIMKLIRLWRFLSISAAEMFGYKDGEEWMISQVLFKKK EcNMT3 MASLVEEGSFVNNKESVKERVSELVKRLKNGLVSDEELRKLMRVELEKRLEWGYKSTHEQQLSQLIDLAHSMKKMEIAMEIDALNSTVYEVP

LSFLQIIHGTTIKESCLYFKDESTTVDEAEIAMMDLYLERAQIKDGQSILDLGCGLGGFSFHIASKFTGCNITAVTNSVKQKEFIEEKCKTLNVPN IKVILADICTTEIENVFDRIIAIGLIEHMKNYELLLKKFSKWMTQDGLLFIEHLCHKTFGYHNEPLDEDDWYTTYFFPAGTLTFIPSSFLLYFQDDV SVVDHWTLNGKHFARSNEEWLKRMDEKMDEVKQIFRSNLKSENEVTKTIGEWRFLSMSAAEMFGYNNGEEWMVSQLLFKKK

NM GfINMT5 MGSNETNGELKTKEMVPDLLKRLESGLVADEELRKLIRFELERRLKWGYKPTHEQQLAELLKLAHSTKQMKIATETDSLNSTMYEVPIPFLQL 8 QFGSAIKESCCYFKDESTTLDEAEVAMMDLYLERTQIKDGOSILDLGCGLGALAFHIVQOKYPNCNVLAITNSVEQKEFIEEKCKIRKVENVKVS o LADICTLEMKTTFDRIFAIGLLEHMKNYQLLLKKFSNWMKQDGLLFIEHLCHKTLAYHYEPLDEDDWYTEYFFPAGTLTIISSSFLLYFQDDVSI 8

VNHWSLSGKHFSRSNEEWLKRMDMKIDEVKEILEAAFENKDHDITKLINHWRFLAINATEMFGYNNGEEWMVSQVLFKKK ScaNMT1 MASDHEVSNKELKKKKEVITELLKRLESGLVSDEELRGLIRFELERRLRWGYKPTHEQQLAQLLNLAHSMKQMKIATEIDALNSTMYEVPIPF LQIQLGSTLKESCCYFKDESTTVDEAEI!AMMDLYLERAQIKDGQSILDLGCGLGALAFHIAQKYTNCNITAITNSVRQKEFIEEKCKILNVSNVK

VSLADICTLEMEATFDRIFAIGLIEHMKNYELLLKKFSEWMKQDGLIFIEHLCHKTLAYHYEPLDEDDWYTEYFFPAGTLTLISSSFLLYFQDDV

SVVDHWTLSGKHFSRSNEEWLKRMDEKIDEVKEIFESVSDSKDDDVTKLINHWRFFCISSAEMFGYNNGEEWMISQVLFKKK CchNMT3 MIKKSKIMAFSDHHHEVVKNHSKKEMIADLLKRLEAGLVPDEEMRNLFRFELERRLOWGYKSIHQEQLSQLLKLAHSTKEMTIVAEMDALNS

SMYELPISFLQIQLGSNLKQSSLYFKDELTTVDEAEVAIMDLYLERAQIEDGQOSILDLGCGLGAFSFHVARKYTNCNITAVTNSLTQKEFIEKKS KILNIQNVKVIFADVTTVEMETTFDRVFAIGLIEHMQNYELFLKKLSKWMKQDGLLFIEHFCHKTLAYHYKPIDEDDWFTNLLYPNGTVISSSLL

LYFQDDVSVVDHWSLSGKHFSRASEESLKRMDAKMDEMKEIFESITDSKEEAMKLINQWRIFCISCAEMFGYNNGEEWMTSHFLFKKKL CchNMT6 MGSSTASDHEMVIMENDSKNKQVVIADLLKRLVGGLVPDEEMRNMFRFELEKRLKWGYKSTHQAOQQALSQLLNLVELNKGIAKIAPEMDALNS

AMYEVPIPYLKLMLGSTLKQSCLYFKDESTTLDEAEIEMMDLYLERADIQDGQOSILDLGCGLGGLGFHIAQKYISCNITALTNSLTQKEFIEEKC KTLNIPNVKVILADVTTVEIETTFDRLFAIGLVEHMENYELFLRKLSKWMKQDGLLFIEHLCHKTLAYHYKPIDEDDWYSNLLYPTGTLTSASFL

Be JB CS | — |ErYFaDDLSvvDHWSLSGKHFSRATEEWLKMIDANMDKIREIYESVTESKEEATRSINQWRIFCISCAEMFGYNDGEEWMISHFLFKNKKQIE CChNMTI1 MATSDQEVKTSKMEMIADLLKRLEAGLVPDDEIRSLIRVELERRLKWGYKSTHQEQLDQLLNLAHSIKKMKIASTEMDGLTSTMYEVPISLVO! QLGSHLKESCLYFKDETTTVDEAEI!AMMDLYLERAQIKDGQSILDLGCGLGAVSFHIAQKYTSCNITAVTNSVROKEFIEEKSKTLNVPNVKVL

LADITTLEMEHTFDRLFAISLIEHMENYELLLRKLSEWMKQDGLLFIEHLCHKTLSYHFEPMDEDDWYTNLLFPAGTLTLVSASFLLYFQDDLS

VVNOWVMSGKHFSRANEEWLKNMDAKMDEMREIFESITDSEEEVVKLINHWRIFCISSAEMFAYNDGEEWMNSHVLFKKKKQIQ CChNMT2 — | MAGSGANKEMIADLLKRLEVGLVPDEEIRSLIRFQLKRRLKWGYKTTHQEQLEQLLSLAHSIRKMKIATEMDALNSTMYEVPISFMQIVFGSTL

KESCLYFKDEATTVNEAEIAMMDLYLERAQIKDGQSILDLGCGMGSLCFHIARKYTNCNITAVTNSVSQKEFIEEKSKTLNLPNVKVILADITTL

EMDDTYDCLFAIGLIEHMKNYELLLRKLSNWMKQDSLLFIDHVCHKTLAYHYEPIDEDDWYTNLLFPAGTLTLVSASFLLYFQDDLSLVDHWS MSGKHFSRTNKEWLKNIDGKMDKIREIVKSITDSEEEVVKLINHWRMLCINSSEMFGFNDGEEWMNSHVLFKKKKQ! ScaNMT2 MEMIADLLKRLEAGLVPDDEIRSLIRVELERRLKWGYKSTHQEQLDOLLNLAHSIKKMKIASTEMDGLTSTMYEVPISLVQIQLGSHLKESCLY

FKDETTTVDEAEIAMMDLYLERAQIKDGQSILDLGCGLGSVCFHIARKYTSCNITAVTNSVSQKEFIEEKSKTLNVPNVKVLLADITTLEMDDTF N DCLFAIGLIEHMENYELLLRKLSDWMKQDGLLFIDHVCHKTLSYHFEPMDEDDWYTNLLFPAGTLTLVSASFLLYFQDDLSLVDHWSMSGKH a FSRTNKEWLKNIDGKMDKIREIVKSITDSEEEVVKLINHWRMLCINSSEMFGFNDGEEWMNSHVLFKKKKO! õ o PbrNMT2 MCTTMDTTKISQQDDLWKNMELGLISDEEVRRLMKIETEKRIKWGTKPTQQEQLAQLLDFNKSLRGMKMATEVHALENHKIYEIPDSFNQIIG o

GKESAGLFTDEATTTIEEANTKMMDLYCERAGLKDGQTILDIGCGAGLLVLHLAKKYKNCKITGVTNTSWHKEHILEQCKNLNLSNVEVILADV TTVDIERTFDRVFVIGLIEHMKNFELFLRKISKWMKDDGLLFLEHLCHKSFSDHWEPLSEDDWYAKNFFPSGTLVIPSATCLLYFQEDVTVKD

HWLLSGNNFARSNEAILKRIDSKIEEVKDIFMSFYGIGEEEAVKLINWWRLLCITANELFKYNNGEEWLISQLLFKKKLMTCI PbrNMT1 MVKGDQFQTTTMEETKISQENDLWTNMELGLIPDEEVRRLMKIEIEKRIEWGMKPTQHQQLAQLLDFTKSLRGMKMATELDKLDSKLYETPH

SFNQIVNGSTLKESSGLYTDVTTTMDEASIKMMDLYCERANIKDGQTILDLGCGPGPLVLHIAKKYSNCKITGVTNAFSQREYILEECKKLSLS NVEIILADVTSLDLETTFDRVFVIGFIEHMKNFELFLRKISKWMKDDAVLFLEHFCHKSFSYHGEPLSEDDWYAKNFFAPGTLVIPSATCLLYFQ

EDLAVIDHWFLSGNHFARTNEEMLKGIDGKIEEIKDIFMSFYGINEAEAVKLINWWRLFCITGAEMFSYNNGEEWFISQLLFKKK EcaNMT4 MALEQEDSMSVPERNEGVADLIKRMELGLVNDEEIRRLMRIQIENRLKWGYKPTHDQQLAQHLHFINSLKEMKMATEMDSLDSQVYESPNS

FQQIMCGRSMKESAGLFMDDVTTVEEAHIRMMDLYCDKATFEDGQKILDLGCGHGSVVLHVAQKYKGCQVTGVTNSSAQKQYILEQCKKL DLSNVEIILADVTTLEMEEKFDRVIIIGLIEHMKNFKLFFQKVSKWMKEGGLLFLENYFHKDFAYHCEKIDEDDWYDGYIFPPGSLLMPSASTLL

YFQEDLTVADHWVLPGTHFAKTFEEFLKKIDLRIEEVREIFEAFYGISKEEAMKLSNYWRNFCISAMEIFNYNNGQEWMISHLLYTKK om Ja CEEE CmaNMT5 METGKNNQNMKTTIDDLWNQMMLGIVPDKEIRRLMKIELKKRLDWGYRPTHQQALSQALLDFAKGLCNYCWTALRCMKMSAEFDTLDSKVY

ETPKSFQQIMCGTTIKESSGLFMNESTTLDQAQISMLDLYFDKAKIKDGOSILDLGCGHGALILYLAQKYQNCNITGVTNSLSQKEFIVEKCKK LGLSNVEILLADVTKLEMEDMFDRVFVIGLIEHMKNFELFLRKISEWMKPDGLLFLEHYCHKSFAHQWEPIDEEDWFSKYIFPPGTVIIPSASFL

LYFQEDVKVIDHWTLSGNHFARTQEEWLKGIDGHIDEVEKTFESFYGISKEEAVKLINFWRVFCLSGVEMFGYNNGEEWMISHLLFKKK GfINMT4 MTMEANNAKKEAIENLWEQMMMGLVPDHEITRLMKSELQOKRLNWGYKPTHQOQAISALLDFAKSLRRMEMSLDFDNLELDTKMYETPESFQ

LIMSGTTLKESSGLFTDETATLDQOTQIRMMDLYLEKAKIKDGOQSILDLGCGHGALILHVAQKYRNCNVTGVTNSIAQKEFIFKQCKKLGLSNVE MVLADVTKCEMKATFDHIFVIGLIEHMKNFELFLRKVSEWMKSDGLLFMEHYCHKSFAYQWEPMDDDDLFSKYVFPPGSAIIPSASFLLYFQ

DDLTVVDHWTLSGNHFARTHQEWLKRIDSQSDEIKGIFESFYGISKEEAVKLINYWRVFCLFGVEMFGYNNGEEWMISHLLFKKK CchNMT5 MEVVATSSARNPKKEIVDLWKRMELGLIPDEEIRDLMKIGLEKRLKWGYKPTHEQQLSQLLHFAKSLRSMKMASEMETLDDQMYETPTAFQ

QLMCGSTIKESAGFFKDESTTLDEAEIKMLDLYCEKARIEDGQKILDLGCGHGAVMLHIAQKYKNCNVTGVTNSISQQQFIVORSKELNLSNV NMILADVTMLEMDATYDRIFIIGLIEHMKNFELFLRKISKWITKEGLLFLEHYCHKTFAYQCEPVDEDDWYNMFIFPPGTLILPSASFLLYFQDDL mM IVVDRWTLNGNHYARTQEEWLKRIDANVDGVKQMFESVCDGNKEEAVKLMNFWRIFCISGAEMLAYNNGEEWMISHYLFKKRN Ns NSNMT2 MEATQITKKQGVAELIKRIENGQVPDEEITRMMKIQIQKRLKLGYKSTHEQQLAQLLHFVHSLQOKMEMAEEVDTLDSELYEIPLPFLHIMCGKA 3 LKFSPGYFKDESTTLDESEVNMLDLYCERAQIEDGQTILDLGCGHGSLTLHVAKKYRGCKVTGITNSVSQKDFIMEECKKLNLSNVEIILEDVT o

KFETGTTYDRIFAVALIEHMKNYELFLKKVSAWMAQDGLLFVEHHCHKVFAYKYEPIDDDDWYTEYIFPTGTLVMSSSSILLYFQEDVSVVNH

WTLSGKHPSLGFKQWLKRIDDNIDEIKEIFESFYGSKEKATKFITYWRVFCIAHSEMYATNGGEEWMLSQVLFKRK ScaNMT5 MGGVADLLKKMELGLVPEEEIRRLMRINEKRLEWGYKPTHAEQLDHLTNFIQCLRGMKMADEIDALDAKMYEIPLPFMQTICGSTLKFSPGYF

KDESTTLDESEIHMMDLYCERAEVKDGHSILDLGCGHGGFVLHVAQKYKNSIVTGVTNSVAEKEFIMTQCKKLCLSNVEIILADVTKFEPETTY DRVFAIALIEHMKNYELVLEKLSKWVAQDGFLFVEHHCHKVFPYKYEPLDEDDWYTEYIFPGGTIVLPSASILLYFQKDVSVVNHWSLNGKHP

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FEDESTTLDESETIMMDLYCERAQVQDGQSILDLGCGHGGFVLHVAQKYKNCKVTGVTNSVSETEYIMEQCKKLGLSNVEIIIADVTKFEPEV TYDRVFAIALIEHMKNYELVLQOKLSKWVAQDGFLFVDHHCHKVFPYKYEPIDEDDWYTQYIFPGGTLVLPSASILLYFQEDVSIVNHWTLSGN

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NM TcoNMT3 MEDNNNLLQEEMNVVELLORPELGLVPDEKIRKLTRLALAKRLKWGYKPTHEAQLSHLFQFIHSLPSLNMESEDENPKSWLYETPTSFLQLL N YGDCIKESDTYYKEDTATLEEAVINMLELYCERARITEGLSVLDLGCGYGALTLHVAQKYKSCKVTGVTSSISQKQYIMEKCKKLNLTNVEIILA o DVATIEIEAASYDRIFALGIFEHVNDYKLFLGKLSKWMKQDGLLFVEYLCHKTFPYQNKPLDKGDKWYNEYVFPSGGLIIPSASFILYFQNDVS 8

VVRQWTOAGGQHSARTFEELLKRIDGNIDKIKEIFIESYGSKEDAVRFINYWRVFLITGVEMFSYNDGEEWMGAHFLFKKKFIMQE CmuNMT4 MEVKQSKGDELRSRVAELLERPELGLVPDEEIRRLAKARLEKRLKWGYKATHGEQLSSLLQFVESLPSLNMASEDDSPKAWLYETPTSFLQ

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EDLSVVSHWATNGTHTGRTCKKLVERIDANIEKIKEIFSEFYGSKEDAIRMINYWRVLCITGAEMYTCKDGEEWMDVYYLFKKK Tabela 7. Variantes de BM3 N-desmetilase A cc]

E RIAA AO S

RR ESA EE $

MTIKEMPQPKTFGELKNLPLLNTDKPVQALMKIADELGEIFKFEAPGRVTRYLSSOQRLIKEACDESRFDKNLSQALKFA RDFAGDGLVTSWTHEKNWKKAHNILLPSFSQQAMKGYHAMMVDIAVQLVQKWERLNADEHIEVSEDMTRLTLDTIGL CGFNYRFNSFYRDOQPHPFIISMVRALDEVMNKLQRANPDDPAYDENKRQFQEDIKVMNDLVDKIIADRKARGEQSDD LLTQMLNGKDPETGEPLDDGNIRYQIITFLIAGHETTSGLLSFALYFLVKNPHVLOKVAEEAARVLVDPVPSYKQVKQL KYVGMVLNEALRLWPTAPAFSLYAKEDTVLGGEYPLEKGDEVMVLIPQLHRDKTVWGDDVEEFRPERFENPSAIPQH AFKPFGNGOQRACIGQQFALHEATLVLGMMLKHFDFEDHTNYELDIKETATLKPKGFVVKAKSKKIPLGGIPSPSTEQSA KKVRKKAENAHNTPLLVLYGSNMGTAEGTARDLADIAMSKGFAPQVATLDSHAGNLPREGAVLIVTASYNGHPPDNA KQFVDWLDQASADEVKGVRYSVFGCGDKNWATTYQKVPAFIDETLAAKGAENIADRGEADASDDFEGTYEEWREH MWSDVAAYFNLDIENSEDNKSTLSLQFVDSAADMPLAKMHGAFSTNVVASKELQQPGSARSTRHLEIELPKEASYQE GDHLGVIPRNYEGIVNRVTARFGLDASQQIRLEAEEEKLAHLPLAKTVSVEELLQYVELQDPVTRTQLRAMAAKTVCP PHKVELEALLEKQAYKEQVLAKRLTMLELLEKYPACEMKFSEFIALLPSIRPRYYSISSSPRVDEKQASITVSVVSGEA WSGYGEYKGIASNYLAELQEGDTITCFISTPQSEFTLPKDPETPLIMVGPGTGVAPFRGFVOARKQLKEQGQOSLGEAH LYFGCRSPHEDYLYQEELENAQSEGIITLHTAFSRMPNQPKTYVQHVMEQDGKKLIELLDQGAHFYICGDGSQMAPA VEATLMKSYADVHQVSEADARLWLQQLEEKGRYAKDVWAG MTIKEMPQPKTFGELKNLPLLNTDKPVQALMKIADELGEIFKFEAPGRVTRYLSSQRLIKEACDESRFDKNLSQALKFA RDFAGDGLVTSWTHEKNWKKAHNILLPSFSQQAMKGYHAMMVDIAVQLVAQKWERLNADEHIEVSEDMTRLTLDTIGL NM

CGFNYRFNSFYRDQPHPFIISMVRAADEVMNKLQRANPDDPAYDENKRQFQEDIKVMNDLVDKIIADRKARGEQSDD R LLTQMLNGKDPETGEPLDDGNIRYQIIAFLIAGHETTSGLLSFALYFLVKNPHVLQKVAEEAARVLVDPVPSYKQVKQL & KYVGMVLNEALRLWPTAPAFSLYAKEDTVLGGEYPLEKGDEVMVLIPQLHRDKTVWGDDVEEFRPERFENPSAIPQH º

AFKPFGNGQRACIGQQFALHEATLVLGMMLKHFDFEDHTNYELDIKETATLKPKGFVVKAKSKKIPLGGIPSPSTEQSA KKVRKKAENAHNTPLLVLYGSNMGTAEGTARDLADIAMSKGFAPQVATLDSHAGNLPREGAVLIVTASYNGHPPDNA KQFVDWLDQASADEVKGVRYSVFGCGDKNWATTYQKVPAFIDETLAAKGAENIADRGEADASDDFEGTYEEWREH MWSDVAAYFNLDIENSEDNKSTLSLQFVDSAADMPLAKMHGAFSTNVVASKELQQPGSARSTRHLEIELPKEASYQE GDHLGVIPRNYEGIVNRVTARFGLDASQQIRLEAEEEKLAHLPLAKTVSVEELLQYVELQDPVTRTQLRAMAAKTVCP PHKVELEALLEKQAYKEQVLAKRLTMLELLEKYPACEMKFSEFIALLPSIRPRYYSISSSPRVDEKQASITVSVVSGEA WSGYGEYKGIASNYLAELQEGDTITCFISTPQSEFTLPKDPETPLIMVGPGTGVAPFRGFVOARKQLKEQGQOSLGEAH LYFGCRSPHEDYLYQEELENAQSEGIITLHTAFSRMPNQPKTYVQHVMEQDGKKLIELLDQGAHFYICGDGSQMAPA

[o ETIMTAOIAITITERIRAIEE 8C7 MTIKEMPQPKTFGELKNLPLLNTDKPVQALMKIADELGEIFKFEAPGRVTRYLSSQORLIKEACDESRFDKNLSQAAKFA

RDFAGDGLVTSWTHEKNWKKAHNILLPSFSQQAMKGYHAMMVDIAVQLVAQKWERLNADEHIEVSEDMTRLTLDTIGL CGFNYRFNSFYRDQPHPFIISMVRAADEVMNKLQRANPDDPAYDENKRQFQEDIKVMNDLVDKIIADRKARGEQSDD LLTQMLNGKDPETGEPLDDGNIRYQIITFLIAGHETTSGLLSFALYFLVKNPHVLQKVAEEAARVLVDPVPSYKQVKQL KYVGMVLNEALRLWPTAPAFSLYAKEDTVLGGEYPLEKGDEVMVLIPQLHRDKTVWGDDVEEFRPERFENPSAIPQH AFKPFGNGQRACIGQQFALHEATLVLGMMLKHFDFEDHTNYELDIKETLTLKPKGFVVKAKSKKIPLGGIPSPSTEQSA KKVRKKAENAHNTPLLVLYGSNMGTAEGTARDLADIAMSKGFAPQVATLDSHAGNLPREGAVLIVTASYNGHPPDNA

KQFVDWLDQASADEVKGVRYSVFGCGDKNWATTYQKVPAFIDETLAAKGAENIADRGEADASDDFEGTYEEWREH NM MWSDVAAYFNLDIENSEDNKSTLSLQFVDSAADMPLAKMHGAFSTNVVASKELQQPGSARSTRHLEIELPKEASYQE e GDHLGVIPRNYEGIVNRVTARFGLDASQQIRLEAEEEKLAHLPLAKTVSVEELLQYVELQDPVTRTQLRAMAAKTVCP & PHKVELEALLEKQAYKEQVLAKRLTMLELLEKYPACEMKFSEFIALLPSIRPRYYSISSSPRVDEKQASITVSVVSGEA º

WSGYGEYKGIASNYLAELQEGDTITCFISTPQSEFTLPKDPETPLIMVGPGTGVAPFRGFVOARKQLKEQGQOSLGEAH LYFGCRSPHEDYLYQEELENAQSEGIITLHTAFSRMPNQPKTYVQHVMEQDGKKLIELLDQGAHFYICGDGSQMAPA VEATLMKSYADVHQVSEADARLWLQQLEEKGRYAKDVWAG MTIKEMPQPKTFGELKNLPLLNTDKPVQALMKIADELGEIFKFEAPGRVTRYLSSQRLIKEACDESRFDKNLSQAAKFA RDFAGDGLVTSWTHEKNWKKAHNILLPSFSQQAMKGYHAMMVDIAVQLVAQKWERLNADEHIEVSEDMTRLTLDTIGL CGFNYRFNSFYRDQPHPFIISAVRAADEVMNKLQRANPDDPAYDENKRQFQEDIKVMNDLVDKIIADRKARGEQSDD LLTQMLNGKDPETGEPLDDGNIRYQIITFLIAGHETTSGLLSFALYFLVKNPHVLQOKVAEEAARVLVDPVPSYKQVKQL KYVGMVLNEALRLWPTAPAFSLYAKEDTVLGGEYPLEKGDEVMVLIPQLHRDKTVWGDDVEEFRPERFENPSAIPQH AFKPFGNGQRACIGQQFALHEATLVLGMMLKHFDFEDHTNYELDIKETLTLKPKGFVVKAKSKKIPLGGIPSPSTEQSA KKVRKKAENAHNTPLLVLYGSNMGTAEGTARDLADIAMSKGFAPQVATLDSHAGNLPREGAVLIVTASYNGHPPDNA KQFVDWLDQASADEVKGVRYSVFGCGDKNWATTYQKVPAFIDETLAAKGAENIADRGEADASDDFEGTYEEWREH MWSDVAAYFNLDIENSEDNKSTLSLQFVDSAADMPLAKMHGAFSTNVVASKELQQPGSARSTRHLEIELPKEASYQE GDHLGVIPRNYEGIVNRVTARFGLDASQQIRLEAEEEKLAHLPLAKTVSVEELLQYVELQDPVTRTQLRAMAAKTVCP PHKVELEALLEKQAYKEQVLAKRLTMLELLEKYPACEMKFSEFIALLPSIRPRYYSISSSPRVDEKQASITVSVVSGEA WSGYGEYKGIASNYLAELQEGDTITCFISTPQSEFTLPKDPETPLIMVGPGTGVAPFRGFVOARKQLKEQGQOSLGEAH LYFGCRSPHEDYLYQEELENAQSEGIITLHTAFSRMPNQPKTYVQHVMEQDGKKLIELLDQGAHFYICGDGSQMAPA

VEATLMKSYADVHQVSEADARLWLQQLEEKGRYAKDVWAG NM 7A1 MTIKEMPQPKTFGELKNLPLLNTDKPVQALMKIADELGEIFKFEAPGRVTRYLSSQRLIKEACDESRFDKNLSQAAKFA o RDFAGDGLVTSWTHEKNWKKAHNILLPSFSQQAMKGYHAMMVDIAVQLVAQKWERLNADEHIEVSEDMTRLTLDTIGL & CGFNYRFNSFYRDQPHPFIISAVRAADEVMNKLQRANPDDPAYDENKRQFQEDIKVMNDLVDKIIADRKARGEQSDD º

LLTQMLNGKDPETGEPLDDGNIRYQIIAFLIAGHETTSGLLSFALYFLVKNPHVLQKVAEEAARVLVDPVPSYKQVKQL KYVGMVLNEALRLWPTAPAFSLYAKEDTVLGGEYPLEKGDEVMVLIPQLHRDKTVWGDDVEEFRPERFENPSAIPQH AFKPFGNGQRACIGQQFALHEATLVLGMMLKHFDFEDHTNYELDIKETLTLKPKGFVVKAKSKKIPLGGIPSPSTEQSA KKVRKKAENAHNTPLLVLYGSNMGTAEGTARDLADIAMSKGFAPQVATLDSHAGNLPREGAVLIVTASYNGHPPDNA KQFVDWLDQASADEVKGVRYSVFGCGDKNWATTYQKVPAFIDETLAAKGAENIADRGEADASDDFEGTYEEWREH MWSDVAAYFNLDIENSEDNKSTLSLQFVDSAADMPLAKMHGAFSTNVVASKELQQPGSARSTRHLEIELPKEASYQE GDHLGVIPRNYEGIVNRVTARFGLDASQQIRLEAEEEKLAHLPLAKTVSVEELLQYVELQDPVTRTQLRAMAAKTVCP PHKVELEALLEKQAYKEQVLAKRLTMLELLEKYPACEMKFSEFIALLPSIRPRYYSISSSPRVDEKQASITVSVVSGEA WSGYGEYKGIASNYLAELQEGDTITCFISTPQSEFTLPKDPETPLIMVGPGTGVAPFRGFVOARKQLKEQGQOSLGEAH LYFGCRSPHEDYLYQEELENAQSEGIITLHTAFSRMPNQPKTYVQHVMEQDGKKLIELLDQGAHFYICGDGSQMAPA

VEATLMKSYADVHQVSEADARLWLQQLEEKGRYAKDVWAG 8F11 ATGACCATCAAAGAAATGCCACAACCTAAGACTTTCGGTGAATTGAAGAATTTGCCTTTGTTGAACACCGATAAG

CCAGTTCAAGCTTTGATGAAGATTGCTGATGAATTGGGTGAAATCTTCAAGTTTGAAGCTCCAGGTAGAGTCACT AGATACTTGTCATCTCAAAGATTGATCAAAGAAGCCTGCGACGAATCCAGATTTGATAAGAATTTGTCTCAAGCTT TGAAGTTCGCTAGAGATTTTGCTGGTGATGGTTTGGTTACTTCTTGGACTCACGAAAAGAATTGGAAGAAGGCCC

ATAACATTTTGTTGCCATCTTTCTCACAACAAGCCATGAAGGGTTATCATGCTATGATGGTTGATATCGCCGTTCA NM ATTGGTTCAAAAGTGGGAAAGATTGAACGCCGATGAACATATCGAAGTCTCTGAAGATATGACCAGATTGACCTT 3 GGATACCATTGGTTTGTGTGGTTTCAACTACAGATTCAACTCCTTCTACAGAGATCAACCACATCCATTCATCATC &S

TCTATGGTTAGAGCTTTGGATGAAGTCATGAACAAATTGCAAAGAGCTAATCCAGACGATCCAGCTTATGACGAA AACAAGAGACAATTCCAAGAAGATATCAAGGTCATGAACGATTTGGTCGATAAGATTATCGCTGATAGAAAGGCT AGAGGTGAACAATCTGATGATTTGTTGACCCAAATGTTGAACGGTAAGGATCCAGAAACTGGTGAACCATTGGAT GATGGTAACATCAGATACCAAATTATCACCTTCTTGATTGCTGGTCACGAAACTACATCTGGTTTGTTGTCTTTTG CCTTGTACTTTTTGGTTAAGAACCCACACGTCTTGCAAAAGGTTGCTGAAGAAGCTGCAAGAGTTTTGGTTGATC CAGTTCCATCTTACAAGCAAGTCAAGCAATTGAAGTACGTTGGTATGGTTTTGAACGAAGCTTTGAGATTGTGGC CAACTGCTCCAGCTTTTTCATTATACGCTAAAGAAGATACCGTCTTGGGTGGTGAATATCCATTGGAAAAAGGTG ATGAAGTTATGGTCTTGATCCCACAATTGCATAGAGATAAGACTGTTTGGGGTGATGATGTCGAAGAATTCAGAC CAGAAAGATTCGAAAACCCATCTGCTATTCCACAACATGCTTTTAAGCCATTTGGTAACGGTCAAAGAGCTTGCA TTGGTCAACAATTCGCTTTACATGAAGCTACCTTGGTTTTGGGTATGATGTTGAAACACTTCGACTTCGAAGATCA CACCAACTACGAATTGGATATCAAAGAAACCGCTACCTTGAAGCCAAAGGGTTTTGTTGTTAAGGCTAAGTCCAA AAAGATTCCATTGGGTGGTATTCCATCTCCATCTACTGAACAATCCGCTAAGAAGGTTAGAAAGAAAGCTGAAAA CGCTCATAACACACCTTTGTTGGTCTTGTACGGTTCTAATATGGGTACTGCTGAAGGTACAGCAAGAGATTTGGC AGATATTGCTATGTCTAAAGGTTTCGCTCCACAAGTTGCTACTTTGGATTCTCATGCTGGTAATTTGCCAAGAGAA GGTGCTGTTTTGATAGTTACTGCTTCTTACAATGGTCACCCACCAGATAATGCTAAGCAATTCGTTGATTGGTTG GATCAAGCTTCAGCTGATGAAGTAAAAGGTGTTAGATACTCTGTTTTCGGTTGCGGTGACAAAAATTGGGCTACT ACTTATCAAAAGGTTCCAGCCTTTATTGACGAAACTTTGGCTGCTAAAGGTGCTGAAAACATTGCTGACAGAGGT

GAAGCTGATGCCTCCGACGACTTCGAAGGTACTTACGAAGAATGGAGAGAACACATGTGGTCTGACGTTGCTGC N TTACTTCAACTTGGACATCGAAAACTCTGAAGACAACAAGTCCACTTTGTCTTTGCAATTCGTTGACTCCGCTGCT o GACATGCCATTGGCTAAGATGCACGGTGCTTTCTCTACCAACGTCGTTGCCTCCAAGGAATTGCAACAACCAGG Ss TTCTGCTAGATCTACTAGACACTTGGAAATCGAATTGCCAAAGGAAGCTTCCTACCAAGAAGGTGACCACTTGGG ?

CGTTATTCCAAGAAACTACGAAGGTATCGTCAACAGAGTTACTGCTAGATTCGGTTTGGATGCTTCTCAACAAAT CAGATTAGAAGCTGAAGAAGAAAAGTTGGCTCACTTGCCATTAGCTAAGACTGTCTCCGTTGAAGAATTGTTGCA ATACGTCGAATTGCAAGACCCAGTTACCAGAACCCAATTGAGAGCCATGGCTGCCAAGACCGTCTGTCCACCAC ACAAGGTTGAATTGGAAGCCTTGTTGGAAAAGCAAGCCTACAAGGAACAAGTTTTGGCTAAGAGATTGACCATGT TGGAATTGTTGGAAAAGTACCCAGCCTGCGAAATGAAGTTCTCTGAATTTATCGCCTTGTTGCCATCTATCAGAC CACGTTACTACTCTATTTCTTCCTCTCCACGTGTTGACGAAAAGCAAGCTTCTATTACTGTTTCCGTTGTCTCCOGG TGAAGCTTGGTCCGGTTACGGTGAATACAAGGGTATTGCTTCTAACTACTTGGCTGAATTGCAAGAAGGTGACA CCATTACTTGTTTCATCTCTACTCCACAATCCGAATTTACTTTGCCAAAGGACCCAGAAACTCCATTGATCATGGT TGGTCCAGGTACTGGTGTCGCTCCATTCAGAGGTTTCGTTCAAGCTAGAAAACAATTGAAGGAACAAGGTCAAT CTTTGGGTGAAGCTCACTTGTACTTCGGTTGTAGATCTCCACACGAAGACTACTTATACCAAGAAGAATTGGAAA ACGCTCAATCCGAAGGTATTATCACTTTGCACACCGCTTTCTCCAGAATGCCAAACCAACCAAAGACTTACGTCC AACACGTTATGGAACAAGACGGTAAGAAGTTGATTGAATTGTTGGACCAAGGTGCTCACTTCTACATTTGTGGTG ATGGTTCTCAAATGGCTCCAGCCGTTGAAGCCACTTTGATGAAGTCTTACGCTGATGTTCACCAAGTTTCCGAAG CCGATGCTAGATTATGGTTGCAACAATTGGAAGAAAAAGGTCGTTACGCTAAGGATGTCTGGGCCGGTTGA ATGACCATCAAAGAAATGCCACAACCTAAGACTTTCGGTGAATTGAAGAATTTGCCTTTGTTGAACACCGATAAG CCAGTTCAAGCTTTGATGAAGATTGCTGATGAATTGGGTGAAATCTTCAAGTTTGAAGCTCCAGGTAGAGTCACT AGATACTTGTCATCTCAAAGATTGATCAAAGAAGCCTGCGACGAATCCAGATTTGATAAGAATTTGTCTCAAGCTT NM

TGAAGTTCGCTAGAGATTTTGCTGGTGATGGTTTGGTTACTTCTTGGACTCACGAAAAGAATTGGAAGAAGGCCC S ATAACATTTTGTTGCCATCTTTCTCACAACAAGCCATGAAGGGTTATCATGCTATGATGGTTGATATCGCCGTTCA & ATTGGTTCAAAAGTGGGAAAGATTGAACGCCGATGAACATATCGAAGTCTCTGAAGATATGACCAGATTGACCTT º

GGATACCATTGGTTTGTGTGGTTTCAACTACAGATTCAACTCCTTCTACAGAGATCAACCACATCCATTCATCATC TCTATGGTTAGAGCTGCAGATGAAGTCATGAACAAATTGCAAAGAGCTAATCCAGACGATCCAGCTTATGACGAA AACAAGAGACAATTCCAAGAAGATATCAAGGTCATGAACGATTTGGTCGATAAGATTATCGCTGATAGAAAGGCT AGAGGTGAACAATCTGATGATTTGTTGACCCAAATGTTGAACGGTAAGGATCCAGAAACTGGTGAACCATTGGAT GATGGTAACATCAGATACCAAATTATCGCTTTCTTGATTGCTGGTCACGAAACTACATCTGGTTTGTTGTCTTTTG CCTTGTACTTTTTGGTTAAGAACCCACACGTCTTGCAAAAGGTTGCTGAAGAAGCTGCAAGAGTTTTGGTTGATC CAGTTCCATCTTACAAGCAAGTCAAGCAATTGAAGTACGTTGGTATGGTTTTGAACGAAGCTTTGAGATTGTGGC CAACTGCTCCAGCTTTTTCATTATACGCTAAAGAAGATACCGTCTTGGGTGGTGAATATCCATTGGAAAAAGGTG ATGAAGTTATGGTCTTGATCCCACAATTGCATAGAGATAAGACTGTTTGGGGTGATGATGTCGAAGAATTCAGAC CAGAAAGATTCGAAAACCCATCTGCTATTCCACAACATGCTTTTAAGCCATTTGGTAACGGTCAAAGAGCTTGCA TTGGTCAACAATTCGCTTTACATGAAGCTACCTTGGTTTTGGGTATGATGTTGAAACACTTCGACTTCGAAGATCA CACCAACTACGAATTGGATATCAAAGAAACCGCTACCTTGAAGCCAAAGGGTTTTGTTGTTAAGGCTAAGTCCAA AAAGATTCCATTGGGTGGTATTCCATCTCCATCTACTGAACAATCCGCTAAGAAGGTTAGAAAGAAAGCTGAAAA CGCTCATAACACACCTTTGTTGGTCTTGTACGGTTCTAATATGGGTACTGCTGAAGGTACAGCAAGAGATTTGGC AGATATTGCTATGTCTAAAGGTTTCGCTCCACAAGTTGCTACTTTGGATTCTCATGCTGGTAATTTGCCAAGAGAA GGTGCTGTTTTGATAGTTACTGCTTCTTACAATGGTCACCCACCAGATAATGCTAAGCAATTCGTTGATTGGTTG GATCAAGCTTCAGCTGATGAAGTAAAAGGTGTTAGATACTCTGTTTTCGGTTGCGGTGACAAAAATTGGGCTACT N

ACTTATCAAAAGGTTCCAGCCTTTATTGACGAAACTTTGGCTGCTAAAGGTGCTGAAAACATTGCTGACAGAGGT S GAAGCTGATGCCTCCGACGACTTCGAAGGTACTTACGAAGAATGGAGAGAACACATGTGGTCTGACGTTGCTGC 3 TTACTTCAACTTGGACATCGAAAACTCTGAAGACAACAAGTCCACTTTGTCTTTGCAATTCGTTGACTCCGCTGCT ?

GACATGCCATTGGCTAAGATGCACGGTGCTTTCTCTACCAACGTCGTTGCCTCCAAGGAATTGCAACAACCAGG TTCTGCTAGATCTACTAGACACTTGGAAATCGAATTGCCAAAGGAAGCTTCCTACCAAGAAGGTGACCACTTGGG CGTTATTCCAAGAAACTACGAAGGTATCGTCAACAGAGTTACTGCTAGATTCGGTTTGGATGCTTCTCAACAAAT CAGATTAGAAGCTGAAGAAGAAAAGTTGGCTCACTTGCCATTAGCTAAGACTGTCTCCGTTGAAGAATTGTTGCA ATACGTCGAATTGCAAGACCCAGTTACCAGAACCCAATTGAGAGCCATGGCTGCCAAGACCGTCTGTCCACCAC ACAAGGTTGAATTGGAAGCCTTGTTGGAAAAGCAAGCCTACAAGGAACAAGTTTTGGCTAAGAGATTGACCATGT TGGAATTGTTGGAAAAGTACCCAGCCTGCGAAATGAAGTTCTCTGAATTTATCGCCTTGTTGCCATCTATCAGAC CACGTTACTACTCTATTTCTTCCTCTCCACGTGTTGACGAAAAGCAAGCTTCTATTACTGTTTCCGTTGTCTCCOGG TGAAGCTTGGTCCGGTTACGGTGAATACAAGGGTATTGCTTCTAACTACTTGGCTGAATTGCAAGAAGGTGACA CCATTACTTGTTTCATCTCTACTCCACAATCCGAATTTACTTTGCCAAAGGACCCAGAAACTCCATTGATCATGGT TGGTCCAGGTACTGGTGTCGCTCCATTCAGAGGTTTCGTTCAAGCTAGAAAACAATTGAAGGAACAAGGTCAAT CTTTGGGTGAAGCTCACTTGTACTTCGGTTGTAGATCTCCACACGAAGACTACTTATACCAAGAAGAATTGGAAA ACGCTCAATCCGAAGGTATTATCACTTTGCACACCGCTTTCTCCAGAATGCCAAACCAACCAAAGACTTACGTCC AACACGTTATGGAACAAGACGGTAAGAAGTTGATTGAATTGTTGGACCAAGGTGCTCACTTCTACATTTGTGGTG ATGGTTCTCAAATGGCTCCAGCCGTTGAAGCCACTTTGATGAAGTCTTACGCTGATGTTCACCAAGTTTCCGAAG

CCGATGCTAGATTATGGTTGCAACAATTGGAAGAAAAAGGTCGTTACGCTAAGGATGTCTGGGCCGGTTGA 8C7 ATGACCATCAAAGAAATGCCACAACCTAAGACTTTCGGTGAATTGAAGAATTTGCCTTTGTTGAACACCGATAAG N

CCAGTTCAAGCTTTGATGAAGATTGCTGATGAATTGGGTGAAATCTTCAAGTTTGAAGCTCCAGGTAGAGTCACT RX AGATACTTGTCATCTCAAAGATTGATCAAAGAAGCCTGCGACGAATCCAGATTTGATAAGAATTTGTCTCAAGCT & GCTAAGTTCGCTAGAGATTTTGCTGGTGATGGTTTGGTTACTTCTTGGACTCACGAAAAGAATTGGAAGAAGGCC º

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CAGATATTGCTATGTCTAAAGGTTTCGCTCCACAAGTTGCTACTTTGGATTCTCATGCTGGTAATTTGCCAAGAGA N AGGTGCTGTTTTGATAGTTACTGCTTCTTACAATGGTCACCCACCAGATAATGCTAAGCAATTCGTTGATTGGTTG Ss

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ATGGTTCTCAAATGGCTCCAGCCGTTGAAGCCACTTTGATGAAGTCTTACGCTGATGTTCACCAAGTTTCCGAAG N CCGATGCTAGATTATGGTTGCAACAATTGGAAGAAAAAGGTCGTTACGCTAAGGATGTCTGGGCCGGTTGA & ATGACCATCAAAGAAATGCCACAACCTAAGACTTTCGGTGAATTGAAGAATTTGCCTTTGTTGAACACCGATAAG & CCAGTTCAAGCTTTGATGAAGATTGCTGATGAATTGGGTGAAATCTTCAAGTTTGAAGCTCCAGGTAGAGTCACT º

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ACGCTCAATCCGAAGGTATTATCACTTTGCACACCGCTTTCTCCAGAATGCCAAACCAACCAAAGACTTACGTCC N AACACGTTATGGAACAAGACGGTAAGAAGTTGATTGAATTGTTGGACCAAGGTGCTCACTTCTACATTTGTGGTG & ATGGTTCTCAAATGGCTCCAGCCGTTGAAGCCACTTTGATGAAGTCTTACGCTGATGTTCACCAAGTTTCCGAAG Ss CCGATGCTAGATTATGGTTGCAACAATTGGAAGAAAAAGGTCGTTACGCTAAGGATGTCTGGGCCGGTTGA ? 7A1 ATGACCATCAAAGAAATGCCACAACCTAAGACTTTCGGTGAATTGAAGAATTTGCCTTTGTTGAACACCGATAAG

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ATTGGTCAACAATTCGCTTTACATGAAGCTACCTTGGTTTTGGGTATGATGTTGAAACACTTCGACTTCGAAGATC N ACACCAACTACGAATTGGATATCAAAGAAACCTTGACCTTGAAGCCAAAGGGTTTTGTTGTTAAGGCTAAGTCCA s AAAAGATTCCATTGGGTGGTATTCCATCTCCATCTACTGAACAATCCGCTAAGAAGGTTAGAAAGAAAGCTGAAA 3 ACGCTCATAACACACCTTTGTTGGTCTTGTACGGTTCTAATATGGGTACTGCTGAAGGTACAGCAAGAGATTTGG ?

CAGATATTGCTATGTCTAAAGGTTTCGCTCCACAAGTTGCTACTTTGGATTCTCATGCTGGTAATTTGCCAAGAGA AGGTGCTGTTTTGATAGTTACTGCTTCTTACAATGGTCACCCACCAGATAATGCTAAGCAATTCGTTGATTGGTTG GATCAAGCTTCAGCTGATGAAGTAAAAGGTGTTAGATACTCTGTTTTCGGTTGCGGTGACAAAAATTGGGCTACT ACTTATCAAAAGGTTCCAGCCTTTATTGACGAAACTTTGGCTGCTAAAGGTGCTGAAAACATTGCTGACAGAGGT GAAGCTGATGCCTCCGACGACTTCGAAGGTACTTACGAAGAATGGAGAGAACACATGTGGTCTGACGTTGCTGC TTACTTCAACTTGGACATCGAAAACTCTGAAGACAACAAGTCCACTTTGTCTTTGCAATTCGTTGACTCCGCTGCT GACATGCCATTGGCTAAGATGCACGGTGCTTTCTCTACCAACGTCGTTGCCTCCAAGGAATTGCAACAACCAGG TTCTGCTAGATCTACTAGACACTTGGAAATCGAATTGCCAAAGGAAGCTTCCTACCAAGAAGGTGACCACTTGGG CGTTATTCCAAGAAACTACGAAGGTATCGTCAACAGAGTTACTGCTAGATTCGGTTTGGATGCTTCTCAACAAAT CAGATTAGAAGCTGAAGAAGAAAAGTTGGCTCACTTGCCATTAGCTAAGACTGTCTCCGTTGAAGAATTGTTGCA ATACGTCGAATTGCAAGACCCAGTTACCAGAACCCAATTGAGAGCCATGGCTGCCAAGACCGTCTGTCCACCAC ACAAGGTTGAATTGGAAGCCTTGTTGGAAAAGCAAGCCTACAAGGAACAAGTTTTGGCTAAGAGATTGACCATGT TGGAATTGTTGGAAAAGTACCCAGCCTGCGAAATGAAGTTCTCTGAATTTATCGCCTTGTTGCCATCTATCAGAC CACGTTACTACTCTATTTCTTCCTCTCCACGTGTTGACGAAAAGCAAGCTTCTATTACTGTTTCCGTTGTCTCCOGG TGAAGCTTGGTCCGGTTACGGTGAATACAAGGGTATTGCTTCTAACTACTTGGCTGAATTGCAAGAAGGTGACA CCATTACTTGTTTCATCTCTACTCCACAATCCGAATTTACTTTGCCAAAGGACCCAGAAACTCCATTGATCATGGT TGGTCCAGGTACTGGTGTCGCTCCATTCAGAGGTTTCGTTCAAGCTAGAAAACAATTGAAGGAACAAGGTCAAT N

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Tabela 8. Sequências pA24, pA25 e pA26

Sequência pA24 cetegecgcagttaattaaagtcagigagegaggaagcgcgtaactataacggtcctaaggtagegaatcctgatgcgagtattttetecttacgcatcetatacagtatttea caccgcatagatcggcaagtgcacaaacaatacttaaataaatactactcagtaataacctatttcttagcatttttyacgaaatttgctattttattagagtcttttacaccatt tgtctecacacctecgcttacatcaacaccaataacgccatttaatctaagegcatcaccaacattttetagegtcagtccaccagctaacataaaatgtaagcttteggg gcetcetettgccttccaacecagtcagaaatcegagttccaatccaaaagttcacctgteccacetgacttictaaatraaacaagggaataaacgaatgagatttctgtaaag ctgcactgagtagtatgttgcagtcttttggaaatacgagtcttttaataactggcaaaccgaggaactcttggtattcttgccacgactcatctecatgcagtggagecaat caattcttgcggtcaactttagacgatatcaatgccgtaatcattgaccagagccaaaacatcctecttaagttgattacgaaacacgccaaccaagtattteggagtge ctgaactatttttatatgcttttacaagacttgaaattttccttgcaataaccgggteaattgttctetttetatigggcacacatataatacccagcaagtcagcatcggaatct agagcacattctgcggcctetgtgctetacaagcegcaaactttraccaatggaccagaactacctgtgaaattaataacagacatactccaagctgcctttgtatactta 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Sequência pA25 aacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagegecacgceticcegaagggagaaaggcggacaggtatceggtaagcggcagggte ggaacaggagagcgcacgagggagcettccagggggaaacgcctagtatctttatagtcctategggtttegecaccetetgacttgagecgtegatttttataatactegtea NM ggggggcggagcectataggaaaaacgccagcaacgeggcagtggaacgtacattatgaattagttacgctagggataacagggtaatatagaacccgaacgaceg 8 agcgcageggeggeegegcetgatacegecegecetegeegcagttaattaaagtcagtgagegaggaagegegtaactataacggtcctaaggtagegaatcectga SS tagcggtattttctecttacgcatctatgcggtatttracaccgcatagateggcaagtgcacaaacaatacttaaataaatactactcagtaataacctatttcttagcattttto ? acgaaatttgctattttattagagtcttttacaccatttgtcetecacacctecgettacatcaacaccaataacgccatttaatcetaagegcatcaccaacattttetagegtea gtccaccagctaacataaaatgtaagcttteggggctetetigecttccaacccagtcagaaategagttccaatccaaaagttcacctgteccaccetgacticigaateaa acaagggaataaacgaatgaggtttctgtgaagctgcactgagtagtatgtigcagtcttttagaaatacgagtcttttaataactggcaaaccgaggaactcttggtattc 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Sequência pA26 acgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagegecacgceticcegaagggagaaaggcggacaggtatceggtaageggcagggteg Ss gaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctagtatctttatagtcctategggtttegecaccetetgacttigagecgtegatttttataatgactegteag ? gggggcggagcectatggaaaaacgccagcaacgeggcagtggaacgtacattatgaattagttacgctagggataacagggtaatatagaacccgaacgaccega gegcageggeggeegegcetgatacegeegecetegecgcagttaattaaagtcagtgagegaggaagegegtaactataacggtcctaaggtagegaatcctgat gcggtattttetecttacgcatcetgtacagtatttracaccgcatagatcggcaagtgcacaaacaatacttaaataaatactactcagtaataacctatttcttagcattttto acgaaatttgctattttattagagtcttttacaccatttgtcetecacacctecgettacatcaacaccaataacgccatttaatcetaagegcatcaccaacattttetagegtea gtccaccagctaacataaaatgtaagcttteggggctetetigecttccaacccagtcagaaategagttccaatccaaaagttcacctgteccaccetgacticigaateaa acaagggaataaacgaatgaggtttctgtgaagctgcactgagtagtatgtigcagtcttttagaaatacgagtcttttaataactggcaaaccgaggaactcttggtattc 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Tabela 9. Enzimas de ajuste Acoplamento carbono-carbono Enzima de ponte berberina (BBE) Ps, Ec, Cj, Bs, Tf Salutaridina sintase (SalSyn) Ps Corituberina sintase (CorSyn) Cj Oxidação Tetra-hidroprotoberberina oxidase (STOX) Cj, Am, Bw Di-hidrobenzofenantridina oxidase (DBOX) Ps Metilsilopina hidroxilase (MSH) Protopina 6-hidroxilase (P6H) Ps Estilopina sintase (StySyn) Ps, Ec Formação de ponte metilenodióxi Queilantiofolina sintase (CheSyn) Ps, Ec, am Canadina sintase (CAS) Ps, Ec, Am O-metilação Norcoclaurina 6-O-metiltransferase (SOMT) Tf, CC NM 3'hidroxi-N-metilcoclaurina 4'-O-metiltransferase (4'OMT) Ps, Tf, Cj, Pb 8 Reticulina 7-O-metiltransferase (7OMT) o Escoulerina 9-O-metiltransferase (9OMT) Ps, Tf, Cj, Cc 8 Coclaurina N-metiltransferase (CNMT) Tetra-hidroberberina N-metiltransferase (TMNT) Ps, Ec Tebaína desmetilase (TSODM) Ps, Tf, Cj, Cc N-metilação Codeína desmetilase (CODM) Salutaridina redutase (SalR) Ps, Tf, Cj Codeína redutase (COR) Ps, Ec, Pb O-desmetilação Sanguinaria redutase (SanR) Salutaridina acetiltransferase (SalAT) Ps Redução Ps, Ga Ps, Pb, Ga Ps Acetilação Ec Ps

Tabela 10. Comparação de impurezas que podem estar presentes em concentrado de matéria-prima de papoula e meio de cultura de levedura clarificado

Impurezas: Concentrado de Pa- Meio de Cultura de Levedura Clari-

lha de Papoula ficado

Inorgânica — Sódio Ú Ú Magnésio Pá Pá Silício Ú x (não em meio de cultura) Fósforo Pá Pá Enxofre Ú Ú Cloro Ú Ú B Potássio Ú Ú S Cálcio Pá Pá &S Cobre Ú Ú Zinco Pá Pá Molibdênio Ú Y (molibdato de sódio no meio) Ferro Pá Pá Manganês Ú Ú Amônio Pá Pá Boro Ú Ú

Orgânica Polissacarídeos (amido, celulose, xilano) x (açúcares simples alimentados

Impurezas: Concentrado de Pa- Meio de Cultura de Levedura Clari- lha de Papoula ficado com levedura)

Lignina (p-coumarila, coniferila, álcoois de x sinapila) Pigmentos (clorofila, antocianinas, caro- tenoides) Já x Flavonoides Ú x Fenantreoides Pá x Látex, goma e cera Ú x NM Rubisco Pá x S Ácido mecônico Ú x &S Pseudomorfina Pá x Narceina Ú x Tebaol Ú x

Outra Pesticidas, Fungicidas, Herbicidas Ú x Pólen Ú x

Tabela 11. Grupos distintos de moléculas presentes em meio de cultura de levedura clarificado (CYCM) quinolina [LL eswmaesiopma Tenama — [isonorremonna — [Boda — [Fangaumaina | [E Freama essere TO reranama | [E oriaosanaimaina Tora O ema [O sengunaia vera TO eetranina | [E Freraidrocombamiva neoprera O een |, LE aaa ma Co [LE rmatenatra Tosa TO o LE nossa vem o 8 O gemea neem o [E [E rarooina rigor [OO [E rarcomo namiasal Torero TOO [E rarcooino heiacol[ranaomendamora [O LO remgotodeina TO AO EE IEEE rara [OO EE IEEE rara JO

Tabela 12. Impurezas que podem estar presentes em preparações de síntese química de compostos empata BARES

Buprenorfina 15,16-Desidrobuprenorfina, 17,18-Desidrobuprenorfina, 18,19-desmetilbuprenorfina, 19,19- Etilbuprenorfina, 2,2'-Bisbuprenorfina, 3-Desidroxibuprenorfina, 3-O-Metilbuprenorfina, 3-O- Metil-N-cianonorbuprenorfina, — 3-O-Metil-N-metilnorbuprenorfina, — 6-O-Desmetilbuprenorfina, Buprenorfina N-óxido, N-But-3-enilnorbuprenorfina, = N-But-3-enilnormetilbuprenorfina, N- Butilnorbuprenorfina, N-Metilbuprenorfina, Norbuprenorfina, Tetrametilfuran buprenorfina

Oximorfona 1-Bromooximorfona, 6-Beta oximorfol, 10-Alfa-hidroxioximorfona, 10-Cetooximorfona, 2,2- Bisoximorfona, Noroximorfona, Oximorfona N-óxido, 10-Hidroxioximorfona, 4- 8 Hidroxioximorfona, 8-Hidroxioximorfona, Hidromorfinol. 3

Naltrexona 10-Hidroxinaltrexona, 10-Cetonaltrexona, 14-Hidroxi-17-ciclopropilmetilnormorfina, — 2,2”- ? Bisnaltrexona, 3-Ciclopropilmetilnaltrexona, 3-O-Metilnaltrexona, 8-Hidroxinaltrexona, N-(3- Butenil)-noroximorfona, Dímero de Naltrexona aldol, N-Formil-noroximorfona

Naloxona 10-Alfa-hidroxinaloxona, 10-Beta-hidroxinaloxona, 10-Cetonaloxona, 3-O-Alilnaloxona, 7,8-

A me peionamena 22. NERO

Nalbufina Epímero beta de nalbufina, 2,2-Bisnalbufina, 6-Cetonalbufina, 10-Cetonalbufina, Alfa-

a LEmon NcGmTTeN Serum ams

Tabela 13. Variantes de DRS sequenciadas a partir de embaralhamento NeXT

Aumerto de dobra vanante ateatório 1 fpsans Ta saga CC a O AAA oa AAA esa as rasos A O a poa O A A ias frag O [sara | asseesaais CC eg Tresa O Tao O Jane OC e Pesar assa rs O re A Moi IN [sas | naneiaonon tva O save CO a II II vv [esses | assaz Jia rea Tra O a O agia O sas assa aa O a II RI ur Mo II ea isoo| [esara | a assa CC Mr CC rasa Pes aa Tea Tra CC A ga OC CC O eo] E [ser asas sa E a CI Vai O orgs O

Aleatório 2 fesaci2 | 1assssaaa O asa fas II II A O A A [eszera | rasaoraom O ago O ga O agr oa O sara sao II ra AAA A ateatório 3 Psa6s a saem A a s [essas aereas CC pot O ras Ss

Aleatório 4 fosses [a assa ias CC a O Joasa o [s38a | nasiagonss Jair IV rao a O onaes ras II & ssa aaa aa rs Ps aaa EI: rr uv O Apa Q CO US SS SS SS US MOSS SUS SS Pesca Farsa aa O lvaç seo asso aa Ii ur II” UI uva lo ssa E aaa CI II O a CI AI” Voa III [Psscio | rasosarone lia ra ZU

[00421] Não obstante as reivindicações apensas, a descrição mos- trada aqui é também definida pelas cláusulas que seguem:

1. Um método de aumento da produção de um produto al- caloide através da epimerização de um alcaloide (S)-1-benzilisoqui- nolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epime- rase dividida engenheirada em uma célula hospedeira engenheirada em comparação com a epimerização de um alcaloide (S)-1-benziliso- quinolina em uma alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimerase fundida em condições similares, o dito método compreen- dendo: contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada na dita célula hospedeira engenhei- rada, desta maneira aumentando a produção de um produto alcaloide, em que o contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada converte o dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina no dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina den- tro da dita célula hospedeira engenheirada.

2. O método da cláusula 1, em que a dita epimerase dividi- da engenheirada compreende um componente oxidase e um compo- nente redutase.

3. O método da cláusula 1, em que a dita epimerase dividi- da engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimerase dividida engenheirada.

4. O método da cláusula 1, em que a dita epimerase dividi- da engenheirada compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilida- de.

5. O método da cláusula 2, em que o dito componente oxi- dase compreende uma sequência que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais mutações, cada mutação em uma posição do códon que corresponde a uma posição selecionada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 17.

6. O método da cláusula 2, em que o dito componente oxi- dase compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 17.

7. O método da cláusula 2, em que o dito componente oxi- dase compreende uma sequência que é pelo menos 85% homóloga à SEQ ID NO. 17.

8. O método da cláusula 2, em que o dito componente oxi- dase compreende uma sequência que é pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO. 17.

9. O método da cláusula 2, em que o dito componente oxi- dase compreende uma sequência que é pelo menos 95% homóloga à SEQ ID NO. 17.

10. O método da cláusula 6, em que o dito componente oxi- dase compreende uma sequência que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substituições no códon, em re- lação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que corresponde a uma posição de aminoácido em SEQ ID NO. 17 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

11. O método da cláusula 2, em que o dito componente re- dutase compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 18.

12. O método da cláusula 2, em que o dito componente re- dutase compreende uma sequência que é pelo menos 85% homóloga à SEQ ID NO. 18.

13. O método da cláusula 2, em que o dito componente re- dutase compreende uma sequência que é pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO. 18.

14. O método da cláusula 2, em que o dito componente re- dutase compreende uma sequência que é pelo menos 95% homóloga à SEQ ID NO. 18

15. Um método de aumento da produção de um produto al- caloide através da epimerização de um alcaloide (S)-1-benzilisoquino- lina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimera- se dividida engenheirada em uma célula hospedeira engenheirada em comparação com a epimerização de um alcaloide (S)-1-benzilisoqui- nolina em uma alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epi- merase fundida em condições similares, o dito método compreenden- do: contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada na dita célula hospedeira engenhei- rada, desta maneira aumentando a produção de um produto alcaloide, em que o contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada converte o dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina no dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina den- tro da dita célula hospedeira engenheirada, e em que a dita epimerase dividida engenheirada produz pelo menos 1% mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida sob condições similares.

16. O método da cláusula 15, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada produz pelo menos 3% mais do dito alcaloide (R)-1- benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selvagem sob condições similares.

17. O método da cláusula 15, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada produz pelo menos 5% mais do dito alcaloide (R)-1-

benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selvagem sob condições similares.

18. O método da cláusula 15, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada produz pelo menos 10% mais do dito alcaloide (R)- 1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selvagem sob condições similares.

19. O método da cláusula 15, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada produz pelo menos 15% mais do dito alcaloide (R)- 1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selvagem sob condições similares.

20. O método da cláusula 15, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada produz pelo menos 20% mais do dito alcaloide (R)- 1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selvagem sob condições similares.

21. O método da cláusula 15, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada produz pelo menos 25% mais do dito alcaloide (R)- 1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selvagem sob condições similares.

22. O método da cláusula 15, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada produz pelo menos 30% mais do dito alcaloide (R)- 1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selvagem sob condições similares.

23. O método da cláusula 15, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumen- tam a atividade da dita epimerase dividida engenheirada.

24. O método da cláusula 23, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibi- lidade.

25. O método da cláusula 15, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada compreende um componente oxidase e um com- ponente redutase.

26. O método da cláusula 25, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 17.

27. O método da cláusula 25, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pelo menos 85% homóloga à SEQ ID NO. 17.

28. O método da cláusula 25, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO. 17.

29. O método da cláusula 25, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pelo menos 95% homóloga à SEQ ID NO. 17.

30. O método da cláusula 25, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é codificada por uma se- quência de DNA que compreende uma ou mais substituições no có- don, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que é equivalente a uma posição no aminoácido na SEQ ID NO. 17 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

31. O método da cláusula 25, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 80% homólo- ga à SEQ ID NO. 18.

32. O método da cláusula 25, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 85% homólo- ga à SEQ ID NO. 18.

33. O método da cláusula 25, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 90% homólo-

ga à SEQ ID NO. 18.

34. O método da cláusula 25, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 95% homólo- ga à SEQ ID NO. 18.

35. Uma célula hospedeira engenheirada que compreende uma epimerase dividida engenheirada, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada aumenta a conversão de um alcaloide (S)-1-ben- Zzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em relação à conversão de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em uma alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimerase fundida sob condi- ções similares.

36. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 35, em que a dita epimerase dividida engenheirada aumenta a produção do dito produto alcaloide em comparação com uma epimerização através de uma epimerase fundida parental sob condições similares.

37. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 35, em que a dita epimerase dividida engenheirada aumenta a produção de dito produto alcaloide em comparação com uma epimerização através de uma epimerase fundida do tipo selvagem.

38. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 35, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimerase dividida enge- nheirada.

39. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 35, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de lo- calização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

40. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 35, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende um compo-

nente oxidase e um componente redutase.

41. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 40, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é co- dificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais mutações, em relação a uma sequência do tipo selvagem, cada muta- ção em uma posição do códon que corresponde a uma posição seleci- onada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 17.

42. À célula hospedeira engenheirada da cláusula 40, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pe- lo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 17 e é codificada por uma se- quência de DNA que compreende uma ou mais substituições em có- don, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que corresponde a uma posição de aminoácido em SEQ ID NO. 17 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

43. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 40, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 18.

44. Uma epimerase dividida engenheirada que compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

45. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 44, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende um compo- nente oxidase e um componente redutase.

46. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 44, em que a dita epimerase dividida engenheirada tem atividade aumentada comparado com uma epimerase fundida do tipo selvagem.

47. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 44, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimerase dividida enge- nheirada.

48. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 45, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é co- dificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais mutações, em relação a uma sequência do tipo selvagem, cada muta- ção em uma posição do códon que corresponde a uma posição seleci- onada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 17.

49. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 45, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pe- lo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 17 e é codificada por uma se- quência de DNA que compreende uma ou mais substituições em có- don, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que corresponde a uma posição de aminoácido em SEQ ID NO. 17 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

50. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 45, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 18.

51. Uma célula hospedeira engenheirada que compreende uma epimerase dividida engenheirada, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada aumenta conversão de um alcaloide (S)-1-benzi- lisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em relação à conversão de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimerase fundida sob condi- ções similares.

52. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 51, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimerase dividida enge- nheirada.

53. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 51, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de lo- calização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

54. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 51, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende um compo- nente oxidase e um componente redutase.

55. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 54, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é co- dificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais mutações, em relação a uma sequência do tipo selvagem, cada muta- ção em uma posição do códon que corresponde a uma posição seleci- onada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 17.

56. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 54, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pe- lo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 17 e é codificada por uma se- quência de DNA que compreende uma ou mais substituições em có- don, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que é equivalente a uma posição no aminoácido na SEQ ID NO. 17 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

57. Uma epimerase dividida engenheirada que compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

58. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 57, em que a dita epimerase dividida engenheirada tem atividade aumentada comparado com uma epimerase fundida do tipo selvagem.

59. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 57, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimerase dividida enge- nheirada.

60. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 57, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende um compo- nente oxidase e um componente redutase.

61. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 60, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pe- lo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 17.

62. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 60, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pe- lo menos 85% homóloga à SEQ ID NO. 17.

63. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 60, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pe- lo menos 90% homóloga à SEQ ID NO. 17.

64. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 60, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pe- lo menos 95% homóloga à SEQ ID NO. 17.

65. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 60, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 18.

66. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 60, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 85% homóloga à SEQ ID NO. 18.

67. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 60, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO. 18.

68. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 60, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 95% homóloga à SEQ ID NO. 18.

69. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 60, em que o dito componente oxidase compreende uma ou mais mutações, cada mutação em uma posição do códon que corresponde a uma po- sição selecionada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 17.

70. A epimerase dividida engenheirada da cláusula 60, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é co- dificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substituições no códon, em relação a uma sequência do tipo selva- gem, em uma posição no códon que corresponde a uma posição de aminoácido em SEQ ID NO. 17 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

71. Um método de produção de um produto alcaloide atra- vés da epimerização de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimerase dividida engenheirada em uma célula hospedeira engenheirada, o dito método compreendendo: contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada na dita célula hospedeira engenhei- rada, desta maneira aumentando a produção de um produto alcaloide, em que contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada converte o dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina no dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina den-

tro da dita célula hospedeira engenheirada, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende um componente oxidase e um componente redutase, em que o dito componente oxidase compreen- de uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 17, e em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 18.

72. O método da cláusula 71, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumen- tam a atividade da dita epimerase dividida engenheirada.

73. O método da cláusula 71, em que a dita epimerase divi- dida engenheirada compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibi- lidade.

74. O método da cláusula 71, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é codificada por uma se- quência de DNA que compreende uma ou mais mutações, cada muta- ção em uma posição do códon que corresponde a uma posição seleci- onada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 17.

75. O método da cláusula 71, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pelo menos 85% homóloga à SEQ ID NO. 17.

76. O método da cláusula 71, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO. 17.

77. O método da cláusula 71, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é pelo menos 95% homóloga à SEQ ID NO. 17.

78. O método da cláusula 71, em que o dito componente oxidase compreende uma sequência que é codificada por uma se- quência de DNA que compreende uma ou mais substituições no có- don, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que corresponde a uma posição de aminoácido em SEQ ID NO. 17 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

79. O método da cláusula 71, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 85% homólo- ga à SEQ ID NO. 18.

80. O método da cláusula 71, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 90% homólo- ga à SEQ ID NO. 18.

81. O método da cláusula 71, em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 95% homólo- ga à SEQ ID NO. 18.

82. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita epimerase fundida é uma epimerase do tipo selvagem.

83. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita epimerase fundida é uma epimerase parental da dita epimerase dividida engenheirada.

84. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita epimerase fundida é uma epimerase fundida engenhei- rada compreendendo um domínio oxidase com uma sequência igual ao dito componente oxidase da dita epimerase dividida engenheirada.

85. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita epimerase fundida é uma epimerase fundida engenhei- rada compreendendo um domínio redutase com uma sequência igual ao dito componente redutase da dita epimerase dividida engenheirada.

86. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita epimerase fundida é uma epimera- se do tipo selvagem.

87. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita epimerase fundida é uma epimera- se parental da dita epimerase dividida engenheirada.

88. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita epimerase fundida é uma epimera- se fundida engenheirada compreendendo um domínio oxidase com uma sequência igual ao dito componente oxidase da dita epimerase dividida engenheirada.

89. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita epimerase fundida é uma epimera- se fundida engenheirada compreendendo um domínio redutase com uma sequência igual ao dito componente redutase da dita epimerase dividida engenheirada.

90. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o componente oxidase tem um domínio do tipo citocromo P450 oxidase.

91. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o componente redutase tem um domínio do tipo codeinona redutase.

92. Um método de produção de um produto alcaloide atra- vés da epimerização de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimerase fundida engenheirada em uma célula hospedeira engenheirada, o dito método compreendendo: contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase fundida engenheirada na dita célula hospedeira engenhei- rada, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimerase fundi-

da engenheirada, em que contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase fundida engenheirada converte o dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina no dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina den- tro da dita célula hospedeira engenheirada.

93. O método da cláusula 92, em que a dita epimerase fun- dida engenheirada compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibi- lidade.

94. O método da cláusula 92, em que a dita epimerase fun- dida engenheirada compreende uma sequência que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais mutações, em relação a uma sequência do tipo selvagem, cada mutação em uma posição do códon que corresponde a uma posição que é selecionada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 16.

95. O método da cláusula 92, em que a dita epimerase fun- dida engenheirada compreende uma sequência que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substituições no códon, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma po- sição no códon que corresponde a uma posição de aminoácido em SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

96. O método da cláusula 92, em que a dita epimerase fun- dida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 16.

97. O método da cláusula 92, em que a dita epimerase fun- dida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos

85% homóloga à SEQ ID NO. 16.

98. O método da cláusula 92, em que a dita epimerase fun- dida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO. 16.

99. O método da cláusula 92, em que a dita epimerase fun- dida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos 95% homóloga à SEQ ID NO. 16.

100. Um método de aumento da produção de um produto alcaloide através da epimerização de um alcaloide (S)-1-benzilisoqui- nolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epime- rase fundida engenheirada em uma célula hospedeira engenheirada em comparação com a epimerização de um alcaloide (S)-1-benziliso- quinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimerase fundida do tipo selvagem em condições similares, o dito método compreendendo: contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase fundida engenheirada na dita célula hospedeira engenhei- rada, desta maneira aumentando a produção de um produto alcaloide; em que contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase fundida engenheirada converte o dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina no dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina com a dita célula hospedeira engenheirada, e em que a dita epimerase fun- dida engenheirada produz pelo menos 1% mais do dito alcaloide (R)-1- benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selvagem sob condições similares.

101. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada produz pelo menos 3% mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selva- gem sob condições similares.

102. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada produz pelo menos 5% mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selva- gem sob condições similares.

103. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada produz pelo menos 10% mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selva- gem sob condições similares.

104. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada produz pelo menos 15% mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selva- gem sob condições similares.

105. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada produz pelo menos 20% mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selva- gem sob condições similares.

106. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada produz pelo menos 25% mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selva- gem sob condições similares.

107. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada produz pelo menos 30% mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selva- gem sob condições similares.

108. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais mutações que au- mentam a atividade da dita epimerase fundida engenheirada.

109. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais mutações seleciona- das do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma muta- ção de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

110. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma sequência que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais mutações, em relação a uma sequência do tipo selvagem, cada mutação em uma posição no códon que corresponde a uma posição que é selecionada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 16.

111. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma sequência que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substitui- ções no códon, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que corresponde a uma posição de aminoácido em SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

112. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 16.

113. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos 85% homóloga à SEQ ID NO. 16.

114. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO. 16.

115. O método da cláusula 100, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos 95% homóloga à SEQ ID NO. 16.

116. Uma célula hospedeira engenheirada que compreende uma epimerase fundida engenheirada, em que a dita epimerase au-

menta a conversão de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina, e em que a dita epimerase fundida engenheirada produz mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selvagem sob condições similares.

117. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 116, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimerase fundida enge- nheirada.

118. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 116, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de lo- calização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

119. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 116, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma sequên- cia que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais mutações, em relação a uma sequência do tipo selvagem, ca- da mutação em uma posição do códon que corresponde a uma posi- ção que é selecionada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 16.

120. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 116, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma sequên- cia que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 16 e é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substitui- ções em códon, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que corresponde a uma posição de aminoácido em SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

121. Uma epimerase fundida engenheirada que compreen-

de uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

122. A epimerase engenheirada da cláusula 121, em que a dita epimerase fundida engenheirada tem atividade aumentada com- parado com uma epimerase fundida do tipo selvagem.

123. A epimerase fundida engenheirada da cláusula 121, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimerase fundida engenheirada.

124. A epimerase fundida engenheirada da cláusula 121, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma se- quência que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais mutações, em relação a uma sequência do tipo selva- gem, cada mutação em uma posição do códon que corresponde a uma posição que é selecionada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 16.

125. A epimerase fundida engenheirada da cláusula 121, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma se- quência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 16 e é codifi- cada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais subs- tituições em códon, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que é equivalente a uma posição no aminoáci- do na SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

126. Um método para formação de uma corrente de produto tendo um produto alcaloide benzilisoquinolina, compreendendo: (a) prover células hospedeiras engenheiradas e uma ma- téria-prima incluindo nutrientes e água a um reator em batelada, célu-

las hospedeiras engenheiradas que compreendem pelo menos uma sequência de codificação heteróloga codificando pelo menos uma epimerase engenheirada, em que a epimerase engenheirada é uma epimerase dividida engenheirada ou epimerase fundida engenheirada de qualquer uma das cláusulas anteriores; (b) no dito reator em batelada, submeter as ditas células hospedeiras engenheiradas à fermentação através da incubação das ditas células hospedeiras engenheiradas por um período de tempo de pelo menos cerca de 5 minutos para produzir uma solução compreen- dendo o dito produto alcaloide benzilisoquinolina e material celular; e (c) usar pelo menos uma unidade de separação para se- parar o dito produto alcaloide benzilisoquinolina do dito material celular para prover a dita corrente de produto compreendendo o dito produto benzilisoquinolina.

127. O método da cláusula 126, em que pelo menos um pa- râmetro de processo do reator em batelada é modificável para alterar uma composição de produto alcaloide benzilisoquinolina resultante.

128. O método da cláusula 126, em que o pelo menos um parâmetro de processo que é modificável compreende pelo menos um de oxigênio dissolvido, pH, velocidade de agitação, taxa de aeração e densidade celular.

129. Um produto medicinal que compreende o produto alca- loide benzilisoquinolina produzido a partir de quaisquer cláusulas ante- riores.

130. O produto medicinal da cláusula 129, em que o produ- to medicinal tem propriedades terapêuticas para câncer.

131. O produto medicinal da cláusula 129, em que o produ- to medicinal tem propriedades analgésicas.

132. O produto medicinal da cláusula 129, em que o produ- to medicinal tem propriedades antimalária.

133. O produto medicinal da cláusula 129, em que o produ- to medicinal tem propriedades antitussígenas.

134. O produto medicinal da cláusula 129, em que o produ- to medicinal tem propriedades de tratamento de overdose de opioide.

135. O produto medicinal da cláusula 129, em que o produ- to medicinal tem propriedades antiviciantes.

136. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o dito produto é processado mais dentro da dita célula hospe- deira engenheirada para produzir um produto nal-opioide.

137. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que em que o dito produto é processado mais dentro da dita célula hospedeira engenheirada para produzir um produto nor-opioide.

138. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que em que o dito produto é processado mais dentro da dita célula hospedeira engenheirada para produzir um produto alcaloide bisbenzi- lisoquinolina.

139. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita célula hospedeira engenheira- da é engenheirada para converter o dito produto em um produto nal- opioide.

140. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita célula hospedeira engenheira- da é engenheirada para converter o dito produto em um produto nor- opioide.

141. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita célula hospedeira engenheira- da é engenheirada para converter o dito produto em um produto alca- loide bisbenzilisoquinolina.

142. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita célula hospedeira engenheira-

da é engenheirada para converter o dito produto em um produto alca- loide promorfinano.

143. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a dita célula hospedeira engenheira- da é engenheirada para converter o dito produto em um produto alca- loide morfinano.

144. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a epimerase fundida engenheirada compreende um domínio oxidase e um domínio redutase.

145. O método da cláusula 144, em que o domínio oxidase é um domínio do tipo citocromo P450 oxidase.

146. O método da cláusula 144, em que o domínio redutase é um domínio do tipo codeinona redutase.

147. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina é (S)-reticulina.

148. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina é (R)-reticulina.

149. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, compreendendo ainda: converter o alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em um alca- loide promorfinano de 4 anéis.

150. O método da cláusula 75, em que o alcaloide promor- finano de 4 anéis é salutaridina.

151. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, compreendendo ainda: converter o alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em um alca- loide morfinano de 5 anéis.

152. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, compreendendo ainda: converter o alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em um alca-

loide bisbenzilisoquinolina.

153. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, compreendendo ainda: converter o alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em um nal- opioide.

154. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, compreendendo ainda: converter o alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em um nor- opioide.

155. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, compreendendo ainda: converter o alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em um pro- morfinano.

156. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, compreendendo ainda: converter o alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em um morfi- nano.

157. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina presente dentro da célula hospedeira engenheirada é produzido dentro de uma célula microbia- na engenheirada.

158. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina é produzido dentro da célu- la hospedeira engenheirada através de uma via metabólica começan- do com L-tirosina.

159. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina é produzido dentro da célu- la hospedeira engenheirada através de uma via metabólica começan- do com uma fonte de carboidrato e nitrogênio.

160. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores,

em que o alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina é selecionado do grupo consistindo em: (S)-norreticulina; (S)-reticulina; (S)-tetra-hidropapa- verina; (S)-norcoclaurina; (S)-coclaurina; (S)-N-metilcoclaurina; (S)-3"- hidroxi-N-metilcoclaurina; (S)-norisoorientalina; (S)-orientalina; (S)-iso- orientalina; (S)-norprotosinomenina; (S)-protosinomenina; (S)-norlau- danosolina; (S)-laudanosolina; (S)-4'-O-metilaudanosolina; (S)-6-O- metilnorlaudanosolina; e (S)-4'-O-metilnorlaudanosolina.

161. O método de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina é um composto de Fórmula !: R'o.

E

R Q OR? Fórmula |, em que: R1, R2, Rº e Rº são independentemente hidrogênio ou meti- la; e Rº é hidrogênio, hidróxi ou metóxi.

162. O método de qualquer uma das cláusulas acima, em que a dita célula hospedeira engenheirada é uma célula não planta engenheirada.

163. O método de qualquer uma das cláusulas acima, em que a dita célula hospedeira engenheirada é uma célula de levedura engenheirada.

164. O método de qualquer uma das cláusulas acima, em que a dita célula hospedeira engenheirada é uma célula bacteriana engenheirada.

165. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a epimerase fundida engenheirada compreende um domínio oxidase e um domínio redutase.

166. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 165, em que o componente oxidase tem um domínio do tipo citocromo P450 oxidase.

167. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 165, em que o componente redutase tem um domínio do tipo codeinona redu- tase.

168. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas acima, em que a dita célula hospedeira engenheirada é uma célula não planta engenheirada.

169. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas acima, em que a dita célula hospedeira engenheirada é uma célula de levedura engenheirada.

170. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas acima, em que a dita célula hospedeira engenheirada é uma célula bacteriana engenheirada.

171. Um método de aumento da produção de um produto alcaloide através da epimerização de um alcaloide (S)-1-benzilisoqui- nolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epime- rase engenheirada em uma célula hospedeira engenheirada, o dito método compreendendo: contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase engenheirada, em que contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase engenheirada converta o dito alcaloide (S)-1- benzilisoquinolina no dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina.

172. O método da cláusula 171, em que a dita epimerase engenheirada é uma epimerase dividida engenheirada.

173. O método da cláusula 172, em que a dita epimerase dividida engenheirada aumenta a dita produção do dito produto alca- loide em comparação com uma epimerização através de uma epime-

rase fundida do tipo selvagem.

174. O método da cláusula 172, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações que au- mentam a atividade da dita epimerase dividida engenheirada.

175. O método da cláusula 172, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações seleciona- das do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma muta- ção de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

176. O método da cláusula 172, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações, cada mu- tação em uma posição que é equivalente a uma posição dentro da SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 16.

177. O método da cláusula 172, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 16 e é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substituições em códon, em rela- ção a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que é equivalente a uma posição no aminoácido na SEQ ID NO. 16 seleci- onada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

178. O método da cláusula 171, em que a dita epimerase engenheirada é uma epimerase fundida engenheirada.

179. O método da cláusula 178, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais mutações que au- mentam a atividade da dita epimerase fundida engenheirada.

180. O método da cláusula 178, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais mutações seleciona-

das do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma muta- ção de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

181. O método da cláusula 178, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais mutações, cada mu- tação em uma posição que é equivalente a uma posição dentro da SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 16.

182. O método da cláusula 178, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 16 e é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substituições em códon, em rela- ção a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que é equivalente a uma posição no aminoácido na SEQ ID NO. 16 seleci- onada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

183. O método de qualquer uma das cláusulas 171-182 acima, em que a dita célula hospedeira engenheirada é uma célula não planta engenheirada.

184. Uma célula hospedeira engenheirada que compreende uma epimerase engenheirada, em que a dita epimerase aumenta a conversão de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina.

185. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 184, em que a dita epimerase engenheirada é uma epimerase dividida enge- nheirada.

186. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 185, em que a dita epimerase dividida engenheirada aumento produção de dito produto alcaloide em comparação com uma epimerização através de uma epimerase fundida do tipo selvagem.

187. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 185, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimerase dividida enge- nheirada.

188. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 185, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de lo- calização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

189. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 185, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações, cada mutação em uma posição que é equivalente a uma posição dentro da SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 16.

190. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 185, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma sequên- cia que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 16 e é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substitui- ções em códon, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que é equivalente a uma posição no aminoáci- do na SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

191. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 184, em que a dita epimerase engenheirada é uma epimerase fundida enge- nheirada.

192. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 191, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimerase fundida enge-

nheirada.

193. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 191, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de lo- calização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

194. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 191, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais mutações, cada mutação em uma posição que é equivalente a uma posição dentro da SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 16.

195. A célula hospedeira engenheirada da cláusula 191, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma se- quência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 16 e é codifi- cada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais subs- tituições em códon, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que é equivalente a uma posição no aminoáci- do na SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

196. A célula hospedeira engenheirada de qualquer uma das cláusulas 184-195, em que a dita célula hospedeira engenheirada é uma célula não planta engenheirada.

197. Uma epimerase engenheirada que compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma muta- ção de localização, uma mutação de interação de citocromo P450 re- dutase e uma mutação de acessibilidade.

198. A epimerase engenheirada da cláusula 197, em que a dita epimerase engenheirada é uma epimerase dividida engenheirada.

199. A epimerase engenheirada da cláusula 197, em que a dita epimerase dividida engenheirada tem atividade aumentada com- parado com uma epimerase fundida do tipo selvagem.

200. A epimerase engenheirada da cláusula 197, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais muta- ções que aumentam a atividade da dita epimerase dividida engenhei- rada.

201. A epimerase engenheirada da cláusula 197, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais muta- ções, cada mutação em uma posição que é equivalente a uma posição dentro da SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posi- ções 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 16.

202. A epimerase engenheirada da cláusula 197, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 16 e é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substituições em códon, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posi- ção no códon que é equivalente a uma posição no aminoácido na SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

203. Uma epimerase engenheirada, em que a dita epimera- se engenheirada é uma epimerase fundida engenheirada que compre- ende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

204. A epimerase engenheirada da cláusula 203, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma ou mais muta- ções em uma posição correspondendo à SEQ ID NO. 16, as ditas uma ou mais mutações correspondendo a uma posição selecionada do grupo consistindo nas posições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128,

155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477.

205. A epimerase engenheirada da cláusula 203, em que a dita epimerase fundida engenheirada compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO. 16 e é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substituições em códon, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma em uma posição no códon que é equivalente a uma posição no aminoáci- do na SEQ ID NO. 16 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

[00422] “Embora modalidades preferidas da invenção tenham sido mostradas e descritas aqui, será óbvio àqueles versados na técnica que tais modalidades são providas a título de exemplo apenas. Inúme- ras variações, mudanças e substituições ocorrerão àqueles versados na técnica sem se afastar da invenção. Deve ser compreendido que várias alternativas às modalidades da invenção descrita aqui podem ser empregadas na prática da invenção. É pretendido que as reivindi- cações que seguem definam o escopo da invenção e que métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalen- tes sejam então cobertos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de aumento da produção de um produto alcaloi- de através da epimerização de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimerase dividida engenheirada em uma célula hospedeira engenheirada em comparação com a epimerização de um alcaloide (S)-1-benzilisoqui- nolina em uma alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epi- merase fundida em condições similares, caracterizado pelo fato de que o método compreende: contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada na dita célula hospedeira engenhei- rada, desta maneira aumentando a produção de um produto alcaloide, em que o contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada converte o dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina no dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina den- tro da dita célula hospedeira engenheirada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita epimerase fundida é uma epimerase do tipo selvagem.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita epimerase fundida é uma epimerase parental da dita epimerase dividida engenheirada.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita epimerase fundida é uma epimerase fundida engenheirada compreendendo um domínio oxidase com uma mesma sequência que o dito componente oxidase da dita epimerase dividida engenheirada.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimerase dividida engenheirada.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita epimerase dividida engenheirada compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma mutação de interação de citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita epimerase dividida engenheirada compreende um componente oxidase e um componente redutase.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito componente oxidase compreende uma sequên- cia que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais mutações, cada mutação em uma posição do códon que cor- responde a uma posição selecionada do grupo consistindo em posi- ções 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 17.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito componente oxidase compreende uma sequên- cia que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO: 17.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito componente oxidase compreende uma sequên- cia que é pelo menos 95% homóloga à SEQ ID NO: 17.

11. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito componente oxidase compreende uma sequên- cia que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substituições de códon, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição no códon que corresponde a uma posição no aminoácido na SEQ ID NO: 17 selecionada do grupo consistindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

12. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito componente redutase compreende uma se- quência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO: 18.

13. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito componente redutase compreende uma se- quência que é pelo menos 95% homóloga à SEQ ID NO: 18.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita epimerase dividida engenheirada produz pelo menos 1% mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que a dita epimerase fundida sob condições similares.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita epimerase dividida engenheirada produz pelo menos 3% mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selvagem sob condições similares.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita epimerase dividida engenheirada produz pelo menos 5% mais do dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina do que uma epimerase fundida do tipo selvagem sob condições similares.

17. Método de produção de um produto alcaloide através da epimerização de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimerase fundida engenhei- rada em uma célula hospedeira engenheirada caracterizado pelo fato de que compreende: contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada na dita célula hospedeira engenhei- rada, desta maneira aumentando a produção de um produto alcaloide, em que o contato do dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina com a dita epimerase dividida engenheirada converte o dito alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina no dito alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina den- tro da dita célula hospedeira engenheirada, em que a dita epimerase dividida engenheirada compreende um componente oxidase e um componente redutase, em que o dito componente oxidase compreen- de uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO: 17, e em que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO: 18.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que a dita epimerase dividida engenheirada compreen- de uma ou mais mutações que aumentam a atividade da dita epimera- se dividida engenheirada.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que a dita epimerase dividida engenheirada compreen- de uma ou mais mutações selecionadas do grupo consistindo em uma mutação de localização, uma mutação de interação da citocromo P450 redutase e uma mutação de acessibilidade.

20. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que a dita epimerase dividida engenheirada compreen- de um componente oxidase e um componente redutase.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que o dito componente oxidase compreende uma se- quência que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais mutações, cada mutação em uma posição de códon que corresponde a uma posição selecionada do grupo consistindo nas po- sições 16, 17, 37, 50, 64, 69, 70, 110, 128, 155, 232, 234, 244, 293, 303, 328, 354, 387, 393, 427 e 477 dentro da SEQ ID NO. 17.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que o dito componente oxidase compreende uma se- quência que é pelo menos 85% homóloga à SEQ ID NO: 17.

23. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que o dito componente oxidase compreende uma se- quência que é pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO: 17.

24. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza-

do pelo fato de que o dito componente oxidase compreende uma se- quência que é pelo menos 95% homóloga à SEQ ID NO: 17.

25. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que o dito componente oxidase compreende uma se- quência que é codificada por uma sequência de DNA que compreende uma ou mais substituições de códon, em relação a uma sequência do tipo selvagem, em uma posição de códon que corresponde a uma po- sição de aminoácido na SEQ ID NO: 17 selecionada do grupo consis- tindo nas posições 75, 160, 191, 256, 359, 366 e 500.

26. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que o dito componente redutase compreende uma se- quência que é pelo menos 85% homóloga à SEQ ID NO: 18.

27. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que o dito componente redutase compreende uma se- quência que é pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO: 18.

28. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteri- zado pelo fato de que o dito componente redutase compreende uma sequência que é pelo menos 95% homóloga à SEQ ID NO: 18.

29. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 20, carac- terizado pelo fato de que um primeiro ácido nucleico que codifica o dito componente oxidase tem um primeiro sítio de iniciação de tradução e em que um segundo ácido nucleico que codifica o dito componente redutase tem um segundo sítio de início de tradução.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteriza- do pelo fato de que o dito primeiro ácido nucleico é separado do dito segundo ácido nucleico.

31. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteriza- do pelo fato de que o dito primeiro ácido nucleico é um mesmo ácido nucleico que o dito segundo ácido nucleico.

32. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 20, carac-

terizado pelo fato de que o dito componente oxidase é codificado por um primeiro RNA mensageiro e em que o dito componente redutase é codificado por um segundo RNA mensageiro.

33. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 20, carac- terizado pelo fato de que o dito componente oxidase compreende uma primeira molécula, e em que o dito componente redutase compreende uma segunda molécula, em que a dita primeira molécula é separada da dita segunda molécula.

34. Célula hospedeira engenheirada que compreende uma epimerase dividida engenheirada caracterizada pelo fato de que a dita epimerase dividida engenheirada aumenta conversão de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina em relação à conversão de um alcaloide (S)-1-benzilisoquinolina em um alcaloide (R)-1-benzilisoquinolina através de uma epimerase fundida sob condições similares.

35. Célula hospedeira engenheirada, de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que a dita epimerase fundida é uma epimerase do tipo selvagem.

36. Célula hospedeira engenheirada, de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que a dita epimerase fundida é uma epimerase parenteral da dita epimerase dividida engenheirada.

37. Célula hospedeira engenheirada, de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que a dita epimerase fundida é uma epimerase fundida engenheirada compreendendo um domínio oxidase com uma mesma sequência que o dito componente oxidase da dita epimerase dividida engenheirada.

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