CN107960102A - 产生差向异构酶和苄基异喹啉生物碱的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使(S)‑1‑苄基异喹啉生物碱差向异构化为(R)‑1‑苄基异喹啉生物碱的方法。所述方法包括使所述(S)‑1‑苄基异喹啉生物碱与至少一种酶接触。使所述(S)‑1‑苄基异喹啉生物碱与所述至少一种酶接触将所述(S)‑1‑苄基异喹啉生物碱转化成(R)‑1‑苄基异喹啉生物碱。

Description

产生差向异构酶和苄基异喹啉生物碱的方法
交叉引用
按照美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求于2015年5月8日提交的美国临时专利申请序列号62/159,122和于2015年6月11日提交的美国临时专利申请序列号62/174,475的提交日期的优先权，所述申请的公开内容以引用方式并入本文。
另外，本申请涉及：美国专利申请序列号14/211,611，现公布为US 2014-0273109，该申请提交于2014年3月14日，代理人案卷号为STAN-1018；PCT申请序列号PCT/US2014/027833，现公布为WO 2014/143744，该申请提交于2014年3月14日，代理人案卷号为STAN-1018WO；美国专利申请序列号15/031,618，该申请提交于2016年4月22日，代理人案卷号为STAN-1078；申请序列号PCT/US2014/063738，现公布为WO 2015/066642，该申请提交于2014年11月3日，代理人案卷号为STAN-1078WO；美国临时专利申请序列号62/080,610，其提交于2014年11月17日，代理人案卷号为STAN-1169PRV；美国临时专利申请序列号62/107,238，其提交于2015年1月23日，代理人案卷号为STAN-1169PRV2；申请序列号PCT/US2015/060891，该申请提交于2015年11月16日，代理人案卷号为STAN-1169WO；美国临时专利申请序列号62/156,701，其提交于2015年5月4日，代理人案卷号为STAN-1221PRV；以及申请序列号PCT/US2016/030808，该申请提交于2016年5月4日，代理人案卷号为STAN-1221WO；所述申请的公开内容均以引用方式并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合同AT007886在政府支持下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。
发明内容
本公开提供了用于在工程化的宿主细胞中产生各种不同的苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法。本公开还提供了在工程化的宿主细胞中产生的各种不同的生物碱的组合物。另外，本公开提供了用于在工程化的宿主细胞中产生差向异构酶的方法。在具体的情况中，本公开提供了用于通过(S)-1-苄基异喹啉生物碱到(R)-1-苄基异喹啉生物碱的差向异构化而在工程化的宿主细胞中产生各种不同的生物碱产物的方法。在另外的具体情况中，本公开提供了用于通过(S)-牛心果碱到(R)-牛心果碱的差向异构化来产生各种不同的生物碱产物的方法。
本发明的一个方面提供了一种相对于非工程化细胞而言具有增加的酪氨酸羟化酶活性的工程化的非植物细胞。本发明的另一个方面提供了一种相对于表达野生型TyrH的细胞而言具有增加的酪氨酸羟化酶活性的工程化的非植物细胞。本发明的另一个方面提供了一种相对于表达不具有如本文所提供的增加酪氨酸羟化酶活性的突变的野生型TyrH的细胞而言具有增加的酪氨酸羟化酶活性的工程化的非植物细胞。具体地讲，工程化的非植物细胞具有选自由以下各项组成的组的至少一个修饰：底物抑制减轻突变；产物抑制减轻突变；以及辅因子回收促进机制。
本发明的另一个方面提供了一种使(S)-1-苄基异喹啉生物碱差向异构化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的方法。该方法包括使(S)-1-苄基异喹啉生物碱与至少一种酶接触。使(S)-1-苄基异喹啉生物碱与至少一种酶接触将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱。
本发明的另一个方面提供了一种产生将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的差向异构酶的工程化的非植物细胞。差向异构酶包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15，在表1中列出。
本发明的另一个方面提供了一种用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的工艺，其包括使(S)-1-苄基异喹啉生物碱与足以将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的量的差向异构酶接触。
在本发明的另一个方面，提供了一种使1-苄基异喹啉生物碱的立构中心差向异构化的方法。该方法包括使1-苄基异喹啉生物碱与至少一种酶接触。使1-苄基异喹啉生物碱与至少一种酶接触将1-苄基异喹啉生物碱的立构中心的立体化学翻转成1-苄基异喹啉生物碱的立构中心的相反的立体化学。
在一些实例中，工程化的非植物细胞包括多个编码序列，其各自编码选自表2中列出的酶的组的酶。在一些实例中，异源编码序列可以可操作地连接。可操作地连接的异源编码序列可以在产生特定苄基异喹啉生物碱产物和/或差向异构酶产物的相同途径内。
在本发明的另一个方面，提供了一种产生双苄基异喹啉生物碱的工程化的非植物细胞。双苄基异喹啉生物碱使用存在于工程化的非植物细胞内的偶合酶产生。另外，工程化的非植物细胞包括编码在工程化的非植物细胞内产生至少一个苄基异喹啉生物碱单体中所用的至少一种酶的至少一个异源编码序列。此外，至少一种偶合酶在工程化的非植物细胞内将两个苄基异喹啉生物碱单体二聚化，从而形成双苄基异喹啉生物碱。
以引用方式并入
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均以引用方式并入本文至如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入的相同程度。
附图说明
本发明的新型特征在随附权利要求中具体阐述。通过参考对其中利用了本发明原理的例示性实施方案作出阐述的以下详细描述以及所述实施方案的附图，将更好地理解本发明的特征和优点：
图1示出根据本发明的实施方案，四氢生物蝶呤的合成、再循环和补救途径的实例。
图2示出根据本发明的实施方案，用于将葡萄糖转化成4-HPA、多巴胺和3,4-DHPA的生物合成方案。
图3示出根据本发明的实施方案，(R)-1-苄基异喹啉生物碱形成的示意性实例。
图4示出根据本发明的实施方案，CYP-COR酶的氨基酸序列。
图5示出根据本发明的实施方案，用于通过去甲乌药碱将L-酪氨酸转化成牛心果碱的生物合成方案。
图6示出根据本发明的实施方案，用于通过全去甲劳丹碱将L-酪氨酸转化成牛心果碱的生物合成方案。
图7示出根据本发明的实施方案，用于将L-酪氨酸转化成吗啡喃生物碱的生物合成方案。
图8示出根据本发明的实施方案，用于将L-酪氨酸转化成原小檗碱、苯酞异喹啉和小檗碱生物碱产物的生物合成方案。
图9示出根据本发明的实施方案，用于将L-酪氨酸转化成诺斯卡品、类诺斯卡品和苯酞异喹啉生物碱产物的生物合成方案。
图10示出根据本发明的实施方案，用于将L-酪氨酸转化成血根碱和苯菲啶生物碱的生物合成方案。
图11A示出根据本发明的实施方案，用于将坎那定转化成诺斯卡品的生物合成方案。
图11B示出根据本发明的实施方案，用于产生半合成的阿片类物质的生物合成方案。
图12示出根据本发明的实施方案，改善在工程化的酵母菌株中由糖产生去甲乌药碱的酪氨酸羟化酶突变体。
图13示出根据本发明的实施方案，改善在工程化的酵母菌株中由糖产生牛心果碱的酪氨酸羟化酶突变体。
图14示出根据本发明的实施方案，改善工程化的酵母菌株中通过酪氨酸羟化酶实现的L-DOPA产生的二氢叶酸还原酶(DHFR)的共表达。
图15示出根据本发明的实施方案，(A)向培养基中添加抗氧化剂改善工程化的酵母菌株中通过酪氨酸羟化酶实现的L-DOPA产生，以及(B)向培养基中添加增加BH4水平的抗氧化剂。
图16示出根据本发明的实施方案，(A)用于将L-酪氨酸转化成bisBIA的生物合成方案，以及(B)被工程化为生物合成bisBIA的酵母菌株。
图17示出根据本发明的实施方案，细胞色素P450氧化酶-可待因酮还原酶样(CYP-COR)融合物的系统发育树。
图18(A)和18(B)示出根据本发明的实施方案，被工程化为将(S)-牛心果碱转化成沙罗泰里啶的酵母菌株的LC-MS/MS分析。
图19示出根据本发明的实施方案，被工程化为将外消旋的全去甲劳丹碱转化成(R)-牛心果碱的酵母菌株的手性LC-MS/MS分析。
图20(A)和20(B)示出根据本发明的实施方案，当在酵母而不是植物中异源表达时观察到的沙罗泰里啶合酶的工程化融合物消除蛋白质的N-连接的糖基化。
图21(A)和21(B)示出根据本发明的实施方案，碎叶紫堇碱合酶-沙罗泰里啶合酶融合设计。
图22示出根据本发明的实施方案，改善在酵母中的活性的沙罗泰里啶合酶密码子优化和工程化融合物。
图23(A)和23(B)示出根据本发明的实施方案，小规模成批发酵的LC-MS/MS分析，其中工程化酵母催化(R)-牛心果碱到蒂巴因的转化和外消旋的全去甲劳丹碱到蒂巴因的转化。
图24示出根据本发明的实施方案，通过随机诱变和筛选生成在酵母中表现出增强活性的CODM酶变体。
图25(A)、25(B)和25(C)示出根据本发明的实施方案，通过工程化酵母将(R)-牛心果碱转化成蒂巴因的发酵优化。
图26示出根据本发明的实施方案，用于由L-酪氨酸产生关键的分支点中间体牛心果碱的酵母平台菌株。
图27(A)、27(B)、27(C)和27(D)示出根据本发明的实施方案，工程化的酵母菌株中的蒂巴因和氢可酮产生。
图28示出根据本发明的实施方案，在工程化的酵母菌株中，通过将NCS基因的拷贝数从两个拷贝增加至三个拷贝来实现苄基异喹啉生物碱牛心果碱的产生增加。
具体实施方式
本公开提供了用于在工程化的宿主细胞中产生各种不同的苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法。本公开还提供了在工程化的宿主细胞中产生的各种不同的生物碱的组合物。另外，本公开提供了用于在工程化的宿主细胞中产生差向异构酶的方法。在具体的情况中，本公开提供了用于通过(S)-1-苄基异喹啉生物碱到(R)-1-苄基异喹啉生物碱的差向异构化而在工程化的宿主细胞中产生各种不同的生物碱产物的方法。在另外的具体情况中，本公开提供了用于通过(S)-牛心果碱到(R)-牛心果碱的差向异构化来产生各种不同的生物碱产物的方法。
目标苄基异喹啉生物碱(BIA)
提供了产生目标BIA的宿主细胞。在一些实例中，宿主细胞的工程化菌株诸如本发明的工程化菌株提供用于产生目标苄基异喹啉生物碱以及遍及若干结构种类的它们的修饰物的平台，所述种类包括但不限于：前体BIA、苄基异喹啉、原小檗碱、原阿片碱、苯菲啶、原吗啡喃(promorphinan)、吗啡喃、断裂小檗碱、苯酞异喹啉、阿朴啡、双苄基异喹啉以及其他。这些种类中的每一种旨在包括可产生该种类的成员的工程化宿主细胞生物合成途径的任何适宜成员的生物合成前体、中间体，以及其代谢物。对于这些结构种类中的每一种，在下文给出化合物的非限制性实例。在一些情况下，给定实例的结构可以或可以不将自身表征为苄基异喹啉生物碱。本发明的化学实体旨在包括所有可能的异构体，包括单一对映体、外消旋混合物、光学纯形式、非对映体的混合物，以及中间体混合物。
BIA前体可包括但不限于去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)，以及NC和NL前体，诸如酪氨酸、酪胺、4-羟基苯乙醛(4-HPA)、4-羟基苯丙酮酸(4-HPPA)、L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、3,4-二羟基苯乙醛(3,4-DHPA)以及多巴胺。在一些实施方案中，一种或多种BIA前体为3,4-二羟基苯乙醛(3,4-DHPA)和多巴胺。在某些情况中，一种或多种BIA前体为4-羟基苯乙醛(4-HPA)和多巴胺。具体地讲，NL和NC可通过皮克特-施彭格勒(Pictet-Spengler)缩合反应由前体分子分别合成，其中反应可自发发生或者可通过任何适宜的酶催化。
苄基异喹啉类可包括但不限于：去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、乌药碱、3’-羟基乌药碱、4’-O-甲基全去甲劳丹碱、4’-O-甲基-劳丹碱、N-甲基去甲乌药碱、劳丹碱、N-甲基乌药碱、3’-羟基-N-甲基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、罂粟碱、劳丹宁、劳丹素、四氢罂粟碱、1,2-二氢罂粟碱，以及东罂粟灵。
原小蘖碱类可包括但不限于金黄紫堇碱、碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、南丁宁碱、药根碱、千金藤啶碱、离木明碱、顺式-N-甲基刺罂粟碱、四氢非洲防己碱、掌叶防己碱、四氢掌叶防己碱、非洲防己碱、坎那定、N-甲基坎那定、1-羟基坎那定、小蘖碱、N-甲基-左旋蛇果黄堇碱、1,13-二羟基-N-甲基坎那定，以及1-羟基-10-O-乙酰基-N-甲基坎那定。
原阿片碱类可包括但不限于原阿片碱、6-羟基原阿片碱、别隐品碱、隐品碱、隐掌叶防己碱(muramine)和黄唐松草碱(thalictricine)。
苯菲啶类可包括但不限于二氢血根碱、血根碱、dihydrocheilirubine、cheilirubine、dihydromarcapine、marcapine和白屈菜红碱。
原吗啡喃类可包括但不限于沙罗泰里啶、沙罗泰里啶醇和沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯。
吗啡喃类可包括但不限于蒂巴因、可待因酮、可待因、吗啡、吗啡酮、东罂粟碱、尼奥品酮、尼奥品、新吗啡(neomorphine)、氢可酮、二氢可待因、14-羟基可待因酮、羟考酮、14-羟基可待因、吗啡酮、氢吗啡酮、二氢吗啡、二氢埃托啡、乙基吗啡、埃托啡、美托酮、丁丙诺啡、福尔可定、异可待因和氧吗啡酮。
断裂小檗碱类可包括但不限于4’-O-脱甲基马克兰特醛(4’-O-desmethylmacrantaldehyde)、4’-O-脱甲基罂粟奥辛、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛、罂粟奥辛，以及3-O-乙酰基罂粟奥辛。
苯肽异喹啉类可包括但不限于那可托灵半缩醛、那可汀半缩醛、那可托灵、诺斯卡品、山缘草定碱、山缘草碱、(+)或(-)-荷包牡丹碱、咖喏定、紫堇明、对叶延胡索碱、紫堇米定碱、夏无碱、5’-O-脱甲基那可汀、(+)或(-)-α或β-白毛莨碱以及角茴香碱。
阿朴啡类可包括但不限于木兰花碱、紫堇块茎碱、阿朴吗啡、波尔定碱、异波尔定碱、异蒂巴因、异紫堇块茎碱以及glaufine。
双苄基异喹啉类可包括但不限于黄芦木碱、guattgaumerine、蝙蝠葛碱和莲心碱。
可通过本发明的工程化菌株产生的其他化合物可包括但不限于丽春花定碱、帕威(pavine)、异帕威(isopavine)和枯拉灵。
在某些实施方案中，本发明的工程化菌株可提供用于产生与四氢生物蝶呤合成相关的化合物的平台，所述化合物包括但不限于二氢新蝶呤三磷酸、6-丙酮酰四氢蝶呤、5,6,7,8-四氢生物蝶呤、7,8-二氢生物蝶呤、四氢生物蝶呤4a-甲醇胺、醌型二氢生物喋呤和生物蝶呤。
宿主细胞
可在主题宿主细胞和方法中利用任何适宜的细胞。在一些情况下，宿主细胞为非植物细胞。在一些情况下，宿主细胞可表征为微生物细胞。在某些情况下，宿主细胞为昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞或酵母细胞。任何适宜类型的宿主细胞可用于产生主题产BIA细胞，参见例如，US2008/0176754和US2014/0273109，其公开内容以引用方式全文并入。目标宿主细胞包括但不限于：细菌细胞，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimuium)细胞；昆虫细胞，诸如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞；以及酵母细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞。在一些实例中，宿主细胞为酵母细胞或大肠杆菌细胞。在一些情况下，宿主细胞为酵母细胞。在一些情况下，宿主细胞来自被工程化以产生目标BIA，诸如(R)-1-苄基异喹啉生物碱的酵母菌株。在一些情况下，宿主细胞来自被工程化为产生目标酶的酵母菌株。在一些情况下，宿主细胞来自被工程化为产生差向异构酶的酵母菌株。差向异构酶可具有氧化酶和还原酶。另外，差向异构酶可以能够将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱。此外，差向异构酶可分成保持氧化酶或还原酶活性的更小的酶，以便用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱。
Smolke等人的US2008/0176754和US2014/0273109中所述的任何宿主细胞可适用于主题细胞和方法。在某些实施方案中，酵母细胞可以是酿酒酵母(S.cerevisiae)物种。在某些实施方案中，酵母细胞可以是粟酒裂殖酵母物种。在某些实施方案中，酵母细胞可以是巴斯德毕赤酵母物种。酵母作为宿主细胞受到关注是因为细胞色素P450蛋白能够正确地折叠到内质网膜中，以使它们的活性得以保持。在实例中，细胞色素P450蛋白参与一些目标生物合成途径。在另外的实例中，细胞色素P450蛋白参与目标BIA的产生。在另外的实例中，细胞色素P450蛋白参与目标酶的产生，所述酶诸如具有氧化酶和还原酶的差向异构酶。
可用于本发明的目标酵母菌株包括但不限于CEN.PK(基因型：MATa/αura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 leu2-3_112/leu2-3_112 his3 Δ1/his3 Δ1MAL2-8C/MAL2-8C SUC2/SUC2)、S288C、W303、D273-10B、X2180、A364A、∑1278B、AB972、SK1和FL100。在某些情况下，酵母菌株是以下中的任一个：S288C(MATα；SUC2mal mel gal2 CUP1 flo1flo8-1 hap1)、BY4741(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)、BY4742(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；lys2Δ0；ura3Δ0)、BY4743(MATa/MATα；his3Δ1/his3Δ1；leu2Δ0/leu2Δ0；met15Δ0/MET15；LYS2/lys2Δ0；ura3Δ0/ura3Δ0)，以及WAT11或W(R)，W303-B菌株的衍生物(MATa；ade2-1；his3-11、-15；leu2-3、-112；ura3-1；canR；cyr+)，其分别表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)NADPH-P450还原酶ATR1和酵母NADPH-P450还原酶CPR1。在另一个实施方案中，酵母细胞是W303α(MATα；his3-11,15trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1)。另外的目标酵母菌株的身份和基因型可见于EUROSCARF(web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html)。
对宿主细胞的基因修饰
宿主细胞可被工程化为包括提供目标BIA的产生的一个或多个修饰(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或甚至更多个修饰)。另外或另选地，宿主细胞可被工程化为包括提供目标酶的产生的一个或多个修饰(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或甚至更多个修饰)。在一些情况下，修饰为基因修饰，诸如基因或其片段的突变、添加或缺失，或基因或其片段的转录调控。如本文所用，术语“突变”是指相对于参考序列或基序，一个或多个氨基酸残基或一个或多个核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变可作为在原始基因座处的天然基因的定向突变并入。在一些情况下，突变可作为在单独基因座处作为遗传整合引入的基因的另外拷贝或作为附加型载体诸如2μ或着丝粒质粒上的另外拷贝并入。在某些情况下，酶的底物抑制的拷贝在天然细胞转录调控下。在一些情况下，通过将酶的底物抑制的拷贝置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控的情况下引入所述拷贝。在一些实例中，一个或多个修饰的对象可以是天然基因。在一些实例中，一个或多个修饰的对象可以是非天然基因。在一些实例中，非天然基因可插入宿主细胞中。在另外的实例中，可在插入宿主细胞中之前通过一个或多个修饰改变非天然基因。
工程化的宿主细胞可过量产生一种或多种目标BIA。所谓的过量产生是指，相对于对照细胞(例如，未修饰细胞)而言，细胞具有改善或增加的目标BIA分子的产生。所谓的改善或增加的产生是指在对照没有目标BIA产生的情况下一定量的目标BIA的产生，以及在其中对照具有一些目标BIA产生的情况下，约10％或更多，诸如约20％或更多，约30％或更多，约40％或更多，约50％或更多，约60％或更多，约80％或更多，约100％或更多，诸如2倍或更多，诸如5倍或更多，包括10倍或更多的增加。
工程化的宿主细胞可过量产生一种或多种(S)-1-苄基异喹啉生物碱。在一些情况下，工程化的宿主细胞可在对照没有(S)-1-苄基异喹啉生物碱产生的情况下产生一定量的目标(S)-1-苄基异喹啉生物碱，并且在其中对照具有一些目标(S)-1-苄基异喹啉生物碱产生的情况下，具有约10％或更多，诸如约20％或更多，约30％或更多，约40％或更多，约50％或更多，约60％或更多，约80％或更多，约100％或更多，诸如2倍或更多，诸如5倍或更多，包括10倍或更多的增加。
工程化的宿主细胞还可过量产生一种或多种(R)-1-苄基异喹啉生物碱。在一些情况下，工程化的宿主细胞可在对照没有(R)-1-苄基异喹啉生物碱产生的情况下产生一定量的目标(R)-1-苄基异喹啉生物碱，并且在其中对照具有一些目标(R)-1-苄基异喹啉生物碱产生的情况下，具有约10％或更多，诸如约20％或更多，约30％或更多，约40％或更多，约50％或更多，约60％或更多，约80％或更多，约100％或更多，诸如2倍或更多，诸如5倍或更多，包括10倍或更多的增加。工程化的宿主细胞还可过量产生吗啡喃、原小檗碱、类诺斯卡品和苯菲啶生物碱中的一种或多种。
在一些情况下，相对于缺乏一个或多个修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞而言，工程化的宿主细胞能够产生增大量的(R)-牛心果碱。在某些情况下，增大量的(R)-牛心果碱为相对于对照宿主细胞约10％或更多，诸如相对于对照宿主细胞约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、约2倍或更多、约5倍或更多、或甚至约10倍或更多。在一些情况下，(R)-牛心果碱为工程化宿主细胞内的差向异构化反应的产物。在这些情况下，(S)-牛心果碱可以是差向异构化反应的底物。
另外，工程化的宿主细胞可过量产生一种或多种目标酶。所谓的过量产生是指，相对于对照细胞(例如，未修饰细胞)而言，细胞具有改善或增加的目标酶的产生。所谓的改善或增加的产生是指在对照没有产生的情况下一定量的目标酶的产生，以及在其中对照具有一些目标酶产生的情况下，约10％或更多，诸如约20％或更多，约30％或更多，约40％或更多，约50％或更多，约60％或更多，约80％或更多，约100％或更多，诸如2倍或更多，诸如5倍或更多，包括10倍或更多的增加。
工程化的宿主细胞可过量产生一种或多种CYP-COR酶。在一些情况下，工程化的宿主细胞可在对照没有CYP-COR酶产生的情况下产生一定量的CYP-COR酶，并且在其中对照具有一些CYP-COR酶产生的情况下，具有约10％或更多，诸如约20％或更多，约30％或更多，约40％或更多，约50％或更多，约60％或更多，约80％或更多，约100％或更多，诸如2倍或更多，诸如5倍或更多，包括10倍或更多的增加。
工程化的宿主细胞还可过量产生衍生自CYP-COR酶的一种或多种酶。在一些情况下，工程化的宿主细胞可在对照没有衍生自CYP-COR酶的酶的产生的情况下产生一定量的衍生自CYP-COR酶的酶，并且在其中对照具有一些衍生自CYP-COR酶的酶产生的情况下，具有约10％或更多，诸如约20％或更多，约30％或更多，约40％或更多，约50％或更多，约60％或更多，约80％或更多，约100％或更多，诸如2倍或更多，诸如5倍或更多，包括10倍或更多的增加。
另外，工程化的宿主细胞可过量产生一种或多种双苄基异喹啉生物碱(bisBIA)。具体地讲，相对于缺乏一个或多个修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞而言，工程化的宿主细胞能够产生增大量的双苄基异喹啉生物碱(bisBIA)。在某些情况下，增大量的bisBIA为相对于对照宿主细胞约10％或更多，诸如相对于对照宿主细胞约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、约2倍或更多、约5倍或更多、或甚至约10倍或更多。在一些情况下，bisBIA由至少一种BIA单体形成，所述BIA单体为工程化宿主细胞内的差向异构化反应的产物或其衍生物。工程化的宿主细胞还可过量产生以下中的一种或多种：千金藤碱、防己诺林碱、莲心碱、甲基莲心碱、筒箭毒碱、蝙蝠葛碱、粉防己碱、箭毒碱、黄芦木碱、guattegaumerine、2’-去甲黄芦木碱和小檗胺。
在一些情况下，一个或多个(诸如两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个)修饰可选自：生物合成酶基因中的底物抑制减轻突变；生物合成酶基因中的产物抑制减轻突变；辅因子回收促进机制；生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；生物合成酶基因中的转录调节修饰；酶基因中的失活突变；差向异构化修饰；bisBIA生成修饰；以及编码酶的异源编码序列。包括一个或多个修饰的细胞可称为工程化细胞。
底物抑制减轻突变
在一些情况下，工程化的宿主细胞为在细胞的一个或多个生物合成酶基因中包括一个或多个底物抑制减轻突变(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或甚至更多个)的细胞。在一些实例中，一个或多个生物合成酶基因对于细胞是天然的(例如，存在于未修饰的细胞中)。在一些实例中，一个或多个生物合成酶基因对于细胞是非天然的。如本文所用，术语“底物抑制减轻突变”是指减轻细胞的底物抑制控制机制的突变。
减轻底物抑制的突变相对于对照细胞减少目标细胞中调控酶的抑制并且提供增加水平的调控化合物或其下游生物合成产物。在一些情况下，所谓的减轻调控酶的抑制是指抑制的IC50增加2倍或更多，诸如增加3倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、30倍或更多、100倍或更多、300倍或更多、1000倍或更多、或甚至更多。所谓的增加的水平是指为对照细胞中的调控化合物或其下游产物的水平的110％或更多的水平，诸如120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多、或200％或更多，诸如至少3倍或更多、至少5倍或更多、至少10倍或更多、或甚至更多的工程化宿主细胞中的调控化合物或其下游产物。
工程化宿主细胞中针对目标BIA或其前体的水平的调控的多种底物抑制控制机制和生物合成酶可被靶向以用于底物抑制减轻。工程化宿主细胞可在一个或多个生物合成酶基因中包括一个或多个底物抑制减轻突变。一个或多个突变可位于其中生物合成酶受到调控控制的任何适宜的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，一个或多个生物合成酶基因编码一种或多种酪氨酸羟化酶。在某些情况下，一个或多个底物抑制减轻突变存在于为TyrH的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，工程化的宿主细胞可在一个或多个生物合成酶基因(诸如表2中所述的那些基因中的一个)中包括一个或多个底物抑制减轻突变。
在某些实施方案中，一个或多个底物抑制减轻突变存在于TyrH基因中。TyrH基因编码酪氨酸羟化酶，其为将酪氨酸转化成L-DOPA的酶。然而，TyrH受其底物酪氨酸的抑制。哺乳动物酪氨酸羟化酶活性，诸如在人或大鼠中所见的，可通过缓解底物抑制的对TyrH基因的突变改善。具体地讲，可通过TyrH基因中的点突变W166Y缓解由酪氨酸造成的底物抑制。TyrH基因中的点突变W166Y也可改善酪氨酸羟化酶的共底物BH4的结合，以催化酪氨酸至L-DOPA的反应。TyrH的突变体当在酵母菌株中表达以由糖产生BIA时(诸如美国临时专利申请序列号61/899,496中所述的那些)可显著改善BIA的产生。
可利用任何适宜数量和类型的突变来减轻底物抑制控制机制。在某些实施方案中，本发明的工程化的宿主细胞可在工程化的宿主细胞内的一个或多个生物合成酶基因中包括1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、或甚至15个或更多个底物抑制减轻突变，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个底物抑制减轻突变。
辅因子回收促进机制
在一些情况下，工程化的宿主细胞为在细胞的一个或多个生物合成酶基因中包括一个或多个辅因子回收促进机制(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或甚至更多个)的细胞。在一些实例中，一个或多个生物合成酶基因对于细胞是天然的(例如，存在于未修饰的细胞中)。在一些实例中，一个或多个生物合成酶基因对于细胞是非天然的。如本文所用，术语“辅因子回收促进机制”是指促进细胞的辅因子回收控制机制的机制。
工程化宿主细胞中针对目标BIA或其前体的水平的调控的多种辅因子回收控制机制和生物合成酶可被靶向以用于辅因子回收促进。工程化宿主细胞可在一个或多个生物合成酶基因中包括一个或多个辅因子回收促进机制。在实例中，工程化的宿主细胞可包括编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的异源编码序列。当DHFR表达时，其可将7,8-二氢生物蝶呤(BH2)转化成四氢生物蝶呤(BH4)，从而回收BH4作为TyrH共底物。在一些实例中，工程化的宿主细胞可在一个或多个生物合成酶基因(诸如表2中所述的那些基因中的一个)中包括一个或多个辅因子回收促进机制。
可利用任何适宜数量和类型的机制来促进辅因子回收控制机制。在某些实施方案中，本发明的工程化的宿主细胞可在工程化宿主细胞内的一个或多个生物合成酶基因中包括1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、或甚至15个或更多个辅因子回收促进机制，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个辅因子回收促进机制。
产物抑制减轻突变
在一些情况下，工程化的宿主细胞为在细胞的一个或多个生物合成酶基因中包括一个或多个产物抑制减轻突变(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或甚至更多个)的细胞。在一些实例中，一个或多个生物合成酶基因对于细胞是天然的(例如，存在于未修饰的细胞中)。在一些实例中，一个或多个生物合成酶基因对于细胞是非天然的。如本文所用，术语“产物抑制减轻突变”是指减轻工程化宿主细胞的短期和/或长期产物抑制控制机制的突变。短期产物抑制是其中在共底物结合位点处存在竞争性结合的细胞的控制机制。长期产物抑制是其中存在远离期望途径的化合物的不可逆结合的细胞的控制机制。
减轻产物抑制的突变相对于对照细胞减少目标细胞中调控酶的抑制并且提供增加水平的调控化合物或其下游生物合成产物。在一些情况下，所谓的减轻调控酶的抑制是指抑制的IC50增加2倍或更多，诸如增加3倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、30倍或更多、100倍或更多、300倍或更多、1000倍或更多、或甚至更多。所谓的增加的水平是指为对照细胞中的调控化合物或其下游产物的水平的110％或更多的水平，诸如120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多、或200％或更多，诸如至少3倍或更多、至少5倍或更多、至少10倍或更多、或甚至更多的工程化宿主细胞中的调控化合物或其下游产物。
工程化宿主细胞中针对目标BIA的水平的调控的多种产物抑制控制机制和生物合成酶可被靶向以用于产物抑制减轻。工程化宿主细胞可在一个或多个生物合成酶基因中包括一个或多个产物抑制减轻突变。突变可位于其中生物合成酶受到调控控制的任何适宜的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，一个或多个生物合成酶基因编码一种或多种酪氨酸羟化酶。在某些情况下，一个或多个产物抑制减轻突变存在于为TyrH的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，工程化的宿主细胞在一个或多个生物合成酶基因(诸如表2中所述的那些基因中的一个)中包括一个或多个产物抑制减轻突变。
在某些实施方案中，一个或多个产物抑制减轻突变存在于TyrH基因中。TyrH基因编码酪氨酸羟化酶，其为将酪氨酸转化成L-DOPA的酶。TyrH需要四氢生物蝶呤(BH4)作为共底物来催化羟化反应。一些微生物菌株，诸如酿酒酵母，不天然地产生BH4，但是可被工程化为通过四酶合成和再循环途径产生此底物，如图1中所示。图1示出根据本发明的实施方案，四氢生物蝶呤的合成、再循环和补救途径的实例。图1提供了酶PTPS(丙酮酰四氢蝶呤合酶)、SepR(墨蝶呤还原酶)、PCD(蝶呤4a-甲醇胺脱水酶)、QDHPR(二氢蝶啶还原酶)和DHFR(二氢叶酸还原酶)的使用。在图1所示的酶中，酵母合成内源性的GTP环化水解酶I。GTP和二氢新蝶呤三磷酸在酵母中天然合成。另外，图1中的其他代谢物不在酵母中天然产生。
TyrH受到其产物L-DOPA，以及其他儿茶酚胺(尤其是多巴胺)的抑制。哺乳动物酪氨酸羟化酶活性，诸如来自人或大鼠的酪氨酸羟化酶，可通过缓解产物抑制的突变改善。例如，短期产物抑制，诸如在共底物结合位点处的竞争性结合，可通过TyrH基因上的点突变W166Y缓解。具体地讲，TyrH基因上的点突变W166Y可改善共底物的结合。另外，用以缓解共底物结合位点处的竞争性结合的短期产物抑制可通过TyrH基因上的点突变S40D改善。短期产物抑制也可通过TyrH基因上的R37E、R38E的联合突变改善。具体地讲，R37E、R38E突变可在多巴胺的存在下一起特定改善酪氨酸羟化酶活性。
另外，长期产物抑制可通过TyrH基因上的点突变缓解。长期产物抑制缓解可包括儿茶酚胺与铁在活性位点中的不可逆结合，由此使得存在较少的儿茶酚胺充当酪氨酸羟化酶活性的产物抑制剂。长期产物抑制可相应地通过TyrH基因中的突变E332D和Y371F缓解。
可制备突变的组合(诸如同时两个或三个或更多个突变)来缓解多种类型的底物和产物抑制以进一步改善TyrH的活性。TyrH的突变体当在酵母菌株中表达以由糖产生BIA时(诸如美国临时专利申请序列号61/899,496中所述的那些)可显著改善BIA的产生。
可利用任何适宜数量和类型的突变来减轻产物抑制控制机制。在某些实施方案中，本发明的工程化的宿主细胞可在工程化的宿主细胞内的一个或多个生物合成酶基因中包括1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、或甚至15个或更多个产物抑制减轻突变，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个产物抑制减轻突变。
反馈抑制减轻突变
在一些情况下，工程化的宿主细胞为在细胞的一个或多个生物合成酶基因中包括一个或多个反馈抑制减轻突变(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或甚至更多个)的细胞。在一些情况下，一个或多个生物合成酶基因对于细胞是天然的(例如，存在于未修饰的细胞中)。另外或另选地，在一些实例中，一个或多个生物合成酶基因对于细胞是非天然的。如本文所用，术语“反馈抑制减轻突变”是指减轻工程化宿主细胞的反馈抑制控制机制的突变。反馈抑制是其中调控化合物的合成途径中的酶在所述化合物积聚到某一水平时受到抑制，从而平衡细胞中化合物的量的细胞控制机制。减轻反馈抑制的突变相对于对照细胞减少工程化宿主细胞中调控酶的抑制。以此方式，工程化宿主细胞提供增大水平的调控化合物或其下游生物合成产物。在一些情况下，所谓的减轻调控酶的抑制是指抑制的IC50增加2倍或更多，诸如增加3倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、30倍或更多、100倍或更多、300倍或更多、1000倍或更多、或甚至更多。所谓的增加的水平是指为对照细胞中的调控化合物或其下游产物的水平的110％或更多的水平，诸如120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多、或200％或更多，诸如至少3倍或更多、至少5倍或更多、至少10倍或更多、或甚至更多的宿主细胞中的调控化合物或其下游产物。
针对目标BIA的水平的调控的多种反馈抑制控制机制和生物合成酶可被靶向以用于宿主细胞中的减轻。宿主细胞可在对于细胞是天然的一个或多个生物合成酶基因中包括一个或多个反馈抑制减轻突变。一个或多个突变可位于其中生物合成酶受到调控控制的任何适宜的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，一个或多个生物合成酶基因可编码选自3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶和分支酸变位酶的一种或多种酶。在一些实施方案中，一个或多个生物合成酶基因编码3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶。在一些情况下，一个或多个生物合成酶基因可编码分支酸变位酶。在某些情况下，一个或多个反馈抑制减轻突变可存在于选自ARO4和ARO7的生物合成酶基因中。在某些情况下，一个或多个反馈抑制减轻突变可存在于为ARO4的生物合成酶基因中。在某些情况下，一个或多个反馈抑制减轻突变存在于为ARO7的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，工程化的宿主细胞可在一个或多个生物合成酶基因(诸如表2中所述的那些基因中的一个)中包括一个或多个反馈抑制减轻突变。
可利用任何适宜数量和类型的突变来减轻反馈抑制控制机制。如本文所用，术语“突变”是指相对于参考序列或基序，一个或多个氨基酸残基或一个或多个核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变可作为在原始基因座处的天然基因的定向突变并入。在一些情况下，突变可作为在单独基因座处作为遗传整合引入的基因的另外拷贝或作为附加型载体诸如2μ或着丝粒质粒上的另外拷贝并入。在某些情况下，酶的反馈抑制的拷贝在天然细胞转录调控下。在一些情况下，通过将酶的反馈抑制的拷贝置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控的情况下引入所述拷贝。
在某些实施方案中，一个或多个反馈抑制减轻突变可存在于ARO4基因中。目标ARO4突变可包括但不限于在229位上用亮氨酸取代赖氨酸残基、在166位上用赖氨酸残基取代谷氨酰胺残基，或如Hartmann M等人((2003)Proc Natl Acad Sci U S A 100(3):862-867)或Fukuda等人((1992)J Ferment Bioeng 74(2):117-119)所述的突变。在一些情况下，赋予反馈抑制的突变可选自酶突变体的诱变文库。此类选择的实例可包括用过量的酪氨酸拯救培养基中的o-氟-D,L-苯丙氨酸的生长或aro3突变酵母菌株的生长，如Fukuda等人((1990)Breeding of Brewing Yeast Producing a Large Amount of Beta-Phenylethyl Alcohol and Beta-Phenylethyl Acetate.Agr Biol Chem Tokyo 54(1):269-271)所述。
在某些实施方案中，本发明的工程化的宿主细胞可在工程化的宿主细胞内的一个或多个生物合成酶基因中包括1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、或甚至15个或更多个反馈抑制减轻突变，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个反馈抑制减轻突变。
转录调节修饰
宿主细胞可包括所述细胞的一个或多个生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多个修饰)。在一些实例中，一个或多个生物合成酶基因对于细胞是天然的。在一些实例中，一个或多个生物合成酶基因对于细胞是非天然的。所述细胞的任何适宜的生物合成酶基因可被靶向以用于转录调节。所谓的转录调节意指相对于对照细胞(例如，未修饰的细胞)调节修饰的细胞中的目标基因的表达，例如，增加或减少、增强或阻抑。在一些情况下，目标基因的转录调节包括增加或增强表达。所谓的增加或增强表达意指相较于对照，即未修饰的相同细胞中的表达(例如，通过使用任何适宜的基因表达测定)，目标基因的表达水平增加2倍或更多，诸如5倍或更多且有时25、50或100倍或更多，并且在某些实施方案中300倍或更多或更高。另选地，在细胞中的目标基因的表达如此低以至于其不可检测的情况下，如果表达被增加至可容易检测的水平，则目标基因的表达水平被认为增加。在某些情况下，目标基因的转录调节包括减少或阻抑表达。所谓的减少或阻抑表达意指相较于对照，目标基因的表达水平减少2倍或更多，诸如5倍或更多且有时25、50或100倍或更多，并且在某些实施方案中300倍或更多或更高。在一些情况下，表达被减少至不可检测的水平。可适于在主题宿主细胞中使用的目标宿主细胞过程的修改描述于Smolke等人的美国公布20140273109(14/211,611)中，所述公布的公开内容以引用方式全文并入本文。
任何适宜的生物合成酶基因可进行转录调节，并且包括但不限于，图2中所述的那些生物合成酶。具体地讲，图2示出根据本发明的实施方案，用于将葡萄糖转化成4-HPA、多巴胺和3,4-DHPA的生物合成方案。图2中所述的酶的实例包括ARO3、ARO4、ARO1、ARO7、TYR1、TYR、TyrH、DODC、MAO、ARO10、ARO9和TKL。在一些情况下，一个或多个生物合成酶基因可选自ARO10、ARO9和TKL。在一些情况下，一个或多个生物合成酶基因可以是ARO10。在某些情况下，一个或多个生物合成酶基因可以是ARO9。在一些实施方案中，一个或多个生物合成酶基因可以是TKL。在一些实施方案中，宿主细胞包括一个或多个基因(诸如表2中描述的那些基因中的一个)的一个或多个转录调节修饰。
在一些实施方案中，转录调节修饰可包括用强启动子取代一个或多个生物合成酶基因的天然启动子或在强启动子的控制下表达一个或多个基因的一个或多个另外的拷贝。驱动目标基因的表达的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，条件是所述启动子在宿主细胞中可以是活性的。目标基因可由其天然启动子表达。另外或另选地，目标基因可由非天然启动子表达。虽然不是要求，但这类启动子在使用它们的宿主中可为中等至高强度的。启动子可以是调控的或组成型的。在一些实施方案中，可使用不受葡萄糖阻抑的、或者在培养基中存在葡萄糖时仅受轻微阻抑的启动子。存在众多合适的启动子，所述启动子的实例包括糖酵解基因的启动子，诸如枯草芽孢杆菌tsr基因的启动子(编码果糖二磷酸醛缩酶)或来自酵母酿酒酵母的GAPDH启动子(编码甘油醛-磷酸脱氢酶)(Bitter G.A.,Meth.Enzymol.152:673 684(1987))。其他目标强启动子包括但不限于面包酵母的ADHI启动子(Ruohonen L.等人，J.Biotechnol.39:193 203(1995))；磷酸饥饿诱导的启动子，诸如酵母的PHO5启动子(Hinnen,A.等人，Yeast Genetic Engineering，Barr,P.J.等人编辑，Butterworths(1989)；来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的碱性磷酸酶启动子(Lee.J.W.K.等人,J.Gen.Microbiol.137:1127 1133(1991))；GPD1和TEF1。目标酵母启动子包括但不限于，诱导型启动子，诸如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS；可阻抑启动子Met25、tetO；以及组成型启动子，诸如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译延长因子-1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子等。在一些情况下，强启动子为GPD1。在某些情况下，强启动子是TEF1。含有可受激素(诸如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素)诱导的启动子的自主复制酵母表达载体也是已知的并且包括但不限于，糖皮质激素反应性元件(GRE)和甲状腺激素反应性元件(TRE)，参见例如在美国专利7,045,290中描述的那些启动子。可使用含有组成型或诱导型启动子诸如α因子、醇氧化酶和PGH的载体。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动目标基因的表达。应理解，可选择对宿主细胞具有特异性的任何适宜的启动子，例如大肠杆菌。在一些情况下，启动子选择可用于优化转录，并且因此，优化酶水平以使产生最大化，同时使能源最小化。
失活突变
工程化的宿主细胞可包括所述细胞的酶的一个或多个失活突变(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多个)。包括一个或多个失活突变可修饰工程化宿主细胞的合成途径的通量以增加目标BIA或产生所述BIA的期望的酶或前体的水平。在一些实例中，一个或多个失活突变是针对对细胞天然的酶。另外或另选地，一个或多个失活突变是针对对细胞非天然的酶。如本文所用，“失活突变”意指细胞的基因或调控DNA序列的一个或多个突变，其中所述突变使由所述目标基因表达的蛋白质的生物活性失活。在一些情况下，基因对于细胞是天然的。在一些情况下，所述基因编码失活的酶，并且是由宿主细胞产生的目标BIA的合成途径的一部分或连接至所述合成途径。在一些情况下，失活突变位于控制目标基因的调控DNA序列中。在某些情况下，失活突变针对基因的启动子。任何适宜的突变(例如，如本文所述)可用于使目标基因或调控DNA序列失活。“失活的”或“失活”意指相对于由未突变对照基因表达的对照蛋白质，由突变基因表达的蛋白质的生物活性被降低10％或更多，诸如20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、或99％或更多。在一些情况下，蛋白质是酶并且失活突变降低酶的活性。
在一些实例中，工程化的宿主细胞在对于细胞天然的酶中包括失活突变。任何适宜的酶可被靶向以失活。目标酶可包括但不限于在表2中描述的那些酶，所述酶在工程化的宿主细胞的合成途径中的作用倾向于降低目标BIA的水平。在一些情况下，所述酶具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。在某些实施方案中，包括失活突变的酶是ZWF1。在一些情况下，所述酶具有醇脱氢酶活性。在一些实施方案中，包括失活突变的酶选自ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7以及SFA1。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH2。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH3。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH4。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH5。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH6。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH7。在一些情况下，所述酶具有醛氧化还原酶活性。在某些实施方案中，包括失活突变的酶选自ALD2、ALD3、ALD4、ALD5以及ALD6。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ALD2。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ALD3。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ALD4。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ALD5。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ALD6。在一些实施方案中，宿主细胞包括表2中描述的一个或多个基因的一个或多个失活突变。
差向异构化修饰
本文提供的一些方法、工艺和系统描述了(S)-1-苄基异喹啉生物碱到(R)-1-苄基异喹啉生物碱的转化。这些方法、工艺和系统中的一些可包括工程化的宿主细胞。在一些实例中，(S)-1-苄基异喹啉生物碱到(R)-1-苄基异喹啉生物碱的转化是底物到各种不同范围的生物碱的转化的关键步骤。在一些实例中，(S)-1-苄基异喹啉生物碱到(R)-1-苄基异喹啉生物碱的转化包括差向异构化反应。在一些情况下，底物生物碱的差向异构化可通过以下方式进行：将(S)-底物氧化成对应的希夫碱或亚胺中间体，接着将此中间体立体定向地还原为(R)-产物(如图3中所提供和方案1中大致表示的)。如方案1中所提供的，R1、R2、R3和R4可为H或CH3。R5可为H、OH或OCH3。
方案1
在一些实例中，(S)-底物到(R)-产物的转化可涉及至少一个氧化反应和至少一个还原反应。在一些情况下，任选地在氧化反应之后进行还原反应。在一些情况下，氧化反应和还原反应中的至少一个在酶的存在下进行。在一些情况下，氧化反应和还原反应中的至少一个通过酶催化。在一些情况下，氧化反应和还原反应两者均在至少一种酶的存在下进行。在一些情况下，至少一种酶可用于催化氧化和还原反应。氧化和还原反应可由相同的酶催化。
在本文所述的一些方法、工艺和系统中，氧化反应可在酶的存在下进行。在一些实例中，酶可以是氧化酶。氧化酶可使用(S)-1-苄基异喹啉作为底物。氧化酶可将(S)-底物转化成对应的亚胺或希夫碱衍生物。氧化酶可被称为1,2-去氢牛心果碱合酶(DRS)。在本公开中适用于(S)-1-苄基异喹啉生物碱的氧化的酶的非限制性实例包括细胞色素P450氧化酶、2-酮戊二酸依赖性氧化酶，以及黄素蛋白氧化酶。例如，(S)-四氢原小檗碱氧化酶(STOX，E.C 1.3.3.8)可将(S)-去甲牛心果碱和其他(S)-1-苄基异喹啉生物碱氧化成1,2-脱氢去甲牛心果碱和其他对应的1,2-脱氢产物。在一些实例中，包括前述实例中的任一个的氧化酶结构域的蛋白质可进行氧化。在一些实例中，氧化酶可催化宿主细胞(诸如如本文所述的工程化的宿主细胞)内的氧化反应。
在一些实例中，还原反应可在氧化反应之后进行。还原反应可通过酶进行。在一些实例中，还原酶可使用衍生自1-苄基异喹啉的亚胺或希夫碱作为底物。还原酶可将亚胺或希夫碱衍生物转化成(R)-1-苄基异喹啉。还原酶可被称为1,2-去氢牛心果碱还原酶(DRR)。适用于衍生自(S)-1-苄基异喹啉生物碱的亚胺或希夫碱的还原的酶的非限制性实例包括醛酮还原酶(例如，可待因酮还原酶样的酶(EC 1.1.1.247))和短链脱氢酶(例如，沙罗泰里啶还原酶样的酶(EC 1.1.1.248))。在一些实例中，包括前述实例中的任一个的还原酶结构域的蛋白质可进行还原。在另一个实施方案中，还原是立体定向的。在一些实例中，还原酶可催化宿主细胞(诸如如本文所述的工程化的宿主细胞)内的还原反应。
可进行将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的差向异构化反应的酶的实例包括具有氧化酶结构域和还原酶结构域的差向异构酶。具体地讲，差向异构酶可具有细胞色素P450氧化酶82Y2样结构域。另外，差向异构酶可具有可待因酮还原酶样结构域。此外，具有细胞色素P450氧化酶82Y2样结构域且具有可待因酮还原酶样结构域的差向异构酶可被称为CYP-COR酶。具体地讲，CYP-COR酶可以是融合酶。
可用于进行(S)-1-苄基异喹啉生物碱到(R)-1-苄基异喹啉生物碱的转化的CYP-COR酶的氨基酸序列的实例提供于图4中。具体地讲，图4示出根据本发明的实施方案的CYP-COR酶的氨基酸序列。如图4中看出，加下划线的文本表示细胞色素P450CYP82Y2样结构域(与AFB74617.1具有59％同一性)。加点划线的文本表示醛酮还原酶NADPH依赖性可待因酮还原酶样结构域(与ACM44066.1具有75％同一性)。CYP-COR酶的另外的氨基酸序列在表1中示出。用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的差向异构酶的氨基酸序列可与如表1中列出的给定氨基酸序列具有75％或更多的同一性。例如，这一差向异构酶的氨基酸序列可包括与如本文提供的氨基酸序列具有至少75％或更多、80％或更多、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、86％或更多、87％或更多、88％或更多、89％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多同一性的氨基酸序列。另外，在某些实施方案中，“相同的”氨基酸序列在氨基酸水平上与特定的氨基酸序列包含至少80％-99％的同一性。在一些情况下，“相同的”氨基酸序列在氨基酸水平上包含至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更多，在某些情况下，至少95％、96％、97％、98％和99％的同一性。在一些情况下，氨基酸序列可以是相同的，但是DNA序列有所改变，诸如例如以优化宿主生物体的密码子使用。
可提供工程化的宿主细胞，其产生将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的差向异构酶，其中差向异构酶包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。在工程化的宿主细胞内产生的差向异构酶可回收和纯化，以便形成生物催化剂。在一些情况下，差向异构酶可拆分成一个或多个酶。另外，可从工程化的宿主细胞中回收通过拆分差向异构酶产生的一个或多个酶。由拆分差向异构酶产生的这一个或多个酶也可用于催化(S)-1-苄基异喹啉生物碱到(R)-1-苄基异喹啉生物碱的转化。具体地讲，从产生差向异构酶的工程化宿主细胞中回收的一种或多种酶可用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的工艺中。所述工艺可包括使(S)-1-苄基异喹啉生物碱与足以将所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的量的差向异构酶接触。在实例中，(S)-1-苄基异喹啉生物碱可与足量的一种或多种酶接触，由此使得至少5％的所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱被转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱。在另外的实例中，(S)-1-苄基异喹啉生物碱可与足量的一种或多种酶接触，由此使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％的所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱被转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱。
可用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的一种或多种酶可在体外接触(S)-1-苄基异喹啉生物碱。另外或另选地，可用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的一种或多种酶可在体内接触(S)-1-苄基异喹啉生物碱。另外，可用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的一种或多种酶可提供至具有(S)-1-苄基异喹啉生物碱的细胞内，或可在工程化的宿主细胞内产生。
在一些实例中，所述方法提供产生生物碱产物的工程化的宿主细胞，其中(S)-底物到(R)-产物的差向异构化可包括生物碱产物的产生中的关键步骤。在一些实例中，所产生的生物碱为(R)-1-苄基异喹啉生物碱。在其他实施方案中，所产生的生物碱衍生自(R)-1-苄基异喹啉生物碱，包括例如，4环原吗啡喃和5环吗啡喃生物碱。在另一个实施方案中，(S)-1-苄基异喹啉生物碱为朝向工程化宿主细胞的产物的中间体。在其他实施方案中，生物碱产物选自由吗啡喃、原小檗碱、类诺斯卡品和苯菲啶生物碱组成的组。
在一些实例中，(S)-底物为(S)-1-苄基异喹啉生物碱，其选自由以下各项组成的组：(S)-去甲牛心果碱、(S)-牛心果碱、(S)-四氢罂粟碱、(S)-去甲乌药碱、(S)-乌药碱、(S)-N-甲基乌药碱、(S)-3’-羟基-N-甲基乌药碱、(S)-去甲异东罂粟灵、(S)-东罂粟灵、(S)-异东罂粟灵、(S)-去甲原青藤碱、(S)-原青藤碱、(S)-全去甲劳丹碱、(S)-劳丹碱、(S)-4’-O-甲基劳丹碱、(S)-6-O-甲基全去甲劳丹碱、(S)-4’-O-甲基全去甲劳丹碱。
在一些实例中，(S)-底物为式I的化合物：
或其盐，其中：
R1、R2、R3和R4独立地选自氢和甲基；并且
R5选自氢、羟基和甲氧基。
在一些其他实例中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个为氢。
在其他实例中，(S)-底物为式II的化合物：
或其盐，其中：
R3选自氢和C1-C4烷基；
R6和R7在每次出现时独立地选自羟基、氟代、氯代、溴代、甲醛、C1-C4酰基、C1-C4
烷基和C1-C4烷氧基；
n为0、1、2、3或4；并且
n’为0、1、2、3、4或5。
当键画在整个环上时，意指取代可发生在非特异性环原子或位置处。例如，在以上所示的式II中，6元环中的任何-CH-的氢可用R7代替，形成-CR7-。
在一些实例中，R6和R7独立地为甲基或甲氧基。在一些其他实例中，n和n’独立地为1或2。在其他实施方案中，R3为氢或甲基。
在一些其他实例中，(S)-底物为式III的化合物：
或其盐，其中：
R6和R7在每次出现时独立地选自羟基、氟代、氯代、溴代、甲醛、C1-C4酰基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基；并且
n和n’独立地为0、1、2、3或4。
在一些实例中，R6和R7独立地为羟基、甲基或甲氧基。在一些其他实例中，n和n’独立地为1或2。在另外的实施方案中，R6和R7独立地为氟代、羟基、甲基或甲氧基。
在一些实例中，所述方法提供由(S)-牛心果碱产生生物碱产物的工程化宿主细胞。(S)-牛心果碱到(R)-牛心果碱的差向异构化可包括由前体产生各种不同的生物碱产物的关键步骤。在一些实例中，前体为L-酪氨酸或糖(例如，葡萄糖)。各种不同的生物碱产物可包括但不限于吗啡喃、原小檗碱、类诺斯卡品和苯菲啶生物碱。
可使用任何合适的碳源作为朝向差向异构化的1-苄基异喹啉生物碱的前体。合适的前体可包括但不限于单糖(例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、低聚糖(例如，乳糖、蔗糖、棉子糖)、多糖(例如，淀粉、纤维素)，或其组合。在一些实例中，可使用来自可再生原料的未纯化混合物(例如，玉米浆液、糖用甜菜糖蜜、大麦麦芽、生物质水解产物)。在其他实施方案中，碳前体可以是一碳化合物(例如，甲醇、二氧化碳)或二碳化合物(例如，乙醇)。在其他实施方案中，可利用其他含碳化合物，例如，甲胺、葡糖胺和氨基酸(例如，L-酪氨酸)。在一些实例中，可将1-苄基异喹啉生物碱直接添加到本发明的工程化宿主细胞中，包括例如，全去甲劳丹碱、劳丹碱、去甲牛心果碱和牛心果碱。在另外的实施方案中，1-苄基异喹啉生物碱可作为单一对映体(例如，(S)-1-苄基异喹啉生物碱)或对映体的混合物(包括例如外消旋混合物)添加到工程化的宿主细胞中。
在一些实例中，所述方法提供1-苄基异喹啉生物碱或其衍生物的立构中心的差向异构化。在另一个实施方案中，该方法包括使1-苄基异喹啉生物碱与至少一种酶接触。至少一种酶可将1-苄基异喹啉生物碱或其衍生物的立构中心的立体化学翻转成相反的立体化学。在一些实例中，至少一种酶将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱。在利用至少一种酶的(S)-1-苄基异喹啉生物碱到(R)-1-苄基异喹啉生物碱的这种转化的一些实例中，(S)-1-苄基异喹啉生物碱选自由以下各项组成的组：(S)-去甲牛心果碱、(S)-牛心果碱、(S)-四氢罂粟碱、(S)-去甲乌药碱、(S)-乌药碱、(S)-N-甲基乌药碱、(S)-3’-羟基-N-甲基乌药碱、(S)-去甲异东罂粟灵、(S)-东罂粟灵、(S)-异东罂粟灵、(S)-去甲原青藤碱、(S)-原青藤碱、(S)-全去甲劳丹碱、(S)-劳丹碱、(S)-4’-O-甲基劳丹碱、(S)-6-O-甲基全去甲劳丹碱，以及(S)-4’-O-甲基全去甲劳丹碱。
在一些其他实例中，至少一种酶将5’R-苯酞异喹啉生物碱转化成5’S-苯酞异喹啉生物碱。在利用至少一种酶的5’R-苯酞异喹啉生物碱到5’S-苯酞异喹啉生物碱的这种转化的一些实例中，5’R-苯酞异喹啉生物碱选自由5’R-那可托灵半缩醛、5’R-那可托灵、5’R-那可汀半缩醛、以及5’R-诺斯卡品组成的组。
在一些实例中，3S,5’R-苯酞异喹啉生物碱为式IV的化合物：
或其盐，其中：
R3选自氢和C1-C4烷基；
R8和R9在每次出现时独立地选自羟基、氟代、氯代、溴代、甲醛、C1-C4酰基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基；
R10不存在、为氢或C1-C4烷基；
两个R8及其所附接的碳原子任选形成5至8元环烷基或杂环烷基部分；
两个R9及其所附接的碳原子任选形成5至8元环烷基或杂环烷基部分；并且
n和n’独立地为0、1、2、3或4。
在一些其他实例中，至少一种酶将5’R-断裂小檗碱生物碱转化成5’S-断裂小檗碱生物碱。在利用至少一种酶的5’R-断裂小檗碱生物碱到5’S-断裂小檗碱生物碱的这种转化的一些实例中，5’R-断裂小檗碱生物碱选自由5’R-4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛、5’R-3-O-乙酰基罂粟奥辛和5’R-罂粟奥辛组成的组。
在一些实例中，5’R-断裂小檗碱生物碱为式V的化合物：
或其盐，其中：
R3选自氢和C1-C4烷基；
R8和R9在每次出现时独立地选自羟基、氟代、氯代、溴代、甲醛、C1-C4酰基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基；
R11选自氢和醛；
R12选自氢、羟基和O-甲基；
R13选自羟基和O-甲基；
两个R8及其所附接的碳原子任选形成5至8元环烷基或杂环烷基部分；
两个R9及其所附接的碳原子任选形成5至8元环烷基或杂环烷基部分；并且
n和n’独立地为0、1、2、3或4。
在其他实施方案中，差向异构化的1-苄基异喹啉生物碱可包括两个或更多个立构中心，其中两个或更多个立构中心中的仅一个被翻转以产生底物的非对映体(例如，(S,R)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R,R)-1-苄基异喹啉生物碱)。在其中当与至少一种酶接触时1-苄基异喹啉生物碱的仅一个立构中心翻转的实例中，产物被称为1-苄基异喹啉生物碱的差向异构体。
在一些实例中，1-苄基异喹啉生物碱作为单一立体异构体呈现给酶。在一些其他实例中，1-苄基异喹啉生物碱作为立体异构体的混合物呈现给酶。在另外的实施方案中，立体异构体的混合物可以是外消旋混合物。在一些其他实例中，立体异构体的混合物可相较于另一种立体异构体富含一种立体异构体。
在一些实例中，回收1-苄基异喹啉生物碱或其衍生物。在一些实例中，从细胞培养物中回收1-苄基异喹啉生物碱。在另外的实施方案中，相较于呈现给酶的1-苄基异喹啉生物碱的原始混合物，回收的1-苄基异喹啉生物碱对映体地富含一种立体异构体。在另外的实施方案中，回收的1-苄基异喹啉生物碱具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％的对映体过量。
“异构体”是具有相同分子式的不同化合物。“立体异构体”是仅在原子的空间布置上不同的异构体。“对映体”是一对不可重叠互为镜像的立体异构体。一对对映体的1:1混合物为“外消旋”混合物。“非对映异构体”或“非对映体”是具有至少两个非对称原子但是彼此不互为镜像的立体异构体。如本文所用的术语“差向异构体”是指具有相同的化学式，但是在特定位置上具有不同的光学构型的化合物。例如，化合物的(R,S)和(S,S)立体异构体为彼此的差向异构体。在一些实例中，1-苄基异喹啉生物碱转化成其差向异构体(例如，差向异构-1-苄基异喹啉生物碱)。绝对立体化学根据Cahn-Ingold-Prelog R-S系统指定。当化合物为纯对映体时，每个手性碳处的立体化学可通过R或S指定。其绝对构型未知的拆分化合物可根据它们在钠D线波长处旋转平面偏振光的方向(右旋或左旋)而被命名为(+)或(-)。本文所述的某些化合物包含一个或多个非对称中心并且因此可产生对映体、非对映体，以及可以绝对立体化学定义为(R)-或(S)-的其他立体异构形式。
表1.CYP-COR融合酶的示例性部分和全长氨基酸序列。
BisBIA生成修饰
本文提供的一些方法、工艺和系统描述了双苄基异喹啉生物碱(bisBIA)的产生。BisBIA是可通过两个BIA单体之间的偶合反应形成的二聚分子。在实例中，bisBIA可通过碳-氧偶合反应形成。在其他实例中，bisBIA可通过碳-碳偶合反应形成。在一些实例中，bisBIA二聚分子为同二聚体，包括两个相同的BIA单体。在实例中，工程化的宿主细胞可产生一个BIA单体。在这些实例中，当与一种或多种偶合酶接触时，BIA单体可形成同二聚体。在其他实例中，bisBIA二聚分子为异二聚体，包括两个不同的BIA单体。例如，bisBIA可以是包括为彼此的对映体的BIA单体的异二聚体。在一些实例中，工程化的宿主细胞可产生两个或更多个BIA单体。在这些实例中，当与一种或多种偶合酶接触时，BIA单体可形成同二聚体和异二聚体。
描述bisBIA的产生的这些方法、工艺和系统中的一些可包括工程化的宿主细胞。在一些实例中，工程化的宿主细胞可被工程化以产生BIA单体，所述BIA单体继而可用作用于形成的bisBIA的构件分子。可用于形成bisBIA的BIA单体的实例包括乌药碱、N-甲基乌药碱、劳丹宁、去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、6-O-甲基-全去甲劳丹碱、3’-羟基-N-甲基乌药碱、3’-羟基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、去甲劳丹宁、劳丹素和罂粟碱。具体地讲，工程化的宿主细胞可通过包括O-甲基转移酶、N-甲基转移酶和3'-羟化酶的异源酶的表达，由去甲乌药碱或全去甲劳丹碱合成BIA单体。O-甲基转移酶的实例可包括来自黄唐松草、莲藕(Nelumbo nucifera)、胡杨(Populus euphratica)或另外的物种的去甲乌药碱6-O-甲基转移酶(6OMT)。O-甲基转移酶的另外的实例可包括来自智人(Homo sapiens)、小家鼠(Musmusculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、大猩猩(Gorilla gorilla)或另外的物种的儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)。N-甲基转移酶的另外的实例可包括来自黄唐松草、莲藕、弱茎马兜铃(Aristolochia fimbriata)或另外的物种的乌药碱N-甲基转移酶(CNMT)。3’羟化酶的实例可包括来自花菱草(Eschscholzia californica)、黄唐松草、莲藕或另外物种的N-甲基乌药碱3'-羟化酶(CYP80B1)。
工程化的宿主细胞可产生任何给定BIA单体的(S)或(R)对映体。另外或另选地，工程化的宿主细胞可产生两种对映体的混合物。(S)和(R)对映体的比率可由合成BIA单体的一种或多种酶的底物和产物特异性确定。另选地，存在的每种对映体的量可通过进行一种立体异构体到另一种立体异构体的差向异构化的一种或多种另外的酶的表达而改变，如上文所论述。
这些BIA单体可融合到二聚bisBIA支架中。具体地讲，BIA单体可利用工程化宿主细胞产生的一种或多种酶融合到二聚bisBIA支架中。另外或另选地，BIA单体可利用从工程化宿主细胞外部的来源提供给BIA单体的一种或多种酶融合到二聚bisBIA支架中。一种或多种酶可用于形成碳-氧和/或碳-碳偶合反应，以在一个、两个或三个位置处融合两个BIA单体。在一些实例中，两个BIA单体可通过醚桥连接。在一些实例中，可使用直接的碳-碳键连接两个BIA单体。在一些实例中，通过融合两个BIA单体形成的bisBIA可包括一个二苯基醚键。在一些实例中，两个BIA单体可融合形成包括两个二苯基醚键的bisBIA。在一些实例中，由两个BIA单体形成的bisBIA可包括三个二苯基醚键。在一些实例中，bisBIA可包括一个二苯基醚键和一个苄基苯基醚键。在一些情况下，bisBIA可包括一个苄基苯基醚键和两个二苯基醚键。
在实例中，BIA单体可与足量的一种或多种酶接触，所述酶可用于形成偶合反应，以融合两个BIA单体，由此使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％的所述BIA单体被转化成bisBIA。可用于将BIA单体二聚化成bisBIA的一种或多种酶可在体外接触BIA单体。另外或另选地，可用于将BIA单体二聚化成bisBIA的一种或多种酶可在体内接触BIA单体。另外，一种或多种bisBIA二聚化酶可在产生BIA单体的宿主细胞中表达。另选地，可向表达bisBIA二聚化酶的工程化宿主细胞中提供BIA单体。另选地，可向其内具有BIA单体的细胞中提供一种或多种bisBIA二聚化酶。
在一些实例中，双苄基异喹啉生物碱是式Va-Vu中的任一个的化合物：
或其盐，其中：
R1a、R1b、R2a和R2b独立地选自氢和C1-C4烷基；
R3a、R3b、R6a、R6b、R8a和R8b独立地选自氢、羟基、氟代、氯代、溴代、甲醛、C1-C4酰基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基；
R4a和R5a独立地选自氢和C1-C4烷基，或R4a和R5a一起形成亚甲基桥；
R4b和R5b独立地选自氢和C1-C4烷基，或R4b和R5b一起形成亚甲基桥；并且
R7a、R7b和R9a独立地选自氢和C1-C4烷基。
在一些实例中，R1a和R1b各自为氢；R2a和R2b各自为甲基；R3a和R3b各自为氢；R4a和R5a独立地为氢或甲基；R4b和R5b独立地为氢或甲基，或R4b和R5b一起形成亚甲基桥；R6a、R6b、R8a和R8b各自为氢；并且R7a、R7b和R9a独立地为氢或甲基。
如上文所示，式Va、Vb和Vd的bisBIA化合物通过使用碳-氧偶合反应融合两个BIA单体形成。另外，式Vc、Vf和Vh的bisBIA化合物通过使用碳-氧偶合反应和碳-碳偶合反应两者融合两个BIA单体形成。此外，式Ve、Vg、Vi、Vj、Vk、Vl、Vm、Vo、Vp和Vq的bisBIA化合物通过使用碳-氧偶合反应融合两个BIA单体形成。式Vn的bisBIA化合物通过使用两个碳-氧偶合反应和一个碳-碳偶合反应融合两个BIA单体形成。另外，式Vr的bisBIA化合物通过使用三个碳-氧偶合反应融合两个BIA单体形成。
可用于形成偶合反应的一种或多种酶可包括已知的细胞色素P450，诸如伏牛花(Berberis stolonifera)CYP80A1或来自天然合成这些化合物的其他植物的类似的细胞色素P450酶。另选地，偶合反应可通过不是细胞色素P450的酶进行。可用于形成偶合反应的一种或多种酶可被工程化为接受非天然底物。因此，可用于形成偶合反应的一种或多种酶可用于生成非天然bisBIA分子。在实例中，一种或多种酶可将天然BIA单体与非天然BIA单体融合，以产生非天然bisBIA分子。在其他实例中，一种或多种酶可将两个非天然BIA单体融合，以产生非天然bisBIA分子。可使用酶工程化策略鉴定可用于形成融合BIA单体产生bisBIA的偶合反应的一种或多种酶。在实例中，酶工程化策略可包括定点诱变、随机诱变和筛选、DNA改组和筛选。
一旦形成bisBIA，bisBIA可进一步衍生或修饰。可利用工程化宿主细胞产生的一种或多种酶衍生或修饰bisBIA。具体地讲，可通过使bisBIA与工程化宿主细胞产生的一种或多种酶接触来衍生或修饰bisBIA。另外或另选地，可通过使bisBIA与从工程化宿主细胞外部的来源提供给bisBIA的一种或多种酶接触来衍生或修饰bisBIA。可用于衍生或修饰bisBIA的一种或多种酶可用于进行裁剪反应。裁剪反应的实例包括氧化、还原、O-甲基化、N-甲基化、O-脱甲基化、乙酰化、亚甲基二氧桥形成以及O,O-脱亚甲基化。可使用一种或多种裁剪反应衍生或修饰bisBIA。
裁剪反应的实例提供于表3中。在一些实例中，裁剪酶可用于催化在bisBIA或其衍生物上进行的碳-碳偶合反应。可用于催化碳-碳偶合反应的裁剪酶的实例包括来自罂粟、花菱草、日本黄连(Coptis japonica)、匍枝小檗(Berberis stolonifer)、黄唐松草或另外物种的小檗碱桥酶(BBE)；来自罂粟或另外物种的沙罗泰里啶合酶(SalSyn)；以及来自日本黄连或另外物种的紫堇块茎碱合酶(CorSyn)。可通过裁剪酶催化的反应的非限制性实例在方案2中示出，其中Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自氢、羟基、氟代、氯代、溴代、甲醛、C1-C4酰基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基。在一些实例中，Ra、Rb及其所附接的碳原子任选形成碳环或杂环。在一些实例中，Rc、Rd及其所附接的碳原子任选形成碳环或杂环。
方案2
在一些实例中，裁剪酶可用于催化在bisBIA或其衍生物上进行的氧化反应。可用于催化氧化反应的裁剪酶的实例包括来自日本黄连、蓟罂粟(Argemone mexicana)、金花小檗(Berberis wilsonae)或另外物种的四氢原小檗碱氧化酶(STOX)；来自罂粟或另外物种的二氢苯菲啶氧化酶(DBOX)；来自罂粟或另外物种的甲基刺罂粟碱羟化酶(MSH)；以及来自罂粟、花菱草或另外物种的原阿片碱6-羟化酶(P6H)。
裁剪酶也可用于催化在bisBIA或其衍生物上进行的亚甲基二氧桥形成反应。可用于催化亚甲基二氧桥形成反应的裁剪酶的实例包括来自罂粟、花菱草、蓟罂粟或另外物种的刺罂粟碱合酶(StySyn)；来自罂粟、花菱草、蓟罂粟或另外物种的碎叶紫堇碱合酶(CheSyn)；以及来自黄唐松草、黄连(Coptis chinensis)或另外物种的坎那定合酶(CAS)。
在其他实例中，裁剪酶可用于催化在bisBIA或其衍生物上进行的O-甲基化反应。可用于催化O-甲基化反应的裁剪酶的实例包括来自罂粟、黄唐松草、日本黄连、大红罂粟或另外物种的去甲乌药碱6-O-甲基转移酶(6OMT)；来自罂粟、黄唐松草、日本黄连、黄连或另外物种的3’羟基-N-甲基乌药碱4’-O-甲基转移酶(4’OMT)；来自罂粟、花菱草或另外物种的牛心果碱7-O-甲基转移酶(7OMT)；以及来自罂粟、黄唐松草、日本黄连、黄连或另外物种的金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶(9OMT)。
另外，裁剪酶可用于催化在bisBIA或其衍生物上进行的N-甲基化反应。可用于催化N-甲基化反应的裁剪酶的实例包括来自罂粟、黄唐松草、日本黄连或另外物种的乌药碱N-甲基转移酶(CNMT)；来自罂粟、花菱草、大红罂粟或另外物种的四氢原小檗碱N-甲基转移酶(TNMT)。
此外，裁剪酶可用于催化在bisBIA或其衍生物上进行的O-脱甲基化反应。可用于催化O-脱甲基化反应的裁剪酶的实例包括来自罂粟或另外物种的蒂巴因脱甲基酶(T6ODM)；以及来自罂粟或另外物种的可待因脱甲基酶(CODM)。
裁剪酶也可用于催化在bisBIA或其衍生物上进行的还原反应。可用于催化还原反应的裁剪酶的实例包括来自罂粟、大红罂粟或另外物种的沙罗泰里啶还原酶(SalR)；来自罂粟或另外物种的可待因酮还原酶(COR)；以及来自花菱草或另外物种的血根碱还原酶(SanR)。在其他实例中，裁剪酶可用于催化在bisBIA或其衍生物上进行的乙酰化反应。可用于催化乙酰化反应的裁剪酶的实例包括来自罂粟或其他物种的沙罗泰里啶乙酰转移酶(SalAT)。
异源编码序列
在一些情况中，工程化的宿主细胞携带一个或多个异源编码序列(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个)，所述异源编码序列编码使工程化的宿主细胞能够产生期望的目标酶和/或目标BIA(例如，如本文所述)的活性。如本文所用，术语“异源编码序列”用于指示编码或最终编码通常不存在于宿主生物体中且可在适当条件下在宿主细胞中表达的肽或蛋白质或其等效氨基酸序列(例如，酶)的任何多核苷酸。因而，“异源编码序列”包括通常存在于宿主细胞中的编码序列的多个拷贝，以使所述细胞表达通常不存在于所述细胞中的编码序列的另外拷贝。异源编码序列可以是RNA或其任何类型(例如，mRNA)、DNA或其任何类型(例如cDNA)或RNA/DNA的杂合体。目标编码序列包括但不限于包括此类特征如编码序列、内含子、启动子区、3'-UTR和增强子区的全长转录单位。
在实例中，工程化的宿主细胞可包括各自编码酶的多个异源编码序列，所述酶诸如表2中列出的酶。在一些实例中，由多个异源编码序列编码的多种酶可以彼此不同。在一些实例中，由多个异源编码序列编码的多种酶中的一些可彼此不同，并且由多个异源编码序列编码的多种酶中的一些可以是重复拷贝。
在一些实例中，异源编码序列可以可操作地连接。可操作地连接的异源编码序列可以在产生特定苄基异喹啉生物碱产物和/或差向异构酶产物的相同途径内。在一些实例中，可操作地连接的异源编码序列可以直接顺序性地沿着产生特定的苄基异喹啉生物碱产物和/或差向异构酶产物的途径。在一些实例中，在由多个异源编码序列编码的一种或多种酶之间，可操作地连接的异源编码序列可具有一种或多种天然酶。在一些实例中，在由多个异源编码序列编码的一种或多种酶之间，异源编码序列可具有一种或多种异源酶。在一些实例中，在由多个异源编码序列编码的一种或多种酶之间，异源编码序列可具有一种或多种非天然酶。
工程化的宿主细胞还可被修饰为具有一个或多个遗传改变以适应异源编码序列。天然宿主基因组的改变包括但不限于修饰基因组以减少或消除可能干扰期望途径的特定蛋白质的表达。此类天然蛋白质的存在可将途径的中间体或最终产物中的一种迅速转化成代谢物或在期望途径中不可用的其他化合物。因此，如果天然酶的活性被降低或完全不存在，则所产生的中间体将可更容易地用于并入期望产物中。
异源编码序列包括但不限于编码通常负责植物中的目标BIA产生的酶的序列(野生型序列或等效序列)。在一些情况下，异源序列所编码的酶可以是1-BIA途径中的任何酶，并且可来自任何适宜的来源。用于特定合成途径的由异源编码序列编码的酶的选择和数目可基于期望产物进行选择。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞可包括1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或甚至15个或更多个异源编码序列，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个异源编码序列。
如本文所用，术语“异源编码序列”还包括肽或酶的编码部分(即，肽或酶的cDNA或mRNA序列)以及全长转录单位的编码部分(即，包括内含子和外含子的基因)，以及编码酶或编码其等效氨基酸序列的“密码子优化的”序列、截短序列或改变的序列的其他形式，条件是等效氨基酸序列产生功能蛋白质。此类等效氨基酸序列可具有一个或多个氨基酸的缺失，其中缺失是N末端、C末端或内部。设想了截短形式，只要它们具有本文所指示的催化能力即可。还设想了两种或更多种酶的融合物以有助于途径中的代谢物的转移，条件是催化活性得以维持。
可操作的片段、突变体或截短形式可通过建模和/或筛选进行鉴定。在一些情况下，通过以逐步方式缺失例如蛋白质的N末端、C末端或内部区域、接着相较于原始序列关于所得衍生物针对期望反应的活性对所得衍生物进行分析来实现这一点。如果讨论中的衍生物在这种能力方面操作，则认为正确构成酶的等效衍生物。
在实例中，一些异源蛋白当在重组宿主中表达时可出现它们被不正确地加工的情况。例如，植物蛋白，诸如在微生物产生宿主中表达的细胞色素P450酶，可出现不正确加工。具体地讲，沙罗泰里啶合酶当在酵母中异源表达时可发生N-连接的糖基化。这种N-连接的糖基化在植物中可能观察不到，这可指示初生SalSyn转录物的不正确的N末端分选，以便降低在异源微生物宿主中的酶活性。在此类实例中，针对校正初生转录物的N末端分选以便去除N连接的糖基化模式的蛋白质工程化可导致沙罗泰里啶合酶在重组产生宿主中的活性得到改善。这在下文的实施例10中进一步解释。
本发明的方面还涉及编码与各种酶的天然氨基酸序列等效的氨基酸序列的异源编码序列。为“等效”的氨基酸序列被定义为与特定氨基酸序列不相同、而是包含至少一些氨基酸变化(缺失、取代、翻转、插入等)的氨基酸序列，当用于期望目的时，与特定氨基酸序列的类似活性相比，所述变化不会实质影响蛋白质的生物活性。在差向易构酶的实例中，生物活性是指其催化活性。等效序列还意在包括已被工程化和/或进化为具有与原始氨基酸序列不同的特性的那些。目标易突变特性包括催化活性、底物特异性、选择性、稳定性、溶解性、定位等。
在一些情况下，每种类型的酶的表达通过另外的基因拷贝(即，多个拷贝)增加，其增加中间体积聚和/或目标BIA产生。本发明的实施方案包括通过同时表达单一或多种酶的多个物种变体，宿主细胞中的目标BIA产生增加。在一些情况下，单一或多种酶的另外基因拷贝包括于宿主细胞中。可利用任何适宜的方法，包括宿主细胞中的酶的异源编码序列的多个拷贝。
在一些实例中，工程化的宿主细胞包括酶的异源编码序列的多个拷贝，诸如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个，或甚至10个或更多个拷贝。这一点的实例描述于图28中。具体地讲，图28示出在工程化的酵母菌株中，通过将NCS基因的拷贝数从两个拷贝增加至三个拷贝来实现苄基异喹啉生物碱牛心果碱的产生增加。
在某些实施方案中，工程化的宿主细胞包括一种或多种酶的异源编码序列的多个拷贝，诸如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种酶等的多个拷贝。在一些情况下，酶的异源编码序列的多个拷贝源自两种或更多种相较于宿主细胞不同的来源生物体。例如，工程化的宿主细胞可包括一个异源编码序列的多个拷贝，其中所述拷贝中的每一个源自不同的来源生物体。因此，每个拷贝可基于由异源编码序列编码的目标酶的种间差异包括显式序列中的一些变异。
可对工程化的宿主细胞培养基取样并且监测目标BIA的产生。可使用任何适宜的方法观察和测量目标BIA。目标方法包括但不限于LC-MS方法(例如，如本文所述)，其中通过与已知量的标准化合物比较来分析目标样品。另外，存在可观察和/或测量目标BIA的其他方式。观察和/或测量BIA的另选方式的实例包括GC-MS、紫外-可见光谱法、NMR、LC-NMR、LC-UV、TLC、毛细管电泳，以及其他方法。身份可例如通过m/z和MS/MS片段化模式确认，并且定量或测量化合物可通过已知保留时间的LC迹线峰和/或参考已知量的化合物标准品的对应LC-MS分析进行的EIC MS峰分析来实现。
另外，可对工程化宿主细胞的培养物取样并且监测目标酶诸如CYP-COR酶的产生。可使用任何适宜的方法观察和测量目标酶。目标方法包括酶活性测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳、一氧化碳光谱法以及蛋白质印迹分析。
方法
工艺步骤
如上文所总结，本发明的方面包括制备目标苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法。另外，本发明的方面包括制备目标酶的方法。因而，本发明的方面包括在功能性地表达一种或多种宿主细胞修饰(例如，如本文所述)的条件下培养工程化的宿主细胞，以使所述细胞将目标起始化合物转化成目标产物酶和/或BIA。还提供以下方法，所述方法包括在适于蛋白质产生的条件下培养工程化的宿主细胞以使得功能性地表达一个或多个异源编码序列并且将目标起始化合物转化成目标产物酶或BIA。在实例中，所述方法是一种制备苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法，其包括培养工程化的宿主细胞(例如，如本文所述)；将起始化合物添加至细胞培养物；以及从细胞培养物中回收BIA。在一些实例中，所述方法是一种制备酶的方法，其包括培养工程化的宿主细胞(例如，如本文所述)；将起始化合物添加至细胞培养物；以及从细胞培养物中回收酶。
发酵培养基可包含合适的碳底物。适于进行本公开的方法的碳源可涵盖广泛多种含碳底物。合适的底物可包括但不限于单糖(例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、低聚糖(例如，乳糖、蔗糖、棉子糖)、多糖(例如，淀粉、纤维素)，或其组合。在一些情况下，可使用来自可再生原料的未纯化混合物(例如，玉米浆液、糖用甜菜糖蜜、大麦麦芽)。在一些情况下，碳底物可以是一碳底物(例如，甲醇、二氧化碳)或二碳底物(例如，乙醇)。在其他情况下，可利用其他含碳化合物，例如，甲胺、葡糖胺和氨基酸。
培养工程化的宿主细胞的任何适宜的方法可用于产生目标酶和/或BIA。所采用的具体方案可例如根据工程化的宿主细胞、异源编码序列、目标酶、目标BIA等而变化。细胞可存在于任何适宜的环境中，诸如其中细胞能够表达一种或多种功能性异源酶的环境。在一些实施方案中，将细胞在有利于酶表达的条件下并且用可用于允许体内产生目标酶和/或BIA的适当底物进行培养。在一些实施方案中，功能性酶从工程化宿主中提取，以用于在体外条件下产生目标酶和/或BIA。在一些情况下，工程化的宿主细胞被放回到多细胞宿主生物体中。工程化的宿主细胞处于任何生长期，包括但不限于稳定期和对数生长期等。此外，培养物本身可以是连续培养物或它们可以是分批培养物。
细胞可在介于14-40℃之间的温度下的适当的发酵培养基中生长。细胞可在任何适宜速度(例如200rpm)的振荡下生长。细胞可在合适的pH下生长。适用于发酵的pH范围可介于pH 5-9之间。发酵可在有氧、缺氧或微氧条件下进行。可使用任何合适的生长培养基。合适的生长培养基可包括但不限于常见的商业制备的培养基，诸如合成限定的(SD)基本培养基或富含酵母提取物蛋白胨右旋糖(YEPD)的培养基。可使用适于微生物的任何其他丰富、限定或合成的生长培养基。
可在基本上任何尺寸和形状的容器中培养细胞。适用于进行本公开的方法的容器的实例可包括但不限于多孔摇板、试管、烧瓶(带挡板和不带挡板的)以及生物反应器。培养物的体积可在10微升至大于10,000升的范围内。
可包括向生长培养基中加入已知以生物碱的产生所期望的方式调节代谢的试剂。在非限制性实例中，可向生长培养基中加入环腺苷2’3’-单磷酸以调节分解代谢物阻抑。
可利用针对特定细胞类型的任何适宜的细胞培养条件。在某些实施方案中，使用标准细胞培养基和补充剂，将包括一个或多个修饰的宿主细胞在标准或容易优化的条件下培养。作为一个实例，当不需要用于质粒维持的选择性压力时，标准生长培养基可包含20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和20g/L右旋糖(YPD)。使含有质粒的宿主细胞在含有1.7g/L酵母氮源、5g/L硫酸铵和20g/L右旋糖、补充有生长和选择所需的适当氨基酸的合成完全(SC)培养基中生长。可用于诱导酶表达的替代碳源包括但不限于蔗糖、棉子糖和半乳糖。在实验室中将细胞在任何适宜的温度(例如，30℃)下在任何适宜速率(例如，200rpm)的振荡下生长于容器中，例如在1-1000mL或更大范围体积的试管或烧瓶中。
培养体积可按比例放大以用于在例如作为工业过程的一部分的较大发酵容器中生长。工业发酵工艺可在封闭补料、分批补料或连续恒化器条件下或任何合适的发酵模式下进行。在一些情况下，可以将细胞作为完整的细胞催化剂固定在底物上并使其经受发酵条件以产生生物碱。
分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不改变。在发酵开始时将一种或多种期望的生物体接种到培养基中。在一些情况下，分批发酵在对系统做出改变以控制诸如pH和氧浓度(而不是碳)的因素的情况下进行。在这种类型的发酵系统中，系统的生物质和代谢物组成在整个发酵过程中持续变化。细胞通常经历了迟滞期，接着到对数期(高生长速率)，接着到稳定期(生长速率降低或停止)，并且最终到死亡期(如果保持未处理的话)。
连续发酵是一种开放式系统，其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并从容器中连续移除等量的发酵培养基用于加工。连续发酵系统通常操作以维持稳态生长条件，由此使得由于移除培养基造成的细胞损失必须通过发酵中的生长速率进行平衡。连续发酵通常在细胞处于恒定高细胞密度的条件下操作。连续发酵允许调节影响目标产物浓度和/或细胞生长的一个或多个因素。
液体培养基可包括但不限于具有上述添加剂组分的丰富或合成限定培养基。培养基组分可溶解于水中并且通过加热、压力、过滤、辐射、化学物质或其任何组合进行灭菌。若干培养基组分可单独制备并灭菌，然后在发酵容器中配混。培养基可以被缓冲，以便有助于在整个发酵过程中保持恒定的pH。
可在整个发酵过程中监测或控制工艺参数，包括温度、溶解氧、pH、搅拌、通气速率和细胞密度。例如，可通过浸入培养基中的温度探针监测发酵过程的温度。可通过调控夹套温度将培养温度控制在设定点。可将水在外部冷却器中冷却，接着使其流动到生物反应器控制塔中并且循环至容器中的处于保持设定点温度所需温度的夹套。
另外，可监测发酵过程中的气体流参数。例如，气体可通过喷射器流动到培养基中。适用于本公开的方法的气体可包括压缩空气、氧气和氮气。气体流可处于固定的速率或被调控以保持溶解氧设定点。
还可监测培养基的pH。在实例中，可通过浸入容器内部的培养基中的pH探针监测pH。如果pH控制起作用，那么可通过酸碱泵调整pH，所述酸碱泵以所需速率向培养基中加入每种溶液。用于控制pH的酸溶液可以是硫酸或盐酸。用于控制pH的碱溶液可以是氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵。
此外，可通过浸入培养基中的溶解氧探针监测培养基中的溶解氧。如果溶解氧调控起作用，那么可通过增大或减小搅拌速度来调整氧水平。也可通过增大或减小气体流动速率来调整溶解氧水平。气体可以是压缩空气、氧气或氮气。
也可监测发酵过程中的搅拌速度。在实例中，搅拌机马达可驱动搅动器。搅拌机速度可在整个发酵过程中设定为恒定rpm或者可动态调控以保持设定的溶解氧水平。
另外，可监测发酵过程中的浊度。在实例中，可使用浊度探针测量细胞密度。另选地，可通过从生物反应器中取样并且在分光光度计中对它们进行分析来测量细胞密度。此外，可通过无菌取样装置以时间间隔从生物反应器中移除样品。可针对宿主细胞产生的生物碱对样品进行分析。也可针对其他代谢物和糖、培养基组分的耗尽或细胞的密度对样品进行分析。
在另一个实例中，可监测发酵过程期间的原料参数。具体地讲，可使用外部泵向发酵中加入原料，所述原料包括糖和其他碳源、营养素和辅因子。也可在发酵过程中加入其他组分，包括但不限于消泡剂、盐、螯合剂、表面活性剂和有机液体。
用于优化宿主细胞中的异源多核苷酸的表达的任何适宜的密码子优化技术可适用于在主题宿主细胞和方法中使用，参见例如，Gustafsson,C.等人(2004)TrendsBiotechnol,22,346-353，其以引用的方式全文并入。
主题方法还可包括将起始化合物添加至细胞培养物。任何适宜的添加方法可适于在主题方法中使用。细胞培养物可补充有足够量的目标起始材料(例如，如本文所述)，例如mM至μM量，诸如约1-5mM之间的起始化合物。应当理解，所添加的起始材料的量、添加定时和速率、添加的材料的形式等可根据多种因素而变化。可纯净地添加起始材料或可将起始材料预先溶解于合适的溶剂(例如，细胞培养基、水或有机溶剂)中。起始材料可以浓缩形式(例如，超过期望浓度10x)添加以使在添加时细胞培养基的稀释最小化。起始材料可以一个或多个批次添加，或通过在延长的时间段(例如，数小时或数天)内连续添加而添加。
用于从发酵培养基中分离产物的方法
主题方法还可包括从细胞培养物中回收目标酶和/或BIA。任何适宜的分开和分离方法(例如，色谱方法或沉淀方法)可适于在主题方法中使用以从细胞培养物中回收目标酶和/或BIA。过滤方法可用于分开细胞培养物的可溶性部分与不溶性部分。在一些情况下，液相色谱方法(例如，反相HPLC、尺寸排阻、正相色谱法)可用于使目标BIA与细胞培养物的其他可溶性组分分开。在一些情况下，萃取方法(例如，液体萃取、基于pH的纯化、固相萃取、亲和色谱法、离子交换等)可用于使目标酶和/或BIA与细胞培养物的其他组分分开。
可使用本领域中已知的方法将所产生的生物碱从发酵培养基中分离。可在发酵之后立即(或在一些情况下，在发酵期间)进行多个回收步骤，以用于初始回收期望产物。通过这些步骤，可将生物碱(例如，BIA)与细胞、细胞碎片和废物分开，并且其他营养素、糖和有机分子可保留在废培养基中。可使用这一过程产生富含BIA的产物。
在一个实例中，通过向间歇式反应器中提供工程化的酵母细胞以及包括营养素和水的原料来形成具有苄基异喹啉生物碱(BIA)产物的产物流。具体地讲，可通过将工程化的酵母细胞孵育至少约5分钟的时间段来使工程化的酵母细胞进行发酵，以产生包含BIA产物和细胞材料的溶液。一旦工程化的酵母细胞已经进行发酵，可使用至少一个分离装置将BIA产物与细胞材料分离以提供包含BIA产物的产物流。具体地讲，产物流可包括BIA产物，以及另外的组分，诸如澄清的酵母培养基。另外，BIA产物可包括一种或多种目标BIA，诸如一种或多种BIA组分。
可使用不同的方法从生物反应器培养基中移除包括目标酶和/或BIA的细胞。在实例中，通过随时间推移的沉降移除细胞。这种沉降过程可通过冷却或通过添加澄清剂诸如二氧化硅来加速。然后可从反应器顶部虹吸废培养基或者可从反应器基部滗析细胞。另选地，可通过用过滤器、膜或其他多孔材料过滤来移除细胞。也可通过离心，例如通过连续流动离心或通过使用连续萃取器来移除细胞。
如果一些有价值的目标酶和/或BIA存在于细胞内部，那么可将细胞透化或裂解，并且可通过上述方法中的任一种移除细胞碎片。用于透化细胞的试剂可包括但不限于有机溶剂(例如DMSO)或盐(例如乙酸锂)。用以裂解细胞的方法可包括添加表面活性剂诸如十二烷基硫酸钠，或通过珠磨或超声处理进行机械破坏。
可通过添加与水性培养基不混溶的有机液体，通过液-液萃取从澄清的废培养基中萃取目标酶和/或BIA。在实例中，除了其他处理步骤之外，可使用液-液萃取的使用。合适的有机液体的实例包括但不限于肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯、甲基异丁基酮、油酸甲酯、甲苯、油醇、丁酸乙酯。可以水性培养基的体积的少至10％或多至100％添加有机液体。
在一些情况下，可在发酵开始时或在发酵期间的任何时间添加有机液体。这一萃取发酵过程可通过将酶和/或BIA连续地移除至有机相而增加来自宿主细胞的目标酶和/或BIA的收率。
搅拌可使有机相与水性培养基形成乳液。促进两个相分成不同层的方法可包括但不限于破乳剂或成核剂的添加或pH的调整。还可例如通过连续锥形板离心将乳液离心以分开两个相。
另选地，可将有机相与水性培养基分离，以使在萃取后可以物理方式移除所述有机相。例如，可将溶剂包封在膜中。
在实例中，可使用吸附方法从发酵培养基中萃取目标酶和/或BIA。在实例中，可通过添加树脂诸如XAD4或通过吸附移除BIA的另一种试剂而从澄清的废培养基中萃取目标BIA。然后可使用有机溶剂从树脂中释放目标BIA。合适的有机溶剂的实例包括但不限于甲醇、乙醇、乙酸乙酯或丙酮。
也可使用过滤从发酵培养基中萃取目标BIA。在高pH下，目标BIA可在生物反应器中形成结晶状沉淀。可通过用过滤器、膜或其他多孔材料过滤直接移除这种沉淀。还可通过离心和/或滗析收集沉淀。
上述萃取方法可原位(在生物反应器中)或非原位(例如，在外部回路中，培养基通过所述外部回路流出生物反应器并接触萃取剂，接着再循环回到容器中)进行。另选地，萃取方法可在发酵结束之后，使用从生物反应器容器中移除的澄清培养基进行。
用于纯化来自富含生物碱的溶液的产物的方法
后续纯化步骤可涉及使用本领域中已知的方法处理富含一种或多种目标BIA产物的发酵后溶液，以回收高纯度的各目标产物物质。
在一个实例中，可将萃取于有机相中的目标BIA转移到水溶液中。在一些情况下，可通过加热和/或真空蒸发有机溶剂，并且可将所得粉末溶解于合适pH的水溶液中。在另一个实例中，可通过添加有利于将目标BIA萃取到水相中的合适pH的水溶液来从有机相中萃取目标BIA。然后可通过滗析、离心或另外的方法移除水相。
可对含BIA的溶液进一步处理以移除金属，例如，通过用合适的螯合剂处理。含目标BIA的溶液可通过沉淀进一步处理，以移除其他杂质，诸如蛋白质和DNA。在一个实例中，用适当的沉淀剂诸如乙醇、甲醇、丙酮或异丙醇处理含目标BIA的溶液。在另选的实例中，可通过渗析或通过将较小的生物碱与污染的生物大分子分开的其他尺寸排阻方法移除DNA和蛋白质。
在另外的实例中，可使用本领域已知的方法通过连续交叉流过滤将包含目标BIA的溶液萃取至高纯度。
如果溶液包含目标BIA的混合物，那么可使用本领域已知的方法使其受到酸-碱处理，以得到各目标BIA物质。在此过程中，调整水溶液的pH以沉淀各BIA。
对于高纯度的小规模制备，可通过液相色谱法在单一步骤中纯化BIA。
酵母来源的生物碱API相对于植物来源的API
澄清的酵母培养基(CYCM)可包含多种杂质。澄清的酵母培养基可通过真空和/或加热脱水，以得到富含生物碱的粉末。此产物类似于由罂粟生长国出口且购自API制造商的罂粟杆的浓缩物(CPS)或鸦片。出于本发明的目的，CPS是任何类型的纯化的植物萃取物的代表性实例，可由其最终进一步纯化一种或多种期望的生物碱产物。表4和表5强调了这两种产物中的杂质，它们对于CYCM或CPS是特异性的或可存在于两者中。虽然一些BIA可能具有作为杂质的颜料，但是其他BIA本身可被归类为颜料。因此，可基于非颜料杂质，针对杂质对这些BIA进行评估。通过针对这些杂质的子组对未知来源的产物进行分析，本领域技术人员可确定产物来源于酵母还是植物产生宿主。
API级药物成分是高度纯化的分子。因而，可指示API的植物或酵母来源的杂质(诸如表4和表5中列出的那些)可能不存在于API级的产物中。实际上，源自本发明的酵母菌株的许多API产物可能非常难以与传统的植物来源的API区分开。然而，在一些情况下，可使用化学合成方法使常规的生物碱化合物经受化学修饰，其可在需要此类化学修饰的基于植物的产物中表现为化学杂质。例如，化学衍生化通常可导致与化学合成工艺相关的一组杂质。在某些情况下，这些修饰可在酵母产生平台中以生物学方式进行，从而避免与化学衍生相关联的一些杂质存在于酵母来源的产物中。具体地讲，来自化学衍生产物的这些杂质可存在于使用化学合成工艺产生的API产物中，但是在使用酵母来源的产物产生的API产物中可能不存在。另选地，如果将酵母来源的产物与化学衍生的产物混合，那么可能存在所得杂质，但是其量少于在仅或主要包含化学衍生产物的API中将预期的量。在此实例中，通过针对这些杂质的子组对API产物进行分析，本领域技术人员可确定产物来源于酵母产生宿主还是传统的化学衍生化路径。
可存在于化学衍生化的吗啡喃API中，但不存在于生物合成的API中的杂质的非限制性实例包括API可待因中的可待因-O(6)-甲基醚杂质；API羟考酮中的8,14-二羟基-7,8-二氢可待因酮；以及API氢可酮中的四氢蒂巴因。可待因-O(6)-甲基醚可通过吗啡的化学过度甲基化形成。API羟考酮中的8,14-二羟基-7,8-二氢可待因酮可通过蒂巴因的化学过度氧化形成。另外，API氢可酮中的四氢蒂巴因可通过蒂巴因的化学过度还原形成。
然而，在其中酵母来源的化合物和植物来源的化合物均通过化学合成方法受到化学修饰的情况下，在产物中可预期与化学合成过程相关联的相同杂质。在这一情况下，可如上所述对起始材料(例如，CYCM或CPS)进行分析。
工程化宿主细胞的方法
还包括出于产生目标酶和/或BIA的目的工程化宿主细胞的方法。将DNA插入宿主细胞中可使用任何适宜的方法来实现。所述方法用于将异源编码序列插入工程化的宿主细胞中，以使得宿主细胞功能性地表达酶并且将目标起始化合物转化成目标产物酶和/或BIA。
任何适宜的启动子可用于主题工程化的宿主细胞和方法中。驱动异源编码序列的表达的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，条件是所述启动子在工程化的宿主细胞中是活性的。异源编码序列可由其天然启动子表达，或可使用非天然启动子。这类启动子可在使用它们的宿主中为低至高强度。启动子可以是调控的或组成型的。在某些实施方案中，使用不受葡萄糖阻抑的、或者在培养基中存在葡萄糖时仅受轻微阻抑的启动子。目标启动子包括但不限于，糖酵解基因的启动子，诸如枯草芽孢杆菌tsr基因的启动子(编码果糖二磷酸醛缩酶基因的启动子区)或来自酵母酿酒酵母基因的编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子(GPD、GAPDH或TDH3)；面包酵母的ADH1启动子；磷酸饥饿诱导的启动子，诸如酵母的PHO5启动子；来自地衣芽孢杆菌的碱性磷酸酶启动子；酵母诱导型启动子，诸如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS；可阻抑启动子Met25、tetO；以及组成型启动子，诸如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译延长因子-1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子等。含有可受激素(诸如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素)诱导的启动子的自主复制酵母表达载体也可使用并且包括但不限于，糖皮质激素反应性元件(GRE)和甲状腺激素反应性元件(TRE)。这些和其他实例描述于美国专利7,045,290中，其以引用的方式并入，包括其中引用的参考文献。可使用包含组成型或诱导型启动子诸如α因子、醇氧化酶和PGH的另外的载体。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动基因的表达。任何适宜的适当启动子可被选择用于宿主细胞，例如大肠杆菌。还可使用启动子选择以优化转录，并且因此，优化酶水平以使产生最大化，同时使能源最小化。
任何适宜的载体可用于主题工程化的宿主细胞和方法中。目标载体包括用于在酵母和其他细胞中使用的载体。酵母载体的类型可分成4种一般类别：整合型载体(YIp)、自主复制高拷贝数目载体(YEp或2μ质粒)、自主复制低拷贝数目载体(YCp或着丝粒质粒)以及用于克隆大片段的载体(YAC)。经由任何适宜转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。另一来源的DNA(例如，PCR生成的双链DNA产物，或合成的双链或单链寡核苷酸)可通过整合到基因组中来用于工程化酵母。任何单转化事件可包括一种或若干核酸(载体、双链或单链DNA片段)以对宿主细胞进行基因修饰。
效用
本发明的工程化的宿主细胞和方法(例如，如上文所述)适用于多种应用。目标应用包括但不限于：研究应用和治疗应用。本发明的方法适用于多种不同的应用中，包括其中酶和/或BIA的产生令人感兴趣的任何适宜的应用。
主题工程化的宿主细胞和方法适用于多种治疗应用。目标治疗应用包括其中制备包含BIA的药物产品令人感兴趣的那些应用。本文所述的工程化的宿主细胞产生目标BIA和目标酶。牛心果碱是包括工程化努力以产生最终产物诸如阿片类产物的BIA合成中的目标主要分支点中间体。主题宿主细胞可用于由简单且廉价的起始材料产生目标BIA，所述材料可适用于产生包括牛心果碱的目标BIA和BIA最终产物。因此，主题宿主细胞适用于供应治疗活性目标BIA。
在一些情况下，工程化的宿主细胞和方法适用于产生商业规模量的其BIA，其中这些化合物的化学合成是低产量的并且不是用于大规模生产的可行手段。在某些情况下，宿主细胞和方法用于发酵设施中，所述发酵设施将包括例如5,000-200,000升容量的生物反应器(发酵罐)，从而允许快速产生用于治疗性产物的其目标BIA。这类应用可包括由可发酵碳源诸如纤维素、淀粉和游离糖工业规模产生目标BIA。
主题工程化的宿主细胞和方法适用于多种研究应用。主题宿主细胞和方法可用于分析多种酶对多种目标酶和/或BIA的生物合成途径的作用。此外，工程化的宿主细胞可被工程化以产生目标酶和/或BIA，所述酶和/或BIA适用于测试在尚未证实的治疗功能方面的目标生物活性。在一些情况下，工程化宿主细胞以包括编码多种酶的多种异源编码序列阐明针对目标酶和/或BIA的高产量生物合成途径。在某些情况下，研究应用包括产生用于目标治疗分子的目标酶和/或BIA，所述目标酶和/或BIA随后可进一步化学修饰或衍生化为期望产物或针对增加的目标治疗活性进行筛选。在一些情况下，宿主细胞菌株用于筛选在这类途径中感兴趣的酶活性，其可导致经由在这些菌株中产生的BIA代谢物的转化发现酶。
主题工程化的宿主细胞和方法可用作植物特化代谢物的产生平台。主题宿主细胞和方法可用作药物库开发以及植物酶发现的平台。例如，主题工程化的宿主细胞和方法可适用于通过采用酵母菌株产生令人感兴趣的支架分子(诸如原阿片碱)并且通过组合生物合成或通过化学手段进一步功能化化合物结构来开发基于天然产物的药物库。通过以这种方式产生药物库，任何潜在药物命中已经与易于大规模培养和产生的产生宿主相关。作为另一个实例，这些主题工程化的宿主细胞和方法可适用于植物酶发现。主题宿主细胞提供限定代谢物的干净背景以表达植物EST库来鉴定新的酶活性。主题宿主细胞和方法提供用于酵母中的植物酶的功能表达和活性增加的表达方法和培养条件。
试剂盒和系统
本发明的方面还包括试剂盒和系统，其中所述试剂盒和系统可包括在本发明的方法中采用的一种或多种组分，例如，工程化的宿主细胞、起始化合物、异源编码序列、载体、培养基等，如本文所述。在一些实施方案中，主题试剂盒包括工程化的宿主细胞(例如，如本文所述)，以及一种或多种选自以下的组分：起始化合物、异源编码序列和/或包括所述异源编码序列的载体、载体、生长原料、适合用于表达系统的组分(例如，细胞、克隆载体、多克隆位点(MCS)、双向启动子、内部核糖体进入位点(IRES)等)以及培养基。
本文所述的任何组分可提供于试剂盒中，例如，包括一个或多个修饰的宿主细胞、起始化合物、培养基等。适合用于制备和使用异源编码序列的多种组分、克隆载体和表达系统可适用于主题试剂盒中。试剂盒还可包括管、缓冲剂等，以及使用说明书。根据需要，试剂盒的各种试剂组分可存在于单独容器中，或所述组分中的一些或全部可预组合于单一容器中的试剂混合物中。
还提供了用于产生目标酶和/或BIA的系统，其中所述系统可包括包含一个或多个修饰(例如，如本文所述)的工程化的宿主细胞、起始化合物、培养基、发酵罐和发酵设备，例如，适于维持宿主细胞的生长条件的装置、取样和监测设备和部件等。适合用于酵母细胞的大规模发酵的多种组分可适用于主题系统中。
在一些情况下，所述系统包括用于工程化的宿主细胞的大规模发酵以及监测和纯化由发酵的宿主细胞产生的酶和/或BIA化合物的部件。在某些实施方案中，在发酵罐中的工程化的宿主细胞产生一种或多种期望的目标BIA产物的条件下将一种或多种起始化合物(例如，如本文所述)添加至所述系统。在一些情况下，宿主细胞产生目标BIA(例如，如本文所述)。在某些情况下，目标BIA产物是阿片类产物，诸如蒂巴因、可待因、尼奥品、吗啡、新吗啡、氢可酮、羟考酮、氢吗啡酮、二氢可待因、14-羟基可待因、二氢吗啡或羟吗啡酮。
在一些情况下，所述系统包括用于监测和或分析通过主题宿主细胞产生的一种或多种目标酶和/或BIA化合物的工艺。例如，如本文所述的LC-MS分析系统、色谱系统或任何适宜的系统，其中样品可进行分析且与标准品比较，例如，如本文所述。可通过取样和分析在发酵之前和期间的任何适宜的时间监测发酵培养基。当起始化合物到目标酶和/或BIA产物的转化完成时，发酵可停止并且可进行BIA产物的纯化。因此，在一些情况下，主题系统包括适用于纯化来自宿主细胞培养基的目标酶和/或BIA产物的纯化部件，所述目标酶和/或BIA产物在宿主细胞培养基中产生。纯化部件可包括可用于纯化发酵产生的目标酶和/或BIA产物的任何适宜的手段，包括但不限于，二氧化硅色谱法、反相色谱法、离子交换色谱法、HIC色谱法、尺寸排阻色谱法、液体萃取和pH萃取方法。在一些情况下，主题系统提供在将一种或多种起始化合物输入至所述系统之后目标酶和/或BIA发酵产物的产生和分离。
给出以下实施例以便为本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且既不旨在限制发明人所认为的他们的发明的范围，也不旨在表示以下实验是所进行的全部或仅有的实验。尽管已经努力确保所用数字(例如，量、温度等)的精确性，但是应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，并且压力为大气压或接近大气压。
酶列表的讨论
宿主细胞可被工程化为包括提供目标BIA和/或目标酶的产生的一个或多个修饰(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或甚至更多个修饰)。表2提供了可受到一个或多个修饰的作用以便在工程化的宿主细胞中提供目标BIA和/或目标酶的产生的示例性基因的列表。
如表2中提供的基因的修饰可用于由工程化的宿主细胞产生目标BIA，所述工程化的宿主细胞被供应有包含生长所需的基本营养素的培养基。这种基本培养基可包含碳源、氮源、氨基酸、维生素和盐。例如，如表2中提供的基因的修饰可用于由进料糖的工程化的宿主细胞产生目标BIA。另外，如表2中提供的一个或多个基因的修饰可用于加强可被工程化用于药物产生的宿主细胞的生物合成过程。
另外，使用这些修饰在工程化的宿主细胞中提供目标BIA和/或目标酶的产生仅由可由所述基因产生的酶的鉴定不容易明白。具体地讲，在宿主细胞(诸如如本文所述的酵母细胞)中已经重构的合成途径包括在自然界中不在单个生物体内一起起作用的多种酶。另外，本文讨论的一些酶在它们的天然背景中不作用于BIA生物合成。此外，本文所述的一些酶不被进化成在特定的宿主细胞诸如酵母细胞中行使功能，并且不被进化成一起行使功能。在这些情况下，将不太清楚酶是否将在宿主细胞诸如酵母中的合成BIA途径的背景中表现出足够的活性，以具有通过所述途径的足够通量以产生下游BIA最终产物。
例如，植物酶通常难以在异源微生物宿主诸如酵母中功能性地表达。在许多情况下，酶可能错误折叠、不正确定位在宿主细胞内和/或不正确加工。酵母与植物之间的蛋白质翻译和加工差异可能导致这些酶在酵母宿主中表现出基本上降低至不可检测的活性。通常针对内膜定位的酶诸如细胞色素P450(其强烈表示于BIA途径中)产生这些质疑。甚至降低的酶活性也可对工程化酵母产生复杂的BIA提出基本的挑战，因为其在每个步骤均需要足够的活性以确保期望BIA产物的高水平积聚。
另外，在一些宿主细胞诸如酵母中存在内源酶/途径，它们可作用于BIA途径中的许多早期前体(即，从酪氨酸至去甲乌药碱的中间体)上，因此可能不容易明白由于这些竞争性内源途径，是否将存在通过异源途径的足够通量，以实现大量的BIA产生。例如，酵母中的Erlich途径(Hazelwood等人2008.Appl.Environ.Microbiol.74:2259-66；Larroy等人2003.Chem.Biol.Interact.143-144:229-38；Larroy等人2002.Eur.J.Biochem.269:5738-45)是作用于将早期BIA途径中的许多中间体转化成非期望产物并且使来自合成途径的通量转向的主内源途径。
此外，如本文所讨论和如表2中所提供的许多酶在天然植物宿主中可在非常特定的调控策略下行使功能，包括部分调控，其在转移至异源酵母宿主中时可能丢失。此外，与酵母细胞相比，植物提供了非常难的生化环境，酶在所述生化环境下进化以行使功能，所述环境包括pH、氧化还原态，以及底物、共底物、辅酶和辅因子可利用性。鉴于天然宿主与异源酵母宿主之间的生化环境和调控策略差异，不太清楚酶在处于酵母环境的背景中时是否将表现出显著活性，并且还不清楚它们是否将一起作用以将简单的前体诸如糖引导成复杂的BIA化合物。在酵母宿主中保持酶的活性是尤其重要的，因为许多途径具有许多反应步骤(>10)，由此使得如果这些步骤无效，那么将不可预期期望下游产物的积聚。
此外，在天然植物宿主中，这些途径中的相关代谢物可遍布不同的细胞和组织类型定位。在若干实例中，存在可专用于生物合成的细胞类型和可被合成用于代谢物积聚的细胞类型。当在异源酵母宿主内表达所述途径时，可能失去这种类型的细胞特化，并且这种类型的细胞特化在控制这些代谢物对细胞的毒性方面可能起到重要作用。因此，不太清楚酵母是否可成功地被工程化以生物合成和积聚这些代谢物，而不受到这些化合物的毒性的伤害。
例如，在天然植物宿主中，酶BBE被报道为具有动态亚细胞定位。具体地讲，酶BBE初始起始于ER中，然后被分选至液泡(Bird和Facchini.2001.Planta.213:888-97)。已经提出，植物中BBE的ER相关(Alcantara等人2005.Plant Physiol.138:173-83)提供对于BBE活性最佳的碱性pH(pH～8.8)(Ziegler和Facchini.2008.Annu.Rev.Plant Biol.59:735-69)。又如，有证据显示，血根碱生物合成发生在植物细胞内的特化囊泡中(Amann等人1986.Planta.167:310-20)，但是仅一些中间体积聚在囊泡中。这可能发生，以便将它们与其他酶活性和/或毒性作用隔离开。
又如，吗啡喃途径分支中的生物合成酶全部定位至韧皮部，这是植物中的维管组织的一部分。在该问题中，途径酶可在两种细胞类型之间进一步划分：所有植物共有的筛管成分；以及乳汁管，它是仅存在于某些植物中的特化细胞类型，其制备特化的次生代谢物。上游酶(即，从NCS一直至SalAT)主要在筛管成分中，并且下游酶(即，T6ODM、COR、CODM)大部分处于乳汁管中(Onoyovwe等人2013.Plant Cell.25:4110-22)。另外，据发现，诺斯卡品生物合成途径中的最终步骤发生在乳汁管中(Chen和Facchini.2014.Plant J.77:173-84)。这种区域化被认为对于通过分离或运输中间体来调控生物合成、提供最佳pH、增强辅因子供应是高度重要的，但是罂粟乳汁管微环境的性质尚在研究中(Ziegler和Facchini.2008.Annu.Rev.Plant Biol.59:735-69)。此外，据推测，几种酶可充当多酶复合物或植物次生代谢常见的代谢通道(Kempe等人2009.Phytochemistry.70:579-89；Allen等人2004.Nat.Biotechnol.22:1559-66)。当将来自不同宿主的生物合成酶组合和/或将所述生物合成酶在异源酵母细胞中重组表达时，这些复合物或通道是否将像它们在天然宿主中那样形成尚不清楚。在另一个实例中，在日本黄连中，小檗碱在根组织中生物合成，然后通过特化的ATP结合盒转运蛋白的作用积聚在根茎内(Shitan等人2013.Phytochemistry.91:109-16)。在鸦片罂粟中，吗啡喃生物碱积聚在乳汁(乳汁管细胞的细胞质)内(Martin等人1967.Biochemistry.6:2355-63)。
此外，即使不考虑这些，还存在的问题是用于本文所述的途径中的若干步骤的植物酶尚未得到表征。例如，酪氨酸到早期苄基异喹啉生物碱支架去甲乌药碱的转化尚未得到表征。另外，如本文所述，(S)-牛心果碱到(R)-牛心果碱的转化仅仅近期才得到表征。因此，对于本文所述的途径中的若干步骤，通过使在自然界中通常不一起发生的酶活性一起用于BIA的生物合成或由基因组序列信息鉴定新酶活性以用于重构的途径来产生另选的生物合成方案。
例如，可通过组合至少5种哺乳动物酶和1种细菌酶来实现酪氨酸到多巴胺的两步转化，所述至少5种哺乳动物酶和1种细菌酶并非天然地一起存在并且未进化成在此途径的背景中或与植物酶一起行使功能。在这些情况下，可能不太清楚是否可利用这些酶进行它们在自然界中并未进化进行的化合物的生物合成，并且它们在异源微生物宿主的背景中和此途径中是否将等效地行使功能也不太清楚。又如，负责(S)-牛心果碱到(R)-牛心果碱的转化的酶是未知的。如本文所讨论的新型酶可在酵母和在合成BIA途径的背景中进行这一差向异构化反应。由于这代表了新酶发现，因而尚不清楚是否可在这一途径的背景中使用这种酶进行那些BIA化合物的合成。
下文讨论了作为修饰对象以便产生目标BIA和/或目标酶的基因的实例。另外，在示出用于生成目标BIA和/或目标酶的途径的一系列附图的上下文中对所述基因进行了讨论。
[TLK1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶转酮醇酶的表达。转酮醇酶由TKL1基因编码。在实例中，转酮醇酶催化果糖-6-磷酸+甘油醛-3-磷酸木酮糖-5-磷酸+赤藓糖-4-磷酸的反应，参考图2。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括TKL1基因的组成型过表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控TKL1基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入TKL1基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于TKL1基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。TKL1基因可来源于酿酒酵母或另外的物种。在一些实例中，TKL1基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[ZWF1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶由ZWF1基因编码。在实例中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸→6-磷酸葡糖酸内酯的反应，参考图2。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中缺失ZWF1基因的编码区。另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成使ZWF1基因的功能性失效，诸如通过引入失活突变。
[ARO4]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶的表达。DAHP合酶由ARO4基因编码。在实例中，DAHP合酶催化赤藓糖-4-磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸→DAHP的反应，参考图2。工程化的宿主细胞可修饰ARO4基因以并入一个或多个反馈抑制减轻突变。具体地讲，反馈抑制减轻突变(例如，ARO4FBR)可作为对原始基因座处的天然ARO4基因的定向突变，作为在单独基因座处的基因整合引入的另一个拷贝，或作为附加型载体(诸如2-μm或着丝粒质粒)上的另一个拷贝并入。突变ARO4FBR中的标识“FBR”称为反馈抗性突变体和突变。DAHP合酶的反馈抑制拷贝可在天然酵母转录调控下，诸如当工程化的宿主细胞为酵母细胞时。另选地，可通过将DAHP合酶的反馈抑制拷贝置于合成启动子的控制下，在蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控的情况下向工程化的宿主细胞中引入DAHP合酶的所述拷贝。在一些情况下，ARO4基因可来源于酿酒酵母。在一些情况下，ARO4基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。ARO4基因的修饰的实例包括反馈抑制抗性突变、K229L或Q166K。
[ARO7]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶分支酸变位酶的表达。分支酸变位酶由ARO7基因编码。在实例中，分支酸变位酶催化分支酸酯→预苯酸酯的反应，参考图2。工程化的宿主细胞可修饰ARO7基因以并入一个或多个反馈抑制减轻突变。具体地讲，反馈抑制减轻突变(例如，ARO7FBR)可作为对原始基因座处的天然ARO7基因的定向突变，作为在单独基因座处的基因整合引入的另一个拷贝，或作为附加型载体(诸如2-μm或着丝粒质粒)上的另一个拷贝并入。突变ARO7FBR中的标识“FBR”称为反馈抗性突变体和突变。分支酸变位酶的反馈抑制拷贝可在天然酵母转录调控下，诸如当工程化的宿主细胞为酵母细胞时。另选地，可通过将分支酸变位酶的反馈抑制拷贝置于合成启动子的控制下，在蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控的情况下向工程化的宿主细胞中引入分支酸变位酶的所述拷贝。在一些情况下，ARO7基因可来源于酿酒酵母。在一些情况下，ARO7基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。ARO7基因的修饰的实例包括反馈抑制抗性突变或T226I。
[ARO10]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶苯丙酮酸脱羧酶的表达。苯丙酮酸脱羧酶由ARO10基因编码。在实例中，苯丙酮酸脱羧酶催化羟苯基丙酮酸酯→4-羟苯基乙酸酯(4HPA)的反应，参考图2。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括ARO10基因的组成型过表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控ARO10基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入ARO10基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于ARO10基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。ARO10基因可来源于酿酒酵母或另外的物种。在一些实例中，ARO10基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[ADH2-7、SFA1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变醇脱氢酶的表达。醇脱氢酶可由ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7和SFA1基因中的一个或多个编码。在实例中，醇脱氢酶催化4HPA→酪醇的反应。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中缺失ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7和SFA1基因中的一个或多个的编码区。另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成使ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7和SFA1基因中的一个或多个的功能性失效，诸如通过引入失活突变。
[ALD2-6]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变醛氧化酶的表达。醛氧化酶可由ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6基因中的一个或多个编码。在实例中，醛氧化酶催化4HPA→羟基苯乙酸的反应。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中缺失ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6基因中的一个或多个的编码区。另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成使ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6基因中的一个或多个的功能性失效，诸如通过引入失活突变。
[ARO9]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶芳族转氨酶的表达。芳族转氨酶由ARO9基因编码。在实例中，芳族转氨酶催化羟苯基丙酮酸酯+谷氨酸酯→酪氨酸+α-酮戊二酸酯的反应，参考图2。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括ARO9基因的组成型过表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控ARO9基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入ARO9基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于ARO9基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。ARO9基因可来源于酿酒酵母或另外的物种。在一些实例中，ARO9基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[TYR]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶酪氨酸酶的表达。酪氨酸酶由TYR基因编码。在实例中，酪氨酸酶催化酪氨酸→L-DOPA的反应，参考图2。在其他实例中，酪氨酸酶催化L-DOPA→多巴醌的反应。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括TYR基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控TYR基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入TYR基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于TYR基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。TYR基因可来源于青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)或另外的物种。在一些实例中，TYR基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[TyrH]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶酪氨酸羟化酶的表达。酪氨酸羟化酶由TyrH基因编码。在实例中，酪氨酸羟化酶催化酪氨酸→L-DOPA的反应，参考图2和5。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括TyrH基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控TyrH基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入TyrH基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于TyrH基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。TyrH基因可来源于智人、褐家鼠、小家鼠或另外的物种。在一些实例中，TyrH基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[DODC]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶L-DOPA脱羧酶的表达。L-DOPA脱羧酶由DODC基因编码。在实例中，L-DOPA脱羧酶催化L-DOPA→多巴胺的反应，参考图2和5。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括DODC基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控DODC基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入DODC基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于DODC基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。DODC基因可来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、褐家鼠或另外的物种。在一些实例中，DODC基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[TYDC]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶酪氨酸/DOPA脱羧酶的表达。酪氨酸/DOPA脱羧酶由TYDC基因编码。在实例中，酪氨酸/DOPA脱羧酶催化L-DOPA→多巴胺的反应，参考图2。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括TYDC基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控TYDC基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入TYDC基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于TYDC基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。TYDC基因可来源于罂粟或另外的物种。在一些实例中，TYDC基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[MAO]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶单胺氧化酶的表达。单胺氧化酶由MAO基因编码。在实例中，单胺氧化酶催化多巴胺→3,4-DHPA的反应，参考图2。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括MAO基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控MAO基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入MAO基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于MAO基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，MAO基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。MAO基因可来源于大肠杆菌、智人、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)或另外的物种。在一些实例中，MAO基因可与天然存在的基因具有77％的相似性。
[NCS]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶去甲乌药碱合酶的表达。去甲乌药碱合酶由NCS基因编码。在实例中，去甲乌药碱合酶催化4HPA+多巴胺→(S)-去甲乌药碱的反应，参考图5。具体地讲，图5示出根据本发明的实施方案，用于通过去甲乌药碱将L-酪氨酸转化成牛心果碱的生物合成方案。图5提供了酶TyrH，酪氨酸羟化酶；DODC，DOPA脱羧酶；NCS，去甲乌药碱合酶，如本文所论述；6OMT，6-O-甲基转移酶；CNMT，乌药碱N-甲基转移酶；CYP80B1，细胞色素P450 80B1；CPR，细胞色素P450NADPH还原酶；4’OMT，3’羟基-N-甲基乌药碱4’-O-甲基转移酶的使用。L-DOPA，L-3,4-二羟基苯丙氨酸；以及4-HPA，4-羟基苯乙醛。在图5所示的酶中，4-HPA和L-酪氨酸在酵母中天然合成。所示出的所有其他代谢物不在酵母中天然产生。另外，尽管TyrH被描绘为催化L-酪氨酸到L-DOPA的转化，也可使用其他酶进行这一步骤，如说明书中所描述。例如，也可使用酪氨酸酶进行L-酪氨酸到L-DOPA的转化。此外，也可使用其他酶诸如细胞色素P450氧化酶进行L-酪氨酸到L-DOPA的转化。此类酶可在包括L-DOPA和L-酪氨酸的相关BIA前体化合物上表现出氧化酶活性。
另外，去甲乌药碱合酶催化3,4-DHPA+多巴胺→(S)-全去甲劳丹碱的反应，参考图6。具体地讲，图6示出根据本发明的实施方案，用于通过全去甲劳丹碱将L-酪氨酸转化成牛心果碱的生物合成方案。图6提供了酶TyrH，酪氨酸羟化酶；DODC，DOPA脱羧酶；maoA，单胺氧化酶；NCS，去甲乌药碱合酶；6OMT，6-O-甲基转移酶；CNMT，乌药碱N-甲基转移酶；4’OMT，3’羟基-N-甲基乌药碱4’-O-甲基转移酶的使用。L-DOPA，L-3,4-二羟基苯丙氨酸；以及3,4-DHPA，3,4-二羟基苯乙醛。在图6所示的酶中，L-酪氨酸在酵母中天然合成。图6所示的其他代谢物不在酵母中天然产生。
工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括NCS基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控NCS基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入NCS基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于NCS基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。另外，去甲乌药碱合酶可具有N末端截短。在一些情况下，NCS基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。NCS基因可来源于日本黄连、罂粟、大红罂粟、黄唐松草、岩黄连(Corydalis saxicola)或另外的物种。在一些实例中，NCS基因可与天然存在的基因具有80％的相似性。
[6OMT]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶去甲乌药碱6-O-甲基转移酶的表达。去甲乌药碱6-O-甲基转移酶由6OMT基因编码。在一些实例中，去甲乌药碱6-O-甲基转移酶催化去甲乌药碱→乌药碱的反应，参考图5。在其他实例中，去甲乌药碱6-O-甲基转移酶催化全去甲劳丹碱→3’羟基乌药碱的反应，以及本文详述的其他反应，诸如图6中提供的那些。另外，工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括6OMT基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控6OMT基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入6OMT基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于6OMT基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。6OMT基因可来源于罂粟、黄唐松草、日本黄连或另外的物种。在一些实例中，6OMT基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[CNMT]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶乌药碱-N-甲基转移酶的表达。乌药碱-N-甲基转移酶由CNMT基因编码。在一些实例中，乌药碱-N-甲基转移酶催化乌药碱→N-甲基乌药碱的反应，参考图5。在其他实例中，乌药碱-N-甲基转移酶可催化3’羟基乌药碱→3’羟基-N-甲基乌药碱的反应。在其他实例中，乌药碱-N-甲基转移酶可催化本文详述的其他反应，诸如图6中提供的那些。另外，工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括CNMT基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控CNMT基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入CNMT基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CNMT基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。CNMT基因可来源于罂粟、黄唐松草、日本黄连或另外的物种。在一些实例中，CNMT基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[4’OMT]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶4’-O-甲基转移酶的表达。4’-O-甲基转移酶由4’OMT基因编码。在一些实例中，4’-O-甲基转移酶催化3’-羟基-N-甲基乌药碱→牛心果碱的反应，参考图5。在其他实例中，4’-O-甲基转移酶催化本文详述的其他反应，诸如图6中提供的那些。另外，工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括4’OMT基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控4’OMT基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入4’OMT基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于4’OMT基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。4’OMT基因可来源于罂粟、黄唐松草、日本黄连或另外的物种。在一些实例中，4’OMT基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[CYP80B1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶细胞色素P450 80B1的表达。细胞色素P450 80B1由CYP80B1基因编码。在实例中，细胞色素P450 80B1催化N-甲基乌药碱→3’-羟基-N-甲基乌药碱的反应，参考图5。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括细胞色素P450 80B1基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控细胞色素P450 80B1基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入细胞色素P450 80B1基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于细胞色素P450 80B1基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，CYP80B1基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。细胞色素P450 80B1基因可来源于罂粟、花菱草、黄唐松草或另外的物种。在一些实例中，P450 80B1基因可与天然存在的基因具有77％的相似性。
[FOL2]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶GTP环化水解酶的表达。GTP环化水解酶由FOL2基因编码。在一些实例中，GTP环化水解酶催化GTP→二氢新蝶呤三磷酸的反应，参考图1。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括FOL2基因的组成型过表达。工程化的宿主细胞也可被修饰成包括天然调控。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控FOL2基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入FOL2基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于FOL2基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。FOL2基因可来源于酿酒酵母、智人、小家鼠或另外的物种。在一些实例中，FOL2基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[PTPS]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶6-丙酮酰四氢生物蝶呤(PTP)合酶的表达。丙酮酰四氢生物蝶呤合酶由PTPS基因编码。在一些实例中，6-丙酮酰四氢生物蝶呤合酶催化二氢新蝶呤三磷酸→PTP的反应，参考图1。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括PTPS基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控PTPS基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入PTPS基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于PTPS基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，PTPS基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。PTPS基因可来源于褐家鼠、智人、小家鼠或另外的物种。在一些实例中，PTPS基因可与天然存在的基因具有80％的相似性。
[SepR]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶墨蝶呤还原酶的表达。墨蝶呤还原酶由SepR基因编码。在一些实例中，墨蝶呤还原酶催化PTP→BH4的反应，参考图1。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括SepR基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控SepR基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入SepR基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于SepR基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，SepR基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。SepR基因可来源于褐家鼠、智人、小家鼠或另外的物种。在一些实例中，SepR基因可与天然存在的基因具有72％的相似性。
[PCD]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶4a-羟基四氢生物蝶呤(蝶呤-4α-甲醇胺)脱水酶的表达。4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶由PCD基因编码。在一些实例中，4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶催化4a-羟基四氢生物蝶呤→H2O+醌型二氢蝶啶的反应，参考图1。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括PCD基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控PCD基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入PCD基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于PCD基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，PCD基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。PCD基因可来源于褐家鼠、智人、小家鼠或另外的物种。在一些实例中，PCD基因可与天然存在的基因具有79％的相似性。
[QDHPR]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶醌型二氢蝶啶还原酶的表达。醌型二氢蝶啶还原酶由QDHPR基因编码。在一些实例中，醌型二氢蝶啶还原酶催化醌型二氢蝶啶→BH4的反应，参考图1。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括QDHPR基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控QDHPR基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入QDHPR基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于QDHPR基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，QDHPR基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。QDHPR基因可来源于褐家鼠、智人、小家鼠或另外的物种。在一些实例中，QDHPR基因可与天然存在的基因具有75％的相似性。
[DHFR]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶二氢叶酸还原酶的表达。二氢叶酸还原酶由DHFR基因编码。在一些实例中，二氢叶酸还原酶催化7,8-二氢生物蝶呤(BH2)→5,6,7,8-四氢生物蝶呤(BH4)的反应，参考图1。该反应可用于回收BH4作为共底物，以用于将酪氨酸转化成L-DOPA，如图5中所示。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括DHFR基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控DHFR基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入DHFR基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于DHFR基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，DHFR基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。DHFR基因可来源于褐家鼠、智人或另外的物种。在一些实例中，DHFR基因可与天然存在的基因具有77％的相似性。
[CYP-COR]如上文关于差向异构化1-BIA所论述的，工程化的宿主细胞可改变BIA差向异构酶的表达。BIA差向异构酶由CYP-COR基因(例如，CYP82Y2-COR基因)编码。在一些实例中，CYP-COR也可称为DRS-DRR。在一些实例中，BIA差向异构酶催化(S)-1-BIA→(R)-1-BIA的转化，参考图7。具体地讲，图7示出根据本发明的实施方案，用于将L-酪氨酸转化成吗啡喃生物碱的生物合成方案。图7提供了酶CPR，细胞色素P450还原酶；CYP-COR，细胞色素P450CYP82Y1-可待因酮还原酶样融合物；SalSyn，沙罗泰里啶合酶；SalR，沙罗泰里啶还原酶；SalAT，沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶；T6ODM，蒂巴因6-O-脱甲基酶；COR，可待因酮还原酶；以及CODM，可待因-O-脱甲基酶的使用。
工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括CYP-COR基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控CYP-COR基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入CYP-COR基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CYP-COR基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。CYP-COR基因可来源于大红罂粟、罂粟、渥美罂粟、白屈菜或另外的物种。在一些实例中，CYP-COR基因可与天然存在的基因具有77％的相似性。
[CPR]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶细胞色素P450还原酶的表达。细胞色素P450还原酶由CPR基因编码。在一些实例中，细胞色素P450还原酶催化(R)-牛心果碱→沙罗泰里啶的反应，参考图7。另外，细胞色素P450还原酶催化其他反应，诸如整篇申请的附图中所述的那些。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括CPR基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控CPR基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入CPR基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CPR基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。CPR基因可来源于花菱草、罂粟、智人、酿酒酵母、拟南芥或另外的物种。在一些实例中，CPR基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[SalSyn]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶沙罗泰里啶合酶的表达。沙罗泰里啶合酶由SalSyn基因编码。在一些实例中，沙罗泰里啶合酶催化(R)-牛心果碱→沙罗泰里啶的反应，参考图7。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括SalSyn基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控SalSyn基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入SalSyn基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于SalSyn基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，SalSyn基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。在一些实例中，SalSyn可以在N末端处进行修饰。SalSyn基因可来源于罂粟、罂粟属物种、白屈菜或另外的物种。在一些实例中，SalSyn基因可与天然存在的基因具有78％的相似性。
[SalR]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶沙罗泰里啶还原酶的表达。沙罗泰里啶还原酶由SalR基因编码。在一些实例中，沙罗泰里啶还原酶可逆地催化沙罗泰里啶醇→沙罗泰里啶的反应，参考图7。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括SalR基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控SalR基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入SalR基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于SalR基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，SalR基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。SalR基因可来源于罂粟、大红罂粟、罂粟属物种、白屈菜或另外的物种。在一些实例中，SalR基因可与天然存在的基因具有80-100％的相似性。
[SalAT]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶乙酰-CoA:沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶的表达。乙酰-CoA:沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶由SalAT基因编码。在一些实例中，乙酰-CoA:沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶催化乙酰-CoA+沙罗泰里啶醇→CoA+7-O-乙酰基沙罗泰里啶醇的反应，参考图7。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括SalAT基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控SalAT基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入SalAT基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于SalAT基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，SalAT基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。SalAT基因可来源于罂粟、大红罂粟、鬼罂粟(Papaver orientale)、罂粟属物种或另外的物种。在一些实例中，SalAT基因可与天然存在的基因具有77-80％的相似性。
[T6ODM]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶蒂巴因6-O-脱甲基酶的表达。蒂巴因6-O-脱甲基酶由T6ODM基因编码。在一些实例中，蒂巴因6-O-脱甲基酶催化蒂巴因→尼奥品酮的反应，参考图7。一旦已经产生尼奥品酮，尼奥品酮可转化成可待因酮。尼奥品酮→可待因酮的转化可自发发生。另选地，尼奥品酮→可待因酮的转化可由于催化反应而发生。在其他实例中，T6ODM酶可催化除蒂巴因之外的底物的O-脱甲基化。例如，T6ODM可使东罂粟碱O-脱甲基化，产生吗啡酮。另选地，T6ODM可催化1-苄基异喹啉、原小檗碱或原阿片碱种类之内的BIA(诸如分别为罂粟碱、坎那定和别隐品碱)的O-脱甲基化。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括T6ODM基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控T6ODM基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入T6ODM基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于T6ODM基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，T6ODM基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。T6ODM基因可来源于罂粟或另外的物种。在一些实例中，T6ODM基因可与天然存在的基因具有76.2％的相似性。
[COR]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶可待因酮还原酶的表达。可待因酮还原酶由COR基因编码。在一些实例中，可待因酮还原酶催化可待因酮至可待因的反应，参考图7。在一些情况下，可待因酮还原酶可催化尼奥品酮至尼奥品的反应。在其他实例中，COR可催化其他吗啡喃的还原，包括氢可酮→二氢可待因、14-羟基可待因酮→14-羟基可待因，以及氢吗啡酮→二氢吗啡。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括COR基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控COR基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入COR基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于COR基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，COR基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。另外或另选地，COR基因可通过添加针对线粒体、液泡、内质网或其组合的靶序列进行修饰。COR基因可来源于罂粟或另外的物种。在一些实例中，COR基因可与天然存在的基因具有76-78％的相似性。在实例中，COR基因可与天然存在的基因具有76.8％、77.0％、77.3％或77.7％的相似性。
[CODM]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶可待因O-脱甲基酶的表达。可待因O-脱甲基酶由CODM基因编码。在一些实例中，可待因O-脱甲基酶催化可待因至吗啡的反应，参考图7。可待因O-脱甲基酶还可催化尼奥品至新吗啡的反应。可待因O-脱甲基酶还可催化蒂巴因至东罂粟碱的反应。在其他实例中，CODM可催化1-苄基异喹啉、阿朴啡和原小檗碱种类之内的BIA(诸如分别为牛心果碱、异可利定和金黄紫堇碱)的O-脱甲基化。在其他实例中，CODM酶可催化O,O-脱亚甲基化反应，以裂解原阿片碱中的亚甲基二氧桥结构。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括CODM基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控CODM基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入CODM基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CODM基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，CODM基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。另外或另选地，CODM基因可通过添加针对线粒体的靶序列进行修饰。CODM基因可来源于罂粟、罂粟属物种或另外的物种。在一些实例中，CODM基因可与天然存在的基因具有75％的相似性。在实例中，CODM基因可与天然存在的基因具有75.2％的相似性。
[BBE]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶小檗碱桥酶的表达。小檗碱桥酶由BBE基因编码。在一些实例中，小檗碱桥酶催化(S)-牛心果碱→(S)-金黄紫堇碱的反应，参考图8。图8示出根据本发明的实施方案，用于将L-酪氨酸转化成原小蘖碱生物碱的生物合成方案。具体地讲，图8提供了酶BBE，小檗碱桥酶；S9OMT，金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶；CAS，坎那定合酶；CPR，细胞色素P450还原酶；以及STOX，四氢原小檗碱氧化酶的使用。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括BBE基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控BBE基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入BBE基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于BBE基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。BBE基因可来源于罂粟、蓟罂粟、花菱草、伏牛花、黄唐松草粉绿亚种(Thalictrum flavum subsp.glaucum)、日本黄连、罂粟属物种或另外的物种。在一些实例中，BBE基因可与天然存在的基因具有99％的相似性。
[S9OMT]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶S-腺苷-L-甲硫氨酸:(S)-金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶的表达。S-腺苷-L-甲硫氨酸:(S)-金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶由S9OMT基因编码。在一些实例中，S-腺苷-L-甲硫氨酸:(S)-金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶催化S-腺苷-L-甲硫氨酸+(S)-金黄紫堇碱→S-腺苷-L-高半胱氨酸+(S)-四氢非洲防己碱的反应，参考图8。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括S9OMT基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控S9OMT基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入S9OMT基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于S9OMT基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，S9OMT基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。S9OMT基因可来源于黄唐松草粉绿亚种、日本黄连、黄连、罂粟、唐松草属物种、黄连属物种、罂粟属物种或另外的物种。在一些实例中，S9OMT基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。在一些实例中，S9OMT基因可与天然存在的基因具有80％的相似性。
[CAS]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶(S)-坎那定合酶的表达。(S)-坎那定合酶由CAS基因编码。在一些实例中，(S)-坎那定合酶催化(S)-四氢非洲防己碱→(S)-坎那定的反应，参考图8。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中表达CAS基因。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括CAS基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控CAS基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入CAS基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CAS基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。CAS基因可来源于黄唐松草粉绿亚种、日本黄连、唐松草属物种、黄连属物种或另外的物种。在一些实例中，CAS基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。
[STOX]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶(S)-四氢原小檗碱氧化酶的表达。(S)-四氢原小檗碱氧化酶由STOX基因编码。在一些实例中，(S)-四氢原小檗碱氧化酶催化(S)-四氢小檗碱+2O2→小檗碱+2H2O2的反应，参考图8。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括STOX基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控STOX基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入STOX基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于STOX基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些实例中，STOX可以在N末端处进行修饰。在一些情况下，STOX基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。STOX基因可来源于金花小檗(Berberis wilsonae)、日本黄连、小檗属物种、黄连属物种或另外的物种。在一些实例中，STOX基因可与天然存在的基因具有78％的相似性。
[TNMT]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶四氢原小檗碱-N-甲基转移酶的表达。四氢原小檗碱-N-甲基转移酶由TNMT基因编码。在一些实例中，四氢原小檗碱-N-甲基转移酶催化坎那定→N-甲基坎那定的反应，参考图9。图9示出根据本发明的实施方案，用于将L-酪氨酸转化成诺斯卡品、类诺斯卡品和苯酞异喹啉的生物合成方案。具体地讲，图9提供了酶BBE，小檗碱桥酶；S9OMT，金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶；CAS，坎那定合酶；CPR，细胞色素P450还原酶；TNMT，四氢原小檗碱顺式-N-甲基转移酶；CYP82Y1，N-甲基坎那定1-羟化酶；CYP82X2，1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶；AT1，1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O-乙酰转移酶；CYP82X1，4'-O-脱甲基-3-O-乙酰罂粟奥辛合酶；CXE1，那可汀半缩醛合酶；NOS(或SDR1)，诺斯卡品合酶；MT2，那可托灵-4'-O-甲基转移酶1；MT3，那可托灵-4'-O-甲基转移酶2；以及6OMT，6-O-甲基转移酶的使用。
在其他实例中，四氢原小檗碱-N-甲基转移酶催化刺罂粟碱→顺式-N-甲基刺罂粟碱的反应，参考图10。图10示出根据本发明的实施方案，用于将L-酪氨酸转化成血根碱和苯菲啶生物碱的生物合成方案。具体地讲，图10提供了酶BBE，小檗碱桥酶；CFS，碎叶紫堇碱合酶；STS，刺罂粟碱合酶；TNMT，四氢小檗碱N-甲基转移酶；MSH，顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶；P6H，原阿片碱6-羟化酶；以及DBOX，二氢苯菲啶氧化酶的使用。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括TNMT基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控TNMT基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入TNMT基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于TNMT基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，TNMT基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。TNMT基因可来源于罂粟、花菱草、大红罂粟、蓟罂粟或另外的物种。在一些实例中，TNMT基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。在实例中，TNMT基因可与天然存在的基因具有81％的相似性。
[CYP82Y1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶N-甲基坎那定1-羟化酶的表达。N-甲基坎那定1-羟化酶由CYP82Y1基因编码。在一些实例中，N-甲基坎那定1-羟化酶催化N-甲基坎那定→1-羟基-N-甲基坎那定的反应，参考图9。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括CYP82Y1基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控CYP82Y1基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入CYP82Y1基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CYP82Y1基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，CYP82Y1基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。在一些实例中，CYP82Y1可以在N末端处进行修饰。CYP82Y1基因可来源于罂粟、罂粟属物种、沙生车前(Plantago arenaria)、Rauwolfia heterophylla、覃状山缘草(Adlumiafungosa)、金印草(Hydrastis canadensis)、异叶罂粟(Stylomecon heterophylla)、角茴香属(Hypecoum)或另外的物种。在一些实例中，CYP82Y1基因可与天然存在的基因具有70-78％的相似性。
[CYP82X2]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶的表达。1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶由CYP82X2基因编码。在一些实例中，1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶催化1-羟基-N-甲基坎那定→1-羟基-N-甲基左旋蛇果黄堇碱(即1,13-二羟基-N-甲基坎那定)的反应，参考图9。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括CYP82X2基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控CYP82X2基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入CYP82X2基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CYP82X2基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，CYP82X2基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。在一些实例中，CYP82X2可以在N末端处进行修饰。CYP82X2基因可来源于罂粟、罂粟属物种、沙生车前、Rauwolfia heterophylla、覃状山缘草、金印草、异叶罂粟、扭果紫金龙(Dactylicapnostorulosa)、黄海罂粟(Glaucium flavum)、月桂小檗(Berberis laurina)、刺檗(B.Vulgaris)、紫堇属物种(Corydalis spp.)、球果紫堇属物种(Fumaria spp.)、紫金龙属物种(Dactylicapnos spp.)或另外的物种。在一些实例中，CYP82X2基因可与天然存在的基因具有70-77％的相似性。在其他实例中，CYP82X2基因可发生N末端工程化。在实例中，N末端工程化可包括N末端截短。
[CYP82X1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶的表达。4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶由CYP82X1基因编码。在一些实例中，4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶催化1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那定→4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛的反应，参考图9。另外，CYP82X1催化1-羟基-N-甲基坎那定→4’-O-脱甲基马克兰特醛的反应。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括CYP82X1基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控CYP82X1基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入CYP82X1基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CYP82X1基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，CYP82X1基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。在一些实例中，CYP82X1可以在N末端处进行修饰。CYP82X1基因可来源于罂粟、罂粟属物种、沙生车前、Rauwolfia heterophylla、覃状山缘草、金印草、异叶罂粟、角茴香属或另外的物种。在一些实例中，CYP82X1基因可与天然存在的基因具有71-77％的相似性。在其他实例中，CYP82X1基因可发生N末端工程化。在实例中，N末端工程化可包括N末端截短。
[CFS]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶碎叶紫堇碱合酶的表达。碎叶紫堇碱合酶由CFS基因编码。在实例中，碎叶紫堇碱合酶催化金黄紫堇碱→碎叶紫堇碱的反应，参考图10。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括CFS基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控CFS基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入CFS基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CFS基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。CFS基因可来源于罂粟、花菱草、蓟罂粟或另外的物种。在一些实例中，CFS基因可与天然存在的基因具有77％、78％或79％的相似性。另外，CFS基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。
[STS]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶刺罂粟碱合酶的表达。刺罂粟碱合酶由STS基因编码。在实例中，刺罂粟碱合酶催化碎叶紫堇碱→刺罂粟碱的反应，参考图10。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括STS基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控STS基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入STS基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于STS基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。STS基因可来源于罂粟、花菱草、蓟罂粟或另外的物种。在一些实例中，STS基因可与天然存在的基因具有76％、78％或79％的相似性。另外，STS基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。
[MSH]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶的表达。顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶由MSH基因编码。在实例中，顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶催化顺式-N-甲基刺罂粟碱→原阿片碱的反应，参考图10。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括MSH基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控MSH基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入MSH基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于MSH基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。MSH基因可来源于罂粟或另外的物种。在一些实例中，MSH基因可与天然存在的基因具有79％的相似性。另外，MSH基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。
[P6H]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶原阿片碱-6-羟化酶的表达。原阿片碱-6-羟化酶由P6H基因编码。在实例中，原阿片碱-6-羟化酶催化原阿片碱→6-羟基原阿片碱的反应，参考图10。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括P6H基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控P6H基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入P6H基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CFS基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。P6H基因可来源于罂粟、花菱草或另外的物种。在一些实例中，P6H基因可与天然存在的基因具有79％的相似性。另外，P6H基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。
[DBOX]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶二氢苯菲啶氧化酶的表达。二氢苯菲啶氧化酶由DBOX基因编码。在实例中，二氢苯菲啶氧化酶催化二氢血根碱→血根碱的反应，参考图10。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括DBOX基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控DBOX基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入DBOX基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于DBOX基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。DBOX基因可来源于罂粟或另外的物种。在一些实例中，DBOX基因可与天然存在的基因具有100％的相似性。另外，DBOX基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。
[AT1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶的表达。1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶由AT1基因编码。在一些实例中，1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶催化1,13-二羟基-N-甲基坎那定→1-羟基-13-O-乙酰基-N-甲基坎那定的反应，参考图11A。图11A示出根据本发明的实施方案，用于将坎那定转化成诺斯卡品的生物合成方案。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括AT1基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控AT1基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入AT1基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于AT1基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，AT1基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。AT1基因可来源于罂粟、罂粟属物种、沙生车前、Rauwolfia heterophylla、覃状山缘草、金印草、异叶罂粟、细果角茴香(Hypecoum leptocarpum)、扭果紫金龙、黄海罂粟、月桂小檗、刺檗、紫堇属物种、球果紫堇属物种、紫金龙属物种或另外的物种。在一些实例中，AT1基因可与天然存在的基因具有81％的相似性。
[CXE1或CXE2]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶那可汀半缩醛合酶的表达。那可汀半缩醛合酶由CXE1基因编码。由CXE2基因编码的酶也可用作那可汀半缩醛合酶。在一些实例中，那可汀半缩醛合酶催化4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛→那可托灵半缩醛和3-O-乙酰基罂粟奥辛→那可汀半缩醛的反应，参考FIG.11A。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括CXE1或CXE2基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控CXE1或CXE2基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入CXE1或CXE2基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CXE1或CXE2基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，CXE1或CXE2基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。CXE1或CXE2基因可来源于罂粟、罂粟属物种、沙生车前、Rauwolfiaheterophylla、覃状山缘草、金印草、异叶罂粟、细果角茴香、扭果紫金龙、黄海罂粟、月桂小檗、刺檗、紫堇属物种、球果紫堇属物种、紫金龙属物种或另外的物种。在一些实例中，CXE1基因或CXE2基因可与天然存在的基因具有78％的相似性。
[SDR1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶诺斯卡品合酶的表达。诺斯卡品合酶由SDR1基因编码。在一些实例中，诺斯卡品合酶催化那可托灵半缩醛→那可托灵的反应，参考图11A。另外，诺斯卡品合酶催化那可汀半缩醛→诺斯卡品的反应。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括SDR1基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控SDR1基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入SDR1基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于SDR1基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，SDR1基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。SDR1基因可来源于罂粟、罂粟属物种、沙生车前、Rauwolfia heterophylla、覃状山缘草、金印草、异叶罂粟、细果角茴香、扭果紫金龙、黄海罂粟、月桂小檗、刺檗、紫堇属物种、球果紫堇属物种、紫金龙属物种或另外的物种。在一些实例中，SDR1基因可与天然存在的基因具有79％的相似性。
[MT2和MT3]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶那可托灵4’-O-甲基化酶的表达。那可托灵4’-O-甲基化酶是由MT2和MT3基因编码的O-甲基转移酶单体形成的异二聚体。在一些实例中，那可托灵4’-O-甲基化酶催化那可托灵→诺斯卡品的反应，参考图11A。另外，那可托灵4’-O-甲基化酶催化那可托灵半缩醛→那可汀半缩醛和4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛→3-O-乙酰基罂粟奥辛的反应。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括MT2和MT3基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控MT2和MT3基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入MT2和MT3基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于MT2和MT3基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，MT2和MT3基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。MT2和MT3基因可来源于罂粟、罂粟属物种、小花球果紫堇(Fumaria parviflora)、对叶车前(Plantago arenaria)、Rauwolfia heterophylla或另外的物种。在一些实例中，MT2和MT3基因可分别与天然存在的基因具有80％和79％的相似性。
[morA]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶吗啡脱氢酶的表达。吗啡脱氢酶由morA基因编码。在一些实例中，吗啡脱氢酶催化吗啡→吗啡酮的反应，参考图11B。在其他实例中，吗啡脱氢酶催化可待因酮→可待因的反应，也参考图11B。图11B示出根据本发明的实施方案，用于产生半合成的阿片类物质的生物合成方案。具体地讲，图11B示出通过并入morA吗啡脱氢酶和morB吗啡还原酶，蒂巴因在酵母中的转化延长。
工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括morA基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控morA基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入morA基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于morA基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，morA基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。morA基因可来源于恶臭假单胞菌或另外的物种。在一些实例中，morA基因可与天然存在的基因具有73.7％的相似性。
[morB]在一些实例中，工程化的宿主细胞可改变酶吗啡酮还原酶的表达。吗啡酮还原酶由morB基因编码。在一些实例中，吗啡酮还原酶催化可待因酮→氢可酮的反应，参考图11B。在其他实例中，吗啡酮还原酶催化吗啡酮→氢吗啡酮的反应，还参考图11B。在其他实例中，吗啡酮还原酶催化14-羟基可待因酮→羟考酮的反应。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括morB基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控morB基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入morB基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于morB基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，morB基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。morB基因可来源于恶臭假单胞菌或另外的物种。在一些实例中，morB基因可与天然存在的基因具有67.2％的相似性。
[CYP80A1]在一些实例中，工程化的宿主细胞可表达酶黄芦木碱合酶。黄芦木碱合酶由细胞色素P450酶80A1(CYP80A1)的基因编码。在一些实例中，CYP80A1催化(S)-N-甲基乌药碱+(R)-N-甲基乌药碱→黄芦木碱的反应。在其他实例中，CYP80A1催化(R)-N-甲基乌药碱+(R)-N-甲基乌药碱→guattegaumerine的反应。在其他实例中，CYP80A1催化(R)-N-甲基乌药碱+(S)-乌药碱→2’去甲黄芦木碱的反应。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括CYP80A1基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控CYP80A1基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入CYP80A1基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于CYP80A1基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，CYP80A1基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。CYP80A1基因可来源于伏牛花或另外的物种。在一些实例中，CYP80A1基因可与天然存在的基因具有76％的相似性。
[PODA]在一些实例中，工程化的宿主细胞可表达酶原阿片碱O-脱烷基酶。原阿片碱O-脱烷基酶由基因PODA编码。在一些实例中，PODA催化原小檗碱类和原阿片碱类诸如坎那定、刺罂粟碱、小檗碱、隐品碱、别隐品碱和原阿片碱的O,O-脱亚甲基化。在一些实例中，PODA催化包括四氢罂粟碱、四氢非洲防己碱和隐品碱的BIA的O-脱甲基化。工程化的宿主细胞可被修饰成在工程化的宿主细胞中包括PODA基因的组成型表达。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成合成性地调控PODA基因在工程化的宿主细胞中的表达。在实例中，工程化的宿主细胞可被修饰成并入PODA基因的一个拷贝、多个拷贝或另外的拷贝。另外或另选地，工程化的宿主细胞可被修饰成包括用于PODA基因在工程化的宿主细胞内的过表达的强启动子元件的引入。在一些情况下，PODA基因可经密码子优化以在酿酒酵母中表达。PODA基因可来源于罂粟或其他物种。在一些实例中，PODA基因可与天然存在的基因具有70-100％的相似性。
前述基因的实例可在宿主细胞中由多种不同的平台表达，包括质粒(2μ，ARS/CEN)、YAC或基因组。此外，前述基因序列的实例可以是天然的或经密码子优化以在期望的异源宿主(例如，酿酒酵母)中表达。
实施例
以下实施例出于说明本发明的各种实施方案的目的给出并且不旨在以任何方式限制本发明。在指出时，表达构建体应理解为并入合适的启动子、基因和终止子，即使未指明所使用的准确终止子序列。本发明的实施例，连同本文所述的方法一起目前代表优选实施方案，是示例性的，并且不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员会发现涵盖在如通过权力要求的范围所限定的本发明的精神之内的其中的变化及其他用途。
实施例1：酪氨酸羟化酶突变体改善工程化酵母菌株中的去甲乌药碱产生
将来自褐家鼠的酪氨酸羟化酶进行酵母密码子优化、合成并且克隆到低拷贝质粒中。通过定点诱变生成单突变体(W166Y、E332D、S40D和R37ER38E)、双突变体(W166Y和E332D、W166Y和S40D、W166Y和R37ER38E)以及一种三突变体(W166Y、R37ER38E和E332D)。每种TyrH突变体由具有GPD启动子的低拷贝质粒在酵母菌株中表达，所述酵母菌株包含对中心代谢的以下突变(如美国临时专利申请序列号61/899,496中所述)：ARO4FBR、ΔZWF1和GPD-TKL1启动子替换。此外，所述菌株表达来自恶臭假单胞菌的DOPA脱羧酶(DODC)的染色体整合的拷贝；来自褐家鼠的生成共底物四氢生物蝶呤(丙酮酰四氢蝶呤合酶，PTPS；墨蝶呤还原酶，SepR；蝶呤4a-甲醇胺脱水酶，PCD；二氢蝶啶还原酶，QDHPR)的四种染色体整合的基因；以及由具有GPD启动子的低拷贝质粒表达的来自日本黄连的去甲乌药碱合酶(NCS)。使携带TyrH突变体的菌株在缺乏酪氨酸的具有2％右旋糖的选择性限定培养基(YNB)中生长96小时，并且通过LC-MS/MS以MRM模式利用272m/z至107m/z的跃迁测量培养基中去甲乌药碱的产生。图12示出该测定的结果并且展示了在与野生型TyrH进行比较时，TyrH突变体可使去甲乌药碱产生改善多至9倍。因而，图12示出根据本发明的实施方案，改善在工程化的酵母菌株中由糖产生去甲乌药碱的酪氨酸羟化酶突变体。
实施例2：酪氨酸羟化酶突变体改善工程化酵母菌株中的牛心果碱产生
将来自褐家鼠的酪氨酸羟化酶进行酵母密码子优化、合成并且克隆到低拷贝质粒中。通过定点诱变生成单突变体(W166Y、E332D、S40D和R37ER38E)、双突变体(W166Y和E332D、W166Y和S40D、W166Y和R37ER38E)以及一种三突变体(W166Y、R37ER38E和E332D)。每种TyrH突变体由具有GPD启动子的低拷贝质粒在酵母菌株中表达，所述酵母菌株包含对中心代谢的以下突变(如美国临时专利申请序列号61/899,496中所述)：ARO4FBR、ΔZWF1和GPD-TKL1启动子替换。此外，所述菌株表达来自恶臭假单胞菌的DOPA脱羧酶(DODC)的染色体整合的拷贝；来自褐家鼠的生成共底物四氢生物蝶呤(丙酮酰四氢蝶呤合酶，PTPS；墨蝶呤还原酶，SepR；蝶呤4a-甲醇胺脱水酶，PCD；二氢蝶啶还原酶，QDHPR)的四种染色体整合的基因；由具有GPD启动子的低拷贝质粒表达的来自日本黄连的去甲乌药碱合酶(NCS)；以及用于由去甲乌药碱生物合成牛心果碱的五种基因(罂粟6-O-甲基转移酶，Ps6OMT；罂粟乌药碱N-甲基转移酶，PsCNMT；花菱草细胞色素P450 80B1，EcCYP80B1；罂粟细胞色素P450NADPH还原酶，PsCPR；以及罂粟3’羟基-N-甲基乌药碱4’-O-甲基转移酶，Ps4’OMT)。使携带TyrH突变体的菌株在缺乏酪氨酸的具有2％右旋糖的选择性限定培养基(YNB)中生长96小时，并且通过LC-MS/MS以MRM模式利用330m/z至137m/z的跃迁测量培养基中的牛心果碱的产生。图13示出该测定的结果并且展示了在与野生型TyrH进行比较时，TyrH突变体可使牛心果碱产生改善多至5倍。因而，图13示出根据本发明的实施方案，改善在工程化的酵母菌株中由糖产生牛心果碱的酪氨酸羟化酶突变体。
实施例3：DHFR的表达改善工程化酵母菌株中的酪氨酸羟化酶活性
将来自褐家鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)进行酵母密码子优化、合成并且克隆到GPD启动子控制下的低拷贝质粒中。DHFR与野生型RnTyrH(具有GPD启动子的低拷贝质粒)在酵母菌株中共表达，所述酵母菌株包含对中心代谢的以下突变(如美国临时专利申请序列号61/899,496中所述)：ARO4FBR、ΔZWF1和GPD-TKL1启动子替换。此外，所述菌株表达来自褐家鼠的生成共底物四氢生物蝶呤(丙酮酰四氢蝶呤合酶，PTPS；墨蝶呤还原酶，SepR；蝶呤4a-甲醇胺脱水酶，PCD；二氢蝶啶还原酶，QDHPR)的四种染色体整合的基因。使表达DHFR和野生型RnTyrH的菌株在缺乏酪氨酸的具有2％右旋糖的选择性限定培养基(YNB)中生长96小时，并且通过LC-MS/MS以MRM模式利用198m/z至152m/z的跃迁测量培养基中L-DOPA的产生。DHFR与野生型RnTyrH的表达使L-DOPA产生增加1.8倍，如图14中所示。因而，图14示出根据本发明的实施方案，改善工程化的酵母菌株中通过酪氨酸羟化酶实现的L-DOPA产生的二氢叶酸还原酶(DHFR)的共表达。
实施例4：向生长培养基中添加抗氧化剂改善工程化的酵母菌株中的酪氨酸羟化酶活性
使酵母菌株在缺乏酪氨酸的具有2％半乳糖和2mM抗坏血酸的选择性限定培养基(YNB)中生长96小时，所述酵母菌株包含对中心代谢的以下突变(如美国临时专利申请序列号61/899,496中所述)：ARO4FBR、ΔZWF1和GPD-TKL1启动子替换并且由GPD启动子控制下的低拷贝质粒表达来自褐家鼠的生成共底物四氢生物蝶呤(丙酮酰四氢蝶呤合酶，PTPS；墨蝶呤还原酶，SepR；蝶呤4a-甲醇胺脱水酶，PCD；二氢蝶啶还原酶，QDHPR)的四种染色体整合的基因以及野生型RnTyrH。
通过LC-MS/MS以MRM模式，利用198m/z至152m/z的跃迁测量培养基中L-DOPA的产生。2mM抗坏血酸的添加使利用野生型RnTyrH的L-DOPA产生改善1.8倍。此外，利用LC-MS/MS以MRM模式，利用以下跃迁测量BH4中间体浓度：B，238m/z至178m/z；BH2，240m/z至165m/z；以及BH4，242m/z至166m/z。抗坏血酸的添加还增加培养基中的BH4，这表明防止了BH4氧化成BH2。
因此，图15示出根据本发明的实施方案，(A)向培养基中添加抗氧化剂改善工程化的酵母菌株中通过酪氨酸羟化酶实现的L-DOPA产生，以及(B)向培养基中添加增加BH4水平的抗氧化剂。具体地讲，图15A示出野生型RnTyrH(由GPD启动子控制下的低拷贝质粒表达)在酵母菌株中表达，所述酵母菌株包含对中心代谢的以下突变(如美国临时专利申请序列号61/899,496中所述)：ARO4FBR、ΔZWF1和GPD-TKL1启动子替换。此外，所述菌株表达来自褐家鼠的生成共底物四氢生物蝶呤(丙酮酰四氢蝶呤合酶，PTPS；墨蝶呤还原酶，SepR；蝶呤4a-甲醇胺脱水酶，PCD；二氢蝶啶还原酶，QDHPR)的四种染色体整合的基因。使表达野生型RnTyrH的菌株在缺乏酪氨酸的具有2％右旋糖、具有和不具有2mM抗坏血酸(aa)的选择性限定培养基(YNB)中生长96小时。通过LC-MS/MS以MRM模式，利用198m/z至152m/z的跃迁测量培养基中L-DOPA的产生。另外，图15B示出，在图15A中所述的相同菌株中，利用LC-MS/MS以MRM模式，利用以下跃迁：BH4，242m/z至166m/z测量菌株在具有和不具有2mM抗坏血酸(aa)的情况下生长的培养基中的BH4中间体的浓度。
实施例5：被工程化为产生bisBIA黄芦木碱的酵母菌株
图16示出根据本发明的实施方案，(A)用于将L-酪氨酸转化成bisBIA的生物合成方案，以及(B)被工程化为生物合成bisBIA的酵母菌株。具体地讲，图16示出(A)用于产生bisBIA黄芦木碱和guattegaumerine的途径。图16提供了酶ARO9，芳族转氨酶；ARO10，苯丙酮酸脱羧酶；TyrH，酪氨酸羟化酶；DODC，DOPA脱羧酶；NCS，去甲乌药碱合酶；6OMT，6-O-甲基转移酶；CNMT，乌药碱N-甲基转移酶；CYP80A1，细胞色素P450 80A1；CPR，细胞色素P450NADPH还原酶的使用。在图16提供的代谢物中，4-HPA、4-HPP和L-酪氨酸在酵母中天然合成。图16所示的其他代谢物不在酵母中天然产生。
在本发明的实例中，产生bisBIA(诸如使用(A)所示的途径生成的那些)的产bisBIA酵母菌株通过将单个构建体整合到基因座YDR514C中而被工程化。另外，图16提供了(B)被工程化为合成bisBIA的示例性酵母菌株。在单个基因座(YDR514C)处将Ps6OMT、PsCNMT、PsCPR和BsCYP80A1整合到酵母基因组中。每种酶由组成型启动子表达。基因表达盒的布置和取向在示意图中通过箭头指示。这些菌株将(R)-和(S)-去甲乌药碱转化成乌药碱，接着转化成N-甲基乌药碱。在一个实例中，菌株可接着缀合一个分子的(R)-N-甲基乌药碱和一个分子的(S)-N-甲基乌药碱以形成黄芦木碱。在另一个实例中，菌株可缀合两个分子的(R)-N-甲基乌药碱，以形成guattegaumerine。在另一个实例中，菌株可缀合一个分子的(R)-N-甲基乌药碱和一个分子的(S)-乌药碱以形成2’-去甲黄芦木碱。在另一个实施方案中，菌株可被工程化为由L-酪氨酸供应前体(R)-和(S)-去甲乌药碱，如图5中所提供。
构建体包括作为它们的天然植物核苷酸序列表达的罂粟酶6OMT和CNMT的表达盒。来自罂粟的第三种酶CPR经密码子优化以在酵母中表达。PsCPR支持第四种酶伏牛花CYP80A1的活性，所述伏牛花CYP80A1也经密码子优化以在酵母中表达。表达盒各自包括唯一的酵母组成型启动子和终止子。最终，整合构建体包括侧接通过Cre重组酶切除的loxP位点的LEU2选择标记。
将表达Ps6OMT、PsCNMT、BsCYP80A1和PsCPR的酵母菌株在选择培养基中在30℃下振荡培养16小时。通过离心收获细胞并且将其重悬于400μL破碎缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 7.0；10％甘油；14mM 2-巯基乙醇；蛋白酶抑制剂混合液)中。通过添加玻璃珠并且涡旋物理破坏细胞。移除液体并且添加以下底物和辅因子以起始反应：1mM(R,S)-去甲乌药碱、10mM S-腺苷甲硫氨酸、25mM NADPH。将粗细胞裂解物在30℃下孵育4小时，然后通过1:1添加用0.1％乙酸酸化的乙醇淬灭。将反应物离心并且通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析上清液以通过它们的保留和质量/电荷检测bisBIA产物黄芦木碱、guattegaumerine和2’-去甲黄芦木碱。
实施例6.差向异构酶的鉴定
为了鉴定适用于进行本文所公开的方法的差向异构化反应的差向异构酶，在公共可用的植物转录组中的单个开放阅读框(CYP-COR)中鉴定细胞色素P450氧化酶82Y1样结构域和可待因酮还原酶样结构域。CYP-COR融合物使用blastn由1000Plants Project(Matasci等人2014.Gigascience.3:17)和PhytoMetaSyn(Facchini等人2012.TrendsBiotechnol.30:127-31；Xiao等人2013.J.Biotechnol.166:122-34)转录组的BLAST搜索鉴定，其中查询为导致牛心果碱积聚的先前公布的COR沉默的VIGS构建体的序列(Wijekoon和Facchini.2012.Plant J.69:1052-63)。一旦观察到一个CYP-COR融合物序列作为命中，就翻译所述序列并且使用氨基酸序列作为查询，以使用tblastn进行两个数据库的二次搜索。由数据库鉴定的CYP-COR融合酶的系统发育树提供于图17。基于生物信息学搜索由The1000Plants Project和PhytoMetaSyn转录组数据库鉴定序列。另外，示例性氨基酸序列提供于图4中，如上文所讨论的。另外，表1列出了针对这种CYP-COR酶鉴定的氨基酸序列的各种实例，它们来自各种植物，包括罂粟(鸦片罂粟)、渥美罂粟(特洛伊罂粟(poppy ofTroy))、大红罂粟(伊朗罂粟(Iranian poppy))，以及白屈菜(白屈菜(greatercelandine))。
实施例7.工程化的非植物宿主细胞中(S)-牛心果碱至(R)-牛心果碱的差向异构化
将非植物宿主细胞工程化为异源表达本文所述的酶。例如，将酵母菌株(酿酒酵母)工程化为异源表达实施例6中所述的所鉴定的差向异构酶并且在此微生物宿主的背景中验证它们的功能。将部分氨基酸序列pbr.PBRST1PF_4328和pbr.PBRST1PF_89405的酵母密码子优化的DNA编码序列与SSDU-2015634(表1)的氨基酸1-40的酵母密码子优化的编码序列框内合成，以分别生成CYP-COR_4328和CYP-COR_89405。将这些CYP-COR编码序列克隆到携带URA3选择标记的低拷贝质粒中并且由TDH3启动子表达。将质粒转化到携带整合到染色体中的细胞色素P450还原酶(PTEF1-ATR1或PTEF1-PsCPRv2)的表达盒的酵母菌株中。使携带两种质粒的这些酵母菌株在具有适当的缺陷性溶液(drop out solution)(-Ura-Trp)的合成完全培养基中生长。向酵母菌株进料(S)-牛心果碱并且在生长72小时之后通过LC-MS/MS分析对BIA代谢物进行分析。
实施例8.在工程化的酵母细胞中由(S)-牛心果碱产生沙罗泰里啶
将酵母菌株(酿酒酵母)工程化为异源表达实施例6中所述的所鉴定的差向异构酶并且在此微生物宿主的背景中验证它们的功能。将部分氨基酸序列pbr.PBRST1PF_4328和pbr.PBRST1PF_89405的酵母密码子优化的DNA编码序列与SSDU-2015634(表1)的氨基酸1-40的酵母密码子优化的编码序列框内合成，以分别生成CYP-COR_4328和CYP-COR_89405。将这些CYP-COR编码序列克隆到携带URA3选择标记的低拷贝质粒中并且由TDH3启动子表达。将沙罗泰里啶合酶(SalSyn)编码序列克隆到携带TRP1选择标记的低拷贝质粒中并且由TDH3启动子表达。将质粒转化到携带整合到染色体中的细胞色素P450还原酶(PTEF1-ATR1或PTEF1-PsCPRv2)的表达盒的酵母菌株中。使携带两种质粒的这些酵母菌株在具有适当的缺陷性溶液(drop out solution)(-Ura-Trp)的合成完全培养基中生长。向酵母菌株进料(S)-牛心果碱并且在生长72小时之后通过LC-MS/MS分析对BIA代谢物进行分析。分析表明，工程化的酵母细胞能够将(S)-牛心果碱转化成(R)-牛心果碱，(R)-牛心果碱接着受到沙罗泰里啶合酶的作用形成沙罗泰里啶，一种4环原吗啡喃生物碱(图7、图18)。沙罗泰里啶合酶先前已经显示出作用于(R)-牛心果碱并且对(S)-牛心果碱没有可观察到的活性(Gesell等人2009.J.Biol.Chem.284:24432-42)。
如图7所示，CYP-COR催化(S)-牛心果碱到(R)-牛心果碱的转化，(R)-牛心果碱接着受到沙罗泰里啶合酶的作用以制备原吗啡喃生物碱沙罗泰里啶。图18示出(A)示出两种差向异构酶变体(CYP-COR_89405、CYP-COR_4328)的牛心果碱和沙罗泰里啶以及标准品的色谱图迹线。图18还示出(B)重新作图以展示与标准品的共洗脱的(A)中的沙罗泰里啶的相同色谱图迹线。在此实验中，酵母包含具有URA3和TRP1选择性标记、TDH3启动子以及CYP-COR和SalSyn编码序列的两种低拷贝CEN/ARS质粒。使酵母从新鲜转化的菌落开始在3mL选择培养基中生长过夜、反向稀释到3.5mL培养基中至OD 0.8，生长7小时，沉淀，接着重悬于具有100μM(S)-牛心果碱(Specs)的pH 7.4HEPES缓冲液中。在30℃的旋转器上16小时之后，将酵母沉淀并且通过LC-MS/MS分析缓冲液上清液。每条迹线来自代表2个样品的单个样品。将峰归一化，以使所有色谱图中最大的峰为100％。
实施例9.在工程化的非植物宿主细胞中由外消旋的全去甲劳丹碱产生(R)-牛心果碱
将酵母菌株(酿酒酵母)工程化为异源表达实施例6中所述的所鉴定的差向异构酶并且在此微生物宿主的背景中验证它们的功能。将实施例7中所述的经酵母密码子优化的DNA编码序列CYP-COR_89405克隆到携带URA3选择标记的低拷贝质粒中并且由TDH3启动子表达。将此质粒转化到携带整合到染色体中的细胞色素P450还原酶(PTEF1-ATR1或PTEF1-PsCPRv2)和三种甲基转移酶(罂粟去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶、乌药碱N-甲基转移酶和3’-羟基-N-甲基乌药碱4’-O-甲基转移酶，均由PTEF1表达)的表达盒的酵母菌株中。使携带该质粒的这种酵母菌株在具有适当的缺陷性溶液(-Ura)的合成完全培养基中生长。向酵母菌株进料外消旋的全去甲劳丹碱并且在生长72小时之后通过LC-MS/MS分析对BIA代谢物进行分析。对于手性表征，通过沉淀5mL酵母培养物由酵母培养基浓缩牛心果碱并且向4mL上清液中添加120mg XAD-4树脂，在室温下在旋转机上孵育过夜，并且用0.5mL甲醇洗脱。通过反相HPLC(Pursuit XRs-C18，5μm，50mm×10mm)，利用等度15％甲醇与0.1％甲酸经6.5min将浓缩物分级，其中流速为5mL/min并且进样体积为40-50μL。在大约4.5min时收集基于峰的级分。将级分汇集、冷冻干燥并且重悬于0.5mL异丙醇中。根据浓度，将0.5-5μL进样到手性柱(Phenomenex Lux纤维素-1，3μm，150mm x 2mm)上，利用等度的72％N-己烷、28％异丙醇、0.1％二乙胺分离，其中流速为0.3mL/min，并且通过MS和250nm UV进行检测。通过Agilent6320Ion Trap质谱仪，利用ESI源气体温度350℃、10L/min的气体流、喷雾器压力40PSI以及m/z 330.1的隔离(宽度为1.0)进行MS检测。将牛心果碱峰的保留时间与真正的(S)-牛心果碱和(R)-牛心果碱标准品的保留时间进行比较。分析表明，包含CYP-COR质粒的工程化的酵母细胞能够将外消旋的全去甲劳丹碱转化成(R)-牛心果碱，而具有空质粒的工程化的酵母细胞仅产生(S)-牛心果碱(图19)。
实施例10：沙罗泰里啶合酶的蛋白质工程化当在微生物宿主中表达时改善其加工和活性
异源蛋白质当在重组宿主中表达时可能不正确加工，例如，植物蛋白，诸如在微生物产生宿主中表达的细胞色素P450酶。例如，将(R)-牛心果碱转化成沙罗泰里啶的沙罗泰里啶合酶当在酵母中异源表达时发生N-连接的糖基化(图20)。在沙罗泰里啶合酶上所观察到的N-连接的糖基化模式当酶在植物中表达时观察不到，并且指示了初生SalSyn转录物的不正确的N末端分选，这降低了酶在异源微生物宿主中的活性。因此，针对校正初生转录物的N末端分选从而去除N连接的糖基化模式的蛋白质工程化将导致沙罗泰里啶合酶在重组产生宿主中的活性得到改善。
例如，使用来自碎叶紫堇碱合酶(CFS)的N末端α-螺旋替换来自沙罗泰里啶合酶(SalSyn，图21)的N末端α-螺旋。这些融合物的接合点基于CFS和SalSyn的二级结构基序或基于CFS和SalSyn的氨基酸比对进行选择。通过用与另一个片段重叠的15-40个核苷酸扩增来自CFS的N末端片段和来自SalSyn的C末端片段，然后通过Gibson组装将它们与彼此以及载体主链组装以形成完整的融合物开放阅读框来克隆融合物(Gibson等人2009.NatMethods.6:343-5)。
又如，将来自沙罗泰里啶合酶的细胞色素P450结构域的编码序列直接置于其他稳定表达的细胞色素P450诸如BM3酶的P450编码区中。例如，沙罗泰里啶合酶的保守细胞色素P450结构域和来自巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)P450单加氧酶CYP102A1(BM3，(Michener和Smolke.2012.Metab.Eng.14:306-16))的工程化变体的细胞色素P450结构域通过NCBI保守结构域搜索进行鉴定。设计引物将BM3的前几个氨基酸的编码序列与沙罗泰里啶合酶的P450结构域的编码序列融合，之后将BM3结构域C末端的编码序列与P450结构域融合。与之前一样，通过Gibson组装来组装此构建体。
通过蛋白质印迹分析来分析工程化的沙罗泰里啶合酶蛋白融合物，以确认在酵母中的全长表达以及N-连接的糖基化模式的改变或消除(图20)。将沙罗泰里啶合酶和蛋白质融合物用人流感血凝素(HA)表位在C末端标记并且克隆到适用于酵母和植物表达的表达质粒中。对于酵母，将酶编码序列克隆到携带URA3选择标记的低拷贝酵母/大肠杆菌穿梭载体中并且由TDH3启动子表达。对于植物，通过根癌农杆菌浸润将序列克隆到具有卡那霉素抗性和花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的大肠杆菌/根癌农杆菌穿梭载体中以用于瞬时植物表达，所述花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子具有侧接的来自豇豆花叶病毒RNA-2的5’和3’-非翻译区。被工程化为表达沙罗泰里啶合酶的酵母表现出指示了N-连接的糖基化的带型。通过在糖基化位点上进行定点诱变，我们确认了这种图谱是由N-连接的糖基化造成的。相比之下，该酶的植物表达不导致指示N-连接的糖基化的带型，如图20的(A)中所见。虽然N-连接的糖基化位点未修饰，但是工程化的沙罗泰里啶合酶蛋白融合物当在酵母中表达时不被N-糖基化，如图20的(B)中所见。通过蛋白质印迹，我们展示了酵母表达的融合酶呈现为单个条带，类似于对于植物表达的亲本酶所观察到的表达，这表明了导致N-连接的糖基化的在酵母中的初生蛋白质错误加工通过工程化的融合物修复。
针对当在酵母中异源表达时改善的酶活性对工程化的沙罗泰里啶合酶蛋白融合物进行分析。将沙罗泰里啶合酶和工程化融合物的编码序列克隆到携带URA3选择标记的低拷贝质粒中并且由TDH3启动子表达。酵母具有整合到TRP1基因座中的PTEF1-PsCPRv2并且包含具有URA3选择标记和沙罗泰里啶合酶编码序列以及TDH3启动子的单个低拷贝质粒。使酵母从新鲜转化的菌落开始在1mL选择培养基(-Ura)中生长过夜并且反向稀释1:20到具有10μM(R)-牛心果碱(Toronto Research Chemicals)的96孔板中的0.5mL选择培养基中。在振荡培养箱中72-96小时之后，将酵母沉淀并且通过LC-MS/MS分析培养基上清液。分析表明，当在酵母中异源表达时，相对于野生型序列，工程化的沙罗泰里啶合酶表现出改善的活性(图22)。
图22示出根据本发明的实施方案，改善在酵母中的活性的沙罗泰里啶合酶密码子优化和工程化融合物。如图22中所见，黑色条柱指示沙罗泰里啶合酶的天然野生型序列PsCYP719B1。具有黑色边界的灰色条柱为来自罂粟的经酵母密码子优化的变体和来自大红罂粟的新鉴定的序列。有斜线图案的条柱指示基于大红罂粟序列的具有最大改善的工程化融合物。误差线指示至少两个生物学重复的范围。实质上，来自大红罂粟、罂粟或渥美罂粟(或相关植物)的沙罗泰里啶合酶的合成的密码子优化的和/或蛋白质工程化的变体可用于这些工程化菌株中。
工程化的沙罗泰里啶合酶蛋白融合物可在生物合成途径的背景中使用，以增加下游苄基异喹啉生物碱产物的产生。在一个实例中，将酵母工程化为异源表达编码工程化的沙罗泰里啶合酶融合物、大红罂粟沙罗泰里啶还原酶以及罂粟沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶的经酵母密码子优化的基因。将三个表达盒(PTDH3-D94yPsSS、PTPI1-yPbSalR、PTEF1-yPsSalAT)组装到具有TRP1区段标记的酵母人工染色体(YAC)中。将YAC置于携带整合到染色体中的细胞色素P450还原酶(PTEF1-ATR1或PTEF1-yPsCPRv2)的表达盒的酵母中。使酵母菌株在具有适当的缺陷性溶液(-Trp)的合成完全培养基中生长并且进料(R)-牛心果碱。在生长96小时后通过LC-MS/MS分析对BIA代谢物进行分析。分析表明用工程化的沙罗泰里啶合酶和其他途径酶工程化的酵母菌株产生吗啡喃生物碱蒂巴因，如图23的(A)中所示。
因此，图23示出(A)根据本发明的实施方案，小规模成批发酵的LC-MS/MS分析，其中工程化酵母催化(R)-牛心果碱到蒂巴因的转化。如图23的(A)中所提供的，酵母菌株被工程化为具有整合到TRP1基因座中的PTEF1-ATR1表达盒并且包含单一酵母人工染色体，所述染色体具有TRP1选择标记和三个表达盒：PTDH3-yEcCFS1-83-yPsSS95-505、PTPI1-yPbSalR和PTEF1-yPsSalAT。使酵母从新鲜转化的菌落开始在3mL选择培养基中生长过夜并且反向稀释1:20到具有100μM(R)-牛心果碱(Toronto Research Chemicals)的培养管中的0.5mL选择培养基中(-Trp)。在振荡培养箱中72小时之后，将酵母沉淀并且通过LC-MS/MS分析培养基上清液。色谱图迹线显示出由此菌株产生的蒂巴因以及积聚的沙罗泰里啶醇和沙罗泰里啶，以及标准品。这些迹线代表了两个样品。
实施例11：下游吗啡喃分支中的酶的蛋白质工程化改善异源微生物宿主的吗啡喃产物的产生
在本发明的一个实施方案中，将途径酶工程化为表现出增加的活性，以增加目标BIA的产生。在该实施例中，通过用Mutazyme II(参见表6)扩增向特定途径酶的开放阅读框中引入突变。在扩增反应中包括足够的模板DNA，以产生每个基因1-4核苷酸取代的突变率。通过缺口修复直接在酵母中将诱变文库克隆到pYES1L载体中。在若干情况下，选择用于文库表达的酵母菌株包含生成诱变酶的底物的基因的整合拷贝。例如，将CODM变体的文库转化到具有T6ODM和COR1.3的整合拷贝的菌株中并且在培养基中进料蒂巴因。T6ODM和COR1.3在这些菌株中的表达确保了可待因和尼奥品将可用作各引入的CODM变体的底物。将各个菌落接种到96孔板中并且培养96小时，然后通过液相色谱-质谱(LC-MS)针对它们产物的产生进行测定。在CODM文库的实例中，所筛选的产物为吗啡和新吗啡。在每次筛选中，对具有增强的BIA产生的变体进行测序并且重新克隆以进行验证。表6包括通过筛选鉴定的在酵母中导致增加的BIA产生的突变的酶变体的汇总。
图24示出这些突变体中的一个的经过验证的增强活性的数据。具体地讲，图24示出根据本发明的实施方案，通过随机诱变和筛选生成在酵母中表现出增强活性的CODM酶变体。CODM变体的文库通过利用易错PCR诱变编码区生成。将通过该文库的筛选鉴定的变体CODMN35S,G335V重新克隆在携带T6ODM和COR1.3的整合拷贝的酵母菌株中并且在其中表达。将该菌株和另一种表达野生型CODM的对照菌株在具有1mM蒂巴因的液体培养基中培养。96小时后，针对CODM活性，通过LC-MS对培养基进行分析。变体CODMN35S,G335V产生比表达野生型CODM的菌株多1.4x的吗啡和多2.6x的新吗啡。
实施例12：用以改善异源微生物宿主的苄基异喹啉生物碱产生的表达和生长条件的优化
工程化的微生物宿主的苄基异喹啉生物碱产生可通过优化途径酶的表达和生长条件而进一步改善。在一个实例中，通过由一系列不同的启动子表达酶来改变沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶在酵母中的表达。将酵母工程化为由不同的启动子异源表达编码罂粟沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶的酵母密码子优化的基因(如图25的(A)中所提供的)。将两个表达盒(PTPI1-yPbSalR、PX-yPsSalAT)组装到具有TRP1区段标记的酵母人工染色体(YAC)中。将YAC置于酵母中并且使细胞在具有适当的缺陷性溶液(-Trp)的合成完全培养基中生长并且进料沙罗泰里啶。在生长72小时后通过LC-MS/MS分析对BIA代谢物进行分析。途径酶表达水平的优化可导致吗啡喃生物碱蒂巴因的产生增加(如图25的(A)中所提供的)。
菌株培养条件(包括但不限于糖源、生长温度和pH)的优化可用于增加工程化的酵母菌株的苄基异喹啉生物碱的产生(如图25的(B)和(C)中所提供的)。在一个实例中，改变pH来增加工程化的酵母菌株的蒂巴因产生。将两个表达盒(PTPI1-yPbSalR、PTEF1-yPsSalAT)组装到具有TRP1区段标记的酵母人工染色体(YAC)中。将YAC置于酵母中并且使细胞在具有适当的缺陷性溶液(-Trp)的合成完全培养基中生长，重悬于pH5.7-9的缓冲液中并且进料沙罗泰里啶。在孵育16小时后通过LC-MS/MS分析对BIA代谢物进行分析。4环原吗啡喃生物碱沙罗泰里啶醇和5环吗啡喃生物碱蒂巴因的水平随着pH的增加而增加(如图25的(B)中所提供的)。
在另一个实例中，改变温度、糖和培养基缓冲剂含量以增加工程化的酵母菌株的蒂巴因产生。将三个表达盒(PTDH3-D94yPsSS、PTPI1-yPbSalR、PTEF1-yPsSalAT)组装到具有TRP1区段标记的酵母人工染色体(YAC)中。将YAC置于携带整合到染色体中的细胞色素P450还原酶(PTEF1-ATR1或PTEF1-yPsCPRv2)的表达盒的酵母中。使酵母菌株在具有适当的缺陷性溶液(-Trp)的合成完全培养基中生长并且进料(R)-牛心果碱。在生长72小时后通过LC-MS/MS分析对BIA代谢物进行分析。分析表明，吗啡喃生物碱蒂巴因的微生物产生在某些培养条件下(30℃的具有右旋糖的缓冲培养基，如图25的(C)中所提供的)增加。
因此，图25示出根据本发明的实施方案，通过工程化酵母将(R)-牛心果碱转化成蒂巴因的发酵优化。(A)SalAT启动子变体的全细胞缓冲测定的LC-MS/MS分析；(B)在不同pH条件下生长的SalR和SalAT菌株的全细胞缓冲测定的LC-MS/MS分析；以及(C)糖源、生长温度和培养基缓冲剂含量的优化。(A)被工程化为包含具有TRP1选择标记和两个表达盒的单一酵母人工染色体的酵母菌株，所述表达盒为：具有变化的SalAT启动子的PTPI1-yPbSalR和PX-yPsSalAT。使酵母从新鲜转化的菌落开始在3mL选择培养基中生长过夜并且反向稀释1:20到具有100μM沙罗泰里啶(Specs)的培养管中的0.5mL培养基中。在振荡培养箱中72小时之后，将酵母沉淀并且通过LC-MS/MS分析培养基上清液。(B)被工程化为包含具有TRP1选择标记和两个表达盒的单一酵母人工染色体的酵母菌株，所述表达盒为：PTPI1-yPbSalR和PTEF1-yPsSalAT。使酵母从新鲜转化的菌落开始在3mL选择培养基中生长过夜，反向稀释到3.5mL培养基中至OD 0.8，生长7小时，沉淀，接着重悬于具有10μM沙罗泰里啶(Specs)的pH5.7的MOPS或pH 7、8或9的Tris缓冲液中。在30℃的旋转器上16小时之后，将酵母沉淀并且通过LC-MS/MS分析缓冲液上清液。误差线代表两个样品的范围。(C)糖源、生长温度和培养基缓冲剂含量的优化。在该实验中，酵母菌株被工程化为具有整合到TRP1基因座中的PTEF1-ATR1并且包含单一酵母人工染色体，所述染色体具有TRP1选择标记和三个表达盒：PTDH3-yEcCFS1-83-yPsSS95-505、PTPI1-yPbSalR和PTEF1-yPsSalAT。使酵母从新鲜转化的菌落开始在3mL选择培养基中生长过夜并且反向稀释1:20到具有100μM(R)-牛心果碱(TorontoResearch Chemicals)的培养管中的0.5mL培养基中。在振荡培养箱中72小时之后，将酵母沉淀并且通过LC-MS/MS分析培养基上清液。
实施例13：被工程化用于由早期1-苄基异喹啉生物碱支架产生蒂巴因的酵母
酵母菌株可被工程化用于由早期1-苄基异喹啉生物碱产生吗啡喃生物碱蒂巴因或衍生自蒂巴因的吗啡喃生物碱。例如，工程化的酵母菌株可由外消旋或(S)-去甲乌药碱或者外消旋或(S)-全去甲劳丹碱产生吗啡喃生物碱产物(图5、6、7以及图23的(B))。通过将三个或五个表达盒整合到酵母基因组中，酵母菌株被工程化为从(S)-去甲乌药碱或外消旋或(S)-全去甲劳丹碱生产(S)-牛心果碱。为了由外消旋或(S)-全去甲劳丹碱产生(S)-牛心果碱，整合的表达盒编码罂粟去甲乌药碱6-O-甲基转移酶(Ps6OMT，EC 2.1.1.128)、4’-O-甲基转移酶(Ps4’OMT，EC 2.1.1.116)以及乌药碱-N-甲基转移酶(CNMT，EC 2.1.1.140)，所述表达盒各自具有TEF1启动子(Hawkins和Smolke.2008.Nat.Chem.Biol.4:564-73)。为了由外消旋或(S)-去甲乌药碱产生(S)-牛心果碱，菌株还携带用于酵母密码子优化的花菱草N-甲基乌药碱3’-羟化酶(yEcCYP80B1，EC 1.14.13.71)和由TDH3或TEF1启动子表达的ATR1或yPsCPRv2细胞色素P450还原酶(CPR，EC 1.6.2.4)的整合的表达盒。这些菌株被进一步工程化为并入差向异构化催化酶(例如，CYP-COR)、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶和沙罗泰里啶醇乙酰转移酶，以将外消旋或(S)-去甲乌药碱或者外消旋或(S)-全去甲劳丹碱转化成吗啡喃生物碱蒂巴因，或衍生自蒂巴因的吗啡喃生物碱(图7)。作为差向异构化催化酶的表达的替代形式，6OMT、4’OMT、CNMT和/或CYP80B1可被工程化，使得由外消旋的去甲乌药碱或外消旋的全去甲劳丹碱产生外消旋的牛心果碱。
在一个实例中，酵母菌株被工程化为将外消旋的全去甲劳丹碱转化成蒂巴因。酵母菌株携带编码Ps6OMT、Ps4’OMT、CNMT和yPsCPRv2的整合的表达盒，所述表达盒各自具有TEF1启动子。在此菌株中将四个表达盒(PTDH3-yEcCFS1-83-yPsSS95-505、PTPI1-yPbSalR、PTEF1-yPsSalAT、PHXT7-CYP-COR_89405)组装到具有TRP1选择标记的酵母人工染色体(YAC)中。使携带YAC和整合的盒的酵母菌株在具有适当的缺陷性溶液(-Trp)和1mM外消旋的全去甲劳丹碱底物的合成完全培养基中生长。生长96小时后，通过LC-MS/MS分析针对BIA代谢物对培养基进行分析。检测到将近200nM蒂巴因(图23的(B))。其他工程化的沙罗泰里啶合酶变体也可用于此菌株(图22，实施例10)。
实施例14：被工程化用于由L-酪氨酸产生牛心果碱的平台酵母菌株
构建由L-酪氨酸产生关键分支点BIA中间体(S)-牛心果碱的平台酵母菌株(图5)。具体地讲，将四种多基因表达构建体整合到酵母菌株的基因组中。四种构建体的组成在图26中指出。每种构建体包括由强组成型启动子表达的4或5种基因。基因定位在每个基因座处作为包括启动子、基因开放阅读框和终止子的完整表达盒，如示意图上方的注释中所指明的。示意图通过代表给定基因的箭头的方向示出每个表达盒的取向。选择性标记在注释中是斜体的并且在示意图中通过灰色箭头表示。每个选择标记侧接loxP位点，以允许从基因座中移除标记。另外，每个构建体具有侧接loxP位点的选择性标记，以使通过Cre重组酶将其移除。
在第一整合构建体中，将来自褐家鼠的四个异源基因与G418选择标记(KanMX)一起整合到YBR197C基因座中。需要RnPTPS、RnSepR、RnPCD和RnQDHPR来由酵母内源性叶酸合成途径合成和再生四氢生物蝶呤(BH4)。每个基因经密码子优化以在酵母中表达。
在第二整合构建体中，将四个异源基因与HIS5选择标记一起整合到HIS3基因座中。褐家鼠酪氨酸羟化酶(RnTyrH)使用由先前的整合构建体生成的共底物BH4将酪氨酸转化成L-DOPA。RnTyrH基因可以是野生型或赋予增强活性的改善的突变体(例如，W166Y、R37E和R38E，实施例2)中的任一个。第二褐家鼠基因RnDHFR编码将二氢生物蝶呤(BH4的氧化产物)还原为BH4的酶，以此方式增加该共底物的可利用性。第三构建体中还包括来自恶臭假单胞菌的PpDODC，一种将L-DOPA转化成多巴胺的酶。第四种酶为来自日本黄连的CjNCS，其缩合4-HPA和多巴胺以制备去甲乌药碱。每个基因经密码子优化以在酵母中表达。
在第三整合构建体中，将来自植物的五种异源基因和LEU2选择标记整合到基因座YDR514C中。Ps6OMT、Ps4’OMT和PsCNMT为来自罂粟的甲基转移酶并且作为天然植物核苷酸序列表达。第四罂粟基因yPsCPRv2针对酵母进行密码子优化并且编码支持来自花菱草的细胞色素P450的活性的还原酶EcCYP80A1。EcCYP80A1作为其天然植物核苷酸序列表达。在此构建体中编码的酶进行两种O-甲基化、一种N-甲基化以及一种羟基化，以由先前的整合构建体产生的去甲乌药碱产生牛心果碱。
在最后的整合构建体中，将酿酒酵母内源性基因ARO4Q166K、ARO7T226I、TKL1和ARO10的另外拷贝与潮霉素抗性选择标记一起整合到ARO4基因座中。ARO4Q166K和ARO7T226I为ARO4和ARO10的反馈抗性突变体，相对于野生型序列而言，其各自编码单个碱基对取代。TKL1和ARO10与天然酵母基因相同，但是在强启动子后面表达。Aro4p和Aro7p为芳族氨基酸(包括酪氨酸)的生物合成中的酶。从这些酶中移除反馈抑制导致内源性酪氨酸生物合成的上调。Tkl1p的过表达使戊糖磷酸途径上调，从而导致酪氨酸的前体赤藓糖4-磷酸(E4P)的供应增强。Aro10p的过表达增加4-HPA的产生。
可用任何数目的所述四个表达盒构建平台酵母菌株。具体地讲，利用整合构建体1-4和整合构建体1-3构建平台酵母菌株。在其中不包括酪氨酸过量产生构建体(构建体4)的后一菌株中，可在培养基中供应另外的酪氨酸以支持牛心果碱的生物合成。可将另外的基因修饰并入平台菌株中，以支持下游BIA的产生和至BIA生物合成的增加的流量。
使酵母菌株在具有适当的氨基酸缺陷性溶液的合成完全培养基中在25和30℃下生长。在生长48和96小时之后通过LC-MS/MS分析对培养基上清液中的BIA代谢物进行分析。
实施例15：被工程化用于由L-酪氨酸产生蒂巴因和其他吗啡喃生物碱的酵母
酵母菌株可被工程化用于由早期前体诸如酪氨酸产生吗啡喃生物碱蒂巴因或衍生自蒂巴因的吗啡喃生物碱。例如，实施例14中所述的平台酵母菌株可进一步工程化以由L-酪氨酸产生吗啡喃生物碱产物(图7)。
将由L-酪氨酸产生(S)-牛心果碱的平台酵母菌株(参见实施例14中的描述)进一步工程化以并入差向易构化催化酶，诸如新鉴定的CYP-COR、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶以及沙罗泰里啶醇乙酰转移酶，以将生物合成的(S)-牛心果碱转化成吗啡喃生物碱蒂巴因或衍生自蒂巴因的吗啡喃生物碱(图7)。直接在平台酵母菌株中将三个表达盒(PTDH3-yEcCFS1-26-yPbSS33-504、PTPI1-yPbSalR、PTEF1-yPsSalAT)组装到具有TRP1选择标记的酵母人工染色体(YAC)中。其他工程化的沙罗泰里啶合酶变体也可并入YAC中(图22，实施例10)。所得酵母菌株也用具有URA3选择标记、TDH3启动子和CYP-COR编码序列的低拷贝CEN/ARS质粒转化。
使携带YAC、低拷贝质粒和整合盒的酵母菌株在具有适当的缺陷性溶液(-Ura-Trp)的合成完全培养基中在25和30℃生长。生长96小时后，通过LC-MS/MS分析针对BIA代谢物对培养基进行分析。进行关于温度、碳源、pH条件和培养基组成的进一步培养基优化来改善BIA产生。
可将另外的基因修饰引入酵母菌株中以产生衍生自蒂巴因的吗啡喃生物碱(图7)。在一个实例中，将表达盒PADH1-T6ODM-TADH1、PHXT7-COR-TPGK1和PTEF1-CODM-TCYC1直接组装并且整合到产蒂巴因酵母菌株的trp1基因座中(Thodey等人，2014)。在另一个实例中，可通过直接组装表达盒PGPD-morA-TCYC1、PPGK1-morB-TPHO5并且将此构建体整合到染色体上的ura3基因座中来将这些酵母菌株进一步工程化以产生另外的吗啡生物碱(Thodey等人，2014)。
实施例16：被工程化用于由L-酪氨酸产生小檗碱和其他原小檗碱生物碱的酵母
酵母菌株可被工程化用于由L-酪氨酸产生生物碱小檗碱和原小檗碱、苯酞异喹啉，以及衍生自小檗碱或参与形成小檗碱的中间体的小檗碱生物碱(图5、8)。例如，将三个或四个表达盒(PPGK1-PsBBE-TPHO5、PTEF1-yPsS9OMT-TCYC1、PTDH3-yCjCAS-TADH1，具有或不具有PTPI1-yBwSTOX-TSTE2)组装到具有TRP1区段标记的酵母人工染色体(YAC)中。将YAC置于由L-酪氨酸产生(S)-牛心果碱(参见实施例14)并且另外携带整合到染色体中的细胞色素P450还原酶(PTEF1-ATR1或PTEF1-PsCPRv2)的表达盒的平台酵母菌株中。将另一种包含PTEF1-S9OMT-TCYC1表达盒的高拷贝质粒转化到该菌株中以改善至下游产物的通量。
使酵母菌株在具有适当的氨基酸缺陷性溶液(-Trp)的合成完全培养基中在25和30℃下生长。在生长48和96小时之后通过LC-MS/MS分析对培养基上清液中的BIA代谢物进行分析。
实施例17：被工程化用于由L-酪氨酸产生诺斯卡品和其他类诺斯卡品生物碱的酵母
酵母菌株可被工程化用于由L-酪氨酸产生苯酞异喹啉生物碱诸如那可托灵和诺斯卡品、参与形成诺斯卡品的中间体，或其衍生物(图5、9)。
例如，将表达盒PADH1-CAS-TADH1、PHXT7-CYP82Y1-TPGK1、PTEF1-S9OMT-TCYC1和PPGK1-BBE-TPHO5直接组装并且整合到由L-酪氨酸产生(S)-牛心果碱(参见实施例14)并且另外携带整合到染色体中的细胞色素P450还原酶(PTEF1-ATR1或PTEF1-PsCPRv2)的表达盒的平台酵母菌株的trp1基因座中。接着，将表达盒PGPD-TNMT-TCYC1、PPGK1-PsMT2-TPHO5、PADH1-CYP82X1-TGAP1和PPYK1-PsCXE1-TMf1直接组装并且整合到酵母菌株的ura3基因座中。接着，将表达盒PHXT7-CYP82X2-TCYC1、PGPD-PsAT1-TADH1、PTPI1-PsSDR1-TSte2和PPGK1-PsMT3-TPHO5直接组装并且整合到酵母菌株的leu2基因座中。将包含PTEF1-S9OMT-TCYC1表达盒的另外的高拷贝质粒和包含PHXT7-CYP82X2-TCYC1表达盒的另外的低拷贝质粒转化到此酵母菌株中以改善至下游产物的通量。
使酵母菌株在具有适当的氨基酸缺陷性溶液(-Trp、Ura)的合成完全培养基中在25和30℃下生长。在生长48和96小时之后通过LC-MS/MS分析对培养基上清液中的BIA代谢物进行分析。
实施例18：被工程化用于由L-酪氨酸产生血根碱和其他苯菲啶生物碱的酵母
酵母菌株可被工程化用于由L-酪氨酸产生原小檗碱、原阿片碱以及苯菲啶生物碱诸如最终产物血根碱、参与形成血根碱的中间体，或其衍生物(图5、10)。
例如，将表达盒PADH1-TNMT-TADH1、PHXT7-EcSTS-TPGK1、PGPD-EcCFS-TCYC1和PPGK1-BBE-TPHO5直接组装并且整合到由L-酪氨酸产生(S)-牛心果碱(参见实施例14)并且另外携带整合到染色体中的细胞色素P450还原酶(PTEF1-ATR1或PTEF1-PsCPRv2)的表达盒的平台酵母菌株的trp1基因座中。接着，将表达盒PGPD-PsMSH-TCYC1、PPGK1-PsP6H-TPHO5直接组装并且整合到酵母菌株的ura3基因座中。
使酵母菌株在具有适当的氨基酸缺陷性溶液的合成完全培养基中在25和30℃下生长。在生长48和96小时之后通过LC-MS/MS分析对培养基上清液中的BIA代谢物进行分析。
实施例19：被工程化用于由L-酪氨酸产生氢可酮和其他吗啡喃生物碱的酵母
酵母菌株可被工程化用于产生氢可酮。例如，实施例15中所述的产蒂巴因酵母菌株可被进一步工程化以产生活性药物成分氢可酮。图27示出根据本发明的实施方案，工程化的酵母菌株中的蒂巴因和氢可酮产生。在图27A中，将多基因构建体并入包含构建体1-4的工程化的酵母菌株中(图26)。在图27B中，相对于包含构建体1-4的菌株而言，构建体5的整合增加牛心果碱滴度。在图27C中，构建体6的整合导致由糖产生蒂巴因。工程化菌株所产生的蒂巴因通过LC-MS/MS分析在培养基中鉴定并且与商业参考标准进行比较。在图27D中，在YAC上引入构建体7导致由糖产生氢可酮。工程化菌株所产生的氢可酮通过LC-MS/MS分析在培养基中鉴定并且与商业参考标准进行比较。
在一个实例中，将由L-酪氨酸产生牛心果碱的酵母菌株(参见实施例14中的描述)进一步工程化以增加牛心果碱产生，接着进一步修饰以并入实施例15中所述的产蒂巴因的酶，然后进一步修饰以并入蒂巴因脱甲基酶和吗啡酮还原酶以将生物合成的蒂巴因转化成氢可酮。将三种多基因表达构建体并入实施例14中所述的产牛心果碱的酵母菌株中；两种作为染色体整合，并且第三种作为附加型YAC构建体。
在第一构建体中，将基因并入以增加实施例14中所述的菌株的(S)-牛心果碱的生物合成。为了增加(S)-牛心果碱产生，将另外拷贝的CjNCS(用以增加多巴胺到去甲牛心果碱中的并入)和Ps4’OMT(用以增加3’-羟基-N-甲基乌药碱到(S)-牛心果碱中的并入)并入菌株中。还包括了另一拷贝的RnTyrH，以增加进入用于牛心果碱生物合成的异源途径的酪氨酸。将三个表达盒(PPGK1-yCjNCS-TPHO5、PTEF1-Ps4'OMT-TCYC1和PGPD-RnTyrHWR-TADH1)与用于腐草霉素抗性的选择标记一起整合到基因座YPL250C中(图27A)。所得的酵母菌株表现出牛心果碱积聚的4倍增加(图27B)。
在第二构建体中，并入由生物合成的(S)-牛心果碱产生蒂巴因的基因。将用于实施例15中所述的蒂巴因产生的四种酶组装为四个表达盒(PHXT7-yPbCYP-COR-TCYC1、PGPD-yEcCFS1-83-yPbSalSyn92-504-TADH1、PTPI1-yPbSalR-TSTE2和PPGK1-yPsSalAT-TPHO5)并且整合到具有选择标记KlURA3的基因座TRP1中(图27A)。所得的酵母菌株当在标准酵母培养基中培养时产生蒂巴因(图27C)。
在第三构建体中，并入由生物合成的蒂巴因产生氢可酮的基因。在此实例中，蒂巴因脱甲基酶活性作为来自罂粟的T6ODM酶并入，以将蒂巴因转化成尼奥品酮，并且吗啡酮还原酶活性作为来自恶臭假单胞菌的morB酶并入以将可待因酮转化成氢可酮。在此实例中，尼奥品酮至可待因酮的居间转化自发发生。在另一个实例中，包括了异构酶以将尼奥品酮酶促转化为可待因酮。T6ODM和morB基因针对酵母进行密码子优化并且作为组装到具有TRP1选择标记的YAC中的两个表达盒(PGPD-yT6ODM-TADH1和PPGK1-yPbmorB-TPHO5)被包括在内(图27A)。在此实例中，将酵母菌株在补充有50mM 2-酮戊二酸以支持T6ODM、2-酮戊二酸依赖性双加氧酶的活性的培养基中培养。在另一个实例中，将酵母宿主细胞工程化为以足以支持T6ODM活性的水平积聚2-酮戊二酸。携带所述多基因构建体且在所述培养基中培养的酵母菌株由葡萄糖生物合成氢可酮(图27D)。
实施例20：增加基因拷贝数以克服途径通量中的瓶颈
在一些情况下，可通过增加活性有限的酶的基因拷贝数优化酵母菌株以提高苄基异喹啉生物碱的产生。
在一个实例中，如实施例19中所述的产牛心果碱菌株的牛心果碱产生通过添加NCS的第三基因拷贝进行优化(图28)。在此实例中，亲本菌株具有整合在YMR206W基因座处的NCS的一个拷贝和整合在YPL250C基因座处的另一个拷贝，其各自由PGK1启动子表达。NCS的第三拷贝(由TDH3启动子表达)整合在BUD9基因座处并且这种修饰导致牛心果碱滴度增加2倍。在另一个实例中，将途径中的其他酶的另外拷贝并入菌株中以进一步增加牛心果碱滴度。
尽管具有随附条款，但本公开也由以下条款限定：
1.一种工程化的非植物细胞，其相对于非工程化细胞而言具有增加的酪氨酸羟化酶活性，所述工程化的非植物细胞具有选自由以下各项组成的组的至少一个修饰：底物抑制减轻突变；产物抑制减轻突变；以及辅因子回收促进机制。
2.根据条款1所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一个修饰包括底物抑制减轻突变。
3.根据条款2所述的工程化的非植物细胞，其中所述底物抑制减轻突变包括点突变W166Y。
4.根据条款1所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一个修饰包括缓解在共底物结合位点处的竞争性结合的至少一个产物抑制减轻突变。
5.根据条款4所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一个产物抑制减轻突变包括点突变S40D。
6.根据条款4所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一个产物抑制减轻突变包括联合突变R37E和R38E。
7.根据条款6所述的工程化的非植物细胞，其中所述联合突变R37E和R38E在多巴胺存在下改善酪氨酸羟化酶活性。
8.根据条款1所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一个修饰包括缓解不可逆的产物抑制的产物抑制减轻突变。
9.根据条款8所述的工程化的非植物细胞，其中所述产物抑制减轻突变包括点突变E332D。
10.根据条款8所述的工程化的非植物细胞，其中所述产物抑制减轻突变包括点突变Y371F。
11.根据条款8所述的工程化的非植物细胞，其中所述产物抑制减轻突变缓解儿茶酚胺与铁在活性位点中的不可逆结合。
12.根据条款1所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一个修饰包括辅因子回收促进机制。
13.根据条款12所述的工程化的非植物细胞，其中所述辅因子回收促进机制包括编码二氢叶酸还原酶的异源编码序列。
14.根据条款13所述的工程化的非植物细胞，其中通过所述工程化的非植物细胞产生的二氢叶酸还原酶在所述工程化的非植物细胞内催化二氢生物蝶呤到四氢生物蝶呤的转化。
15.一种用于形成具有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，包括：
(a)向间歇式反应器中提供工程化的非植物细胞以及包括营养素和水的原料，所述工程化的非植物细胞具有选自由以下各项组成的组的至少一个修饰：底物抑制减轻突变；产物抑制减轻突变；以及辅因子回收促进机制
(b)在所述间歇式反应器中，通过将所述工程化的非植物细胞孵育至少约5分钟的时间段而使所述工程化的非植物细胞进行发酵，以产生包括所述苄基异喹啉生物碱产物和细胞材料的溶液；以及
(c)使用至少一个分离装置将所述苄基异喹啉生物碱产物与所述细胞材料分离，以提供包括所述苄基异喹啉生物碱产物的所述产物流。
16.根据条款15所述的方法，其中所述间歇式反应器的至少一个工艺参数可修改，以改变所得的苄基异喹啉生物碱产物组成。
17.根据条款16所述的方法，其中可修改的所述至少一个工艺参数包括溶解氧、pH、搅拌速度、通气速率和细胞密度中的至少一个。
18.根据条款15所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包括苄基异喹啉生物碱前体。
19.根据条款18所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱前体选自下组：去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、酪氨酸、酪胺、4-羟基苯乙醛、4-羟基苯丙酮酸、L-3,4-二羟基苯丙氨酸、3,4-二羟基苯乙醛以及多巴胺。
20.根据条款15所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包括苄基异喹啉生物碱。
21.根据条款20所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱具有选自下组的结构种类：苄基异喹啉类、原小蘖碱类、原阿片碱类、苯菲啶类、原吗啡喃类、吗啡喃类、断裂小檗碱类、苯酞异喹啉类、阿朴啡类，以及双苄基异喹啉类。
22.根据条款21所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的苄基异喹啉：乌药碱、3’-羟基乌药碱、4’-O-甲基全去甲劳丹碱、4’-O-甲基-劳丹碱、N-甲基去甲乌药碱、劳丹碱、N-甲基乌药碱、3’-羟基-N-甲基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、罂粟碱、劳丹宁、劳丹素、四氢罂粟碱、1,2-二氢罂粟碱以及东罂粟灵。
23.根据条款21所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的原小蘖碱：金黄紫堇碱、碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、南丁宁碱、药根碱、千金藤啶碱、离木明碱、顺式-N-甲基刺罂粟碱、四氢非洲防己碱、掌叶防己碱、四氢掌叶防己碱、非洲防己碱、坎那定、N-甲基坎那定、1-羟基坎那定、小蘖碱、N-甲基-左旋蛇果黄堇碱、1,13-二羟基-N-甲基坎那定，以及1-羟基-10-O-乙酰基-N-甲基坎那定。
24.根据条款21所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的原阿片碱：原阿片碱、6-羟基原阿片碱、别隐品碱、隐品碱、隐掌叶防己碱和黄唐松草碱。
25.根据条款21所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的苯菲啶：二氢血根碱、血根碱、dihydrocheilirubine、cheilirubine、dihydromarcapine、marcapine和白屈菜红碱。
26.根据条款21所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的原吗啡喃：沙罗泰里啶、沙罗泰里啶醇，以及沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯。
27.根据条款21所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的吗啡喃：蒂巴因、可待因酮、可待因、吗啡、吗啡酮、东罂粟碱、尼奥品酮、尼奥品、新吗啡、氢可酮、二氢可待因、14-羟基可待因酮、羟考酮、14-羟基可待因、吗啡酮、氢吗啡酮、二氢吗啡、二氢埃托啡、乙基吗啡、埃托啡、美托酮、丁丙诺啡、福尔可定、异可待因和氧吗啡酮。
28.根据条款21所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的断裂小檗碱：4’-O-脱甲基马克兰特醛、4’-O-脱甲基罂粟奥辛、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛和3-O-乙酰基罂粟奥辛。
29.根据条款21所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的苯酞异喹啉：那可托灵半缩醛、那可汀半缩醛、那可托灵和诺斯卡品。
30.根据条款21所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的阿朴啡：木兰花碱、紫堇块茎碱、阿朴吗啡、波尔定碱、异波尔定碱、异蒂巴因、异紫堇块茎碱以及glaufine。
31.根据条款21所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的双苄基异喹啉：黄芦木碱、guattgaumerine、蝙蝠葛碱和莲心碱。
32.一种用于形成具有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，包括：
(a)向反应器中提供工程化的非植物细胞、包括营养素和水的原料，所述工程化的非植物细胞相对于表达不具有增加酪氨酸羟化酶活性的突变的野生型酪氨酸羟化酶的细胞而言具有增加的酪氨酸羟化酶活性；
(b)在所述反应器中，通过将所述工程化的非植物细胞孵育至少约5分钟的时间段而使所述工程化的非植物细胞进行发酵，以产生包括细胞材料和所述苄基异喹啉生物碱产物的溶液，其中所述溶液包括不超过一个种类的选自下组的分子：原小檗碱、吗啡喃、异帕威、阿朴啡以及双苄基异喹啉；以及
(c)使用至少一个分离装置将所述苄基异喹啉生物碱产物与所述细胞材料分离，以提供包括所述苄基异喹啉生物碱产物的所述产物流。
33.根据条款32所述的方法，其中所述产物流不包含超过5ppm的选自下组的分子：木质素、类黄酮、类菲(phenanthreoid)、乳胶、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)、袂康酸、假吗啡、那碎因、蒂巴酚和花粉。
34.根据条款33所述的方法，其中所述产物流不包含超过5ppm的袂康酸。
35.根据条款32所述的方法，其中所述产物流不包含可检测量的选自由以下各项组成的组的物质：杀虫剂、杀真菌剂或除草剂。
36.根据条款32所述的方法，其中使用至少液-液萃取从所述产物流中回收所述苄基异喹啉生物碱产物。
37.根据条款36所述的方法，其中在发酵过程完成之后立即回收所述苄基异喹啉生物碱产物。
38.一种使(S)-1-苄基异喹啉生物碱差向异构化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的方法，包括：
使所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱与至少一种酶接触，
其中使所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱与所述至少一种酶接触将所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱。
39.根据条款38所述的方法，其中所述至少一种酶通过培养具有编码所述至少一种酶的编码序列的工程化的非植物细胞产生。
40.根据条款39所述的方法，还包括：
向所述细胞培养物中添加(S)-1-苄基异喹啉生物碱。
41.根据条款40所述的方法，还包括：
从所述细胞培养物中回收所述(R)-1-苄基异喹啉生物碱或其衍生物。
42.根据条款38-41中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶包括氧化酶。
43.根据条款38-42中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶包括还原酶。
44.根据条款38-43中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶包括差向异构酶。
45.根据条款44所述的方法，其中所述差向异构酶包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
46.根据条款44或45所述的方法，其中所述差向异构酶包括氧化酶结构域和还原酶结构域。
47.根据条款46所述的方法，其中所述氧化酶结构域为细胞色素P450氧化酶样结构域。
48.根据条款46所述的方法，其中所述还原酶结构域为可待因酮还原酶样结构域。
49.根据条款38-48中任一项所述的方法，其中所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱为(S)-牛心果碱。
50.根据条款38-49中任一项所述的方法，其中所述(R)-1-苄基异喹啉生物碱为(R)-牛心果碱。
51.根据条款38-50中任一项所述的方法，还包括：
将所述(R)-1-苄基异喹啉生物碱转化成4-环原吗啡喃生物碱。
52.根据条款51所述的方法，其中所述4环原吗啡喃生物碱为沙罗泰里啶。
53.根据条款38-50中任一项所述的方法，还包括：
将所述(R)-1-苄基异喹啉生物碱转化成5-环吗啡喃生物碱。
54.根据条款38-53中任一项所述的方法，其中在工程化的微生物细胞内产生存在于所述工程化的非植物细胞内的所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱。
55.根据条款38-54中任一项所述的方法，其中通过以L-酪氨酸起始的代谢途径在所述工程化的非植物细胞内产生所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱。
56.根据条款38-54中任一项所述的方法，其中通过以碳水化合物和氮源起始的代谢途径在所述工程化的非植物细胞内产生所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱。
57.根据条款38-56中任一项所述的方法，其中所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱选自由以下各项组成的组：(S)-去甲牛心果碱、(S)-牛心果碱、(S)-四氢罂粟碱、(S)-去甲乌药碱、(S)-乌药碱、(S)-N-甲基乌药碱、(S)-3’-羟基-N-甲基乌药碱、(S)-去甲异东罂粟灵、(S)-东罂粟灵、(S)-异东罂粟灵、(S)-去甲原青藤碱、(S)-原青藤碱、(S)-全去甲劳丹碱、(S)-劳丹碱、(S)-4’-O-甲基劳丹碱、(S)-6-O-甲基全去甲劳丹碱，以及(S)-4’-O-甲基全去甲劳丹碱。
58.根据条款38-57中任一项所述的方法，其中所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱为式I的化合物：
式I，
其中：
R1、R2、R3和R4独立地为氢或甲基；并且
R5为氢、羟基或甲氧基。
59.一种工程化的非植物细胞，其由存在于所述工程化的非植物细胞内的(S)-1-苄基异喹啉生物碱产生(R)-1-苄基异喹啉生物碱，其包括编码差向异构酶的异源编码序列，其中所述差向异构酶将所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成所述(R)-1-苄基异喹啉生物碱。
60.根据条款59所述的工程化的非植物细胞，还包括编码沙罗泰里啶合酶的异源编码序列。
61.根据条款60所述的工程化的非植物细胞，其中所述沙罗泰里啶合酶将所述(R)-1-苄基异喹啉生物碱转化成沙罗泰里啶。
62.一种产生将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的差向异构酶的工程化的非植物细胞，其中所述差向异构酶包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
63.一种用于将(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的工艺，其包括使所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱与足以将所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱的量的差向异构酶接触。
64.根据条款63所述的工艺，其中所述差向异构酶包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
65.根据条款63所述的工艺，其中至少5％的所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱被转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱。
66.一种使1-苄基异喹啉生物碱的立构中心差向异构化的方法，包括：
使所述1-苄基异喹啉生物碱与至少一种酶接触，
其中所述1-苄基异喹啉生物碱与所述至少一种酶的所述接触将所述1-苄基异喹啉生物碱的所述立构中心的立体化学翻转成所述1-苄基异喹啉生物碱的所述立构中心的相反的立体化学。
67.根据条款66所述的方法，其中所述至少一种酶通过培养具有编码所述至少一种酶的编码序列的工程化的非植物细胞产生。
68.根据条款67所述的方法，还包括：
向所述细胞培养物中添加所述1-苄基异喹啉生物碱。
69.根据条款66所述的方法，其中所述1-苄基异喹啉生物碱呈现为所述1-苄基异喹啉生物碱的单一立体异构体。
70.根据条款66所述的方法，其中所述1-苄基异喹啉生物碱呈现为所述1-苄基异喹啉生物碱的立体异构体的混合物。
71.根据条款70所述的方法，其中所述1-苄基异喹啉生物碱的立体异构体的所述混合物为所述1-苄基异喹啉生物碱的对映体的外消旋混合物。
72.根据条款67所述的方法，还包括：
从所述细胞培养物中回收所述1-苄基异喹啉生物碱的立体异构体或其衍生物。
73.根据条款72所述的方法，其中所回收的1-苄基异喹啉生物碱具有至少约80％的对映体过量。
74.根据条款72所述的方法，其中所回收的1-苄基异喹啉生物碱具有至少约98％的对映体过量。
75.根据条款66-74中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶包括氧化酶。
76.根据条款66-75中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶包括还原酶。
77.根据条款66-74中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶包括差向异构酶。
78.根据条款77所述的方法，其中所述差向异构酶包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
79.根据条款77所述的方法，其中所述差向异构酶包括与以下中的任一个具有至少75％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
80.根据条款77所述的方法，其中所述差向异构酶包括与以下中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
81.根据条款77所述的方法，其中所述差向异构酶包括与以下中的任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
82.根据条款77所述的方法，其中所述差向异构酶包括与以下中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
83.根据条款77所述的方法，其中所述差向异构酶包括与以下中的任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
84.根据条款77所述的方法，其中所述差向异构酶包括与以下中的任一个具有至少98％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
85.根据条款77-84中任一项所述的方法，其中所述差向异构酶包括氧化酶结构域和还原酶结构域。
86.根据条款85所述的方法，其中所述氧化酶结构域为细胞色素P450氧化酶样结构域。
87.根据条款85所述的方法，其中所述还原酶结构域为可待因酮还原酶样结构域。
88.一种工程化的非植物细胞，其由存在于所述工程化的非植物细胞内的两个苄基异喹啉生物碱单体产生双苄基异喹啉生物碱，其包括：
编码至少一种偶合酶的异源编码序列，
其中所述至少一种偶合酶将所述两个苄基异喹啉生物碱单体二聚化，从而形成所述双苄基异喹啉生物碱。
89.根据条款88所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一种偶合酶通过形成一个或多个共价键将所述两个苄基异喹啉生物碱单体二聚化。
90.根据条款88所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一种偶合酶通过形成一个或多个碳-碳键将所述两个苄基异喹啉生物碱单体二聚化。
91.根据条款88所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一种偶合酶通过形成一个或多个碳-氧键将所述两个苄基异喹啉生物碱单体二聚化。
92.根据条款88所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一种偶合酶将相同的苄基异喹啉生物碱单体二聚化，从而形成同二聚体。
93.根据条款88所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一种偶合酶将不同的苄基异喹啉生物碱单体二聚化，从而形成异二聚体。
94.根据条款88所述的工程化的非植物细胞，其中所述两个苄基异喹啉生物碱单体为彼此的立体异构体。
95.根据条款88所述的工程化的非植物细胞，其中所述两个苄基异喹啉生物碱单体中的第一苄基异喹啉生物碱单体选自下组：乌药碱、N-甲基乌药碱、劳丹宁、去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、6-O-甲基-全去甲劳丹碱、3’-羟基-N-甲基乌药碱、3’-羟基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、去甲劳丹宁。
96.根据条款95所述的工程化的非植物细胞，其中所述两个苄基异喹啉生物碱单体中的第二苄基异喹啉生物碱单体选自下组：乌药碱、N-甲基乌药碱、劳丹宁、去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、6-O-甲基-全去甲劳丹碱、3’-羟基-N-甲基乌药碱、3’-羟基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、去甲劳丹宁。
97.根据条款88所述的工程化的非植物细胞，其中所述两个苄基异喹啉生物碱单体中的至少一个在所述工程化的非植物细胞内产生。
98.根据条款88所述的工程化的非植物细胞，其中所述两个苄基异喹啉生物碱单体中的至少一个在所述工程化的非植物细胞外产生。
99.一种工程化的非植物细胞，其使用存在于所述工程化的非植物细胞内的偶合酶产生双苄基异喹啉生物碱，其包括：
编码在所述工程化的非植物细胞内产生至少一种苄基异喹啉生物碱单体中所用的至少一种酶的至少一个异源编码序列，
其中所述至少一种偶合酶在所述工程化的非植物细胞内将两个苄基异喹啉生物碱单体二聚化，从而形成所述双苄基异喹啉生物碱。
100.根据条款99所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一种偶合酶通过形成一个或多个共价键将所述两个苄基异喹啉生物碱单体二聚化。
101.根据条款99所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一种偶合酶通过形成一个或多个碳-碳键将所述两个苄基异喹啉生物碱单体二聚化。
102.根据条款99所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一种偶合酶通过形成一个或多个碳-氧键将所述两个苄基异喹啉生物碱单体二聚化。
103.根据条款99所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一种偶合酶将相同的苄基异喹啉生物碱单体二聚化，从而形成同二聚体。
104.根据条款99所述的工程化的非植物细胞，其中所述至少一种偶合酶将不同的苄基异喹啉生物碱单体二聚化，从而形成异二聚体。
105.根据条款99所述的工程化的非植物细胞，其中所述两个苄基异喹啉生物碱单体为彼此的立体异构体。
106.根据条款99所述的工程化的非植物细胞，其中所述两个苄基异喹啉生物碱单体中的第一苄基异喹啉生物碱单体选自下组：乌药碱、N-甲基乌药碱、劳丹宁、去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、6-O-甲基-全去甲劳丹碱、3’-羟基-N-甲基乌药碱、3’-羟基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、去甲劳丹宁。
107.根据条款106所述的工程化的非植物细胞，其中所述两个苄基异喹啉生物碱单体中的第二苄基异喹啉生物碱单体选自下组：乌药碱、N-甲基乌药碱、劳丹宁、去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、6-O-甲基-全去甲劳丹碱、3’-羟基-N-甲基乌药碱、3’-羟基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、去甲劳丹宁。
108.根据条款99所述的工程化的非植物细胞，其中所述偶合酶在所述工程化的非植物细胞内产生。
109.根据条款99所述的工程化的非植物细胞，其中所述偶合酶在所述工程化的非植物细胞外产生。
110.一种用于形成具有双苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，包括：
(a)向间歇式反应器中提供工程化的非植物细胞以及包括营养素和水的原料，所述工程化的非植物细胞包括编码至少一种偶合酶的至少一个异源编码序列，其中所述工程化的非植物细胞还包括编码在至少一个苄基异喹啉生物碱单体的产生中使用的至少一种酶的至少一个异源编码序列；
(b)在所述间歇式反应器中，通过将所述工程化的非植物细胞孵育至少约5分钟的时间段而使所述工程化的非植物细胞进行发酵，以产生包括所述双苄基异喹啉生物碱产物和细胞材料的溶液；以及
(c)使用至少一个分离装置将所述双苄基异喹啉生物碱产物与所述细胞材料分离，以提供包括所述双苄基异喹啉生物碱产物的所述产物流。
111.根据条款108所述的方法，其中所述间歇式反应器的至少一个工艺参数可修改，以改变所得的双苄基异喹啉生物碱产物组成。
112.根据条款109所述的方法，其中可修改的所述至少一个工艺参数包括溶解氧、pH、搅拌速度、通气速率和细胞密度中的至少一个。
113.根据条款108所述的方法，其中所述至少一个苄基异喹啉生物碱单体包括以下各项中的至少一个：乌药碱、N-甲基乌药碱、劳丹宁、去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、6-O-甲基-全去甲劳丹碱、3’-羟基-N-甲基乌药碱、3’-羟基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、去甲劳丹宁。
114.一种工程化的非植物细胞，其将碳水化合物源转化成衍生自(S)-牛心果碱的苄基异喹啉生物碱产物。
115.根据条款114所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括具有编码用于将鸟苷三磷酸转化成四氢生物蝶呤的一种或多种酶的多个异源编码序列的多个多基因表达构建体。
116.根据条款115所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列编码以下各项中的至少一个：丙酮酰四氢蝶呤合酶、墨蝶呤还原酶、蝶呤4a-甲醇胺脱水酶以及二氢蝶啶还原酶。
117.根据条款115所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞还包括编码用于将酪氨酸转化成L-DOPA的一种或多种酶的一个或多个异源编码序列。
118.根据条款117所述的工程化的非植物细胞，其中一个或多个异源编码序列编码酪氨酸羟化酶中的至少一种。
119.根据条款114所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括具有编码用于将L-DOPA转化成(S)-牛心果碱的一种或多种酶的多个异源编码序列的多个多基因表达构建体。
120.根据条款119所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列编码以下各项中的至少一个：L-DOPA脱羧酶、去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及4’-O-甲基转移酶。
121.根据条款119所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列编码以下各项中的至少一个：L-DOPA脱羧酶、单胺氧化酶、去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶，以及4’-O-甲基转移酶。
122.根据条款114所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括具有编码用于将(S)-牛心果碱转化成吗啡喃生物碱的一种或多种酶的多个异源编码序列的多个多基因表达构建体。
123.根据条款122所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列编码以下各项中的至少一个：1-苄基异喹啉生物碱差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、细胞色素P450还原酶、沙罗泰里啶还原酶，以及沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶。
124.根据条款123所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列另外编码以下各项中的至少一个：蒂巴因-6-O-脱甲基酶、可待因酮还原酶，以及可待因脱甲基酶。
125.根据条款122所述的工程化的非植物细胞，其中所述一种或多种酶用于将(S)-牛心果碱转化成原吗啡喃生物碱。
126.根据条款122所述的工程化的非植物细胞，其中所述一种或多种酶用于将(S)-牛心果碱转化成半合成的吗啡喃生物碱。
127.根据条款114所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括具有编码用于将(S)-牛心果碱转化成坎那定的一种或多种酶的多个异源编码序列的多个多基因表达构建体。
128.根据条款127所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列编码以下各项中的至少一个：小檗碱桥酶、金黄紫堇碱-9-O-甲基转移酶、坎那定合酶，以及细胞色素P450还原酶。
129.根据条款128所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列另外编码用以将坎那定转化成原小檗碱产物的一种或多种酶。
130.根据条款128所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列另外编码用以将坎那定转化成苯酞异喹啉产物的一种或多种酶。
131.根据条款128所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列另外编码用以将坎那定转化成类诺斯卡品产物的一种或多种酶。
132.根据条款114所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括具有编码用于将(S)-牛心果碱转化成小檗碱的一种或多种酶的多个异源编码序列的多个多基因表达构建体。
133.根据条款132所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列编码以下各项中的至少一个：小檗碱桥酶、金黄紫堇碱-9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、细胞色素P450还原酶，以及四氢原小檗碱氧化酶。
134.根据条款133所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列另外编码用以将小檗碱转化成小檗碱产物的一种或多种酶。
135.根据条款114所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括具有编码用于将(S)-牛心果碱转化成原小檗碱产物的一种或多种酶的多个异源编码序列的多个多基因表达构建体。
136.根据条款138所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列编码小檗碱桥酶。
137.根据条款114所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括具有编码用于将(S)-牛心果碱转化成原阿片碱的一种或多种酶的多个异源编码序列的多个多基因表达构建体。
138.根据条款137所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列编码以下各项中的至少一个：小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、细胞色素P450还原酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶，以及顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶。
139.根据条款138所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列另外编码用以将原阿片碱转化成原阿片碱产物的一种或多种酶。
140.根据条款138所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列另外编码用以将原阿片碱转化成苯菲啶产物的一种或多种酶。
141.根据条款140所述的工程化的非植物细胞，其中所述多个异源编码序列另外编码原阿片碱-6-羟化酶。
142.一种用于形成具有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，包括：
(a)向间歇式反应器中提供工程化的非植物细胞以及包括营养素和水的原料；
(b)在所述间歇式反应器中，使所述工程化的非植物细胞与碳水化合物源和氮源接触，并且通过将所述工程化的非植物细胞孵育至少约5分钟的时间段而使所述工程化的非植物细胞进行发酵，以产生包括所述苄基异喹啉生物碱产物和细胞材料的溶液，其中所述苄基异喹啉生物碱产物衍生自牛心果碱；以及
(c)使用至少一个分离装置将所述苄基异喹啉生物碱产物与所述细胞材料分离，以提供包括所述苄基异喹啉生物碱产物的所述产物流。
143.根据条款139所述的方法，其中所述间歇式反应器的至少一个工艺参数可修改，以改变所得的苄基异喹啉生物碱产物组成。
144.根据条款140所述的方法，其中可修改的所述至少一个工艺参数包括溶解氧、pH、搅拌速度、通气速率和细胞密度中的至少一个。
145.根据条款139所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包括苄基异喹啉生物碱。
146.根据条款142所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱具有选自下组的结构种类：苄基异喹啉类、原小蘖碱类、原阿片碱类、苯菲啶类、原吗啡喃类、吗啡喃类、断裂小檗碱类、苯酞异喹啉类、阿朴啡类，以及双苄基异喹啉类。
147.根据条款143所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的苄基异喹啉：罂粟碱、四氢罂粟碱、1,2-二氢罂粟碱，以及东罂粟灵。
148.根据条款143所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的原小蘖碱：金黄紫堇碱、碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、南丁宁碱、药根碱、千金藤啶碱、离木明碱、顺式-N-甲基刺罂粟碱、四氢非洲防己碱、掌叶防己碱、四氢掌叶防己碱、非洲防己碱、坎那定、N-甲基坎那定、1-羟基坎那定、小檗碱、N-甲基-左旋蛇果黄堇碱、1,13-二羟基-N-甲基坎那定，以及1-羟基-10-O-乙酰基-N-甲基坎那定。
149.根据条款143所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的原阿片碱：原阿片碱、6-羟基原阿片碱、别隐品碱、隐品碱、隐掌叶防己碱和黄唐松草碱。
150.根据条款143所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的苯菲啶：二氢血根碱、血根碱、dihydrocheilirubine、cheilirubine、dihydromarcapine、marcapine和白屈菜红碱。
151.根据条款143所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的原吗啡喃：沙罗泰里啶、沙罗泰里啶醇，以及沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯。
152.根据条款143所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的吗啡喃：蒂巴因、可待因酮、可待因、吗啡、吗啡酮、东罂粟碱、尼奥品酮、尼奥品、新吗啡、氢可酮、二氢可待因、14-羟基可待因酮、羟考酮、14-羟基可待因、吗啡酮、氢吗啡酮、二氢吗啡、二氢埃托啡、乙基吗啡、埃托啡、美托酮、丁丙诺啡、福尔可定、异可待因和氧吗啡酮。
153.根据条款143所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的断裂小檗碱：4’-O-脱甲基马克兰特醛、4’-O-脱甲基罂粟奥辛、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛和3-O-乙酰基罂粟奥辛。
154.根据条款143所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的苯酞异喹啉：那可托灵半缩醛、那可汀半缩醛、那可托灵和诺斯卡品。
155.根据条款143所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的阿朴啡：木兰花碱、紫堇块茎碱、阿朴吗啡、波尔定碱、异波尔定碱、异蒂巴因、异紫堇块茎碱以及glaufine。
156.根据条款143所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱为选自下组的双苄基异喹啉：黄芦木碱、guattgaumerine、蝙蝠葛碱和莲心碱。
157.一种用于形成具有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，包括：
(a)向反应器中提供工程化的非植物细胞以及包括营养素和水的原料；
(b)在所述反应器中，使所述工程化的非植物细胞与碳水化合物源和氮源接触，从而产生包括细胞材料和所述苄基异喹啉生物碱产物的溶液，其中所述苄基异喹啉生物碱产物衍生自牛心果碱，其中所述溶液包括不多于一个种类的选自下组的分子：原小檗碱、吗啡喃、异帕威、阿朴啡，以及双苄基异喹啉；以及
(c)使用至少一个分离装置将所述苄基异喹啉生物碱产物与所述细胞材料分离，以提供包括所述苄基异喹啉生物碱产物的所述产物流。
158.根据条款154所述的方法，其中所述产物流不包含超过5ppm的选自下组的分子：木质素、类黄酮、类菲、乳胶、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶、袂康酸、假吗啡、那碎因、蒂巴酚和花粉。
159.根据条款155所述的方法，其中所述产物流不包含超过5ppm的袂康酸。
160.根据条款154所述的方法，其中所述产物流不包含可检测量的选自由以下各项组成的组的物质：杀虫剂、杀真菌剂或除草剂。
161.根据条款154所述的方法，其中使用至少液-液萃取从所述产物流中回收所述苄基异喹啉生物碱产物。
162.根据条款158所述的方法，其中在发酵过程完成之后立即回收所述苄基异喹啉生物碱产物。
163.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞包括两个或更多个异源编码序列，其中所述两个或更多个异源编码序列编码参与将底物转化成苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一酶和第二酶，其中所述第一酶和所述第二酶沿着所述代谢途径可操作地连接。
164.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞包括三个异源编码序列，其中所述三个异源编码序列编码参与将底物转化成苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一酶、第二酶和第三酶，其中所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶沿着所述代谢途径可操作地连接。
165.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：4’-O-甲基转移酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱氧化酶、原阿片碱O-脱烷基酶，以及细胞色素P450还原酶。
166.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：4’-O-甲基转移酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱氧化酶、原阿片碱O-脱烷基酶，以及细胞色素P450还原酶。
167.根据条款165或166所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原小檗碱产物。
168.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶、原阿片碱O-脱烷基酶，以及细胞色素P450还原酶。
169.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶、原阿片碱O-脱烷基酶，以及细胞色素P450还原酶。
170.根据条款168或169所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原阿片碱产物。
171.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶、二氢苯菲啶氧化酶，以及细胞色素P450还原酶。
172.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶、二氢苯菲啶氧化酶，以及细胞色素P450还原酶。
173.根据条款171或172所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苯菲啶产物。
174.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：4’-O-甲基转移酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶，以及细胞色素P450还原酶。
175.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：4’-O-甲基转移酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶，以及细胞色素P450还原酶。
176.根据条款174或175所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原吗啡喃产物。
177.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶、蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因酮还原酶、可待因O-脱甲基酶、吗啡脱氢酶、吗啡酮还原酶，以及细胞色素P450还原酶。
178.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶、蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因酮还原酶、可待因O-脱甲基酶、吗啡脱氢酶、吗啡酮还原酶，以及细胞色素P450还原酶。
179.根据条款177或178所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为吗啡喃产物。
180.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶，以及细胞色素P450还原酶。
181.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶，以及细胞色素P450还原酶。
182.根据条款180或181所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为断裂小檗碱产物。
183.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶、那可汀半缩醛合酶、诺斯卡品合酶、那可托灵4’-O-甲基化酶，以及细胞色素P450还原酶。
184.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶、那可汀半缩醛合酶、诺斯卡品合酶、那可托灵4’-O-甲基化酶，以及细胞色素P450还原酶。
185.根据条款183或184所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苯酞异喹啉产物。
186.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P45080B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶，以及黄芦木碱合酶。
187.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶，以及黄芦木碱合酶。
188.根据条款186或187所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为双苄基异喹啉产物。
189.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P45080B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
190.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
191.根据条款189或190所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苄基异喹啉产物。
192.根据条款165-191中任一项所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞包括两个或更多个另外的异源编码序列，其中所述两个或更多个另外的异源编码序列编码参与将底物转化成所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一附加酶和第二附加酶，其中所述第一附加酶和所述第二附加酶沿着所述代谢途径可操作地连接，并且其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一附加酶和所述第二附加酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
193.根据条款165-191中任一项所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞包括三个另外的异源编码序列，其中所述三个异源编码序列编码参与将底物转化成所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一附加酶、第二附加酶和第三附加酶，其中所述第一附加酶、所述第二附加酶和所述第三附加酶沿着所述代谢途径可操作地连接，并且其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一附加酶、所述第二附加酶和所述第三附加酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
194.根据前述条款中任一项所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括两个或更多个异源编码序列，其中所述两个或更多个异源编码序列编码参与将底物转化成苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一酶和第二酶，其中所述第一酶和所述第二酶沿着所述代谢途径可操作地连接。
195.根据前述条款中任一项所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括三个异源编码序列，其中所述三个异源编码序列编码参与将底物转化成所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一酶、第二酶和第三酶，其中所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶沿着所述代谢途径可操作地连接。
196.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：4’-O-甲基转移酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱氧化酶、原阿片碱O-脱烷基酶，以及细胞色素P450还原酶。
197.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：4’-O-甲基转移酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱氧化酶、原阿片碱O-脱烷基酶，以及细胞色素P450还原酶。
198.根据条款196或197所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原小檗碱产物。
199.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶、原阿片碱O-脱烷基酶，以及细胞色素P450还原酶。
200.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶、原阿片碱O-脱烷基酶，以及细胞色素P450还原酶。
201.根据条款199或200所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原阿片碱产物。
202.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶、二氢苯菲啶氧化酶，以及细胞色素P450还原酶。
203.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶、二氢苯菲啶氧化酶，以及细胞色素P450还原酶。
204.根据条款202或203所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苯菲啶产物。
205.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：4’-O-甲基转移酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶，以及细胞色素P450还原酶。
206.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：4’-O-甲基转移酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶，以及细胞色素P450还原酶。
207.根据条款205或206所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原吗啡喃产物。
208.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶、蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因酮还原酶、可待因O-脱甲基酶、吗啡脱氢酶、吗啡酮还原酶，以及细胞色素P450还原酶。
209.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶、蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因酮还原酶、可待因O-脱甲基酶、吗啡脱氢酶、吗啡酮还原酶，以及细胞色素P450还原酶。
210.根据条款208或209所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为吗啡喃产物。
211.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶，以及细胞色素P450还原酶。
212.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶，以及细胞色素P450还原酶。
213.根据条款211或212所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为断裂小檗碱产物。
214.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶、那可汀半缩醛合酶、诺斯卡品合酶、那可托灵4’-O-甲基化酶，以及细胞色素P450还原酶。
215.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶、那可汀半缩醛合酶、诺斯卡品合酶、那可托灵4’-O-甲基化酶，以及细胞色素P450还原酶。
216.根据条款214或215所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苯酞异喹啉产物。
217.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶，以及黄芦木碱合酶。
218.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶，以及黄芦木碱合酶。
219.根据条款217或218所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为双苄基异喹啉产物。
220.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
221.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
222.根据条款220或221所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苄基异喹啉产物。
223.根据条款196-222中任一项所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括两个或更多个另外的异源编码序列，其中所述两个或更多个另外的异源编码序列编码参与将底物转化成所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一附加酶和第二附加酶，其中所述第一附加酶和所述第二附加酶沿着所述代谢途径可操作地连接，并且其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一附加酶和所述第二附加酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
224.根据条款196-222中任一项所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括三个另外的异源编码序列，其中所述三个异源编码序列编码参与将底物转化成所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一附加酶、第二附加酶和第三附加酶，其中所述第一附加酶、所述第二附加酶和所述第三附加酶沿着所述代谢途径可操作地连接，并且其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一附加酶、所述第二附加酶和所述第三附加酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
225.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P45080B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、4’-O-甲基转移酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱氧化酶，以及原阿片碱O-脱烷基酶。
226.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、4’-O-甲基转移酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱氧化酶，以及原阿片碱O-脱烷基酶。
227.根据条款225或226所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原小檗碱产物。
228.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P45080B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶，以及原阿片碱O-脱烷基酶。
229.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶，以及原阿片碱O-脱烷基酶。
230.根据条款228或229所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原阿片碱产物。
231.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P45080B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶，以及二氢苯菲啶氧化酶。
232.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶，以及二氢苯菲啶氧化酶。
233.根据条款231或232所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苯菲啶产物。
234.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P45080B1、细胞色素P450还原酶、4’-O-甲基转移酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶，以及沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶。
235.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、4’-O-甲基转移酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶，以及沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶。
236.根据条款234或235所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原吗啡喃产物。
237.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P45080B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶、蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因酮还原酶、可待因O-脱甲基酶、吗啡脱氢酶，以及吗啡酮还原酶。
238.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶、蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因酮还原酶、可待因O-脱甲基酶、吗啡脱氢酶，以及吗啡酮还原酶。
239.根据条款237或238所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为吗啡喃产物。
240.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P45080B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶，以及1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶。
241.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶，以及1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶。
242.根据条款240或241所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为断裂小檗碱产物。
243.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P45080B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶、那可汀半缩醛合酶、诺斯卡品合酶，以及那可托灵4’-O-甲基化酶。
244.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶、那可汀半缩醛合酶、诺斯卡品合酶，以及那可托灵4’-O-甲基化酶。
245.根据条款243或244所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苯酞异喹啉产物。
246.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：酪氨酸羟化酶、dopa脱羧酶、酪氨酸/dopa脱羧酶、单胺氧化酶、酪氨酸酶、去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶，以及黄芦木碱合酶。
247.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：酪氨酸羟化酶、dopa脱羧酶、酪氨酸/dopa脱羧酶、单胺氧化酶、酪氨酸酶、去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶，以及黄芦木碱合酶。
248.根据条款246或247所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为双苄基异喹啉产物。
249.根据条款163所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：酪氨酸羟化酶、dopa脱羧酶、酪氨酸/dopa脱羧酶、单胺氧化酶、酪氨酸酶、去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
250.根据条款164所述的方法，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：酪氨酸羟化酶、dopa脱羧酶、酪氨酸/dopa脱羧酶、单胺氧化酶、酪氨酸酶、去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
251.根据条款249或250所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苄基异喹啉产物。
252.根据条款225-251中任一项所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞包括两个或更多个另外的异源编码序列，其中所述两个或更多个另外的异源编码序列编码参与将底物转化成所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一附加酶和第二附加酶，其中所述第一附加酶和所述第二附加酶沿着所述代谢途径可操作地连接，并且其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一附加酶和所述第二附加酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
253.根据条款225-251中任一项所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞包括三个另外的异源编码序列，其中所述三个异源编码序列编码参与将底物转化成所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一附加酶、第二附加酶和第三附加酶，其中所述第一附加酶、所述第二附加酶和所述第三附加酶沿着所述代谢途径可操作地连接，并且其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一附加酶、所述第二附加酶和所述第三附加酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
254.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、4’-O-甲基转移酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱氧化酶，以及原阿片碱O-脱烷基酶。
255.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、4’-O-甲基转移酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱氧化酶，以及原阿片碱O-脱烷基酶。
256.根据条款254或255所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原小檗碱产物。
257.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶，以及原阿片碱O-脱烷基酶。
258.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶，以及原阿片碱O-脱烷基酶。
259.根据条款257或258所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原阿片碱产物。
260.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶，以及二氢苯菲啶氧化酶。
261.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、碎叶紫堇碱合酶、刺罂粟碱合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、顺式-N-甲基刺罂粟碱14-羟化酶、原阿片碱-6-羟化酶，以及二氢苯菲啶氧化酶。
262.根据条款260或261所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苯菲啶产物。
263.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、4’-O-甲基转移酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶，以及沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶。
264.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、4’-O-甲基转移酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶，以及沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶。
265.根据条款263或264所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为原吗啡喃产物。
266.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶、蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因酮还原酶、可待因O-脱甲基酶、吗啡脱氢酶，以及吗啡酮还原酶。
267.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、沙罗泰里啶合酶、沙罗泰里啶还原酶、沙罗泰里啶醇7-O-乙酰转移酶、蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因酮还原酶、可待因O-脱甲基酶、吗啡脱氢酶，以及吗啡酮还原酶。
268.根据条款266或267所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为吗啡喃产物。
269.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶，以及1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶。
270.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶，以及1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶。
271.根据条款269或270所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为断裂小檗碱产物。
272.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶、那可汀半缩醛合酶、诺斯卡品合酶，以及那可托灵4’-O-甲基化酶。
273.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶、小檗碱桥酶、金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶、坎那定合酶、四氢原小檗碱-N-甲基转移酶、N-甲基坎那定1-羟化酶、1-羟基-N-甲基坎那定13-羟化酶、4’-O-脱甲基-3-O-乙酰基罂粟奥辛合酶、1,13-二羟基-N-甲基坎那定13-O乙酰转移酶、那可汀半缩醛合酶、诺斯卡品合酶，以及那可托灵4’-O-甲基化酶。
274.根据条款272或273所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苯酞异喹啉产物。
275.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：酪氨酸羟化酶、dopa脱羧酶、酪氨酸/dopa脱羧酶、单胺氧化酶、酪氨酸酶、去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶，以及黄芦木碱合酶。
276.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：酪氨酸羟化酶、dopa脱羧酶、酪氨酸/dopa脱羧酶、单胺氧化酶、酪氨酸酶、去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶、BIA差向异构酶，以及黄芦木碱合酶。
277.根据条款275或276所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为双苄基异喹啉产物。
278.根据条款194所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶和所述第二酶中的每一个选自由以下各项组成的组：酪氨酸羟化酶、dopa脱羧酶、酪氨酸/dopa脱羧酶、单胺氧化酶、酪氨酸酶、去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
279.根据条款195所述的工程化的非植物细胞，其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每一个选自由以下各项组成的组：酪氨酸羟化酶、dopa脱羧酶、酪氨酸/dopa脱羧酶、单胺氧化酶、酪氨酸酶、去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
280.根据条款220或221所述的工程化的非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物为苄基异喹啉产物。
281.根据条款196-222中任一项所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括两个或更多个另外的异源编码序列，其中所述两个或更多个另外的异源编码序列编码参与将底物转化成所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一附加酶和第二附加酶，其中所述第一附加酶和所述第二附加酶沿着所述代谢途径可操作地连接，并且其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一附加酶和所述第二附加酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
282.根据条款196-222中任一项所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包括三个另外的异源编码序列，其中所述三个异源编码序列编码参与将底物转化成所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一附加酶、第二附加酶和第三附加酶，其中所述第一附加酶、所述第二附加酶和所述第三附加酶沿着所述代谢途径可操作地连接，并且其中参与产生所述苄基异喹啉生物碱产物的所述代谢途径的所述第一附加酶、所述第二附加酶和所述第三附加酶中的每一个选自由以下各项组成的组：去甲乌药碱合酶、去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、4’-O-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶，以及BIA差向异构酶。
283.根据前述条款中任一项所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞为工程化的酵母细胞。
284.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞为工程化的酵母细胞。
285.根据条款1-282中任一项所述的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞为工程化的细菌细胞。
286.根据条款1-282中任一项所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞为工程化的细菌细胞。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是将对本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅以举例的方式提供。本领域的技术人员可以对其做出许多变形、改变和替换而不脱离本发明。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可在本发明的实践中采用。以下权利要求旨在限定本发明的范围并且从而覆盖在这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

Claims (15)

1.一种使(S)-1-苄基异喹啉生物碱差向异构化为(R)-1-苄基异喹啉生物碱的方法，其包括：
使所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱与至少一种酶接触，
其中使所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱与所述至少一种酶接触将所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱转化成(R)-1-苄基异喹啉生物碱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种酶通过培养具有编码所述至少一种酶的编码序列的工程化的非植物细胞产生。
3.根据权利要求2所述的方法，其还包括：
向所述细胞培养物中添加(S)-1-苄基异喹啉生物碱。
4.根据权利要求3所述的方法，其还包括：
从所述细胞培养物中回收所述(R)-1-苄基异喹啉生物碱或其衍生物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶包括氧化酶。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶包括还原酶。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶包括差向异构酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述差向异构酶包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述差向异构酶包括氧化酶结构域和还原酶结构域。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述氧化酶结构域为细胞色素P450氧化酶样结构域。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述还原酶结构域为可待因酮还原酶样结构域。
12.根据权利要求7-11中任一项所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞为工程化的酵母细胞。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱为(S)-牛心果碱。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述(R)-1-苄基异喹啉生物碱为(R)-牛心果碱。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中通过以L-酪氨酸起始的代谢途径在所述工程化的非植物细胞内产生所述(S)-1-苄基异喹啉生物碱。
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