ES2379368T3

ES2379368T3 - Método para aumentar la producción de compuestos isoprenoides

Info

Publication number: ES2379368T3
Application number: ES05857432T
Authority: ES
Inventors: Jay D. Keasling; Jack D. Newman; Douglas J. Pitera
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2004-05-21
Filing date: 2005-05-20
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2025-05-20
Also published as: EP1765418A4; JP2008500063A; US20090004724A1; CA2567547C; BRPI0510115B1; AU2005327292B2; EP1765418A2; US20060079476A1; US7670825B2; JP4926061B2; US7183089B2; AU2005327292A1; BRPI0510115A; MXPA06013502A; WO2006085899A2; EP1765418B1; WO2006085899A3; CN101023181A; ATE537269T1; EP2365090A1

Abstract

Método para producir un isoprenoide o precursor de isoprenoide a través de la ruta del mevalonato en Escherichia coli, comprendiendo el método: (i) cultivar en un medio adecuado una célula de E. coli modificada genéticamente para producir hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintasa (HMGS) heteróloga y HMG-CoA reductasa (HMGR) heteróloga, y en el que la célula de E. coli modificada genéticamente se modifica genéticamente adicionalmente para producir una o más enzimas heterólogas adicionales de la ruta del mevalonato seleccionadas entre: (a) una acetoacetil-CoA tiolasa; (b) una mevalonato quinasa; (c) una fosfomevalonato quinasa; y (d) una mevalonato pirofosfato descarboxilasa; en el que en ausencia de dicha HMGR heteróloga, los niveles de HMG-CoA producidos en la célula son tóxicos para la célula, y en el que el nivel de actividad relativo de la HMGR producida en la célula de E. coli modificada genéticamente es superior al nivel de actividad relativo de la HMGS producida en la célula de E. coli modificada genéticamente, de manera que el nivel de HMG-CoA presente en la célula no es tóxico para dicha célula y/o no inhibe sustancialmente el crecimiento celular; y (ii) recuperar el isoprenoide o precursor de isoprenoide producido.

Description

Método para aumentar la producción de compuestos isoprenoides

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención pertenece al campo de la producción de compuestos isoprenoides, y en particular, a células huésped que son modificadas genéticamente para producir compuestos isoprenoides.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Los isoprenoides constituyen un grupo extremadamente amplio y diverso de productos naturales que tienen un origen biosintético común, es decir, un único precursor metabólico, isopentenil difosfato (IPP). Se han descrito por lo menos 20.000 isoprenoide. Por definición, los isoprenoides están formados de las denominadas unidades de isopreno (C5). El número de átomos de C presentes en los isoprenoides es normalmente divisible por cinco (C5, C10, C15, C20, C25, C30 y C40), aunque se han descrito isoprenoides irregulares y politerpenos. Los compuestos isoprenoides también se refieren como "terpenos" o "terpenoides”. Los miembros importantes de los isoprenoides incluyen carotenoides, sesquiterpenoides, diterpenoides, y hemiterpenos. Los carotenoides incluyen, por ejemplo, licopeno, 1-caroteno, y similares, muchos de los cuales actúan como antioxidantes. Los sesquiterpenoides incluyen, por ejemplo, artemisinina, un compuesto que tiene material contra la malaria. Los diterpenoides incluyen, por ejemplo, taxol, un agente quimioterapéutico contra el cáncer.

[0003] Los isoprenoides comprenden la familia más numerosa y estructuralmente diversa de productos naturales. En esta familia, los terpenoides aislados de plantas y otras fuentes naturales se utilizan como compuestos de aromas y fragancias comerciales, así como fármacos contra la malaria y el cáncer. Una mayoría de los compuestos terpenoides que se utilizan actualmente son productos naturales o sus derivados. Los organismos de origen (por ejemplo, árboles, invertebrados marinos) de muchos de estos productos naturales no son susceptibles de un cultivo a gran escala necesario para producir cantidades comercialmente viables ni de manipulación genética para una mayor producción o derivatización de estos compuestos. Por lo tanto, los productos naturales deben producirse semisintéticamente a partir de análogos o sintéticamente utilizando síntesis química convencional. Además, muchos productos naturales presentan estructuras complejas y, como resultado, son actualmente caros o imposibles de sintetizar. Dichos productos naturales deben extraerse de sus fuentes nativas, tales como árboles, esponjas, corales y microbios marinos; o producirse sintéticamente o semisintéticamente a partir de precursores abundantes. La extracción de un producto natural a partir de una fuente nativa está limitada por la disponibilidad de la fuente nativa; y la producción sintética o semisintética de productos naturales puede sufrir un rendimiento bajo y/o un coste elevado. Dichos problemas de producción y disponibilidad limitada de la fuente natural pueden limitar el desarrollo comercial y clínico de dichos productos.

[0004] La biosíntesis de productos naturales de isoprenoides en microbios modificados podría aprovechar el potencial comercial y terapéutico sin explotar de estos recursos naturales y producir productos de química fina y farmacéuticos menos caros y más ampliamente disponibles. Un obstáculo en cuestión para la biosíntesis de terpenoides a nivel elevado es la producción de precursores de terpenos. Los estudios previos han demostrado que, cuando se expresa en E. coli, la ruta de mevalonato proporciona la producción de isopentenil pirofosfato (IPP), que se puede isomerizar y polimerizar en isoprenoides y terpenos de valor comercial. La redirección óptima de metabolismo microbiano hacia la producción de isoprenoides requiere que la ruta biosintética introducida se modifique correctamente para canalizar eficientemente el carbono al IPP y no permitir la formación de intermedios que pueden ser tóxicos. De hecho, se ha observado que la expresión de enzimas que producen mevalonato puede inhibir el crecimiento celular y limitar la productividad de cultivos microbianos. Se sugirió que la inhibición del crecimiento descrita previamente tras la expresión de la ruta de mevalonato en ausencia de una IPP isomerasa, FPP sintasa, y terpeno sintasa conducía a la acumulación de niveles tóxicos de IPP.

[0005] Existe la necesidad en la técnica por células huésped mejoradas productoras de isoprenoides o precursores de isoprenoides que proporcionen un crecimiento robusto de células huésped y una producción a nivel elevado de compuestos isoprenoides, así como precursores de poliprenil difosfato de dichos compuestos. La presente invención se refiere a esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas.

Literatura

[0006] Publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/005678; Publicación de patente de Estados Unidos No. 2003/0148479; Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21(7):796-802; Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol.

49: 67-71; Wilding et al. (2000) J Bacteriol 182(15): 4319-27; Publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/0194162; Donald et al. (1997) Appl. Env. Microbiol. 63:3341-3344; Jackson et al (2003) Organ. Lett. 5:16291632; Publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/0072323; Publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/0029239; Publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/0110259; Publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/0063182; Patente de Estados Unidos No. 5,460,949; Publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/0077039; Patente de Estados Unidos No. 6,531,303; Patente de Estados Unidos No. 6,689,593; Hamano et al. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:1627-1635; T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(4): 931-934; T. Kazuhiko. (2004) Biotechnology Letters. 26: 1487-1491; Brock et al (2004) Eur J. Biochem. 271: 32273241; Choi, et al (1999) Appl. Environ. Microbio. 65 4363-4368; Parke et al., (2004) Appl. Environ. Microbio. 70: 2974-2983; Subrahmanyam et al (1998) J. Bact. 180: 4596-4602; Murli et al. (2003) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 500-509; Publicación de patente de Estados Unidos No. 2003/0148416; Publicación de Patente Internacional No. WO 2005/033287.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

[0007] La presente invención proporciona un método para producir un isoprenoide o precursor de isoprenoide a través de un mecanismo de mevalonato en Escherichia coli, comprendiendo el método:

(i) cultivar en un medio adecuado una célula de E. coli modificada genéticamente para producir hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintasa (HMGS) heteróloga y HMG-CoA reductasa (HMGR) heteróloga, y donde la célula de E. coli modificada genéticamente se modifica adicionalmente genéticamente para producir una o más enzimas de la ruta del mevalonato heterólogas adicionales seleccionadas entre:

(a): una acetoacetil-CoA tiolasa;

(b): una mevalonato quinasa;

(c): una fosfomevalonato quinasa; y

(d): una mevalonato pirofosfato descarboxilasa;

en el que en ausencia de dicha HMGR heteróloga, los niveles de HMG-CoA producidos en la célula son tóxicos para la célula, y en el que el nivel de actividad relativa de la HMGR producida en la célula de E. coli modificada genéticamente es superior al nivel de actividad relativa de la HMGS producida en la célula de E. coli modificada genéticamente, de manera que el nivel de HMG-CoA presente en la célula no es tóxica para dicha célula y/o no inhibe sustancialmente el crecimiento celular; y

(ii) recuperar el isoprenoide o precursor de isoprenoide producido.

La presente invención proporciona además una célula huésped modificada genéticamente que produce un isoprenoide o precursor de isoprenoide, en la que la célula huésped modificada genéticamente es una célula huésped procariota que no produce normalmente isopentenil pirofosfato a través de un mecanismo de mevalonato, en la que la célula huésped modificada genéticamente se modifica genéticamente para producir hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintasa (HMGS) heteróloga y HMG-CoA reductasa (HMGR) heteróloga, en el que la célula huésped modificada se modifica adicionalmente genéticamente para producir una o más enzimas de la ruta del mevalonato heterólogas adicionales seleccionadas entre:

(a): una acetoacetil-CoA tiolasa;

(b): una mevalonato quinasa;

(c): una fosfomevalonato quinasa; y

(d): una mevalonato pirofosfato descarboxilasa;

en la que en ausencia de dicha HMGR heteróloga, los niveles de HMG-CoA producidos en la célula son tóxicos para la célula, y en el que el nivel de actividad relativa de la HMGR producida en la célula huésped modificada genéticamente es superior al nivel de actividad relativa de la HMGS producida en la célula huésped modificada genéticamente, de manera que el nivel de HMG-CoA presente en la célula no es tóxica para dicha célula y/o no inhibe sustancialmente el crecimiento celular.

Se describen en la presente invención constructos de ácidos nucleicos recombinantes para utilizar en la generación de una célula huésped modificada genéticamente en cuestión, incluyendo constructos de ácidos nucleicos recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas de la ruta de mevalonato, y vectores recombinantes (por ejemplo, vectores de expresión recombinante) que comprenden los mismos. También se describen en la presente invención métodos para identificar ácidos nucleicos que codifican variantes de HMG-CoA reductasa (HMGR) que proporcionan un paliamiento de la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA. También se describen en la presente invención métodos para identificar agentes que reducen la acumulación intracelular de HMG-CoA.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0008] La figura 1 es una representación esquemática de los mecanismos metabólicos de los isoprenoides que dan lugar a la producción de los intermedios de mecanismo biosintético de los isoprenoides polipropenil difosfatos, geranil difosfato (GPP), farnesil difosfato (FPP), y geranilgeranil difosfato (GGPPP), a partir de isopentenil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP).

[0009] La figura 2 es una representación esquemática de la ruta de mevalonato (MEV) para la producción de IPP.

[0010] La figura 3 es una representación esquemática de la ruta de DXP para la producción de IPP y dimetilalil

pirofosfato (DMAPP). [0011] La figura 4 representa la producción de amorfadieno en una cepa de E. coli modificada genéticamente para producir IPP a través de la ruta del mevalonato, cultivada en un medio suplementado sin mevalonato, mevalonato 10 mM, o mevalonato 20 mM.

[0012] La figura 5 representa el efecto inhibidor de la expresión incrementada del operón MevT en el crecimiento

celular de E. coli modificado genéticamente con el operón MevT. [0013] La figura 6 representa el efecto de la expresión incrementada de cada uno de los genes individuales contenidos en el operón MevT y combinaciones de los mismos en el crecimiento celular.

[0014] La figura 7 representa el efecto de la HMGS catalíticamente inactiva en el crecimiento celular de E. coli.

[0015] La figura 8 representa la acumulación intracelular de HMG-CoA en cepas de E. coli que expresan constructos tóxicos de la ruta del mevalonato. [0016] La figura 9 representa el efecto de la acumulación de HMG-CoA en el crecimiento celular. [0017] La figura 10 representa el efecto de la expresión incrementada de tHMGR en el crecimiento celular. [0018] La figura 11 representa el efecto de la expresión incrementada de tHMGR en la acumulación de HMG-CoA. [0019] La figura 12 representa el efecto de la expresión incrementada de tHMGR en la producción de mevalonato. [0020] La figuras 13A-C representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pBAD24MevT (SEQ ID NO:1). [0021] La figuras 14A-C representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pBAD33MevT (SEQ ID NO:2). [0022] La figuras 15A-C representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pMevT (SEQ ID NO:3). [0023] La figuras 16A-D representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pMBIS (SEQ ID NO:4). [0024] La figuras 17A-B representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pADS (SEQ ID NO:5). [0025] La figuras 18A-B representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pAtoB (SEQ ID NO:6). [0026] La figuras 19A-B representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pHMGS (SEQ ID NO:7). [0027] La figuras 20A-C representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pHMGR (SEQ ID NO:8). [0028] La figuras 21A-C representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pBAD18HMGR (SEQ ID NO:9). [0029] La figuras 22A-C representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pHMGSR (SEQ ID NO:10). [0030] La figuras 23A-C representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pBAD33MevT(C159A) (SEQ ID

NO:11). [0031] La figuras 24A-C representan la secuencia de nucleótidos del plásmido pHMGS(C159A) (SEQ ID NO: 12). DEFINICIONES [0032] Los términos "isoprenoide," "compuesto isoprenoide," "terpeno," "compuesto terpeno," "terpenoide," y

"compuesto terpenoide" se utilizan indistintamente en la presente invención. Los compuestos isoprenoides están formados de varias cantidades de unidades los denominados isopreno (C5). El número de átomos de C presentes en los isoprenoides es normalmente divisible uniformemente por cinco (por ejemplo, C5, C10, C15, C20, C25, C30 y C40). Se han descrito isoprenoides y politerpenos irregulares y también se incluyen en la definición de “isoprenoide”. Los compuestos Isoprenoides incluyen pero sin limitación, monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos, politerpenos, y diterpenos.

[0033] Tal como se utiliza aquí, el término "prenil difosfato" se utiliza indistintamente con “pernil pirofosfato” e incluye monoprenil disfosfatos que tiene un único grupo prenilo (por ejemplo, IPP y DMAPP), así como poliprenil difosfatos que incluyen 2 o más grupos prenilo. Los monoprenil difosfatos incluyen isopentenil pirofosfato (IPP) y su isómero dimetilalil pirofosfato (DMAPP).

[0034] Tal como se utiliza aquí, el término "terpeno sintasa" se refiere a cualquier enzima que modifica enzimáticamente IPP, DMAPP, o un poliprenil pirofosfato, se manera que se produce un compuesto terpenoide. El término "terpeno sintasa" incluye enzimas que catalizan la conversión de un pernil difosfato en un isoprenoide.

[0035] La palabra "pirofosfato" se utiliza indistintamente aquí con "difosfato." De este modo, por ejemplo, los términos "pernil difosfato" y "prenil pirofosfato" son intercambiables; los términos "isopentenil pirofosfato" y "isopentenil difosfato" son intercambiables; los términos farnesil difosfato" y farnesil pirofosfato" son intercambiables; etc.

[0036] El término "mecanismo del mevalonato" o "mecanismo del MEV" se utiliza aquí para referirse al mecanismo biosintético que convierte el acetil-CoA en IPP. La ruta del mevalonato comprende enzimas que catalizan las siguientes etapas: (a) condensar dos moléculas de acetil-CoA a acetoacetil-CoA; (b) condensar acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMGCoA; (c) convertir HMG-CoA en mevalonato; (d) fosforilar mevalonato en mevalonato 5fosfato; (e) convertir mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato; y (f) convertir mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil pirofosfato. La ruta del mevalonato se ilustra esquemáticamente en la figura 2. La "mitad superior’ de la ruta del mevalonato se refiere a las enzimas responsables de la conversión de acetil-CoA en mevalonato a través de un intermedio de la ruta del MEV.

[0037] El término "mecanismo de 1-desoxi-D-xilulosa 5-difosfato" o "mecanismo de DXP" se utiliza aquí para referirse al mecanismo que convierte el gliceraldehído-3-fosfato y piruvato en IPP y DMAPP a través de un intermedio de la ruta de DXP, donde la ruta de DXP comprende enzimas que catalizan las reacciones representadas esquemáticamente en la figura 3.

[0038] Tal como se utiliza aquí, el término "prenil transferasa" se utiliza indistintamente con los términos "isoprenil difosfato sintasa" y "poliprenil sintasa" (por ejemplo, "GPP sintasa," "FPP sintasa," "OPP sintasa," etc.) para referirse a una enzima que cataliza la condensación 1’-4 consecutiva de isopentenil difosfato con sustratos cebadores alílicos, dando lugar a la formación de prenil difosfatos de varias longitudes de cadena.

[0039] Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico," utilizados indistintamente aquí, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos. De este modo, este término incluye, pero sin limitación, ADN o ARN de monocadena, doble cadena o múltiples cadenas, ADN genómico, ADNc, híbridos ADN-ARN, o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases de nucleótidos naturales, modificados química o bioquímicamente, no naturales o derivadas.

[0040] Tal como se utiliza aquí, los términos "operón" y "unidad de transcripción individual” se utilizan indistintamente para referirse a dos o más regiones codificantes contiguas (secuencias de nucleótidos que codifican un producto génico, tal como un ARN o una proteína) que son regulados de forma coordinada por uno o más elementos de control (por ejemplo, un promotor). Tal como se utiliza aquí, el término "producto génico" se refiere a ARN codificado por ADN (o viceversa) o proteína que es codificada por un ARN o ADN, donde un gen comprenderá habitualmente una o más secuencias de nucleótidos que codifican una proteína, y pueden incluir también intrones y otras secuencias de nucleótidos no codificantes.

[0041] Los términos "péptido," "polipéptido," y "proteína" se utilizan indistintamente aquí y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados o derivatizados química o bioquímicamente, y polipéptidos que tienen esqueletos peptídicos modificados.

[0042] El término "natural" tal como se utiliza aquí aplicado a un ácido nucleico, una célula, o un organismo, se refiere a un ácido nucleico, célula, u organismo que se halla en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se pueden aislar de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el ser humano es natural.

[0043] El término "ácido nucleico heterólogo," tal como se utiliza aquí, se refiere a un ácido nucleico en el que por lo menos una de las frases siguientes es cierta: (a) el ácido nucleico es foráneo (“exógeno”) a (es decir, no natural hallado en) un microorganismo huésped o célula huésped determinados; (b) el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que se halla de forma natural en (por ejemplo, es “endógena a”) un microorganismo huésped o célula huésped determinados (por ejemplo, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos endógena al microorganismo huésped o célula huésped); sin embargo, en el contexto de un ácido nucleico heterólogo, la misma secuencia de nucleótidos que la hallada endógenamente se produce en una cantidad no natural (por ejemplo, mayor que la esperada o mayor que la hallada de forma natural) en la célula, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que difiere en la secuencia de la secuencia de nucleótidos endógena, pero codifica la misma proteína (que tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos) que la hallada endógenamente se produce en una cantidad no natural (por ejemplo, mayor que la esperada o mayor que la hallada de forma natural) en la célula; (c) el ácido nucleico comprende dos o más secuencias de nucleótidos que no se hallan en la misma relación entre sí en la naturaleza, por ejemplo, el ácido nucleico es recombinante. Un ejemplo de un ácido nucleico heterólogo es una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR unida operativamente a un elemento de control de la transcripción (por ejemplo, un promotor) a la que una secuencia codificante de HMGR endógena (natural) no está normalmente unida operativamente. Otro ejemplo de un ácido nucleico heterólogos un plásmido con un elevado número de copias que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR. Otro ejemplo de un ácido nucleico heterólogo es un ácido nucleico que codifica HMGR, donde una célula huésped que no produce normalmente HMGR se modifica genéticamente con el ácido nucleico que codifica HMGR; dado que los ácidos nucleicos que codifican HMGR no se hallan de forma natural en la célula huésped, el ácido nucleico es heterólogo a la célula huésped modificada genéticamente.

[0044] "Recombinante," tal como se utiliza aquí, significa que un ácido nucleico particular (ADN o ARN) es el producto de varias combinaciones de etapas de clonación, restricción, y/o unión que dan lugar a un constructo que tiene una secuencia estructural codificante y no codificante diferenciable de los ácidos nucleicos endógenos hallados en sistemas naturales. En general, las secuencias de ADN que codifican la secuencia codificante estructural se pueden ensamblar a partir de fragmentos de ADNc y enlazadores de oligonucleótidos cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos sintéticos, para proporcionar un ácido nucleico sintético que es capaz de expresarse a partir de una unidad transcripcional recombinante contenida en una célula o en un sistema de transcripción y traducción libre de células. Dichas secuencias se pueden proporcionar en forma de un marco de lectura abierto no interrumpido por secuencias no traducidas internas o intrones, que están presentes normalmente en genes eucariotas. El ADN genómico que comprende las secuencias relevantes también se pueden utilizar en la formación de un gen o unidad transcripcional recombinante. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en 5’ ó 3’ con respecto al marco de lectura abierto, donde dichas secuencias no interfieren con la manipulación o la expresión de las regiones codificantes, y pueden de hecho actuar para modular la producción de un producto deseado mediante varios mecanismos (véanse las “secuencias reguladoras de ADN” a continuación).

[0045] De este modo, por ejemplo, el término polinucleótido o ácido nucleico "recombinante" se refiere a aquel que no es natural, por ejemplo, se produce mediante la combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados a través de la intervención humana. Esta combinación artificial se realiza a menudo mediante medios de síntesis química, o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética. Esto se realiza normalmente para sustituir un codón por un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido conservativo, mientras que normalmente introduce o elimina un sitio de reconocimiento de secuencia. Alternativamente, se realiza para unir juntos segmentos de ácidos nucleicos de funciones deseadas para generar una combinación deseada de funciones. Esta combinación artificial se realiza a menudo mediante medios de síntesis química, o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética

[0046] Por "constructo" se entiende un ácido nucleico recombinante, generalmente ADN recombinante, que ha sido generado con el objetivo de expresar una secuencia o secuencias de nucleótidos específicas, o va a utilizarse en la construcción de otras secuencias de nucleótidos recombinantes.

[0047] Tal como se utiliza aquí, el término "ácido nucleico exógeno" se refiere a un ácido nucleico que no está normalmente o se halla de forma natural en y/o es producido por una bacteria, organismo o célula determinada en la naturaleza. Tal como se utiliza aquí, el término "ácido nucleico endógeno" se refiere a un ácido nucleico que se halla normalmente en y/o es producido por una bacteria, organismo o célula determinada en la naturaleza. Un “ácido nucleico endógeno” también se refiere como un “ácido nucleico nativo” o un ácido nucleico que es “nativo” a una bacteria, organismo o célula determinada. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican HMGS, mevalonato quinasa, y fosfomevalonato quinasa en el ejemplo 1 representan ácidos nucleicos exógenos a E. coli. Estos ácidos nucleicos de la ruta del mevalonato se clonaron a partir de Sacchromyces cerevisiae. En S. cerevisiae, las secuencias de genes que codifican HMGS, MK, y PMK en el cromosoma serían ácidos nucleicos “endógenos”.

[0048] Los términos "secuencias reguladoras de ADN," "elementos de control," y "elementos reguladores," utilizados indistintamente aquí, se refieren a secuencias de control transcripcional y traduccional, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores, señales de degradación de proteínas, y similares, que proporcionan y/o regulan la expresión de una secuencia codificante y/o producción de un polipéptido codificado en una célula huésped.

[0049] El término "transformación" se utiliza indistintamente aquí con "modificación genética" y se refiere a un cambio genético permanente o traNsitorio inducido en una célula después de la introducción nuevo ácido nucleico (es decir, ADN exógeno a la célula). El cambio (“modificación”) genética se puede llevar a cabo mediante la incorporación del nuevo ADN en el genoma de la célula huésped o mediante el mantenimiento traNsitorio o estable del nuevo ADN como elemento episomal. Cuando la célula es una célula eucariota, en general se coNsigue un cambio genético permanente mediante la introducción del ADN en el genoma de la célula. En células procariotas, los cambios permanentes se pueden introducir en el cromosoma o a través de elementos extracromosómicos, tales como plásmidos y vectores de expresión, que pueden contener uno o más marcadores seleccionables para ayudar en su mantenimiento en la célula huésped recombinante.

[0050] “Unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite actuar en su manera pretendida. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a su transcripción o expresión. Tal como se utiliza aquí, los términos "promotor heterólogo" y "regiones de control heterólogas" se refieren a promotores y otras regiones de control que no están normalmente asociados con un ácido nucleico concreto en la naturaleza. Por ejemplo, una "región de control de la transcripción heteróloga a una región codificante" es una región de control de la transcripción que no está normalmente asociada con la región codificante en la naturaleza.

[0051] Una "célula huésped,", tal como se utiliza aquí, indica una célula procariota que puede utilizarse o se ha utilizado como un receptor para un ácido nucleico (por ejemplo, un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más productos génicos de un mecanismo biosintético, tales como los productos génicos de la ruta del mevalonato), e incluye la progenie de la célula original que se ha modificado genéticamente por el ácido nucleico. Se entiende que la progenie de una célula individual puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total a la original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una “célula huésped recombinante” (también referida como “célula huésped modificada genéticamente”) es una célula huésped en que se ha introducido un ácido nucleico heterólogo, por ejemplo, un vector de expresión. Por ejemplo, una célula huésped procariota en cuestión es una célula huésped procariota modificada genéticamente (por ejemplo, una bacteria), debido a la introducción en una célula huésped procariota adecuada de un ácido nucleico heterólogo, por ejemplo, un ácido nucleico exógeno que es foráneo a (no hallado normalmente en la naturaleza en) la célula huésped procariota, o un ácido nucleico recombinante que no se halla normalmente en la célula huésped procariota.

[0052] Tal como se utiliza aquí, el término "aislado" pretende describir un polinucleótido, un polipéptido, o una célula que está en un medio diferente de aquel en que el polinucleótido, el polipéptido o la célula aparece de forma natural. Una célula huésped modificada genéticamente aislada puede estar presente en una población mixta de células huésped modificadas genéticamente.

[0053] Se pueden preparar cassettes de expresión que comprenden una región o regiones de inicio de la transcripción o de control de la transcripción (por ejemplo, un promotor), la región codificante para la proteína de interés, y una región de terminación de la transcripción. Las regiones de control de la transcripción incluyen aquellas que proporcionan la sobreexpresión de la proteína de interés en la célula huésped modificada genéticamente; aquellas que proporcionan una expresión inducible, de manera que cuando se añade un agente inductor al medio de cultivo, se induce o aumenta la transcripción de la región codificante de la proteína de interés hasta un nivel superior al de antes de la inducción.

[0054] Un ácido nucleico es "hibridable" a otro ácido nucleico, tal como ADNc, ADN genómico, o ARN, cuando una forma de cadena única del ácido nucleico se puede hibridar a otro ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y lavado son conocidas y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente el capítulo 11 y la Tabla 11.1 en la misma; y Sambrook, J. y Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la “rigurosidad” de la hibridación. Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para cribar fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homólogas de organismos relacionados de forma distante, hasta fragmentos altamente similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados. Las condiciones de hibridación y los lavados de post-hibridación son útiles para obtener las condiciones de rigurosidad determinadas deseadas de la hibridación. Un grupo de lavados post-hibridación ilustrativos es una serie de lavados que empiezan con 6 x SSC (donde SSC es NaCl 0,15 M y tampón citrato 15 mM), SDS al 0,5% SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos, a continuación se repite con 2 x SSC, SDS al 0,5% a 45°C durante 30 minutos, y a continuación se repite dos veces con 0,2 x SSC, SDS al 0,5% a 50°C durante 30 minutos. Otras condiciones de rigurosidad se obtienen utilizando temperaturas más elevadas en las que los lavados son idénticos a los anteriores a excepción de la que la temperatura del final de dos lavados de 30 minutos en 0,2 x SSC, SDS al 0,5%, se incrementa hasta 60°C. Otro grupo de condiciones de rigurosidad elevada utiliza dos lavados finales en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 65°C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación astringentes es la hibridación a 50°C o superior y 0,1xSSC (cloruro sódico 15 mM/citrato sódico 1,5 mM). Otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es incubación durante la noche a 42°C en una solución: formamida al 50%, 5 X SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 !g/ml de ADN de esperma de salmón roto desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente 65°C. Las condiciones de hibridación rigurosas y las condiciones de lavado posthibridación son condiciones de hibridación y codiciones de lavado de post-hibridación que son por lo menos tan rigurosas como las condiciones representativas anteriores.

[0055] La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles desapareamientos entre bases. La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementación, variables conocidas en la técnica. Cuanto mayor es el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor es el valor de la temperatura de fusión (Tf) para híbridos de ácidos nucleicos que tienen aquellas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a una Tf superior) de hibridaciones de ácido nucleico disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos superiores a 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular Tf (véase Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Para hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los desapareamientos se vuelve más importante, y la longitud de los oligonucleótidos determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Habitualmente, la longitud de un ácido nucleico hibridable es por lo menos aproximadamente de 10 nucleótidos. Las longitudes mínimas ilustrativas para un ácido nucleico hibridable son: por lo menos aproximadamente de 15 nucleótidos; por lo menos aproximadamente de 20 nucleótidos; y por lo menos aproximadamente de 30 nucleótidos. Además, el experto en la materia reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado se pueden ajustar según sea necesario según los factores, tales como la longitud de la sonda.

[0056] El término "sustitución conservativa de aminoácidos” se refiere a la intercambiabilidad de proteínas de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas que coNsiste en glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales ahidroxil-alifáticas que coNsiste en serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida que coNsisten en asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas que coNsisten en fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas que coNsisten en lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre que coNsisten en cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos de ejemplo son valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisinaarginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina.

[0057] Los "ácidos nucleicos sintéticos" se pueden ensamblar a partir de bloques de construcción de oligonucleótidos que se sintetizan químicamente utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Estos bloques de construcción se ligan e hibridan para formar segmentos génicos que a continuación se ensamblan enzimáticamente para construir el gen completo. “Sintetizado químicamente”, en relación con una secuencia de ADN, significa que los nucleótidos del componente se ensamblaron in vitro. La síntesis química manual de ADN se puede realizar utilizando procedimientos bien establecidos, o se puede llevar a cabo una síntesis química automatizada utilizando uno de un conjunto de máquinas disponibles comercialmente. La secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos se puede modificar para una expresión óptima en base a la optimización de la secuencia de nucleótidos para reflejar la tendencia del codón de la célula huésped. El experto en la materia valora la probabilidad de una expresión satisfactoria si la utilización de un codón es propensa a aquellos codones favorecidos por el huésped. La determinación de codones preferidos se puede basar en un reconocimiento de genes derivados de la célula huésped en la que está disponible la información de la secuencia.

[0058] Un polinucleótido o polipéptido tiene un cierto porcentaje de “identidad en la secuencia” con otro polinucleótido o polipéptido, lo que significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases o aminoácidos es el mismo, y en la misma posición relativa, cuando se comparan las dos secuencias. La similitud de secuencias se puede determinar de diferentes maneras. Para determinar la identidad de secuencia, las secuencias se pueden alinear utilizando los métodos programas informáticos, incluyendo BLAST, disponibles en la página web ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. Otro algoritmo de alineación es FASTA, disponible en el paquete Genetics Computing Group (GCG), de Madison, WiscoNsin, Estados Unidos, una subsidiaria totalmente propiedad de Oxford Molecular Group, Inc. Otras técnicas para la alineación se describen en Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., una división de Harcourt Brace & Co., San Diego, California, Estados Unidos. De particular interés son los programas de alineación que permiten espacios en la secuencia. El algoritmo Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite espacios en las alineaciones de secuencia. Véase Meth. Mol. Biol.

70: 173-187 (1997). Además, el programa GAP que utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch se puede utilizar para alinear secuencias. Véase J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).

[0059] Antes de describir la presente invención con más detalle, debe entenderse que la presente invención no se limita a realizaciones particulares descritas, y, por tanto, naturalmente, puede variar. Debe entenderse también que la terminología utilizada aquí es para el objetivo de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará sólo por las reivindicaciones adjuntas.

[0060] Cuando se proporciona un intervalo de valores, debe entenderse que cada valor que interviene, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dictamine claramente lo contrario, entre el límite superior y el límite inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o que interviene en este intervalo indicado, se encuentra comprendido en la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en los intervalos más pequeños y también están comprendidos en la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen alguno o ambos de esos límites incluidos también están incluidos en la invención.

[0061] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la invención. Aunque se puede utilizar en la práctica o evaluación de la presente invención cualquier método y material similar a los descritos aquí, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación.

[0062] Debe indicarse que, tal como se utiliza aquí y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/una" y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dictamine claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a “una célula huésped modificada genéticamente” incluye una pluralidad de dichas células huésped y la referencia a la “HMG-CoA reductasa" incluye la referencia a una o más HMG-CoA reductasas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y así sucesivamente. Debe indicarse también que las reivindicaciones se pueden redactar para excluir cualquier elemento opcional. Por tanto, esta afirmación pretende servir como base antecedente para utilizar dicha terminología exclusiva como “solamente”, “sólo” y similares en relación con la redacción de los elementos de la reivindicación o utilización de una limitación “negativa”.

[0063] Las publicaciones aquí descritas se proporcionan solamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no presenta el derecho de prefechar dicha publicación debido a la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden ser necesarias de confirmar independientemente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0064] La presente invención proporciona métodos de reducción de la acumulación inhibidora de HMG-CoA en células huésped genéticamente modificadas útiles en la producción de isoprenoides o precursor de isoprenoides y métodos para incrementar la producción de un isoprenoide o precursor de isoprenoide en estas células huésped a través de la eliminación de esta toxicidad. Los métodos implican en general modular el nivel de hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) en la célula huésped, de manera que el nivel de HMG-CoA no es tóxico para la célula huésped y/o no inhibe sustancialmente el crecimiento celular de la célula huésped. La presente invención también proporciona células huésped modificadas genéticamente que son adecuadas para utilizar en un método en cuestión. Se describen aquí constructos de ácido nucleico recombinantes para utilizar en la generación de una célula huésped modificada genéticamente en cuestión. También se describen aquí métodos para identificar variantes de polipéptidos de HMGR que proporcionan paliamiento de la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA. Los métodos implican en general determinar el efecto, si lo hay, de una variante de HMGR de prueba en HMG-CoA. También se describe aquí la toxicidad celular inducida por la acumulación. También se describen aquí métodos para identificar inhibidores de HMGS. Los métodos en general implican determinar el efecto, si lo hay, de un compuesto de prueba en la toxicidad celular inducida por la acumulación de HMG-CoA.

[0065] La presente invención se basa en parte en la observación inesperada de que HMG-CoA, un intermedio en la ruta del mevalonato, es tóxico cuando se acumula en un huésped microbiano modificado genéticamente para producir isoprenil pirofosfato (IPP) o un precursor de IPP a través de la ruta del mevalonato. Esta observación se realizó estudiando la mayor producción de compuestos isoprenoides (y/o precursores, tales como mevalonato, IPP, y poliprenil difosfatos) en células huésped (por ejemplo, un microorganismo huésped) que se transformaron (“modificaron genéticamente”) con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas de la ruta de mevalonato. Las enzimas de la ruta del mevalonato se representan en la figura 2. La ruta del mevalonato comprende las siguientes reacciones enzimáticas: (a) condensación de dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA; (b) condensación de acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA; (c) conversión de HMG-CoA en mevalonato; (d) fosforilación de mevalonato en mevalonato 5-fosfato; (e) converción de mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato; y (f) conversión de mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil pirofosfato. La observación de que el incremento del nivel de expresión de la ruta del mevalonato daba lugar a la inhibición del crecimiento celular era inesperada.

[0066] Se pueden generar compuestos isoprenoides (para constructos y métodos adecuados, véanse las publicaciones de patentes de Estados Unidos Nos. 20030148479, y 20040005678; y Martin et al. (2003) Nature Biotech. 21(7):796-802) mediante la expresión de la ruta del mevalonato en una bacteria. Las enzimas de la ruta del mevalonato requeridas para la producción de IPP varían dependiendo de las condiciones de cultivo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una célula huésped que produce compuestos isoprenoides o precursores de isoprenoides es aquella que se ha modificado genéticamente con dos o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican la mevalonato quinasa (MK), la fosfomevalonato quinasa (PMK), la mevalonato pirofosfato descarboxilasa (MPD) (y opcionalmente también la isopentenil pirofosfato isomerasa); y la célula huésped se cultiva en medio que incluye mevalonato. En otras realizaciones, una célula huésped que produce compuestos isoprenoides o precursores de isoprenoides es aquella que se ha modificado genéticamente con dos o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, hidroximetilglutaril-CoA sintasa (HMGS), hidroximetilglutaril-CoA reductasa (HMGR), MK, PMK, y MPD (y opcionalmente también IPP isomerasa).

[0067] En un esfuerzo por incrementar los niveles de producción de isoprenoides en huéspedes alterados genéticamente para contener un mecanismo de mevalonato exógeno o en huéspedes que ya contienen un mecanismo de mevalonato nativo (endógeno), se puede incrementar el nivel de actividad de las enzimas individuales en la ruta en la célula. Una herramienta habitual utilizada para modular los niveles de actividad de enzimas modificadas en una célula es modular la velocidad en que se transcribe un ARNm que codifica la enzima. Se puede intentar conseguir este objetivo cambiando el promotor (secuencias de inicio de la transcripción o el control de la transcripción) por un promotor más fuerte.

[0068] En células huésped que expresan la ruta del mevalonato, se esperaría en general que el cambio de fuerza del promotor que controla la expresión de la ruta completo del mevalonato cambiaría los niveles de producción de los isoprenoides. Por ejemplo, cuando se cambia de un promotor inducible por lactosa modificado, tal como el hallado en los plásmidos pBluescript y pBBR1MCS, a un promotor más fuerte, tal como un promotor inducible por arabinosa o lactosa de consenso, se esperaría en general que aumentara la expresión de cada una de las enzimas, incrementando de este modo los niveles de producción de isoprenoides. Debido a que la ruta del mevalonato alimenta el abundante precursor celular acetil-CoA, la producción de IPP no se espera que esté limitada por la producción del precursor. Al contrario de lo que se esperaría, se observó que el incremento del nivel de expresión de la primera mitad de la ruta del mevalonato (es decir, incrementando el nivel de expresión de acetoacetil CoA tiolasa, HMGS, y HMGR) daba lugar a la inhibición del crecimiento celular, aunque la cantidad del producto isoprenoide deseado no se incrementaba.

[0069] Cuando se introduce una molécula de ADN recombinante en un organismo para la producción de una enzima, tanto si esa enzima va a utilizarse catalíticamente en la célula o purificarse de la célula, se pueden observar efectos tóxicos (B.R. Glick. (1995) Biotech Advances. 13(12): 247-261). Estos efectos pueden ser debidos a la utilización de los recursos celulares del huésped, a una actividad inesperada de la enzima o a la acumulación de un intermedio tóxico. El último caso puede estar causado por los niveles incrementados del producto final de la ruta, o puede ser específico a una enzima individual para la que la actividad está fuera del equilibrio con la de las otras enzimas en la ruta que conduce a la acumulación de un intermedio hasta niveles que son tóxicos para la célula. Además, es difícil predecir a priori a qué nivel los metabolitos de un mecanismo introducido será tóxico o los niveles a los que empezarán a mostrar efectos tóxicos como intermedios químicamente similares pueden tener efectos intracelular drásticamente diferentes.

[0070] Por ejemplo, los niveles de acetil-CoA pueden ser bastante elevados en una célula, sin ningún efecto tóxico. Se ha observado que el propionil-CoA es tóxico para Aspirgillus nidulans desarrollado en glucosa (Brock et al. Eur J. Biochem. 271, 3227-3241 (2004)). El E. coli diseñado para la acumulación de PHA utilizando una propionil-coA sintetasa no muestra una inhibición del crecimiento inducido por propionil-CoA aparente y se puede desarrollar hasta deNsidades celulares elevadas (Choi, et al. Appl. Environ. Microbio. 65 4363-4368 (1999)). Se observó seNsibilidad a cafeato, p-cumarato, y ferulato en cepas de Acinetobacter con una falta de hidroxicinnamoil-CoA hidratasa/liasa potencialmente debida a la acumulación de Hidroxicinnamoil-CoA (Parke et al., Appl. Environ. Microbio. 70, 29742983 (2004)). La misma referencia demostró seNsibilidad a los mismos tres sustratos en E. coli tras la sobreexpresión de hcaC, potencialmente debida a la acumulación de hidroxicinnamoil-CoA. La sobreproducción de una 1-cetoacil proteína portadora sintetasa II (KAS II) en E. coli conducía a la acumulación de malonil-coA hasta niveles que inhibían el crecimiento. La expresión de malonil-CoA:ACP transacilasa, la enzima que cataliza la conversión de malonil-CoA en malonyl-ACP, junto con KAS II paliaron parcialmente esta oxicidad (Subrahmanyam et al. J. Bact. 180 4596-4602 (1998)). La expresión de malonil/metilmalonil-CoA ligasa en E. coli combinada con alimentación de metilmalonato condujo a acumulaciones de metilmalonil-CoA hasta como máximo el 90% del grupo de acil-coA. No se describió la inhibición del crecimiento en esta cepa (Murli et al. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30 500-509 (2003)).

[0071] La mayoría de organismos que contienen la ruta del mevalonato, Homo sapiens por ejemplo, utilizan HMGR como punto regulador en la producción de isoprenoides. Para limitar la producción de isoprenoides, estos organismos reducen la actividad de HMGR, la cual induciría de forma natural el aumento de su precursor HMG-CoA. Este aumento de HMG-CoA presumiblemente también aparecería en pacientes que toman fármacos para disminuir el colesterol [(tales como las estatinas, Atorvastatina (Lipitor) Fluvastatina (Lescol) Lovastatina (Altocor, Mevacor) Pravastatina (Pravachol) Rosuvastatina (Crestor), y Simvastatina (Zocor)],)), que inhiben la actividad de HMGR. La amplia utilización de fármacos de estatina sin toxicidad sistémica debido a la acumulación de HMG-CoA indicaría que la HMG-CoA no es un metabolito tóxico para el Homo sapiens.

[0072] En el caso de toxicidad debido a la expresión de las enzimas de la ruta del mevalonato, el análisis del metabolito utilizando cromatografía líquida –espectrometría de masas unía e fenotipo de la inhibición del crecimiento con la acumulación del intermedio de la ruta, 3-hidroxi-3-metilglutarilcoenzima A (HMG-CoA). Este hallazgo demuestra que en células huésped microbianas diseñadas (“modificadas genéticamente”), el intermedio HMG-CoA se puede acumular y provocar la muerte celular o evitar que la célula crezca adicionalmente y, por tanto, impida la producción de IPP limitando el crecimiento celular y/o indicando una criba en el flujo de carbono a los isoprenoides deseados.

[0073] La acumulación de HMG-CoA implica que existe un desequilibrio entre la producción de HMG-CoA y la posterior conversión de HMG-CoA en mevalonato en la ruta de mevalonato diseñada. Al incrementar la actividad total de HMG-CoA Reductasa (HMGR), que es la enzima que convierte HMG-CoA en mevalonato, esta toxicidad se supera, dando lugar a un incremento en la producción de mevalonato e isoprenoides sintetizados a partir de mevalonato. Otra manera de disminuir la acumulación de HMG-CoA es limitar la producción de HMG-CoA disminuyendo la actividad total de HMG-CoA sintasa (HMGS), que es la enzima que convierte la acetoacetil-CoA en HMG-CoA. Otra manera de disminuir la acumulación de HMG-CoA es disminuir el nivel y/o la actividad de una enzima, tal como acetoacetil-CoA tiolasa, que afecta a la producción de acetoacetil-CoA, que es un precursor directo de HMG-CoA.

[0074] Según los métodos de la invención, se pueden ajustar los niveles de HMG-CoA hasta aquellos que eliminan la toxicidad y permiten el crecimiento correcto de células microbianas, permitiendo de este modo aumentos significativos en la producción de isoprenoides o precursores de isoprenoides. Es importante indicar que aunque el ajuste de los niveles de HMG-COA puede no conducir a un incremento en el isoprenoide producido por célula e incluso puede conducir a un descenso, un incremento en el crecimiento celular puede más que compensar esas pérdidas, dar lugar a la producción de más isoprenoide en un cultivo. Por ejemplo y como ilustración, si se modifican las actividades de HMGS, de manera que los niveles de HMG-CoA disminuyen en la célula y el nivel de isoprenoide por célula disminuye en un 10%, pero el crecimiento celular se duplica, la productividad total del cultivo (la actividad por célula multiplicada por el número de células en el cultivo), de hecho, aumentará. De este modo, la producción de IPP o un compuesto isoprenoide puede incrementarse mediante la reducción del nivel de actividad de HMG-CoA Sintasa y/o mediante el incremento del nivel de actividad de HMG-CoA Reductasa en la célula.

[0075] La modulación (incremento o disminución) del nivel de HMGS activa y/o actividad de HMGR en una célula se puede conseguir mediante: 1) modulación (incremento o disminución) de la transcripción de un ácido nucleico que codifica la enzima; 2) la modulación (incremento o disminución) de la traducción de un ARNm que codifica la enzima; 3) la modulación (incremento o disminución) de la estabilidad del ARNm que codifica la enzima; 4) modulación (incremento o disminución) de la estabilidad de la propia enzima; y 5) modulación (incremento o disminución) de la actividad enzimática de la enzima. Para reducir o eliminar el efecto tóxico de HMG-CoA y aumentar la producción de isoprenoide y/o precursor de isoprenoide, la presente invención también proporciona células, y ácidos nucleicos y vectores de expresión útiles en la preparación de dichas células, en que la ruta del mevalonato se ha rediseñado de manera que los niveles de HMG-CoA ya no son tóxicos.

[0076] Los esfuerzos por conseguir una producción más elevada de IPP se han centrado en la sobreexpresión de enzimas posiblemente limitantes de la velocidad que incluyen HMGR en células que contienen una ruta de mevalonato endógeno. Véase, por ejemplo, Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 67-71 (que produce el isoprenoide escualeno); Donald et al. (1997) Appl. Env. Microbiol. 63: 3341-3344 (que produce el isoprenoide escualeno); y Jackson et al. (2003) Org. Letters 5:1629-1632 (que produce el isoprenoide epi-cedrol). Estos artículos no describen la paliación de la toxicidad inducida por HMG-CoA a través de la expresión de HMGR, sino que en cambio están dirigidos por la observación de que en muchos organismos la HMGR es el punto de regulación desarrollado para la producción de isoprenoides en organismos que utiizan de forma natural la ruta del mevalonato para producir isoprenoides. En estos casos, la producción del respectivo isoprenoide se incrementó de tres a diez veces tras la sobreexpresión de la HMGR.

[0077] Los siguientes estudios han observado las enzimas de la ruta de mevalonato en E coli. Hamano et al ((2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65: 1627-1635) describieron que los intentos por transformar la cepa de E. coli DYM1 con un constructo con un número de copias elevado pGEM-MEV, que contenía un clúster de la ruta del mevalonato de Streptomyces, no fueron satisfactorios. Los intentos por transformar la misma cepa con pMW-MEV, un constructo con un número de copias bajo que contenía el mismo clúster de la ruta del mevalonato, fueron satisfactorios. Los autores sugirieron que una expresión elevada de los genes de la ruta del mevalonato de Streptomyces en E. coli podría ser letal. Wilding et al. (2000) J Bacteriol 182(15): 4319-27) describieron que en presencia de mevalonato la bacteria gram-positiva S. pneumoniae, los mutantes que carecían de HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa eran viables, mientras que los mutantes que sólo carecían de HMG-CoA sintasa no eran viables.

[0078] Adicionalmente, se describen en el presente documento métodos de cribado para identificar un producto génico que tiene la actividad de detoxificación de HMG-CoA. Los métodos implican en general a) producir una célula de prueba mediante la introducción en una célula huésped modificada genéticamente de un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico candidato, en el que la célula huésped modificada genéticamente produce, en ausencia de dicho ácido nucleico exógeno, HMG-CoA a niveles eficaces para inhibir el crecimiento de la célula huésped modificada genéticamente; y b) determinar el efecto, si lo hay, de la expresión del producto génico candidato en el crecimiento de la célula de prueba. Una reducción en la inhibición del crecimiento indica que el ácido nucleico exógeno codifica un producto génico que tiene suficiente actividad para paliar la actividad de HMG-CoA.

[0079] Adicionalmente, en el presente documento se describen métodos de cribado para identificar compuestos que inhiben la acumulación de HMG-CoA. Los métodos implican en general a) poner en contacto una célula de prueba que produce HMG-CoA a niveles eficaces para inhibir su crecimiento con el compuesto de prueba; y b) determinar el efecto en el crecimiento celular, si lo hay, del contacto del compuesto de prueba con la célula. Una reducción en la inhibición del crecimiento indica que el compuesto exógeno tiene suficiente actividad para paliar la toxicidad de HMG-CoA.

[0080] Tal como se ha mencionado anteriormente, la mayoría de organismos que contienen la ruta del mevalonato, Homo sapiens por ejemplo, utilizan HMGR como un punto regulador en la producción de isoprenoides. Para limitar la producción de isoprenoides, estos organismos reducen la actividad de HMGR, lo cual causaría un aumento de su precursor HMG-CoA. Este aumento de HMG-CoA también tendría lugar en pacientes que toman fármacos para disminuir el colesterol que inhiben la actividad de HMGR.

[0081] Para ayudar a entender la presente invención, se proporcionan las figuras 1-3, las cuales ilustran esquemáticamente rutas biosintéticas que conducen a la producción de isoprenoides o precursores de isoprenoides.

[0082] La figura 1 representa rutas de isoprenoides que implican la modificación de isopentenil difosfato (IPP) y/o su isómero dimetilalil difosfato (DMAPP) por prenil transferasas para generar los poliprenil difosfatos geranil difosfato (GPP), farnesil difosfato (FPP), y geranilgeranil difosfato (GGPP). GPP y FPP son modificados adicionalmente mediante terpeno sintasas para generar monoterpenos y sesquiterpenos, respectivamente; y GGPP es modificado adicionalmente por terpeno sintasas para generar diterpenos y carotenoides. IPP y DMAPP con generados por una de las dos rutas: la ruta del mevalonato (MEV) y la ruta del 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato (DXP).

[0083] La figura 2 representa esquemáticamente la ruta del MEV, donde el acetil CoA se convierte a través de una serie de reacciones en IPP.

[0084] La figura 3 representa esquemáticamente la ruta del DXP, en la que el piruvato y el D-gliceraldehido-3-fosfato se convierten a través de una serie de reacciones en IPP y DMAPP. Las células eucariotas diferentes a las células vegetales utilizan la ruta de MEV para isoprenoides exclusivamente para convertir acetil-coenzima A (acetil-CoA) en IPP, que posteriormente se isomeriza en DMAPP. Las plantas utilizan las rutas del MEV y las rutas independientes del MEV, o las rutas del DXP para la síntesis de isoprenoides. Los procariotas, con algunas excepciones, utilizan la ruta de DXP para producir IPP y DMAPP por separado a través de un punto de ramificación.

MÉTODOS DE PALIACIÓN DE LA TOXICIDAD DE HMG-COA Y AUMENTO DE LA PRODUCCIÓN DE ISOPRENOIDES Y PRECURSORES DE ISOPRENOIDES

[0085] La presente invención proporciona métodos de producción de un isoprenoide o precursor de isoprenoide en una célula huésped que comprende, o se modifica genéticamente para comprender, ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas en la ruta del mevalonato. Los métodos implican en general modular el nivel de HMG-CoA en la célula, de manera que el nivel de HMG-CoA no es tóxico para la célula y/o no inhibe sustancialmente el crecimiento celular, aunque el nivel de HMG-CoA proporciona una mayor producción de isoprenoide o precursor de isoprenoide por la célula. Los métodos implican en general cultivar una célula huésped modificada genéticamente en un medio adecuado, donde la célula huésped modificada genéticamente es aquella que es modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos a la célula huésped, donde uno o más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos que proporcionan la paliación o reducción de la inhibición o toxicidad del crecimiento celular inducido por la acumulación de HMG-CoA. Los polipéptidos que proporcionan una paliación o reducción de la inhibición o toxicidad del crecimiento celular inducido por la acumulación de HMG-CoA incluyen, pero sin limitación, HMG-CoA reductasa (HMGR), HMG-CoA sintasa (HMGS), y una enzima que afecta el nivel de acetoacetil-CoA (el precursor de HMG-CoA) o mevalonato. El nivel de un compuesto isoprenoide (y/o un precursor isoprenoide en la cascada abajo de HMG-CoA, tal como mevalonato, isoprenil pirofosfato (IPP), o un poliprenil difosfato) producido en la célula huésped modificada genéticamente es superior al nivel del compuesto isoprenoide (y/o un precursor isoprenoide cascada abajo de HMG-CoA, tal como mevalonato, IPP, o un poliprenil difosfato) producido en una célula huésped de control ("original") que no está modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que codifican HMGS y/o HMGR. La presente invención proporciona además. También se describen en este documento células huésped que son adecuadas para utilizar en un método en cuestión. También se describen en el presente documento constructos de ácidos nucleicos recombinantes para utilizar en la generación de una célula huésped modificada genéticamente en cuestión.

[0086] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para reducir la toxicidad de HMG-CoA y aumentar la producción de un isoprenoide o precursor de isoprenoide a través de la ruta de mevalonato en una célula huésped, donde la célula huésped produce el isoprenoide o precursor de isoprenoide a través de la ruta del mevalonato. El método implica en general: (a) modificar genéticamente la célula huésped para contener uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas que, cuando se producen en la célula, reducen la inhibición del crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA, en comparación con una célula huésped original de control que no está modificada genéticamente con dichos ácidos nucleicos heterólogos; y (b) cultivar la célula huésped modificada genéticamente bajo condiciones, tales que el nivel de isoprenoide o precursor de isoprenoide producido en la célula huésped modificada genéticamente es superior al nivel de isoprenoide o precursor de isoprenoide producido en la célula huésped original de control.

[0087] El nivel de HMG-CoA en una célula huésped original se modula disminuyendo el nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad de HMGR en la célula y/o equilibrando el nivel de actividad de HMGS y actividad de HMGR, de manera que se palia la toxicidad celular inducida por la acumulación de HMG-CoA. El nivel de HMG-CoA en una célula huésped original también es modulado por modificaciones genéticas que inducen al flujo equilibrado de metabolitos a través de la ruta del mevalonato, tal como se ha descrito con más detalle a continuación.

[0088] La presente invención es aplicable a células huésped que producen IPP y/o mevalonato a través de la ruta del mevalonato. Dichas células huésped son referidas aquí como células huésped “originales” y comprenden, o son modificadas genéticamente para comprender, ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas en la ruta del mevalonato (y, por tanto, producen IPP y/o mevalonato a través de la ruta del mevalonato). Las células huésped originales muestran una toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA, donde el nivel de HMG-CoA intracelular inhibe el crecimiento celular, en ausencia de una modificación genética adicional, tal como se describe en la presente invención; de este modo, por ejemplo, una célula huésped original, pero para una modificación genética tal como se describe en la presente invención, acumularía HMG-CoA intracelularmente y mostraría una toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA. Las células huésped originales se modifican genéticamente para incluir uno o más ácidos nucleicos heterólogos a la célula huésped, donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótidos que codifican HMGR y/o HMGS y que proporcionan un nivel incrementado de actividad de HMGR y/o un nivel disminuido de actividad de HMGS en la célula. La inhibición del crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA en la célula huésped modificada genéticamente con el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican HMGR y/o HMGS se reduce, en comparación con una célula huésped original no modificada genéticamente con el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican HMGR y/o HMGS. La modificación genética de una célula huésped con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican HMGR y/o HMGS da lugar a: a) un menor nivel de actividad de HMGS en la célula; b) un mayor nivel de actividad de HMGR en la célula; c) un menor nivel de actividad de HMGS y un mayor nivel de actividad de HMGR en la célula; o d) un equilibrio entre el nivel de actividad de HMGS y la actividad de HMGR, de manera quese palia la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA en la célula.

[0089] De este modo, por ejemplo, una célula huésped "original" (o "parental") está modificada genéticamente para incluir uno o más ácidos nucleicos heterólogos para la célula huésped, donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótidos que codifican HMGR y/o HMGS. La célula huésped original es aquella que produce IPP a través de la ruta del mevalonato y/o que produce mevalonato a través de la ruta del mevalonato. La célula original comprende, o está modificada genéticamente para comprender, ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas en la ruta del mevalonato (y produce IPP a través de la ruta del mevalonato y/o produce mevalonato a través de la ruta del mevalonato). La célula original muestra la inhibición del crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA.

[0090] Una célula original que se ha modificado genéticamente para incluir uno o más ácidos nucleicos heterólogos para la célula huésped, donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótidos que codifican HMGR y/o HMGS, se refiere como una "célula huésped modificada genéticamente." La inhibición del crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA en la célula huésped original modificada genéticamente se reduce en comparación con una célula huésped original no modificada genéticamente con el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican HMGR y/o HMGS. Además, la producción de un isoprenoide o un precursor de isoprenoide se incrementa en la célula huésped modificada genéticamente, en comparación con la célula huésped original. De este modo, por ejemplo, la producción de un isoprenoide o precursor de isoprenoide se incrementa en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces; por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, en la célula huésped modificada genéticamente, en comparación con la célula huésped original.

Disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad de HMGR.

[0091] En algunas realizaciones, un método en cuestión de disminución de la toxicidad celular inducida por la acumulación de HMG-CoA en una célula huésped comprende disminuir el nivel de actividad de HMGS en la célula y/o incrementar el nivel de actividad de HMGR en la célula. La disminución del nivel de actividad de HMGS en una célula incluye disminuir la cantidad total de polipéptido HMGS en a célula; y disminuir la actividad específica de polipéptido HMGS en la célula. De este modo, en algunas realizaciones, el nivel de actividad de HMGS en una célula disminuye al disminuir la cantidad total de HMGS en la célula. En otras realizaciones, el nivel de actividad de HMGS en una célula disminuye al disminuir la actividad específica de HMGS en la célula. De manera similar, incrementar el nivel de actividad de HMGR en una célula incluye incrementar la cantidad total de polipéptido HMGR en la célula; e incrementar la actividad específica de polipéptido HMGR en la célula. De este modo, en algunas realizaciones, el nivel de actividad de HMGR en una célula se incrementa al incrementar la cantidad total de HMGR en la célula. En otras realizaciones, el nivel de actividad de HMGR en una célula se incrementa al incrementar la actividad específica de HMGR en la célula.

[0092] Disminuir el nivel de actividad de HMGS en una célula se coNsigue de varias maneras, incluyendo, pero sin limitación: 1) disminuir la transcripción de un ácido nucleico que codifica HMGS; 2) disminuir la traducción de un ARNm que codifica HMGS; 3) disminuir la estabilidad del ARNm que codifica HMGS; 4) disminuir la estabilidad del polipéptido HMGS; y 5) disminuir la activida denzimática de la enzima HMGS. El incremento del nivel de actividad de HMGR en una célula se coNsigue de varias maneras, que incluyen, pero sin limitación: 1) incrementar la transcripción de un ácido nuceico que codifica HMGR; 2) incrementar la traducción de un ARNm que codifica HMGR; 3) incrementar la estabilidad del ARNm que codifica HMGR; 4) incrementar la estabilidad de la enzima HMGR; y 5) incrementar la actividad enzimática de la enzima HMGR.

[0093] De este modo, en algunas realizaciones de la invención, el nivel no tóxico deseado de HMG-CoA se coNsigue a través de la modulación de la actividad de HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa en la célula. En una realización, la célula huésped original es una célula de levadura natural, o una célula huésped E. coli, que está modificada genéticamente con un vector o vectores que contienen secuencias codificantes de HMGS y HMGR. Las enzimas HMGS y HMGR codificadas se producen en la célula, de manera que no se alcanzan los niveles tóxicos de HMG-CoA y se coNsigue un flujo óptimo a través de la ruta, proporcionando rendimientos elevados de los productos deseados (compuesto isoprenoide o precursores de isoprenoides). En una realización, las regiones que codifican HMGS y HMGR son controladas por diferentes promotores. En otra realización, las secuencias que codifican HMGS y HMGR están en vectores diferentes, con la secuencia codificante de HMGS opcionalmente localizada en un vector con un número de copias inferior. En una realización, las secuencias codificantes de HMGS y HMGR están en el mismo operón, pero las secuencias codificantes de HMGR se localizan en dirección 5’ de la secuencia codificante de HMGS, y esta disposición es diferente de la de un operón natural que contiene ambas secuencias codificantes de HMGS y HMGR.

[0094] En algunas realizaciones, la disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad de HMGR en una célula reduce el nivel de HMG-CoA en la célula, de manera que se reduce la toxicidad y/o inhibición del crecimiento de nivel de HMG-CoA. De este modo, en algunas realizaciones, la disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad de HMGR en una célula reduce el nivel de HMG-CoA en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 15%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 25%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 35%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 45%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, o por lo menos aproximadamente un 90%, en comparación con una célula original de control que muestra inhibición del crecimiento inducida por la acumulación de HMGCoA. El nivel de HMG-CoA en una célula se determina fácilmente utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas, y similares.

[0095] En algunas realizaciones, la disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad de HMGR en una célula reduce la inhibición del crecimiento por la acumulación de HMG-CoA en la célula. De este modo, en algunas realizaciones, la disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad de HMGR en una célula reduce la inhibición del crecimiento mediado por la acumulación de HMG-CoA en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 15%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 25%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 35%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 45%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, o por lo menos aproximadamente un 90%, en comparación con una célula de control que muestra una inhibición del crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA. El crecimiento de células huésped modificadas genéticamente se determina fácilmente utilizando métodos conocidos, por ejemplo, medición de la deNsidad óptica (DO) a aproximadamente 600 nm (DO600) de cultivos líquidos de bacterias; tamaño de la colonia; velocidad de crecimiento; y similares.

[0096] En una realización de ejemplo, una célula original de control es una célula huésped procariota que ha sido modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, donde HMG-CoA se produce y acumula intracelularmente a niveles que son inhibidores del crecimiento o tóxicos para la célula. Como ejemplo no limitante, una célula original de control es una célula huésped E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR en un único operón policistrónico en el orden indicado en un plásmido o en el cromosoma; y la célula huésped modificada genéticamente es una E. coli modificada genéticamente con el constructo o constructos de expresión que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGR, y HMGS en un único operón policistrónico en el orden indicado ajustado en un plásmido o en el cromosoma. Como ejemplo adicional no limitante, una célula original de control es una célula huésped E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR en un único operón policistrónico en el orden indicado en un plásmido de medio número de copias; y la célula huésped modificada genéticamente es una E. coli modificada genéticamente con el constructo o constructos de expresión que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica acetoacetil-CoA tiolasa y HMGS en el orden indicado en un plásmido con un número bajo de copias, y una secuencia de nucleótidos de HMGR en un plásmido separado con un alto número de copias. Como ejemplo adicional no limitante, una célula original de control es una célula huésped E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR en un único operón policistrónico en el orden indicado en un plásmido de medio número de copias; y la célula huésped modificada genéticamente es una E. coli modificada genéticamente con el constructo o constructos de expresión que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica acetoacetil-CoA tiolasa y HMGS en el orden indicado en un plásmido de medio número de copias en que el sitio de unión a ribosoma ha sido alterado para reducir la traducción, y una secuencia de nucleótidos de HMGR en un plásmido separado con un número medio de copias para el que el promotor se ha cambiado a una versión más fuerte. Como ejemplo adicional no limitante, una célula original de control es una célula huésped E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR en un único operón policistrónico en el orden indicado en un plásmido de medio número de copias; y la célula huésped modificada genéticamente es una E. coli modificada genéticamente con el constructo o constructos de expresión que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS con un sitio de proteasa diseñado, y HMGR a la que se ha fusionado una proteína altamente soluble, tal como glutatión transferaasa, en el orden indicado en un plásmido con un número medio de copias.

[0097] La alteración genética que da lugar a cambios a la secuencia de aminoácidos de proteínas, tales como los indicados anteriormente, darán lugar a cambios en la actividad catalítica relativa (medida por Vmax o Vmax/Km) de HMGS y HMGR. De este modo, en algunas realizaciones, la disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad catalítica de HMGR da lugar a un incremento de la proporción de actividad catalítica de HMGR con respecto a la actividad catalítica de HMGS en una base de célula de HMGR de por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 15%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 25%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 35%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 45%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, que HMGS en la célula huésped modificada genéticamente, en comparación con la célula huésped original. El crecimiento de células huésped modificadas genéticamente se determina fácilmente utilizando métodos conocidos, por ejemplo, medición de la deNsidad óptica (DO) a aproximadamente 600 nm (DO600) de cultivos líquidos de bacterias; tamaño de la colonia; velocidad de crecimiento; y similares.

Modificaciones que reducen la acumulación de HMG-CoA mediante la disminución del nivel de actividad de HMG-CoA sintasa

[0098] Los expertos en la material entenderán, tras contemplar esta descripción, que el nivel de HMG-CoA depende, por lo menos en parte, del nivel de actividad de HMGS en la célula. Las disminuciones mencionadas anteriormente en la inhibición del crecimiento celular inducida por la acumulación de HMG-CoA y/o las disminuciones en los niveles intracelulares de HMG-CoA se coNsiguen en algunas realizaciones a través de la modulación de los niveles de actividad de HMGS en la célula. De este modo, en algunas realizaciones, la paliación de la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA y/o un nivel no tóxico de HMG-CoA se coNsigue a través de la modulación del nivel de actividad de HMG-CoA en la célula. En estas realizaciones, una célula huésped original que comprende, o está modificada genéticamente para comprender, ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas en la ruta del mevalonato (y produce IPP y/o mevalonato a través de la ruta del mevalonato) se modifica genéticamente para incluir un ácido nucleico heterólogo para la célula huésped, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGS, donde se reduce la inhibición del crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA en la célula huésped modificada genéticamente con el ácido nucleico heterólogo que comprende secuencias de nucleótidos que codifican HMGS, en comparación con una célula huésped original no modificada genéticamente con el ácido nucleico heterólogo que comprende secuencias de nucleótidos que codifican HMGS.

[0099] En una realización, el ácido nucleico heterólogo que codifica HMGS se utiliza para sustituir todo o parte de un gen endógeno de HMGS. En otra realización, la célula huésped original es aquella que ha sido modificada genéticamente para contener un gen de HMGS exógeno; y el gen de HMGS exógeno de la célula huésped original se sustituye por un gen de HMGS modificado que proporciona un nivel más bajo de actividad HMGS, por ejemplo, la cantidad de HMGs y/o la actividad de la HMGS es inferior a la de la célula huésped original. En otra realización, el ácido nucleico heterólogo que reduce el nivel de actividad de HMGS codifica un inhibidor de HMGS o un ARN antisentido que reduce la traducción del transcrito de HMGS. En ambos casos, aunque el índice de producción de isoprenoide o precursor de isoprenoide específicos de la célula huésped modificada puede disminuir cuando se compara con la cepa original, la paliación resultante en la inhibición del crecimiento asociada con HMG-CoA conduciría a mayores deNsidades celulares, dando lugar a un incremento global en la producción.

[0100] En algunas realizaciones, se introduce un ácido nucleico heterólogo en una célula huésped original, y el ácido nucleico heterólogo se recombina con un ácido nucleico endógeno que codifica HMGS, modificando así genéticamente la célula huésped original. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo comprende un promotor que tiene una fuerza de promotor reducida en comparación con el promotor endógeno que controla la transcripción de la HMGS endógena, y la recombinación da lugar a la sustitución del promotor endógeno por el promotor heterólogo. En otras realizaciones, el ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una HMGS que muestra una actividad enzimática reducida en comparación con la HMGS endógena, y la recombinación da lugar a la sustitución de la secuencia codificante de HMGS endógena por la secuencia codificante de HMGs heteróloga.

[0101] Una célula huésped modificada genéticamente adecuada para utilizar en un método en cuestión se modifica genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos, incluyendo un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGS, de manera que disminuye el nivel de actividad de HMGS en la célula. El nivel de actividad de HMGS disminuye en la célula en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 15%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 25%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 35%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 45%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, o por lo menos aproximadamente un 90%, en comparación con una célula huésped original no modificada genéticamente con el uno

o más ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica HMGS. La célula huésped original muestra inhibición del crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA.

[0102] En una realización de ejemplo, una célula original de control es una célula huésped procariota que ha sido modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, donde HMG-CoA se produce y acumular intracelularmente a niveles que son inhibidores del crecimiento o tóxicos para la célula. Como ejemplo no limitante, una célula original de control es una célula huésped E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:1; y la célula huésped modificada genéticamente es una E. coli modificada genéticamente con el constructo o constructos de expresión que comprenden una versión modificada de las secuencias de nucleótidos establecidas en la SEQ ID NO:1 en que el sitio de unión a ribosoma en dirección 5’ de HMGS ha sido alterado de manera que se reduce la traducción. Como ejemplo no limitante, una célula original de control es una célula huésped E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO:1; y la célula huésped modificada genéticamente es una E. coli modificada genéticamente con el constructo o constructos de expresión que comprenden una versión modificada de las secuencias de nucleótidos establecidas en la SEQ ID NO:1 en que un sitio de ARNasa ha sido introducido en la región codificante de HMGS. Como ejemplo no limitante, una célula original de control es una célula huésped E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:1; y la célula huésped modificada genéticamente es una E. coli modificada genéticamente con el constructo o constructos de expresión que comprenden las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO:2. Véase, por ejemplo, la figura 5 y el ejemplo 2. Como ejemplo no limitante, una célula original de control es una célula huésped E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:1; y la célula huésped modificada genéticamente es una E. coli modificada genéticamente con el constructo o constructos de expresión que comprenden las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:8.

[0103] El nivel de actividad de HMGS en la célula huésped modificada genéticamente se puede disminuir de varias maneras, incluyendo, pero sin limitación, 1) disminuir la fuerza de promotor del promotor al que está unida operativamente la región codificante de HMGS; 2) disminuir el número de copias del plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGS; 3) disminuir la estabilidad de un ARNm de HMGS (donde "un ARNm de HMGS" es un ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGS); 4) modificar la secuencia del sitio de unión a ribosoma de un ARNm de HMGS, de manera que disminuye el nivel de traducción del ARNm de HMGS; 5) modificar la distancia y/o secuencia entre el sitio de unión a ribosoma del ARNm de HMGS y el codón de partida de la secuencia codificante de HMGS, de manera que disminuye el nivel de traducción del ARNM de HMGS; 6) modificar la región 5’ intercistrónica completa del codón de partida de la secuencia codificante de HMGS, de manera que se disminuye el nivel de traducción del ARNm de HMGS; 7) modificar el uso de codones de HMGS, de manera que se disminuye el nivel de traducción del ARNm de HMGS; 8) disminuir la estabilidad enzimática de HMGS; 9) disminuir la actividad específica (unidades de actividad por unidad de proteína) de HMGS; y 10) cuando HMGS está codificada en un operón, cambiar el orden de las regiones codificantes en el ARNm policistrónico. Se pueden realizar dos o más de las modificaciones mencionadas anteriormente, a efectos de disminuir el nivel de actividad de HMGS en la célula huésped modificada genéticamente.

[0104] En algunas realizaciones, el nivel de actividad de HMGS disminuye en relación con la actividad de HMGS en una célula original de control mediante la utilización de un plásmido con un número de copias bajo, el cual comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGS. La disminución del número de copias del plásmido de un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGS se coNsigue mediante la selección de un esqueleto plasmídico que se sabe que es un plásmido con un número de copias bajo. Los plásmidos con un número de copias bajo proporcionan menos de aproximadamente 20 copias de plásmidos por célula, por ejemplo, desde aproximadamente 5 copias de plásmidos por células hasta aproximadamente 20 copias de plásmidos por célula. Entre los plásmidos con un número de copias bajo adecuados se incluyen, pero sin limitación, pACYC184, pBR332, pBAD33, pBBR1MCS, y pSC101. Por ejemplo, pSC101 está generalmente presente en una célula a aproximadamente 5 copias por célula. En una realización de la presente invención, los niveles de HMGS y HMGR se modulan mediante la colocación de los dos genes en dos vectores de expresión diferentes, de manera que la secuencia codificante de HMGS está en un vector con un número de copias bajo y la secuencia codificante de HMGR está en un vector con un número de copias alto. En otra realización de la invención, los genes están en el mismo vector, pero bajo el control de promotores diferentes, estando la secuencia codificante de HMGS bajo el control del más débil de los dos promotores.

Modificaciones que reducen la acumulación intracelular de HMG-CoA mediante el incremento del nivel de actividad de HMG-CoA reductasa

[0105] Los expertos en la material entenderán, tras contemplar esta memoria, que el nivel de HMG-CoA depende, por lo menos in parte, del nivel de actividad de HMGR en la célula. Las disminuciones mencionadas anteriormente en la inhibición del crecimiento celular inducido por la acumulación de HMG-CoA y/o las disminuciones en los niveles intracelulares de HMg-CoA se pueden conseguir según los métodos de la invención modulando los niveles de actividad de HMGR en la célula. De este modo, en una realización de la invención, un nivel no tóxico de HMG-CoA y/o paliación de la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA se coNsigue a través de la modulación del nivel de actividad de HMG-CoA reductasa en la célula. En estas realizaciones, una célula huésped original que comprende, o está modificada genéticamente para comprender, ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas en la ruta de mevalonato, y produce IPP y/o mevalonato a través de la ruta de mevalonato, está modificada genéticamente para incluir un ácido nucleico heterólogo para la célula huésped, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR, donde se reduce la inhibición del crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA en la célula huésped modificada genéticamente con el ácido nucleico heterólogo que comprende secuencias de nucleótidos que codifican HMGR, en comparación con una célula huésped original de control no modificada genéticamente con el ácido nucleico heterólogo que comprende secuencias de nucleótidos que codifican HMGR.

[0106] Una célula huésped modificada genéticamente adecuada para utilizar en un método en cuestión está modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos, incluyendo un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR, de manera que se aumenta el nivel de actividad de HMGR en la célula. El nivel de actividad de HMGR se incrementa en la célula en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 15%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 25%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 35%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 45%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, o por lo menos aproximadamente un 90%, en comparación con una célula original de control no modificada genéticamente con el uno o más ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR.

[0107] En una realización de ejemplo, una célula original de control es una célula huésped procariota que ha sido modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, donde HMG-CoA se produce y acumula intracelularmente a niveles que son inhibidores del crecimiento o tóxicos para la célula. En una realización, una célula original de control es una célula huésped procariota que no contiene de forma natural una ruta de mevalonato y que ha sido modificada genéticamente para producir mevalonato; y la célula huésped modificada genéticamente se modifica adicionalmente para alterar la actividad de HMGR, de manera que los niveles intracelulares de HMG-CoA no son inhibidores o o tóxicos para la célula. En una realización de ejemplo, una célula original de control es una célula huésped E. coli que ha sido modificada genéticamente para producir mevalonato; y la célula huésped modificada genéticamente es una versión de E. coli modificada genéticamente de la célula original de control aumentada con los constructos diferentes de los indicados en las siguientes referencias: Kato-Emori et al. Mol Genet Genomics (2001) 265:135-42, Learned RM, et al. PNAS. (1989) 86:2779-83, T. Dairi, et al. Mol Gen Genet (2000) 262: 957 - 964, Allen, et al. Appl. Environ. Microbio. (1997). 63:3341-3344, Hedl, et al. J. Bacteriol., (2002), 184:2116-2122,Jackson, et al. Org. Lett.(2003) 5:1629-1632,Randolph Y. Hampton, et al. (1994) Cell, 125:299-312,Markus Veen, et al. FEMS Yeast Res (2003) 4:87-95, Beach MJ, et al. J Bacteriol (1989) 171:2994-3001, BischoffKM, et al. Protein Sci (1997) 6:156-161, Friesen JA, et al. Biochemistry. (1997) 36:2173-7, Frimpong, et al. J Biol Chem. (1994) 269:11478-83,Panda, et al. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 143-152.

[0108] Como ejemplo no limitante, una célula original de control es una célula huésped E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructor de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO:1; y la célula huésped modificada genéticamente es una E. coli modificada genéticamente con el constructor de expresión que comprende las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:8. Véase, por ejemplo, las figuras 6 y 7 y los ejemplos 3 y 4. Como ejemplo no limitante, una célula original de control es una célula huésped E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO:2; y la célula huésped modificada genéticamente es una E. coli modificada genéticamente con el constructo de expresión que comprende las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:9. Véase, por ejemplo, las figuras 10 y el ejemplo 6.

[0109] El nivel de actividad de HMGR en la célula huésped modificada genéticamente se puede incrementar de varias maneras, incluyendo, pero sin limitación, 1) aumentar la fuerza de promotor del promotor al que está unida operativamente la región codificante de HMGR; 2) aumentar el número de copias del plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR; 3) aumentar la estabilidad de un ARNm de HMGR (donde "un ARNm de HMGR" es un ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR); 4) modificar la secuencia del sitio de unión a ribosoma de un ARNm de HMGR, de manera que aumenta el nivel de traducción del ARNm de HMGR; 5) modificar la secuencia entre el sitio de unión a ribosoma de un ARNm de HMGR y el codón de partida de la secuencia codificante de HMGR, de manera que aumenta el nivel de traducción del ARNM de HMGR; 6) modificar la región 5’ intercistrónica completa del codón de partida de la región codificante de HMGR, de manera que se aumenta la traducción del ARNm de HMGR; 7) modificar el uso de codones de HMGR, de manera que se aumenta el nivel de traducción del ARNm de HMGR; 8) expresar ARNt de codones raros utilizados en HMGR, de manera que se aumenta el nivel de traducción del ARNm de HMGR; 9) aumentar la estabilidad enzimatica de HMGR; o 10) incrementar la actividad específica (unidades de actividad por unidad de proteína) de HMGR. Se pueden realizar dos o más modificaciones anteriores para proporcionar un nivel incrementado de actividad de HMGR.

[0110] En la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO:2, la región codificante de HMGR está bajo el control transcripcional del promotor pBAD. En algunas realizaciones, el promotor al que está unida operativamente la región codificante de HMGR es un promotor más fuerte que el promotor pBAD, por ejemplo, el nivel de ARNm transcrito es por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 15%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 25%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 35%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 45%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, o más, más elevado que el nivel de ARNm transcrito utilizando el promotor pBAD. Los promotores adecuados incluyen, pero sin limitación, un promotor lac consenso, un promotor trp, un promotor tac, un promotor trc, un promotor lambda, y un promotor T7.

[0111] Incrementar el número de copias del plásmido se coNsigue seleccionando un esqueleto de plásmido que es conocido por ser un plásmido con un número de copias medio o elevado. Los plásmidos con un número de copias bajo proporcionan en general menos de aproximadamente 20 copias de plásmidos por células. Los plásmidos con un número de copias medio proporcionan en general de aproximadamente 20 copias de plásmidos por célula a aproximadamente 50 copias de plásmidos por célula, o de aproximadamente 20 copias de plásmidos por célula a aproximadamente 80 copias de plásmidos por célula. Los plásmidos con un número de copias elevado proporcionan en general de aproximadamente 80 copias de plásmidos por célula a aproximadamente 200 copias de plásmidos por célula, o más. En muchas realizaciones, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR es un vector plasmídico con un número de copias elevado que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR. Los plásmidos con un número de copias elevado adecuados incluyen, pero sin limitación, vectores pUC (por ejemplo, pUC8, pUC18, pUC19, y similares), vectores pBluescript, vectores pGEM, y vectores pTZ.

[0112] Los expertos en la material entenderán, tras contemplar esta descripción, que el nivel de HMG-CoA en una célula se puede modificar modulando los niveles relativos de las actividades de HMGS y HMGR en la célula. De este modo, en una realización de la invención, el nivel no tóxico deseado de HMG-CoA se coNsigue a través de la modulación la actividad de HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa en la célula. En una realización, la célula huésped original es una célula huésped E. coli que está genéticamente modificada con un vector o vectores que contienen secuencias codificantes de HMGS y HMGR. Las enzimas HMGS y HMGR codificadas se producen en la célula, de manera que no se coNsiguen los niveles tóxicos de HMG-CoA y se coNsigue el flujo óptimo a través de la ruta, proporcionando rendimientos elevados de los productos deseados (compuesto isoprenoide o precursor de isoprenoide). En una realización, las regiones codificantes de HMGS y HMGR están controladas por diferentes promotores. En otra realización, las secuencias codificantes de HMGS y HMGR están en diferentes vectores, con la secuencia codificante de HMGS opcionalmente localizada en un vector con un número de copias inferior. En una realización, las secuencias codificantes de HMGS y HMGR están en el mismo operón, pero la secuencia codificante de HMGR está localizada en dirección 5’ de la secuencia codificante de HMGS, y esta disposición es diferente de la de un operón natural que contiene ambas secuencias codificantes de HMGS y HMGR.

Modificaciones que reducen la acumulación de HMG-CoA mediante el equilibrio del flujo a través de la ruta de mevalonato

[0113] En algunas realizaciones, la inhibición o toxicidad del crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA se reduce mediante el equilibrio del flujo de metabolito a través de la ruta. El flujo de metabolitos se puede equilibrar de varias maneras, incluyendo, pero sin limitación, 1) mutaciones en enzimas en dirección 5’ (es decir, AtoB, AtoC, AtoA, AtoD) de HMGS que limita el sustrato (AcetoAcetil-CoA) disponible para la enzima; 2) cambios en la expresión de enzimas en dirección 5’ (por ejemplo, AtoC, AtoA, AtoD, y enzimas implicadas e la biosíntesis de ácidos grasos) de HMGS que limita el sustrato (acetoacetil-CoA) disponible para la enzima; 3) cambios en la expresión de enzimas en dirección 3’ (es decir, MK, PMK, MVD) de HMGR que agota el suministro de mevalonato y, de este modo, induce la conversión de HMG-CoA en mevalonato; 4) mutaciones que cambian las enzimas de características catalíticas en dirección 3’ (es decir, MK, PMK, MVD) de HMGR que agotan el suministro de mevalonato y, de este modo, inducen la conversión de HMGCoA en mevalonato; 5) fusiones de proteínas de HMGR con una enzima en dirección 5’ (es decir acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS,) para coincidir la expresión de una enzima de producción de HMG-CoA a HMGR; 6) fusiones de proteínas de HMGS con una enzima en dirección 3’ (es decir, MK) para coincidir la expresión de una enzima de producción de HMG-CoA a una enzima responsable para el movimiento de metabolitos lejos de HMG-CoA.

Aumento de la producción de isoprenoide o precursores de isoprenoide

[0114] Los métodos descritos anteriormente dan lugar a una paliación de la toxicidad y/o inhibición del crecimiento celular inducido por la acumulación de HMG-CoA en una célula; y proporcionan una producción incrementada de un compuesto isoprenoide y/o un compuesto precursor isoprenoide en la célula. De este modo, la presente invención proporciona métodos para incrementar la producción de un compuesto isoprenoide o un compuesto precursor de isoprenoide en una célula, donde los métodos implican en general modular los niveles de HMG-CoA en la célula, de manera que los niveles de HMG-CoA permanecen por debajo de un nivel tóxico o inhibidor del crecimiento, y sin embargo están a un nivel que es suficientemente elevado para proporcionar una producción incrementada de un compuesto isoprenoide o un compuesto precursor de isoprenoide.

[0115] La presente invención proporciona métodos para incrementar la producción de un compuesto isoprenoide o un precursor del compuesto isoprenoide (por ejemplo, mevalonato, IPP, un poliprenil disfosfato, etc.) por una célula

o cultivos de una célula. Los métodos implican en general aumentar el nivel de actividad de HMGR y/o disminuir el nivel de actividad de HMGS, en una célula que muestra inhibición del crecimiento celular inducida por la acumulación de HMG-CoA. Una célula que muestra inhibición del crecimiento celular Inducida por la acumulación de HMG-CoA es, en algunas realizaciones, una célula huésped original que normalmente no sintetiza IPP o mevalonato a través de una ruta de mevalonato, y que ha sido modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una enzima o enzimas de la ruta de mevalonato, cuyas enzimas se producen a niveles que dan lugar a la acumulación de niveles tóxicos o inhibidores del crecimiento de HMG-CoA en la célula. Una célula que muestra inhibición del crecimiento celular inducida por la acumulación de HMG-CoA es, en algunas realizaciones, una célula huésped original que normalmente sintetiza IPP o mevalonato a través de la ruta de mevalonato, pero que está modificada genéticamente, de manera que la HMG-CoA intracelular se acumula a niveles tóxicos o inhibidores del crecimiento. En una realización, el compuesto es el compuesto precursor de isoprenoides IPP. En una realización, la célula huésped es una célula E. coli.

[0116] En algunas realizaciones, la disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el aumento del nivel de HMGR en una célula incrementa la producción de mevalonato por la célula huésped modificada genéticamente, o por un cultivo de la célula huésped modificada genéticamente. De este modo, en algunas realizaciones, la disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad de HMGR en una célula aumenta la producción del mevalonato en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 15%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 25%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 35%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 45%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, en la célula huésped modificada genéticamente, en comparación con la célula huésped original. La producción de mevalonato se determina fácilmente utilizando métodos conocidos, por ejemplo, cromatografía de gases-espectrometría de masas, cromatografía líquida-espectrometría de masas, cromatografía iónica-espectrometría de masas, cromatografía de capa fina, detección amperométrica de pulsos, espectrometría UV-VIS, y similares.

[0117] En algunas realizaciones, la disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad de HMGR en una célula incrementa la producción de IPP por la célula huésped modificada genéticamente, o por un cultivo de la célula huésped modificada genéticamente. De este modo, en algunas realizaciones, la disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad de HMGR en una célula incrementa la producción de IPP en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 15%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 25%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 35%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 45%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, en la célula huésped modificada genéticamente, en comparación con la célula huésped original. La producción de IPP se determina fácilmente utilizando métodos conocidos, por ejemplo, cromatografía líquida-espectrometría de masas, cromatografía de capa fina, cromatografía iónica-espectrometría de masas, detección amperométrica de pulsos, espectrometría UV-VIS, y similares.

[0118] En algunas realizaciones, la disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad de HMGR en una célula incrementa la producción de isoprenoide por la célula huésped modificada genéticamente. De este modo, en algunas realizaciones, la disminución del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de actividad de HMGR en una célula incrementa la producción de mevalonato en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 15%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 25%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 35%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 45%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, en la célula huésped modificada genéticamente, en comparación con la célula huésped original. La producción de isoprenoide se determina fácilmente utilizando métodos conocidos, por ejemplo, cromatografía de gases-espectrometría de masas, cromatografía líquida-espectrometría de masas, cromatografía iónicaespectrometría de masas, detección amperométrica de pulsos, espectrometría UV-VIS, y similares.

[0119] En algunas realizaciones, un método en cuestión proporciona una mayor producción de isoprenoide o precursor de isoprenoide por célula, por ejemplo, la cantidad de compuesto isoprenoide o precursor de isoprenoide producida utilizando un método en cuestión es por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 15%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente un 35%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 45%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, más elevada que la cantidad del compuesto isoprenoide o precursor de isoprenoide producida por una célula original de control, en una base por célula. Cantidad de células medida midiendo el peso celular en seco o midiendo la deNsidad óptica del cultivo celular.

[0120] En otras realizaciones, un método en cuestión proporciona una mayor producción de isoprenoide o precursor de isoprenoide por unidad de volumen de cultivo celular, por ejemplo, la cantidad de compuesto isoprenoide o precursor de isoprenoide producida utilizando un método en cuestión es por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 15%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 25%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 35%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 45%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente

2.5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, más elevada que la cantidad del compuesto isoprenoide o precursor isoprenoide producida por una célula original de control, en una base de por unidad de volumen de cultivo celular

[0121] En algunas realizaciones, un método en cuestión para incrementar la producción de un compuesto isoprenoide o un compuesto precursor de isoprenoide comprende modular la composición del medio en que se cultiva una célula huésped, de manera que se incrementa el nivel de intermedio de la ruta de mevalonato (por ejemplo, acetil-CoA). En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende acetato, lo cual incrementa el nivel de acetil-CoA, y que a su vez incrementa el nivel de HMG-CoA en la célula.

[0122] Los isoprenoides que se pueden producir utilizando el método de la invención incluyen, pero sin limitación, monoterpenos, incluyendo, pero sin limitación, limoneno, citranelol, geraniol, mentol, perilil alcohol, linalool, tujona; sesquiterpenos, incluyendo, pero sin limitación, periplanona B, gingkolide B, amorfadieno, artemisinina, ácido artemisínico, valenceno, nootkatona, epi-cedrol, epi-aristoloqueno, farnesol, gossypol, sanonina, periplanona, y forskolina; diterpenos, incluyendo, pero sin limitación, casbeno, eleuterobina, paclitaxel, prostratina, y pseudopterosina; triterpenos, incluyendo, pero sin limitación, arbruside E, bruceantina, testosterona, progesterona, cortisona, digitoxina. Los isoprenoids también incluyen, pero sin limitación, carotenoides, tales como licopeno, (- y 1caroteno, (- y 1-criptoxantina, bixina, zeaxantina, astaxantina, y luteína. Los isoprenoides también incluyen, pero sin limitación, triterpenos, compuestos esteroides, y compuestos que están compuestos de isoprenoides modificados por otros grupos químicos, tales como terpeno-alcaloides mezclados, y la coenzima Q-10.

CÉLULAS HUÉSPED MODIFICADAS GENÉTICAMENTE

[0123] La presente invención proporciona células huésped modificadas genéticamente; y composiciones que comprenden las células huésped modificadas genéticamente. Las células huésped modificadas genéticamente son útiles para producir un compuesto isoprenoide o un compuesto precursor de isoprenoide, tal como se ha descrito anteriormente.

[0124] Tal como se ha indicado anteriormente, un método en cuestión para la producción de un isoprenoide o precursor de isoprenoide implica en general cultivar una célula huésped modificada genéticamente en un medio adecuado. La célula huésped modificada genéticamente es aquella que ha sido modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas que, cuando se producen en la célula, palian la inhibición del crecimiento (toxicidad) inducida por la acumulación de HMG-CoA en la célula. La célula original (por ejemplo, la célula no modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas que, cuando se producen en la célula, palian la inhibición del crecimiento y/o toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA en la célula) es una célula que produce, o está modificada genéticamente para producir, IPP a través de la ruta de mevalonato.

[0125] De este modo, por ejemplo, una célula huésped "original" (o "parental") está modificada genéticamente para incluir uno o más ácidos nucleicos heterólogos para la célula huésped, donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótidos que codifican HMGR y/o HMGS. La célula huésped original produce IPP a través de la ruta del mevalonato y/o produce mevalonato a través de la ruta del mevalonato. La célula original comprende, o está modificada genéticamente para comprender, ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas en la ruta de mevalonato (y produce IPP a través de la ruta de mevalonato y/o produce mevalonato a través de la ruta del mevalonato). Una célula original que ha sido modificada genéticamente para incluir uno o más ácidos nucleicos heterólogos para la célula huésped, donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótidos que codifican HMGR y/o HMGS, se refiere como una "célula huésped modificada genéticamente." La inhibición del crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA en la célula huésped original modificada genéticamente se reduce, en comparación con una célula huésped original no modificada genéticamente con el uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican HMGR y/o HMGS. Además, la célula huésped modificada genéticamente muestra mayores niveles de mevalonato o productos isoprenoides derivados de una combinación de una mayor producción por célula de mevalonato y/o una mayor viabilidad celular. Se entiende que la presente invención se puede aplicar iterativamente para aumentar incrementalmente la producción de compuestos isoprenoides, de manera que, en un contexto, una línea celular particular puede ser una célula huésped modificada genéticamente y a continuación, en un contexto posterior, puede ser una célula huésped original utilizada como punto de partida para una mejora adicional. Alternativamente, la presente invención divulga la toxicidad de la acumulación de HMG-CoA y permite la construcción de novo de sistemas genéticos y células huésped asociadas que evitan la toxicidad de HMG-CoA asociadas con una producción a nivel elevado de isoprenoides. De este modo, si una célula huésped modificada genéticamente se puede modificar genéticamente adicionalmente para producir una célula que muestra una menor viabilidad celular debido a la acumulación de HMG-CoA, la célula modificada genéticamente adicionalmente será de hecho una célula huésped original con respecto a la célula huésped modificada genéticamente inicial.

[0126] En algunas realizaciones, la célula original es una célula que normalmente no produce IPP o mevalonato a través de la ruta de mevalonato; por ejemplo, la célula original es aquella que ha sido modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas en la ruta de mevalonato. Como ejemplo, una célula original es una célula procariota que normalmente no produce IPP o mevalonato a través de la ruta de mevalonato, y que ha sido modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, donde los niveles de acetoacetil-CoA tiolasa y la actividad de HMGS son tales que se acumula intracelularmente HMG-CoA a un nivel que inhibidor del crecimiento o tóxico. Un ejemplo es una célula E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se establece en SEQ ID NO:1. Un segundo ejemplo de una célula huésped original es una célula E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se establece en SEQ ID NO:2.

[0127] En otras realizaciones, la célula original es una célula que normalmente produce IPP y/o mevalonato a través de la ruta del mevalonato, por ejemplo, la célula original es una célula que comprende ácidos nucleicos endógenos que codifican una o más enzimas en la ruta de mevalonato. En estas realizaciones, la célula original está modificada genéticamente, de manera que el nivel de HMG-CoA que se acumula intracelularmente es tóxico o inhibidora del crecimiento para la célula. Como ejemplo, se introducen una o más mutaciones en un gen de piruvato descarboxilasa de la célula huésped que normalmente produce IPP y/o mevalonato a través de la ruta de mevalonato, de manera que el gen de piruvato descarboxilasa está funcionalmente desactivado, y de manera que la HMG-CoA se acumula intracelularmente a un nivel que tóxico para la célula. La célula original en este caso es una célula huésped que normalmente produce IPP y/o mevalonato a través de la ruta de mevalonato, y que ha sido modificada genéticamente para introducir una o más mutaciones en el gen de piruvato descarboxilasa endógeno, de manera que el gen de piruvato descarboxilasa está funcionalmente desactivado.

[0128] Para generar una célula huésped modificada genéticamente en cuestión, se introducen de forma estable o traNsitoria uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una enzima o enzimas que palian la inhibición del crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA en una célula huésped original, utilizando técnicas establecidas, incluyendo, pero sin limitación, la electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposoma, y similares. Para una transformación estable, un ácido nucleico incluirá generalmente además un marcador seleccionable, por ejemplo, cualquiera de varios marcadores seleccionables conocidos, tales como resistencia a neomicina, resistencia a ampicilina, resistencia a tetraciclina, resistencia a cloramfenicol, resistencia a kanamicina, y similares.

Enzimas de la ruta de mevalonato

[0129] Tal como se ha indicado anteriormente, una célula original es una célula huésped que produce, o está modificada genéticamente para producir IPP a través de una ruta del mevalonato y/o mevalonato a través de la ruta del mevalonato, y que muestra toxicidad o inhibición de crecimiento Inducida por la acumulación de HMG-CoA. La ruta de mevalonato comprende: (a) condensar dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA; (b) condensar acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA; (c) convertirHMG-CoA en mevalonato; (d) fosforilar el mevalonato en mevalonato 5-fosfato; (e) convertir el mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato; y (f) convertir mevalonato 5-pirofosfato en isopentenil pirofosfato. Las enzimas de la ruta del mevalonato requeridas para la producción de IPP varían dependiendo de las condiciones de cultivo.

[0130] En algunas realizaciones, una célula huésped original es aquella que ha sido modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, y la célula huésped original es aquella que produce mevalonato. Un ejemplo no limitante de una célula huésped original es una célula E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se establece en SEQ ID NO:1 o una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEQ ID NO:1 Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped original es una célula de E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se establece en SEQ ID NO:2 o una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEQ ID NO:2. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped original es una célula de levadura que ha sido modificada genéticamente con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se establece en SEQ ID NO:7 o una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEQ ID NO:7. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped original es una célula E. coli que ha sido modificada genéticamente con uno o más constructos que comprenden secuencias de nucleótidos tal como se establecen en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:6 o secuencias de nucleótidos que codifican enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:6. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped original es una célula E. coli que ha sido modificada genéticamente con uno o más constructos que comprenden las secuencias de nucleótidos tal como se establece en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:7 o secuencias de nucleótidos que codifican enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:7. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped original es una célula E. coli que ha sido modificada genéticamente con uno o más constructos que comprenden secuencias de nucleótidos tal como se establecen en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:11 o secuencias de nucleótidos que codifican enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:11. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped original es una célula de levadura que ha sido modificada genéticamente con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los genes de la ruta de mevalonato codificados en SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7 o una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas funcionalmente análogas a las enzimas de la ruta de mevalonato codificadas en SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped original es una célula de levadura que ha sido modificada genéticamente con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende enzimas de la ruta de mevalonato codificadas en SEQ ID NO:11 o una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEQ ID NO:11.

[0131] En otras realizaciones, una célula huésped original es aquella que ha sido modificada genéticamente con uno

o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, HMGR, mevalonato quinasa (MK), fosfomevalonato quinasa (PMK), y mevalonato pirofosfato descarboxilasa (MPD) (y opcionalmente también IPP isomerasa). Un ejemplo de una célula huésped original es una célula E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se establece en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4. Un ejemplo adicional de una célula huésped original es una célula E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se establece en SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO: 4.

[0132] En algunas realizaciones, una célula huésped original es aquella que ha sido modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican mevalonato quinasa (MK), fosfomevalonato quinasa (PMK), y mevalonato pirofosfato descarboxilasa (MPD) (y opcionalmente también isopentenil pirofosfato isomerasa); y la célula huésped original se cultiva en medio que incluye mevalonato.

[0133] En otras realizaciones, una célula huésped original es aquella que ha sido modificada genéticamente con uno

: o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, hidroximetilglutaril-CoA sintasa (HMGS), hidroximetilglutaril-CoA reductasa (HMGR), MK, PMK, y MPD (y opcionalmente también IPP isomerasa).

[0134] En otras realizaciones, una célula huésped original es aquella que ha sido modificada genéticamente con uno

: o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican MK, PMK, MPD, IPP isomerasa, y una prenil transferasa. En otras realizaciones, una célula huésped original es aquella que está modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, IPP isomerasa, y una prenil transferasa. Un ejemplo de una célula huésped original es una célula E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se establece en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. Un ejemplo adicional es una célula E. coli que ha sido modificada genéticamente con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se establece en SEQ ID NO: y SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO:

5.

[0135] En otras realizaciones, una célula huésped original es aquella que tiene una ruta de mevalonato nativo (endógeno) y ha sido modificada genéticamente, de manera que se incrementa el nivel de HMG-CoA en relación con una célula huésped no modificada, y de manera que la acumulación de HMG-CoA provoca la inhibición del crecimiento.

[0136] En otras realizaciones, la célula huésped es una célula procariota. Las células procariotas adecuadas incluyen, pero sin limitación, cualquiera de una variedad de cepas de laboratorio de Escherichia coli, Lactobacillus sp., Salmonella sp., Shigella sp., y similares. Véase, por ejemplo, Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181; Patente de Estados Unidos No. 6,447,784; y Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302. Ejemplos de cepas de Samonella que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, pero sin limitación, Salmonella typhi y S. typhimurium. Las cepas de Shigella adecuadas incluyen, pero sin limitación, Shigella flexneri, Shigella sonnei, y Shigella disenteriae. Habitualmente, la cepa de laboratorio es aquella que no es patogénica. Los ejemplos no limitantes de otras bacterias adecuadas incluyen, pero sin limitación, Bacillus subtilis, Pseudomonas pudita, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Rhodococcus sp., y similares. En algunas realizaciones, la célula huésped es Escherichia coli.

[0137] Tal como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, una célula huésped original es aquella que ha sido modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una enzima o enzimas de la ruta de mevalonato. Para modificar genéticamente una célula huésped original, de manera que produce IPP a través de la ruta del mevalonato y/o que produce mevalonato a través de la ruta de mevalonato, se introduce de manera estable o traNsitoria uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas de la ruta del mevalonato en una célula huésped, utilizando técnicas establecidas que incluyen, pero sin limitación, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, y similares. Para la transformación, un ácido nucleico incluirá adicionalmente en general un marcador seleccionable, por ejemplo, cualquiera de varios marcadores seleccionables conocidos, tales como resistencia a neomicina, resistencia a ampicilina, resistencia a tetraciclina, resistencia a cloramfenicol, resistencia a kanamicina, y similares.

[0138] En muchas realizaciones, el ácido nucleico con el que la célula huésped es modificada genéticamente de manera que produce IPP y/o mevalonato a través de la ruta del mevalonato es un vector de expresión que incluye un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima o enzimas de la ruta de mevalonato. De manera similar, en muchas realizaciones, el ácido nucleico con el que la célula huésped original es modificada genéticamente, de manera que se reduce la toxicidad y/o inhibición del crecimiento celular inducidas por la acumulación de HMG-CoA, es un vector de expresión que incluye un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más enzimas que proporcionan la paliación de la toxicidad y/o inhibición del crecimiento celular inducida por la acumulación de HMG-CoA. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero sin limitación, vectores de baculovirus, vectores de bacteriófagos, plásmidos, fagémidos, cósmicos, fósmidos, cromosomas artificiales bacterianas, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en virus de vacuna, poliovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, SV40, virus de herpes simplex, y similares), cromosomas artificiales basados en P1, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualquier otro vector específico para huéspedes específicos de interés (tales como E. coli y levadura). De este modo, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica productos génicos de la ruta de mevalonato está incluido en cualquiera de un grupo de vectores de expresión para expresar el producto o productos génicos de la ruta de mevalonato. Dichos vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético.

[0139] Se conocen numerosos vectores de expresión adecuados por los expertos en la materia, y muchos están disponibles comercialmente. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo; para células huésped bacterianas: vectores pQE (Qiagen), plásmidos pBluescript, vectores pNH, vectores lambda-ZAP (Stratagene); pTrc99a, pKK223-3, pDR540, y pRIT2T (Pharmacia); para células huésped eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro plásmido o vector siempre que sea compatible con la célula huésped.

[0140] Para generar una célula huésped original que comprende uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican secuencias de nucleótidos que codifican enzimas de la ruta de mevalonato, se inserta una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas de la ruta de mevalonato en un vector de expresión. La secuencia de nucleótidos que codifica enzimas de la ruta de mevalonato en el vector de expresión está unido operativamente a una secuencia

o secuencias de control de la expresión apropiadas (por ejemplo, un promotor) para dirigir la síntesis del producto génico codificado. De forma similar, para generar una célula huésped modificada genéticamente a partir de una célula huésped original, se utilizará un vector de expresión que comprende secuencias de nucleótidos que codifican, por ejemplo, HMGS y/o HMGR. Las secuencias codificantes de HMGS y/o HMGR están unidas operativamente a la secuencia o secuencias de control de la expresión apropiadas para dirigir la síntesis del producto génico codificado. Dependiendo del sistema huésped/vector utilizado, se pueden utilizar en el vector de expresión cualquiera de un conjunto de elementos de control adecuados de la transcripción y traducción, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción (véase, por ejemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).

[0141] Los promotores adecuados para utilizar en células huésped procariotas incluyen, pero sin limitación, a promotor de T7 ARN polimerasa de bacteriófago; un promotor trp; un promotor de operón lac; un promotor híbrido, por ejemplo, un promotor híbrido lac/tac, un promotor híbrido tac/trc, un promotor trp/lac, un promotor T7/lac; un promotor trc; un promotor tac, y similares; un promotor araBAD; promotores regulados in vivo, tales como un promotor ssaG o un promotor relacionado (véase, por ejemplo, publicación de patente de Estados Unidos No. 20040131637), un promotor pagC (Pulkkinen y Miller, J. Bacteriol., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), un promotor nirB (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813), y similares (véase, por ejemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:32433255; and Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); un promotor sigma70, por ejemplo, un promotor consenso sigma70 (véase, por ejemplo, GenBank Accesos Nos. AX798980, AX798961, y AX798183); un promotor de fase estacionaria, por ejemplo, un promotor dps, un promotor spv, y similares; un promotor derivado de de la isla de patogenicidad SPI-2 (véase, por ejemplo, WO96/17951); un promotor actA (véase, por ejemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096); un promotor rpsM (véase, por ejemplo, Valdivia y Falkow (1996). Mol. Microbiol. 22:367-378); un promotor tet (véase, por ejemplo, Hillen,W. y Wissmann,A. (1989) en Saenger,W. and Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pág. 143-162); un promotor SP6 (véase, por ejemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035-7056); y similares.

[0142] Además, los vectores de expresión contendrán en muchas realizaciones uno o más genes marcadores seleccionables para proporciona una característica fenotípica para la selección de células huésped transformadas, tales como resistencia a tetraciclina o ampicilina en células huésped procariotas, tales como E. coli.

[0143] En general, los vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de la secuencia codificante. Dichos promotores pueden derivar de operones que codifican enzimas glicolíticos, tales como 3fosfoglicerato quinasa (PGK), factor (, fosfatasa ácida, o proteínas de choque térmico, entre otros.

[0144] En muchas realizaciones, una célula huésped original comprende una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas de la ruta de mevalonato unida operativamente a un promotor inducible. De manera similar, en muchas realizaciones, una célula huésped modificada genéticamente comprenderá una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR y/o HMGS unida operativamente a un promotor inducible. Los promotores inducibles son conocidos en la técnica. Los promotores inducibles adecuados incluyen, pero sin limitación, el pL de bacteriófago A; Plac; Ptrp; Ptac (promtoor híbrido Ptrp-lac); un promotor inducible por isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG), por ejemplo, un promotor lacZ; un promotor inducible por tetraciclina; un promotor inducible por arabinosa, por ejemplo, PBAD (véase, por ejemplo, Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177:4121-4130); un promotor inducible por xilosa, por ejemplo, Pxyl (véase, por ejemplo, Kim et al. (1996) Gene 181: 71-76); un promotor GAL1; un promotor de triptófano; un promotor lac; un promotor inducible por alcohol, por ejemplo, un promotor inducible por metanol, un promotor inducible por etanol; un promotor inducible por rafinosa; un promotor inducible por el calor, por ejemplo, un promotor PL lambda inducible por el calor, un promotor controlado pro un represor seNsible al calor (por ejemplo, vectores de expresión basados en lambda reprimidos por CI857; véase, por ejemplo, Hoffmann et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 177(2):327-34); y similares.

[0145] En muchas realizaciones, se genera una célula huésped original mediante la modificación genética de una célula huésped con un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de la ruta de mevalonato, donde la secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de la ruta de mevalonato está unido operativamente a un promotor constitutivo. De manera similar, en algunas realizaciones, una secuencia codificante de HMGS y/o HMGR está unida operativamente a un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos adecuados para utilizar en células procariotas son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, un promotor sigma70, por ejemplo, un promotor consenso sigma70.

[0146] Cuando una célula huésped original ha sido modificada genéticamente para producir dos o más enzimas de la ruta de mevalonato, las secuencias de nucleótidos que codifican las dos o más enzimas estarán contenidas cada una, en algunas realizaciones, en vectores de expresión separados. Cuando la célula huésped está modificada genéticamente para expresar una o más enzimas de la ruta de mevalonato, las secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas de la ruta de mevalonato estarán contenidos, en algunas realizaciones, en un único vector de expresión. Cuando las secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas de la ruta de mevalonato están contenidas en un único vector de expresión, en algunas realizaciones, las secuencias de nucleótidos estarán unidas operativamente a un elemento de control común (por ejemplo, un promotor), por ejemplo, el elemento de control común controla la expresión de todas las secuencias de nucleótidos que codifican enzimas de la ruta de mevalonato en el vector de expresión único.

[0147] Cuando las secuencias de nucleótidos que codifican la enzima o enzimas de la ruta de mevalonato están contenidas en un único vector de expresión, en algunas realizaciones, las secuencias de nucleótidos estarán unidas operativamente a diferentes elementos de control (por ejemplo, un promotor), por ejemplo, los diferentes elementos de control controlan la expresión de cada una de las secuencias de nucleótidos que codifican enzimas de la ruta de mevalonato por separado en un único vector de expresión.

[0148] Cuando una célula huésped original está modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una enzima o enzimas que proporcionan la paliación de la toxicidad de inducida por la acumulación de HMG-CoA, en algunas realizaciones, las enzimas serán codificadas en dos constructos de expresión diferentes (separados). Por ejemplo, en algunas realizaciones, se expresará la HMGR a partir de un plásmido con un número de copias elevado, mientras que HMGS se expresará a partir de un plásmido con un número bajo de copias, bajo el control de un promotor idéntico. En otras realizaciones, HMGR y HMGS se expresarán a partir de plásmidos con un número de copias similar, expresándose HMGR por un promotor más fuerte que HMGS. Cuando una célula huésped original está modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una enzima o enzimas que proporcionan la paliación de la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA, en algunas realizaciones las enzimas serán codificadas en un único constructor de expresión. Por ejemplo, en algunas realizaciones, HMGR y HMGS se expresarán a partir de un único plásmido bajo el control de un único promotor, de manera que la estabilidad del transcrito modificado de HMGR será mayor que la de HMGS.

[0149] Cuando las secuencias de nucleótidos que codifican la enzima o enzimas que proporciona una paliación de la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA están contenidas en un único constructo de expresión, en algunas realizaciones; las secuencias de nucleótidos estarán unidas operativamente a diferentes elementos de control (por ejemplo, promotores), por ejemplo los diferentes elementos de control controlan la expresión de cada una de las enzimas que proporcionan una paliación de la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA por separado en un único constrcuto de expresión. Por ejemplo, en algunas realizaciones, HMGR y HMGS se expresarán a partir de un único plásmido, expresándose HMGR por un promotor más fuerte que HMGS.

Secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas de la ruta de mevalonato

[0150] Las secuencias de nucleótidos que codifican los productos génicos de la ruta de MEV son conocidas en la técnica y se puede utilizar cualquier secuencia de nucleótidos conocida que codifique el producto génico de la ruta de MEV para generar una célula huésped modificada genéticamente en cuestión. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, e IDI son conocidas en la técnica. Los siguientes son ejemplos no limitantes de secuencias de nucleótidos conocidas que codifican productos génicos de las rutas de MEV, con números de acceso de GenBank y organismo después de cada enzima de la ruta de MEV, en paréntesis: acetoacetil-CoA tiolasa: (NC_000913 REGION: 2324131..2325315; E. coli), (D49362; Paracoccus denitrificans), y (L20428; Saccharomyces cerevisiae); HMGS: (NC_001145. complemento 19061..20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), y (BT007302; Homo sapiens); HMGR: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NM_204485; Gallus gallus), (AB015627; Streptomyces sp. KO-3988), (AF542543; Nicotiana attenuata), (AB037907; Kitasatospora griseola), (AX128213, que proporciona la secuencia que codifica una HMGR truncada; Saccharomyces cerevisiae), y (NC_001145: complemento (115734.. 118898; Saccharomyces cerevisiae)); MK: (L77688; Arabidopsis thaliana), y (X55875; Saccharomyces cerevisiae); PMK: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens), (NC_001145. complemento 712315..713670; Saccharomyces cerevisiae); MPD: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium), y (U49260; Homo sapiens); e IDI: (NC_000913, 3031087..3031635; E. coli), y (AF082326; Haenzatococcus pluvialis).

[0151] En algunas realizaciones, la región codificante de HMGR está establecida en SEQ ID NO:13, que codifica una forma truncada de HMGR ("tHMGR") que carece del dominio transmembrana de HMGR de tipo salvaje. El dominio transmembrana de HMGR contiene las partes reguladoras de la enzima y no tiene actividad catalítica.

[0152] La secuencia codificante de cualquier enzima de la ruta de mevalonato conocida se puede alterar de varias maneras conocidas en la técnica para generar cambios dirigidos en la secuencia de aminoácidos de la enzima codificada. La secuencia de aminoácidos de una enzima de la ruta de MEV variante será normalmente sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos de cualquier enzima de la ruta de MEV conocida, es decir, diferirá en por lo menos un aminoácido, y puede diferir en por lo menos dos, por lo menos 5, por lo menos 10, o por lo menos 20 aminoácidos, pero normalmente no más de aproximadamente cincuenta aminoácidos. Los cambios en las secuencias pueden ser sustituciones, inserciones o deleciones. Por ejemplo, tal como se describe a continuación, la secuencia de nucleótidos se puede alterar por la predisposición del codón de una célula huésped concreta. Además, se pueden introducir una o más diferencias en las secuencias de nucleótidos que dan lugar a cambios conservativos de aminoácidos en la proteína codificada. En una realización, los niveles relativos deseados de HMGS y HMGR y los niveles no tóxicos de HMG-CoA se coNsiguen mediante la expresión de una proteína HMGS o HMGR alterada, o ambas.

Prenil transferasas

[0153] En algunas realizaciones, una célula huésped modificada genéticamente en cuestión está modificada genéticamente para incluir uno o más ácidos nucleicos que comprenden una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas de la ruta de mevalonato, tal como se describen anteriormente; y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una prenil transferasa.

[0154] Las preniltransferasas constituyen un amplio grupo de enzimas que catalizan la condensación consecutiva de IPP que da lugar a la formación de prenil difosfatos de varias longitudes de cadena. Las preniltransferasas adecuadas incluyen enzimas que catalizan la condensación de IPP con sustratos de cebadores arílicos para formar compuestos isoprenoides con aproximadamente 2 unidades de isopreno a aproximadamente 6000 unidades de isopreno o más, por ejemplo, 2 unidades de isopreno (Geranil Pirofosfato sintasa), 3 unidades de isopreno (Farnesil pirofosfato sintasa), 4 unidades de isopreno (geranilgeranil pirofosfato sintasa), 5 unidades de isopreno, 6 unidades de isopreno (hexadecilpirofosfato sintasa), 7 unidades de isopreno, 8 unidades de isopreno (fitoeno sintasa, octaprenil pirofosfato sintasa), 9 unidades de isopreno (nonaprenil pirofosfato sintasa, 10 unidades de isopreno (decaprenil pirofosfato sintasa), de aproximadamente 10 unidades de isopreno a aproximadamente 15 unidades de isopreno, de aproximadamente 15 unidades de isopreno a aproximadamente 20 unidades de isopreno, de aproximadamente 20 unidades de isopreno a aproximadamente 25 unidades de isopreno, de aproximadamente 25 unidades de isopreno a aproximadamente 30 unidades de isopreno, de aproximadamente 30 unidades de isopreno a aproximadamente 40 unidades de isopreno, de aproximadamente 40 unidades de isopreno a aproximadamente 50 unidades de isopreno, de aproximadamente 50 unidades de isopreno a aproximadamente 100 unidades de isopreno, de aproximadamente 100 unidades de isopreno a aproximadamente 250 unidades de isopreno, de aproximadamente 250 unidades de isopreno a aproximadamente 500 unidades de isopreno, de aproximadamente 500 unidades de isopreno a aproximadamente 1000 unidades de isopreno, de aproximadamente 1000 unidades de isopreno a aproximadamente 2000 unidades de isopreno, de aproximadamente 2000 unidades de isopreno a aproximadamente 3000 unidades de isopreno, de aproximadamente 3000 unidades de isopreno a aproximadamente 4000 unidades de isopreno, de aproximadamente 4000 unidades de isopreno a aproximadamente 5000 unidades de isopreno, o de aproximadamente 5000 unidades de isopreno a aproximadamente 6000 unidades de isopreno o más.

[0155] Las preniltransferasa adecuadas incluyen, pero sin limitación, una E-isoprenil difosfato sintasa, incluyendo, pero sin limitación, geranil difosfato (GPP) sintasa, farnesil difosfato (FPP) sintasas, geranilgeranil bifosfato (GGPP) sintasa, hexaprenil difosfato (HexPP) sintasa, heptaprenil difosfato (HepPP) sintasa, octaprenil (OPP) difosfato sintasa, solanesil difosfato (SPP) sintasa, decaprenil difosfato (DPP) sintasa, chicle sintasa, y gutapercha sintasa; y una Z-isoprenil difosfato sintasa, incluyendo, pero sin limitación, nonaprenil difosfato (NPP) sintasa, undecaprenil difosfato (UPP) sintasa, deshidrodoliquil difosfato sintasa, eicosaprenil difosfato sintasa, caucho natural sintasa, y otras Z-isoprenil difosfato sintasas.

[0156] Las secuencias de nucleótidos de un conjunto de prenil transferasas de una variedad de especies son conocidas y se pueden utilizar o modificar para utilizar en la generación de una célula huésped modificada genéticamente en cuestión. Las secuencias de nucleótidos que codifican prenil transferasas son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, el ARNm de farnesil pirofosfato sintetasa humano (GenBank Acceso No. J05262; Homo sapiens); gen de farnesil difosfato sintetasa (FPP) (GenBank Acceso No. J05091; Saccharomyces cerevisiae); gen de isopentenil difosfato:dimetilalil difosfato isomerasa (J05090; Saccharomyces cerevisiae); Wang y Ohnuma (2000) Biochim. Biophys. Acta 1529:33-48; patente de Estados Unidos No. 6,645,747; ARNm de farnesil pirofosfato sintetasa 2 (FPS2) / FPP sintetasa 2 / farnesil difosfato sintasa 2 (At4g17190) de Arabidopsis thaliana (GenBank Acceso No. NM_202836); ARNm de geranilgeranil difosfato sintasa (ggpps) de Ginkgo biloba (GenBank Acceso No. AY371321); ARNm de geranilgeranil pirofosfato sintasa (GGPP1) / GGPP sintetasa/ farnesiltranstransferasa (At4g36810) de Arabidopsis thaliana (GenBank Acceso No. NM_119845); gen de Synechococcus elongatus para farnesil, geranilgeranil, geranilfarnesil, hexaprenil, heptaprenil difosfato sintasa (SelF-HepPS) (GenBank Acceso No. AB016095); etc.

Uso de codones

[0157] En algunas realizaciones, se modifica la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de la ruta del mevalonato, de manera que la secuencia de nucleótidos refleja la preferencia de codón para la célula huésped concreta. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se modificará la secuencia de nucleótidos para la preferencia del codón de levadura. Ver, por ejemplo, Bennetzen y Hall (1982) J. Biol. Chem. 257(6): 3026-3031. Como otro ejemplo no limitante, en otras realizaciones se modificará la secuencia de nucleótidos para la preferencia de codón de E. coli. Ver, por ejemplo, Gouy y Gautier (1982) Nucleic Acids Res. 10(22):7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mol. Biol. Evol. 13(6):864-872. Ver también Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):292.

[0158] Tal y como se indica anteriormente, en algunas realizaciones, se modifica el uso de codones de una secuencia codificante de HMGS, de manera que se disminuye el nivel de traducción del ARNm de HMGS. La reducción del nivel de traducción de ARNm de HMGS por modificación del uso de codones se coNsigue mediante la modificación de la secuencia para incluir codones que son raros o que no son comúnmente utilizados por la célula huésped. Están disponibles tablas de uso de codones para muchos organismos que resumen el porcentaje de tiempo que un organismo específico utiliza un codón específico para codificar un aminoácido. Ciertos codones se utilizan más frecuentemente que otros, los codones “raros”. El uso de codones “raros” en una secuencia disminuye generalmente su índice de traducción. De este modo, por ejemplo, se modifica la secuencia codificante mediante la introducción de uno o más codones raros, que afectan el índice de traducción, pero no la secuencia de aminoácidos de la enzima traducida. Por ejemplo, hay 6 codones que codifican para arginina: CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, and AGG. En E. coli se utilizan los codones CGT y CGC mucho más frecuentemente (codificando aproximadamente el 40% de las argininas en E. coli cada uno) que el codón AGG (que codifica aproximadamente el 2% de las argininas en E. coli). Modificando un codón CGT en la secuencia de un gen en un codón AGG no cambiaría la secuencia de la enzima, pero probablemente disminuiría el índice de traducción del gen.

Modificaciones genéticas adicionales

[0159] En algunas realizaciones, una célula huésped modificada genéticamente en cuestión es aquella que se modificada genéticamente para incluir uno o más ácidos nucleicos que comprenden una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican enzimas que palian la toxicidad inducida por acumulación de HMG-CoA; y que se modifica adicionalmente genéticamente para conseguir una producción mejorada de un intermedio de la ruta biosintética del terpeno, y/o que se modifica adicionalmente genéticamente para mejorar la producción de un isoprenoide o precursor de isoprenoide, y/o que se modifica adicionalmente genéticamente de manera que se inactiva funcionalmente un gen endógeno de la ruta biosintética del terpeno. El término “inactivado funcionalmente”, tal y como se utiliza en la presente invención, hace referencia a una modificación genética de un ácido nucleico, cuya modificación da lugar a la producción de un producto génico codificado por el ácido nucleico que se produce por debajo de los niveles normales, y/o es no funcional. Dicha modificación o modificaciones genéticas pueden disminuir la productividad específica de mevalonato o IPP de una cepa (producción por célula) en comparación con una cepa original, pero la paliación en la toxicidad inducida por HMG-CoA incrementaría la deNsidad celular de manera que se incrementaría la productividad total del cultivo (productividad específica multiplicada por la deNsidad celular del cultivo).

[0160] Las modificaciones genéticas que aumentan la producción de un intermedio endógeno de la ruta biosintética de terpeno incluyen, pero sin limitación, modificaciones genéticas que dan lugar a un nivel y/o actividad reducidos de una fosfotransacetilasa en la célula huésped. La concentración intracelular de un intermedio de la ruta biosintética de isoprenoide aumenta mediante el incremento de la concentración intracelular del acetil-CoA. La E. coli secreta una fracción significativa de acetil-CoA intracelular en forma de acetato en el medio. La eliminación del gen que codifica la fosfotransacetilasa, pta, la primera enzima responsable de la transformación de acetil-CoA en acetato, reduce la secreción de acetato. Las modificaciones genéticas que reducen el nivel y/o la actividad de la fosfotransacetilasa en una célula huésped procariota son particularmente útiles cuando la célula huésped original es aquella que está modificada genéticamente con un ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos que codifican uno o más productos génicos de la ruta de MEV.

[0161] Debido a que el acetil-CoA es un reactivo utilizado tanto por la acetoacetil-CoA tiolasa como por la HMGS en la síntesis de HMG-CoA, y en algunas células huésped, los incrementos en el grupo intracelular de acetil-CoA podría conducir a incrementos en el grupo intracelular de HMG-CoA, que a su vez podría conducir a un efecto de toxicidad. Por tanto, las modificaciones genéticas que reducen la actividad total de la fosfotransacetilasa podrían conducir a una reducción en la velocidad de crecimiento o la deNsidad celular final debido a la acumulación de HMG-CoA, generando una cepa original que podría modificarse utilizando el método de la invención. De modo alternativo, podrían utilizarse las modificaciones genéticas que incrementan la actividad total de fosfotransacetilasa para superar el efecto de toxicidad causado por la acumulación de HMG-CoA.

[0162] En algunas realizaciones, una modificación genética que da lugar a un nivel reducido de fosfotransacetilasa en una célula huésped procariota es una mutación genética que inactiva funcionalmente el gen pta endógeno de la célula huésped procariota que codifica la fosfotransacetilasa. El gen pta puede inactivarse funcionalmente de varias maneras, incluyendo la inserción de un elemento genético móvil (por ejemplo, un transposón, etc.); la deleción de todo o parte del gen, de manera que no se fabrica el producto génico, o está truncado y no es funcional en la conversión de acetil-CoA en acetato; la mutación del gen, de manera que no se fabrica el producto génico, o está truncado y no es funcional en la conversión de acetil-CoA en acetato; la deleción o la mutación de uno o más elementos de control que controlan la expresión de control del gen pta de manera que el producto génico no se fabrica; y similares.

[0163] En algunas realizaciones, se elimina el gen pta endógeno de una célula huésped modificada genéticamente. Puede utilizarse cualquier método para la eliminación de un gen. Un ejemplo no limitante de un método para eliminar un gen pta es mediante el uno del sistema de recombinación ARed. Datsenko y Wanner (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(12): p. 6640-5. En algunas realizaciones el gen pta se eliminará de una célula huésped (por ejemplo, E. coli) que está modificada genéticamente con un ácido nucleico que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican MK, PMK, MPD, e IDI. En algunas realizaciones el gen pta se eliminará de una célula huésped (por ejemplo, E. coli) que está modificada genéticamente con un ácido nucleico que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican MK, PMK, MPD, e IPP. En algunas realizaciones el gen pta se eliminará de una célula huésped (por ejemplo, E. coli) que está modificada genéticamente con un ácido nucleico que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican MK, PMK, MPD, IPP y una prenil transferasa.

[0164] Otras modificaciones que incrementarían los niveles de acetil-CoA intracelular incluyen, pero sin limitación, modificaciones que disminuirían la actividad total de la lactato deshidrogenasa en la célula, modificaciones que disminuirían la actividad total de la acetato quinasa en la célula, modificaciones que disminuirían la actividad total de la alcohol deshidrogenasa en la célula, modificaciones que interrumpirían el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, tales como aquellas que disminuirían la actividad total de la 2-cetoglutarato deshidrogenasa, o modificaciones que interrumpirían la fosforilación oxidativa, tales como aquellos que disminuirían la actividad total de la (F1F0)H+-ATP sintasa, o combinaciones de las mismas.

[0165] Otras modificaciones que disminuirían los niveles de acetil-CoA intracelular incluyen, pero sin limitación, modificaciones que incrementarían la actividad total de la lactato deshidrogenasa en la célula, modificaciones que incrementarían la actividad total de la acetato quinasa en la célula, y modificaciones que incrementarían la actividad total de la alcohol deshidrogenasa en la célula, o combinaciones de las mismas.

[0166] En algunas realizaciones, una célula huésped original es aquella que está modificada genéticamente, tal y como se describe anteriormente, para incrementar los niveles de HMG-CoA; y se modifica genéticamente adicionalmente de manera que se inactiva funcionalmente un gen endógeno de la ruta biosintética de DXP. Dicha célula huésped modificada genéticamente es útil en el cribado de enzimas que convierten HMG-CoA en mevalonato, tal y como se describe con más detalle más adelante, ya que la toxicidad de HMG-CoA se exacerbaría mediante la dependencia de la célula con la ruta del mevalonato para la producción de los isoprenoides requeridos.

[0167] En otras realizaciones, una célula huésped modificada genéticamente en cuestión es aquella que se modifica genéticamente para incluir uno o más ácidos nucleicos que comprenden una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican productos génicos de la ruta biosintética del DPX; y que se modifica genéticamente adicionalmente de manera que se inactiva funcionalmente un gen endógeno de la ruta biosintética del MEV. Dicha célula huésped sería útil en el caso en que por razones técnicas el cribado de enzimas asociadas con la toxicidad de HMG-CoA se llevara a cabo más fácilmente en un organismo que de modo natural utiliza la ruta del mevalonato para la producción de isoprenoides.

[0168] En algunas realizaciones en las que la célula huésped modificada genéticamente en cuestión es una célula huésped procariota que se ha modificado genéticamente con un ácido o ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican uno o más productos génicos de la ruta de MEV, la célula huésped se modificará genéticamente adicionalmente de manera que se inactiva uno o más genes endógenos de la ruta del DXP. Los genes de la ruta del DXP que pueden inactivarse funcionalmente incluyen uno o más de los genes que codifican cualquiera de los siguientes productos génicos de DXP: 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa, 1-desoxi-Dxilulosa-5-fosfato reductoisomerasa, 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintasa, 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinasa, 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa, y 1-hidroxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sintasa.

[0169] Un gen endógeno de la ruta del DXP puede inactivarse funcionalmente de varias maneras, incluyendo la inserción de un elemento genético móvil (por ejemplo, un transposón, etc.); la deleción de todo o de parte del gen, de manera que el producto génico no se fabrica, o está truncado y es enzimáticamente inactivo; la mutación del gen, de manera que el producto génico no se fabrica, o está truncado y no es enzimáticamente funcional; la deleción o la mutación de uno o más elementos de control que controlan la expresión del gen, de manera que el producto génico no se fabrica; y similares.

Composiciones que comprenden una célula huésped genéticamente modificada en cuestión

[0170] La presente invención proporciona adicionalmente composiciones que comprenden una célula huésped genéticamente modificada en cuestión. Una composición en cuestión comprende una célula huésped genéticamente modificada en cuestión; y en algunas realizaciones comprenderá uno o más componentes adicionales, cuyos componentes se seleccionan basándose en parte en el uso pretendido de las células huésped modificadas genéticamente. Los componentes aptos incluyen, pero sin limitación, sales; tampones, estabilizadores; agentes inhibidores de proteasas; compuestos conservantes de la membrana celular y/o de la pared celular, por ejemplo, glicerol, dimetilsulfóxido, etc.; medios nutricionales apropiados para la célula; y similares.

�?CIDOS NUCLEICOS

[0171] En el presente documento se describen un ácido o ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican HMGS y/o HMGR, en el que el ácido o ácidos nucleicos, cuando se introduce en una célula huésped original que incluye o está modificada genéticamente para incluir, palian la toxicidad o la inhibición de crecimiento inducida por acumulación de HMG-CoA. De este modo, un ácido nucleico en cuestión, cuando se introduce en una célula huésped que muestra toxicidad inducida por acumulación de HMG-CoA, palia la toxicidad o la inhibición de crecimiento inducida por acumulación de HMG-CoA. En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR unido operativamente a un promotor fuerte.

[0172] En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión es un constructo de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR. En algunas realizaciones, el constructo de expresión es aquel que proporciona la síntesis de la HMGR codificada en una célula procariota. En algunas realizaciones, el constructor de expresión es aquel que proporciona la síntesis de la HMGR codificada en una célula eucariota. En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR, donde el ácido nucleico es un plásmido con un número medio de copias. En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR, donde el ácido nucleico es un plásmido con un número de copias elevado. En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR unida operativamente con un promotor fuerte, donde el ácido nucleico es un plásmido con un número de copias elevado. En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR unida operativamente con un promotor fuerte, donde el ácido nucleico es un plásmido con un número medio de copias. En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR unida operativamente con un promotor débil en un plásmido con un número medio de copias.

[0173] En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende una acetoacetil-CoA tiolasa unida operativamente con HMGR. En algunas realizaciones, se genera un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión acetoacetil-CoA/HMGR mediante la unión de las secuencias que codifican la acetoacetil-CoA tiolasa y HMGR. En algunas realizaciones, la proteína de fusión es aquella que se encuentra en la naturaleza. En otras realizaciones, la proteína de fusión es aquella que se encuentra en la naturaleza, y es diferente de la proteína de fusión descrita en Hedl et al. ((2002) J.Bacteriol. 184:2116-2122). En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende acetoacetil-CoA tiolasa y HMGS. En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS y HMGR. En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende HMGS y HMGR.

[0174] En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión es un constructo de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR, donde el constructo de expresión es diferente de un constructo de expresión descrito en cualquiera de las siguiente referencias: Kato-Emori et al. Mol Genet Genomics (2001) 265:13542, Learned RM, et al. PNAS. (1989) 86:2779-83, T. Dairi, et al. Mol Gen Genet (2000) 262: 957 - 964, Allen, et al. Appl Environ. Microbio. (1997). 63:3341-3344, Hedl, et al. J. Bacteriol., (2002), 184:2116-2122. Jackson, et al. Org.

Lett. (2003) 5:1629-1632. Randolph Y. Hampton, et al. (1994) Cell, 125:299-312, Markus Veen, et al. FEMS Yeast Res (2003) 4:87-95. Beach MJ, et al. J Bacteriol (1989) 171:2994-3001. Bischoff KM, et al. Protein Sci (1997) 6:156

161. Friesen JA, et al. Biochemistry. (1997) 36:2173-7. Frimpong, et al. J Biol Chem. (1994) 269:11478-83. Panda, et al. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 143-152.

MÉTODOS DE CRIBADO

[0175] En el presente documento se describen métodos de cribado para la identificación de un producto génico que tiene actividad de detoxificación de HMG-CoA; y métodos para la identificación de un agente que inhibe la acumulación de HMG-CoA. En una realización, el producto génico identificado es aquel que codifica una HMGR, por ejemplo, una HMGR variante. En una realización, el producto génico identificado es aquel que codifica una HMGR variante, en la que la HMGR variante proporciona un incremento en la actividad total de HMGR en la célula. En otra realización, el producto génico identificado produce un producto que reduce la actividad de HMGS. En otra realización, el producto génico identificado produce un producto que utiliza mevalonato como sustrato. En otra realización, el gen identificado produce un producto que codifica una MK. En otro ejemplo, el producto génico identificado proporciona el transporte del mevalonato desde la célula. En otra realización, el producto génico identificado es una HMG-CoA liasa o codifica una HMG-CoA liasa. En otra realización, el producto génico identificado codifica una succinato-hidroximetilglutarato CoA-transferasa, o es una succinato-hidroximetilglutarato CoA-transferasa.

[0176] Para identificar un producto génico que reduce la toxicidad inducida por acumulación de HMG-CoA, los métodos generalmente implican la producción de una célula de análisis mediante la introducción dentro de una célula huésped de un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico candidato, en el que la célula huésped produce HMG-CoA a niveles efectivos para inhibir el crecimiento de la célula huésped; y b) la dterminación del efecto, si lo hay, de la expresión del producto génico candidato en el crecimiento de la célula de análisis. Para identificar un agente que reduce la acumulación de HMG-CoA intracelular, y/o que reduce el nivel de actividad de HMGS en una célula, los métodos generalmente implican a) la puesta en contacto de una célula de análisis con un agente de análisis, en el que la célula de análisis sintetiza mevalonato a través de la ruta del mevalonato, y en el que la célula de análisis muestra inhibición del crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA; y b) la determinación del efecto, si lo hay, del agente de análisis sobre la inhibición del crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA. Tal y como se utiliza en la presente invención, el término “determinación” hace referencia tanto a determinaciones cuantitativas como cualitativas y, por tanto, el término “determininación” se utiliza de manera intercambiable con “ensayo”, “medición”, y similares.

[0177] Los métodos de cribado en cuestión son ensayos basados en células in vitro. Puede utilizarse cualquiera de una variedad de células. Las células utilizadas en el ensayo son en algunas realizaciones células eucariotas. En otras realizaciones, las células utilizadas en el ensayo son células procariotas, tal y como se describe anteriormente.

Métodos de identificación de un producto génico que tiene actividad de detoxificación de HMG-CoA

[0178] En la presente invención se describen métodos de cribado in vitro para identificar un producto génico que tiene actividad de detoxificación de HMG-CoA. Los productos génicos así identificados son útiles para paliar la toxicidad inducida por acumulación de HMG-CoA, y por tanto son útiles en métodos de producción de compuestos isoprenoide o precursores de isoprenoide. Estos métodos generalmente implican a) la producción de una célula de análisis mediante la introducción dentro de una célula huésped de un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico candidato, en el que la célula huésped produce HMG-CoA a niveles efectivos para inhibir el crecimiento de la célula huésped; y b) la determinación del efecto, si lo hay, de la expresión del producto génico candidato sobre el crecimiento de la célula de análisis, en comparación con la célula huésped. La capacidad del producto génico candidato de reducir la acumulación de HMG-CoA y paliar la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA se determina mediante la capacidad del producto génico candidato de reducir la inhibición de crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA. Una reducción en la inhibición del crecimiento en la célula de análisis, en comparación con la célula huésped, indica que el ácido nucleico exógeno codifica un producto génico que tiene actividad suficiente para paliar la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA. La célula huésped es aquella que produce una o más enzimas en la ruta del mevalonato, de modo que se produce HMG-CoA. En algunas realizaciones, la célula huésped es aquella que no produce normalmente mevalonato a través de la ruta del mevalonato, y que ha sido modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más enzimas de la ruta del mevalonato, de modo que se produce y se acumula intracelularmente HIMG-CoA a niveles de inhibición de crecimiento. En otras realizaciones, la célula huésped es aquella que produce de forma natural HMG-CoA a niveles de inhibición de crecimiento o que ha sido modificada genéticamente, aparte de a través de la introducción de uno o más genes exógenos de la ruta del MEV, para producirlo.

[0179] La HMG-CoA se produce en la célula huésped en una cantidad que inhibe el crecimiento de la célula huésped, por ejemplo, la concentración intracelular de HMG-CoA inhibe el crecimiento de la célula huésped. Típicamente, se acumula HMG-CoA en la célula huésped en una cantidad que inhibe el crecimiento de la célula huésped en por lo menos aproximadamente el 10%, por lo menos aproximadamente el 20%, por lo menos aproximadamente el 30%, por lo menos aproximadamente el 40%, por lo menos aproximadamente el 50%, por lo menos aproximadamente el 60%, por lo menos aproximadamente el 70%, por lo menos aproximadamente el 80%, por lo menos aproximadamente el 90%, o más, en comparación con la velocidad de crecimiento de una célula huésped control que no produce HM-CoA, o en comparación con la velocidad de crecimiento de la célula huésped que se cultiva bajo condiciones que no son propicias para la síntesis de cantidades de HMG-CoA inhibidoras del crecimiento. En algunas realizaciones, se acumula HMG-CoA intracelularmente en la célula huésped en una cantidad que es letal para la célula huésped, por ejemplo, induce la muerte de la célula huésped.

[0180] En algunas realizaciones, una célula huésped que muestra inhibición del crecimiento celular inducida por la acumulación de HMG-CoA es una célula que normalmente no sintetiza mevalonato o IPP a través de una ruta de mevalonato, y se ha modificado genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una enzima o enzimas de la ruta del mevalonato. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una célula huésped que muestra inhibición del crecimiento celular inducida por la acumulación de HMG-CoA es una célula procariota que se ha modificado genéticamente con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, donde la acetoacetil-CoA tiolasa, la HMGS y la HMGR se producen en la célula en cantidades que dan lugar a inhibición de crecimiento celular inducida por acumulación de HMG-CoA.

[0181] En otras realizaciones, una célula huésped que muestra inhibición del crecimiento celular inducida por la acumulación de HMG-CoA es una célula que normalmente produce mevalonato o IPP a través de una ruta de mevalonato, y que se ha modificado genéticamente de modo que se incrementan los niveles intracelulares de HMG-CoA, dando lugar a inhibición del crecimiento celular inducida por acumulación de HMG-CoA.

[0182] La célula de análisis in vitro se cultiva bajo condiciones de manera que se acumula HMG-CoA intracelularmente en una cantidad que es inhibidora del crecimiento y/o inductora de la muerte. En algunas realizaciones, se cultiva la célula de análisis en presencia de un inductor que induce la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica HMGS o HMGR, en la que la secuencia de nucleótidos está bajo control de un promotor inducible. Puede determinarse si el HMG-CoA está presente en la célula de análisis en una cantidad que inhibe el crecimiento de la célula de análisis utilizando cualquier método estándar para detectar la inhibición de crecimiento de una célula. Por ejemplo, frecuentemente se mide el crecimiento como un incremento en la deNsidad óptica cuando las células se desarrollan en cultivos líquidos; y puede detectarse la inhibición de crecimiento comparando la deNsidad óptica (por ejemplo, a 600 nm) del cultivo líquido de células huésped que producen una cantidad inhibidora de crecimiento de HMG-CoA, con la deNsidad óptica de un cultivo líquido de las mismas células huésped que producen una cantidad inhibidora del crecimiento del intermedio. También puede detectarse la inhibición del crecimiento inspeccionando visualmente el tamaño de la colonia de células dispuestas en placas en agar que contiene medios de crecimiento adecuados.

[0183] Un método de cribado en cuestión implica la introducción de un ácido nucleico exógeno dentro de la célula huésped, la producción de una célula de análisis, en la que la célula huésped es aquella que muestra inhibición de crecimiento cuando se produce HMG-CoA en una cantidad inhibidora del crecimiento. Cuando un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR se introduce dentro de la célula huésped, se palia la inhibición de crecimiento de la célula de análisis. De este modo, una reducción en la inhibición del crecimiento indica que el ácido nucleico exógeno codifica HMGR, en el que se produce el HMGR codificado a un nivel y/o tiene una actividad que palia la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA. Una reducción en la inhibición del crecimiento incluye una reducción de por lo menos aproximadamente el 20%, por lo menos aproximadamente el 30%, por lo menos aproximadamente el 40%, por lo menos aproximadamente el 50%, por lo menos aproximadamente el 60%, por lo menos aproximadamente el 70%, por lo menos aproximadamente el 80%, por lo menos aproximadamente el 90%, o más, en la inhibición del crecimiento. En algunas realizaciones, la HMGR codificada por el ácido nucleico exógeno reduce la inhibición del crecimiento de modo que la velocidad de crecimiento celular se restablece hasta la velocidad de crecimiento celular de la célula huésped cuando se desarrolla bajo condiciones de modo que no se produce HMG-CoA en cantidades inhibidoras de crecimiento.

[0184] En algunas realizaciones, por ejemplo, cuando el ácido nucleico exógeno es una pluralidad de ácidos nucleicos exógenos (por ejemplo, una biblioteca de ADNc, una biblioteca genómica, una población de ácidos nucleicos, cada uno codificando una HMGR con una secuencia de aminoácidos diferente, etc.), se introducen los ácidos nucleicos exógenos dentro de la pluralidad de células huésped, formando una pluralidad de células de análisis. En algunas realizaciones, las células de análisis se desarrollan en cultivo líquido bajo condiciones tales que se acumula HMG-CoA intracelularmente en una cantidad inhibidora de crecimiento y/o inductora de muerte; aquellas células de análisis que comprenden un ácido nucleico exógeno que comprende secuencias de nucleótidos que codifican HMGR se desarrollarán más rápido que las células de análisis que no comprenden un ácido nucleico exógeno que comprende secuencias de nucleótidos que codifican HMGR, o aquellas células de análisis que comprenden un ácido nucleico exógeno que comprende secuencias de nucleótidos que codifican HMGR vivirán, mientras que las células de análisis que no comprenden un ácido nucleico exógeno que comprende secuencias de nucleótidos que codifican HMGR morirán.

[0185] En algunas realizaciones, el método implica adicionalmente el aislamiento de un ácido nucleico exógeno de una célula de análisis, en el que el ácido nucleico exógeno que palia la inhibición de crecimiento en un método de cribado en cuestión. Los métodos de aislamiento del ácido nucleico exógeno de una célula de análisis son bien conocidos en la técnica. Los métodos adecuados incluyen, sin limitación, cualquiera de los métodos de lisis alcalina que son estándar en la técnica.

[0186] En algunas realizaciones, un método de cribado en cuestión comprenderá adicionalmente la caracterización adicional de un producto génico candidato. En estas realizaciones, se aíslan de una célula de análisis los ácidos nucleicos que comprenden la(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican HMGR; se expresan los producto(s) génico(s) en una célula y/o en un sistema de transcripción/traducción sin células in vitro. En algunas realizaciones, el ácido nucleico exógeno se somete al análisis de secuencia de nucleótidos, y se deduce la secuencia de aminoácidos del producto génico a partir de la secuencia de nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del producto génico se compara con otras secuencias de aminoácidos en una base de datos pública de secuencias de aminoácidos, para determinar si existe alguna identidad de secuencia de aminoácidos significativa con una secuencia de aminoácidos de una proteína conocida. Además, se expresan el(los) producto(s) génico(s) en una célula y/o en un sistema de transcripción/traducción sin células in vitro; y se “analiza el efecto de los producto(s) génicos en un intermedio de la ruta metabólica u otro metabolito.

[0187] Los ácidos nucleicos exógenos que son aptos para introducir en una célula huésped, para producir una célula de análisis, incluyen, sin limitarse, ácidos nucleicos que se encuentran de forma natural aislados de una célula; ácidos nucleicos que se encuentran de forma natural que han sido modificados (por ejemplo, mediante mutación) antes o después del aislamiento de una célula; ácidos nucleicos sintéticos, por ejemplo, ácidos nucleicos sintetizados en un laboratorio que utiliza métodos estándar de síntesis química de ácidos nucleicos, o generados mediante métodos recombinantes; ácidos nucleicos sintéticos o que se encuentran de forma natural que se han amplificado in vitro, ya sea dentro de una célula o en un sistema sin célula; y similares.

[0188] Los ácidos nucleicos exógenos que son aptos para la introducción dentro de una célula huésped incluyen, pero sin limitación, ADN genómico; ARN; una copia complementaria de ADN (ADNc) de ARNm aislado de una célula; ADN recombinante; y ADN sintetizado in vitro, por ejemplo, utilizando métodos in vitro sin célula estándar para síntesis de ADN. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos exógenos son una biblioteca de ADNc fabricada a partir de células, ya sean células procariotas o células eucariotas. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos exógenos son una biblioteca de ADN genómico fabricada a partir de células, ya sean células procariotas o células eucariotas.

[0189] En algunas realizaciones los ácidos nucleicos serán mutados antes de ser introducidos dentro de la célula huésped. Los métodos de mutación de un ácido nucleico son bien conocidos en la técnica e incluyen métodos de mutación química bien establecidos, mutagénesis inducida por radiación, y métodos de mutación de un ácido nucleico durante la síntesis. Los métodos químicos de mutación de ADN incluyen la exposición de ADN a mutágeno químico, por ejemplo, metanosulfonato de etilo (EMS), metanosulfonato de metilo (MMS), N-nitrosourea (ENU), Nmetil-N-nitro-N’-nitrosoguanidina, 4-nitroquinolina N-óxido, dietilsulfato, benzopireno, ciclofosfamida, bleomicina, trietilmelamina, monómero de acrilamida, mostaza de nitrógeno, vincristina, diepoxialcanos (por ejemplo, diepoxibutano), ICR-170, formaldehído, clorhidrato de procarbazina, óxido de etileno, dimetilnitrosamina, 7,12 dimetilbenz(a)antraceno, clorambucil, hexametilfosforamida, bisulfan, y similares. Los agentes de radiación inductores de mutación incluyen radiación ultravioleta, radiación y, rayos X, y bombardeo de neutrones rápido. También pueden introducirse mutaciones dentro de un ácido nucleico utilizando, por ejemplo, trimetilpsoraleno con luz ultravioleta. Otro método apto para generar mutaciones es la inserción aleatoria o dirigida de un elemento de ADN móvil, por ejemplo; un elemento transponible. Pueden introducirse mutaciones dentro de un ácido nucleico durante la amplificación en un sistema in vitro sin célula, por ejemplo, utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como PCR propenso a error. Pueden introducirse mutaciones dentro de un ácido nucleico in vitro utilizando técnicas de barajado de ADN (por ejemplo, barajado de exones, intercambio de dominios, y similares). También pueden introducirse mutaciones dentro de un ácido nucleico como resultado de una deficiencia en una enzima de reparación de ADN en una célula, por ejemplo, se espera que la presencia en una célula de un gen mutante que codifica una enzima de reparación de ADN mutante genere una alta frecuencia de mutaciones (es decir, aproximadamente 1 mutación/100 genes-1 mutación/10.000 genes) en el genoma de la célula. Ejemplos de genes que codifican enzimas de reparación de ADN incluyen sin limitarse Mut H, Mut S, Mut L, y Mut U, y los homólogos de los mismos en otras especies (por ejemplo, MSH 1-6, PMS 1-2, MLH 1, GTBP, ERCC-1, y ese tipo). Los métodos de mutación de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica, y cualquier método conocido es apto para su uso. Ver, por ejemplo, Stemple (2004) Nature 5:1-6; Chiang et al. (1993) PCR Methods Appl 2(3): 210217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-51; y patente de Estados Unidos nº 6.033.861, y

6.773.900.

[0190] En muchas realizaciones, se inserta el ácido nucleico exógeno dentro de un vector de expresión. Los vectores de expresión que son aptos para su uso en células huésped procariotas y eucariotas son conocidos en la técnica, y puede utilizarse cualquier vector de expresión apto. Los vectores de expresión aptos son tal y como se describe anteriormente.

[0191] Tal y como se indica anteriormente, en algunas realizaciones, se aislará un ácido nucleico exógeno a partir de una célula o un organismo en su medio natural. En algunas realizaciones, se mutará el ácido nucleico de la célula u organismo antes de aislarse el ácido nucleico de la célula u organismo. En otras realizaciones, se sintetiza el ácido nucleico exógeno en un sistema sin célula in vitro.

[0192] Los ácidos nucleicos exógenos que son aptos para introducir en una célula huésped incluyen ácidos nucleicos aislados de las células o el organismo de una especie diferente de la célula huésped. Las fuentes aptas de ácidos nucleicos exógenos incluyen, sin limitarse, una célula u organismo de cualquiera de los seis reinos, por ejemplo, Bacteria (por ejemplo, Eubacteria); Archaebacteria; Protista; Fungi; Plantae; y Animalia. Las fuentes aptas de ácidos nucleicos exógenos incluyen miembros de tipo vegetal del reino Protista, incluyendo, pero sin limitación, algas (por ejemplo, algas verdes, algas rojas, glaucofitos, cianobacterias); miembros de tipo hongo de Protista, por ejemplo, moho mucilaginoso, Oomycota, etc.; miembros de tipo animal de Protista, por ejemplo, flagelados (por ejemplo, Euglena), ameboides (por ejemplo, ameba), esporozoos (por ejemplo, Apicomplexa, Myxozoa, Microsporidia), y ciliados (por ejemplo, Paramecium). Las fuentes aptas de ácidos nucleicos exógenos incluyen miembros del reino Fungi, incluyendo, pero sin limitación, miembros de cualquiera de los filos: Basidiomycota (club hongos; por ejemplo, miembros de Agaricus, Amanita, Boletus, Cantherellus, etc.); Ascomycota (sac fungi, incluyendo, por ejemplo, Saccharomyces); Mycophycophyta (líquenes); Zygomycota (conjugación hongos); y Deuteromycota. Fuentes aptas de ácidos nucleicos exógenos incluyen miembros del reino Plantae, incluyendo, sin limitación, miembros de cualquiera de las divisiones siguientes: Bryophyta (por ejemplo, musgos), Anthocerotophyta (por ejemplo, antoceros), Hepaticophyta (por ejemplo, hepática), Lycophyta (por ejemplo, club musgos), Sphenophyta (por ejemplo, colas de caballo), Psilophyta (por ejemplo, Psilotum), Ophioglossophyta, Pterophyta (por ejemplo, helechos), Cycadophyta, Gingkophyta, Pinophyta, Gnetophyta, y Magnoliophyta (por ejemplo, plantas florales). Fuentes aptas de ácidos nucleicos exógenos incluyen miembros del reino Animalia, incluyendo, sin limitación, miembros de cualquiera de los filos siguientes: Porifera (esponjas); Placozoa; Orthonectida (parásitos de invertebrados marinos); Rhombozoa; Cnidaria (corales, anémonas, medusas, plumas de mar, sea paNsies, avispas de mar); Ctenophora (portadores de peines); Platyhelminthes (gusanos planos); Nemertina (gusanos cinta); Ngathostomulida (“jawed Worms”)p Gastrotricha; Rotifera; Priapulida; Kinorhyncha; Loricifera; Acanthocephala; Entoprocta; Nemotoda; Nematomorpha; Cycliophora; Mollusca (moluscos); Sipuncula (gusanos cacahuete); Annelida (gusanos segmentados); Tardigrada (osos de agua); Onychophora (gusanos aterciopelados); Arthropoda (incluyendo los subfilos: Chelicerata, Myriapoda, Hexapoda, y Crustacea, dentro de los Chelicerata incluyen, por ejemplo, arácnidos, Merostomata, y Pycnogonida, dentro de los Myriapoda incluyen, por ejemplo, Chilopoda (ciempiés), Diplopoda (milpiés), Paropoda, y Symphyla, dentro de los Hexapoda incluyen insectos, y dentro de los Crustacea incluyen gambas, krill, percebes, etc.; Phoronida; Ectoprocta (animales musgo); Brachiopoda; Echinodermata (por ejemplo estrellas de mar, margaritas de mar, estrellas plumosas, erizos de mar, pepinos de mar, ofiuras, Euryalida, etc.); Chaetognatha (gusanos flecha); Hemichordata (gusanos de bellota); y Chordata. Miembros aptos de Chordata incluyen cualquiera de los miembros de los subfilos siguientes: Urochordata (sea squirts; incluyendo Ascidiacea, Thaliacea, y Larvacea); Cephalochordata (lanceolados); Myxini (mixino); y Vertebrata, dentro de los miembros de Vertebrata incluyen, por ejemplo, miembros de Petromyzontida (lampreas), Chondrichthyces (pez cartilaginoso), Actinopterygii (pez con aletas radiadas), Actinista (celacantos), Dipnoi (peces pulmonados), Reptilia (réptiles, por ejemplo, serpientes, caimanes, cocodrilos, lagartos, etc.), Aves (pájaros); y Mammalian (mamíferos). Los vegetales aptos incluyen cualquier monocotiledóneo y cualquier dicotiledóneo.

[0193] De este modo, por ejemplo, las células aptas incluyen células de organismos que incluyen, sin limitación, un protozoo, un vegetal, un hongo, una célula de alga, una levadura, un réptil, un anfibio, un mamífero, un microorganismo marino, un invertebrado marino, un artrópodo, un isópodo, un insecto, un arácnido, una arqueobacteria, y una eubacteria.

[0194] En algunas realizaciones, se aislará el ácido nucleico exógeno a partir de tejido tomado de un organismo; de una célula concreta o un grupo de células aisladas de un organismo; etc. Por ejemplo, cuando el organismo es una planta, en algunas realizaciones se aislará el ácido nucleico exógeno del xilema, el floema, la capa de cámbium, hojas, raíces, etc. Cuando el organismo es un animal, en algunas realizaciones se aislará el ácido nucleico exógeno de un tejido concreto (por ejemplo, pulmón, hígado, corazón, riñón, cerebro, bazo, piel, tejido fetal, etc.), o un tipo concreto de célula (por ejemplo, células neuronales, células epiteliales, células endoteliales, astrocitos, macrófagos, células gliales, células de islote, linfocitos T, linfocitos B, etc.).

[0195] En algunas realizaciones, el ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico sintético. En algunas realizaciones, un ácido nucleico sintético comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una HMGR variante, por ejemplo, una HMGR que difiere en la secuencia de aminoácidos en uno o más aminoácidos de una HMGR que se encuentra de modo natural u otra HMGR original. En algunas realizaciones, una HMGR variante difiere en la secuencia de aminoácidos en un aminoácido, dos aminoácidos, tres aminoácidos, cuatro aminoácidos, cinco aminoácidos, seis aminoácidos, siete aminoácidos, ocho aminoácidos, nueve aminoácidos, o aminoácidos, o más, en comparación con la secuencia de aminoácidos de una HMGR original que se encuentra de modo natural. En algunas realizaciones, una HMGR variante difiere en la secuencia de aminoácidos en desde aproximadamente 10 aminoácidos hasta aproximadamente 15 aminoácidos, desde aproximadamente 15 aminoácidos hasta aproximadamente 20 aminoácidos, desde aproximadamente 20 aminoácidos hasta aproximadamente 25 aminoácidos, desde aproximadamente 25 aminoácidos hasta aproximadamente 30 aminoácidos, desde aproximadamente 30 aminoácidos hasta aproximadamente 35 aminoácidos, desde aproximadamente 35 aminoácidos hasta aproximadamente 40 aminoácidos, desde aproximadamente 40 aminoácidos hasta aproximadamente 50 aminoácidos, o desde aproximadamente 50 aminoácidos hasta aproximadamente 60 aminoácidos, o más, en comparación con la secuencia de aminoácidos de una HMGR original que se encuentra de forma natural.

[0196] En algunas realizaciones, se codifica una HMGR variante mediante un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas a un ácido nucleico que codifica una HMGR conocida. En otras realizaciones, se codifica una HMGR variante mediante un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de hibridación moderadas a un ácido nucleico que codifica una HMGR conocida. En otras realizaciones, se codifica una HMGR variante mediante un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de hibridación de bajo rigor a un ácido nucleico que codifica una HMGR conocida.

[0197] En algunas realizaciones, se muta un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una HMGR que se encuentra de forma natural, utilizando cualquier método de entre varios bien establecidos, dando lugar a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una HMGR variante. Los métodos de mutagénesis aptos incluyen, pero sin limitación, métodos de mutación química, mutagénesis inducida por radiación, y métodos de mutación de un ácido nucleico durante la síntesis, tal y como se describe anteriormente. De ese modo, por ejemplo, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una HMGR que se encuentra de forma natural se expone ante un mutágeno químico, tal y como se describe anteriormente, o se somete a mutación por radiación, o se somete a una PCR propenso a error, y se introduce el ácido nucleico mutagenizado dentro de un(as) célula(s) huésped genéticamente modificada(s) tal y como se describe anteriormente. También son bien conocidos en la técnica los métodos para mutagénesis aleatoria que utilizan una cepa “mutadora” de bacterias y pueden utilizarse para generar una HMGR variante. Ver, por ejemplo, Greener et al., "An Efficient Random Mutagenesis Technique Using an E. coli Mutator Strain", Methods in Molecular Biology, 57:375-385 (1995). También se conocen bien y pueden utilizarse las técnicas de mutagénesis de saturación que emplean una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos nº 6.171.820. Los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una HMGR variante se identifican por su capacidad de paliar la inhibición de crecimiento causada por la acumulación de HMG-CoA.

[0198] Las secuencias de nucleótidos que codifican HMGR son conocidas en la técnica, y puede alterarse cualquier secuencia de nucleótidos conocida que codifique HMGR para generar un ácido nucleico sintético para utilizar en un método en cuestión.

[0199] En algunas realizaciones es de particular interés la identificación de HMGR variante que muestra una actividad enzimática incrementada, que por tanto reduce la inhibición de crecimiento celular inducida por la acumulación de HMG-CoA. Una HMGR variante que muestra actividad enzimática incrementada muestra por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, o por lo menos aproximadamente 25 veces, o más, mayor actividad enzimática en comparación con una HMGR original.

Métodos de identificación de un agente que reduce la acumulación de HMG-CoA

[0200] En la presente invención también se describen métodos de cribado in vitro para identificar un agente que inhibe o reduce la acumulación de HMG-CoA; métodos de identificación de agentes que reducen el nivel de actividad de HMGS en una célula; métodos de identificación de un agente que inhibe la producción de HMG-CoA; y métodos de la identificación de un agente que convierte o acelera la conversión de HMG-CoA en otro compuesto. Los métodos generalmente implican a) el contacto de una célula de análisis con un agente de análisis, en la que la célula de análisis sintetiza mevalonato a través de una ruta de mevalonato, y en la que la célula de análisis muestra inhibición del crecimiento inducida por acumulación de HMG-CoA; y b) la determinación del efecto, si lo hay, del agente de análisis sobre la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA. Una reducción en la inhibición del crecimiento indica que el agente reduce la acumulación intracelular de niveles de inhibición de crecimiento de HMG-CoA.

[0201] Los agentes que inhiben o reducen la acumulación de HMG-CoA en una célula y promueven el crecimiento celular son útiles para incrementar la producción de un compuesto isoprenoide, tal y como se describe en la presente invención. Los agentes que inhiben o reducen la acumulación de HMG-CoA en una célula, y que reducen el nivel de actividad de HMGS en la célula, también son útiles en la reducción de la biosíntesis del colesterol, y de ese modo son útiles para tratar varias enfermedades asociadas con niveles altos de colesterol en sangre.

[0202] Los términos “agente candidato”, “agente de análisis”, “agente”, “sustancia” y “compuesto” se utilizan en la presente invención de forma intercambiable. Los agentes candidatos engloban numerosas clases químicas, típicamente moléculas orgánicas o inorgánicas sintéticas, semi-sintéticas, o que se encuentran de forma natural. Los agentes candidatos incluyen aquellos encontrados en grandes bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, las bibliotecas de compuestos sintéticos están disponibles comercialmente en Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), ComGenex (South San Francisco, CA), y MicroSource (New Milford, CT). Está disponible una biblioteca química rara de Aldrich (Milwaukee, Wis.) y también puede utilizarse. De modo alternativo, están disponibles bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales, y animales en Pan Labs (Bothell, WA) o son fácilmente producibles.

[0203] Los agentes candidatos pueden ser compuestos pequeños orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de más de 50 y menos de aproximadamente 2.500 daltons. Los agentes candidatos pueden comprender grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente puentes de hidrógeno, y pueden incluir por lo menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, y pueden contener por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos pueden comprender estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas substituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. También se encuentran agentes candidatos entre biomoléculas incluyendo péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.

[0204] Los ensayos descritos en la presente invención incluyen controles, en los que los controles aptos incluyen una célula que muestra inhibición del crecimiento inducida por acumulación de HMG-CoA en ausencia del agente de análisis. Generalmente se procesa una pluralidad de mezclas de ensayo en paralelo con concentraciones diferentes de agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Típicamente, una de esas concentraciones sirve como un control negativo, es decir a concentración cero o por debajo del nivel de detección.

[0205] Puede determinarse empíricamente el periodo de tiempo adecuado para poner en contacto el agente con la célula, y es generalmente un tiempo suficiente para permitir la entrada del agente dentro de la célula y para permitir que el agente tenga un efecto medible sobre la inhibición de crecimiento celular inducida por la acumulación de HMG-CoA. Generalmente, un tiempo adecuado es entre 10 minutos y 24 horas, o desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 8 horas.

[0206] Los métodos de cribado pueden diseñarse de varias maneras diferentes, en la que pueden utilizarse varios protocolos y configuraciones de ensayo, tal y como se conocen en la técnica. Por ejemplo, pueden ponerse en placas células de análisis (células que muestran inhibición del crecimiento inducida por acumulación de HMG-CoA) en pocillos de una placa multi-pocillos (por ejemplo, una placa de 96 pocillos, una placa de 384 pocillos, etc.) y añadirse varios agentes de análisis individualmente a los pocillos de la placa. Puede automatizarse el método de cribado.

[0207] Se evalúa un agente candidato para cualquier actividad citotóxica que éste pueda mostrar hacia la célula utilizada en el ensayo, utilizando ensayos bien conocidos, como la exclusión del colorante de azul tripano, un ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2 H-tetrazolio), y similares. Los agentes que no muestran actividad citotóxica son coNsiderados agentes candidatos.

[0208] Un agente de análisis de interés es aquel que reduce la inhibición de crecimiento celular inducida por acumulación de HMG-CoA en por lo menos aproximadamente el 10%, por lo menos aproximadamente el 20%, por lo menos aproximadamente el 25%, por lo menos aproximadamente el 30%, por lo menos aproximadamente el 35%, por lo menos aproximadamente el 10%, por lo menos aproximadamente el 40%, por lo menos aproximadamente el 45%, por lo menos aproximadamente el 50%, por lo menos aproximadamente el 55%, por lo menos aproximadamente el 60%, por lo menos aproximadamente el 65%, por lo menos aproximadamente el 70%, por lo menos aproximadamente el 80%, por lo menos aproximadamente el 90%, o más, cuando se compara con un control en ausencia del agente de análisis. Se determina fácilmente si el agente de análisis tiene un efecto sobre la inhibición del crecimiento celular utilizando métodos estándar, tal y como se describe anteriormente.

[0209] En algunas realizaciones, el agente de análisis es aquel que reduce el nivel de actividad de HMGS en la célula. Un agente de análisis de interés es aquel que reduce el nivel de actividad de HMGS en por lo menos aproximadamente el 10%, por lo menos aproximadamente el 20%, por lo menos aproximadamente el 25%, por lo menos aproximadamente el 30%, por lo menos aproximadamente el 35%, por lo menos aproximadamente el 10%, por lo menos aproximadamente el 40%, por lo menos aproximadamente el 45%, por lo menos aproximadamente el 50%, por lo menos aproximadamente el 55%, por lo menos aproximadamente el 60%, por lo menos aproximadamente el 65%, por lo menos aproximadamente el 70%, por lo menos aproximadamente el 80%, por lo menos aproximadamente el 90%, o más, cuando se compara con un control en ausencia del agente de análisis.

[0210] Se determina fácilmente si un agente de análisis reduce el nivel de actividad de HMGS en la célula utilizando varios métodos de ensayo. Como ejemplo no limitante, se mide la actividad enzimática de HMGS en un lisato celular de muestras de células en las que un agente de análisis reduce la inhibición de crecimiento celular inducida por acumulación HMG-CoA. Pueden ensayarse HMGS mediante la adición de un exceso de acetil-CoA y acetoacetil-CoA a una solución tamponada (por ejemplo, 100 mM Tris-HCl) que contiene extracto celular o enzima purificada. Después de cinco minutos, la reacción puede pararse (por ejemplo mediante congelación de la muestra) y puede medirse la HMGCoA creada mediante LC-MS.

[0211] Como otro ejemplo, se miden los niveles de ARNm de HMGS en una célula. Están disponibles una variedad de métodos para analizar ácidos nucleicos por la presencia y/o el nivel de un ARNm específico en una célula. Puede ensayarse el ARNm directamente o transcrito inverso en de ADNc para análisis. Puede amplificarse el ácido nucleico mediante técnicas convencionales, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para proporcionar cantidades suficientes para análisis. El uso de la reacción en cadena de la polimerasa se describe en Saiki, et al. (1985), Science 239:487; puede encontrarse una revisión de técnicas en Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp.14.2-14.33; y se describen ampliamente varios protocolos de PCR en varios libros de texto, incluyendo, por ejemplo, PCR Protocols J. Bartlett y D. Stirling, eds. (2003) Humana Press.

[0212] Puede incluirse un marcador detectable en una reacción de amplificación. Los marcadores aptos incluyen, fluorocromos, por ejemplo isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, Texas Red, ficoeritrina, aloficocianina, 6carboxifluoresceína (6-FAM), 2’, 7’-dimetoxi-4’,5’-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2’,4’,7’,4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 5-carboxifluoresceína (5-FAM) o N,N,N’,N’-tetrametil-6carboxirodamina (TAMRA), marcadores radioactivos, por ejemplo 32P, 35S, 3H; etc. El marcador puede ser un sistema de dos etapas, en el que el ADN amplificado se conjuga con biotina, haptenos, etc. que tienen una pareja de unión de alta afinidad, por ejemplo avidina, anticuerpos específicos etc., en el que la pareja de unión se conjuga con un marcador detectable. Puede conjugarse el marcador a uno o ambos cebadores. De modo alternativo, se marca el conjunto de nucleótidos utilizados en la amplificación, de modo que se incorpora el marcador dentro del producto de la amplificación.

[0213] Son conocidos por aquellos expertos en la materia varios métodos diferentes para determinar la abundancia de ácido nucleico en una muestra, entre los que se incluyen aquellos métodos concretos de interés descritos en: Pietu et al., Genome Res. (June 1996) 6: 492-503; Zhao et al., Gene (April 24, 1995) 156: 207-213; Soares, Curr. Opin. Biotechnol. (October 1997) 8: 542-546; Raval, J. Pharmacol Toxicol Methods (November 1994) 32: 125-127; Chalifour et al., Anal. Biochem (February 1, 1994) 216: 299-304; Stolz & Tuan, Mol. Biotechnol. (December 19960 6: 225-230; Hong et al., Bioscience Reports (1982) 2:907; y McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143: 298. También son de interés los métodos descritos en WO 97/27317.

[0214] Están disponibles varios métodos para determinar el nivel de expresión de una proteína en una muestra concreta. Por ejemplo, la detección puede utilizar la tinción de células o secciones histológicas con anticuerpos marcados específicos para la proteína, realizada según los métodos convencionales. Se permeabilizan las células para teñir las moléculas citoplasmáticas. Se añaden los anticuerpos de interés a la muestra celular, y se incuban durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión al epítopo, normalmente por lo menos aproximadamente 10 minutos. Puede marcarse el anticuerpo con radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes, quimioluminiscentes, u otros marcadores para la detección directa. Alternativamente, se utiliza un anticuerpo o reactivo de segunda etapa para amplificar la señal. Dichos reactivos se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, puede conjugarse el anticuerpo primario con biotina, con avidina conjugada con peroxidasa de rábano picante añadida como un reactivo de segunda etapa. La detección final utiliza un sustrato que experimenta un cambio de color en presencia de la peroxidasa. Alternativamente, el anticuerpo secundario se conjuga con un compuesto fluorescente, por ejemplo fluoresceína, rodamina, Texas Red, etc. Puede determinarse la ausencia o la presencia de la unión de anticuerpo mediante varios métodos, incluyendo citometría de flujo de células disociadas, microscopía, radiografía, recuento por centelleo, etc.

EJEMPLOS

[0215] Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a los expertos en la materia una información y descripción completas de cómo realizar y utilizar la presente invención, y no están destinados a limitar el alcance de lo que los inventores coNsideran su invención ni pretenden representar que los experimentos que siguen son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, peso molecular es peso molecular promedio en peso, la temperatura es en grados Celsius, y la presión está en o cerca de la atmosférica. Se pueden utilizar abreviaturas estándar, por ejemplo, pb, pares de bases; kb, kilobases; pi, picolitros; s

o seg, segundos; min, minutos; h, horas; aa, aminoácidos; kb, kilobases; pb, pares de bases; nt, nucleótidos;. Lm, intramuscular(mente); ip, intraperitoneal(mente); s.c., subcutánea(mente); y similares.

Ejemplo 1: La producción in vivo de mevalonato limita la producción de amorfadieno

[0216] En los siguientes ejemplos se utilizaron las siguientes cepas, vectores y condiciones de crecimiento y métodos analíticos.

Cepas, construcción de plásmidos y medios de crecimiento

Cepas

[0217] Se utilizaron las cepas de E. coli TOPlO y DH1OB, ambas de Invitrogen, para la clonación y construcción de plásmidos. Se utilizó DHIOB de E. coli para la producción, crecimiento y ensayos de metabolitos de isoprenoide.

Medios de crecimiento

[0218] Para la clonación y propagación de cepas de E. coli que albergan los diversos vectores recombinantes descritos aquí, se utilizó caldo de Luria y modificación de Miller (Sigma- Aldrich) con los antibióticos apropiados para la selección de plásmidos. Para la producción, crecimiento y ensayos de metabolitos, se desarrollaron cepas de E. coli modificadas (“modificadas genéticamente” o “recombinantes”) en caldo de Luria con modificación de Miller (LB) glicerol al 1% (p/v) y antibióticos apropiados. El DL-mevalonato preparado para la complementación del medio se preparó mezclando 1 volumen de lactona del ácido DL-mevalónico 2 M (Sigma- Aldrich) con 1,02 volúmenes de KOH 2 M e incubación a 37°C durante 30 minutos (Campos et al. (2001) Biochem. J. 353:59-67). Para mantener los plásmidos, se añadieron los antibióticos necesarios, según fuera apropiado, al medio de crecimiento. Se utilizó isopropilo-beta-D-tiogalatósido (IPTG), de Roche, y L-Arabinosa, de Sigma-Aldrich, para la inducción de los sistemas de promotores.

Construcción de plásmidos/operones

[0219] Los operones multigénicos heterólogos de la ruta de mevalonato se ensamblaron tal como se describe en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 20030148479 y 20040005678, y Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21(7):796-802. El operón MevT codifica los genes atoB E. coli, HMGS de S. cerevisiae, y una forma truncada de HMGR1 de S. cerevisiae denominada "tHMGR.. " El operón MevT codifica las enzimas responsables de la conversión de acetil-CoA en mevalonato (Figura 2). El operón ensamblado se clonó en el vector pCR4 TOPO utilizando el sistema de clonación TOPO PA de Invitrogen (Carlsbad, CA) para la secuenciación. La unión en el vector pCR4 TOPO y la transformación de células TOP10 de Escherichia coli se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante.

[0220] Dado que la expresión de las rutas bioquímicas es a menudo óptima en un nivel de expresión específico, el operón MevT se clonó en una variedad de vectores de expresión para determinar el efecto del número de copias del plásmido y la fuerza del promotor en la expresión de la ruta clonada. El operón MevT se clonó en el sitio SalI del plásmido pBAD24 (Guzman et al. (1995) J Bacteriology 177:4121-4130), M. Ehrmann et al., (1997) Proc. Natl. Acad ScL USA 94: 13111-13115), número medio de copias, inducible por arabinosa, mediante la digestión del vector vacío y el operón MevT en pCR4 TOPO con la enzima de restricción SalI y la unión con la T4 DNA ligasa. El plásmido resultante se denominó pBAD24MevT (SEQ ID NO:1) (publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 20030148479, 20040005678).

[0221] El operón MevT también se clonó en sitios Xmal-Pstl del plásmido pBAD33 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriology 177:4121-4130); Hiszczynska-Sawicka. (1997) PLASMID 38: 174- 179), número bajo de copias, inducible por arabinosa, mediante la digestión del vector vacío y el operón MevT operon en pCR4 TOPO con las enzimas de restricción Xmal y Pstl y la unión con T4 DNA ligasa. El plásmido resultante se denominó pBAD33MevT (SEQ ID NO:2), véase Martin et al. (2003) supra.

[0222] Para colocar el operón MevT bajo el control de un promotor PLAC modificado (promotor más débil), el fragmento araC-PBAD Nsil-Xmal de pBAD33MevT se sustituyó por el fragmento Nsil-Xmal de pBBRlMCS (Kovach et al. (1995) Gene 166:175-176) que contenía el promotor PLAC modificado. La digestión de pBAD33MevT y pBBRlMCS se realizó utilizando las enzimas de restricción NsiI y Xmal y se unieron utilizando T4 DNA ligasa. El plásmido resultante se denominó MevT (SEQ ID NO:3), véase la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 20040005678 y Martin et al. (2003) supra.

[0223] Para generar el control del plásmido vacío para pMevT, se escindió el operón MevT de pMevT utilizando la enzima de restricción Sall. El plásmido resultante que contenía sólo el promotor PLAC se denominó pLac33 (Martin et al. (2003) supra).

[0224] Para producir FPP, IPP, y DMAPP a partir de mevalonato, se construyó el operón denominado MBIS tal como se describe en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos números 20030148479, 20040005678, y Martin et al. (2003) supra. MBIS contiene los genes MK, PMK y MPD de S. cerevisiea y idi, y ispA de E. coli (Figura 2). Tal como se ha descrito, el operón MBIS se ensambló en el plásmido pBBRlMCS-3 (Kovach et al. (1995) supra) bajo el control de un promotor PLAC modificado. El plásmido inducible por IPTG se denominó pMBIS (SEQ ID NO 4).

[0225] Para producir amorfa-4,11-dieno a partir de FPP, se creó una amorfadina sintasa sintética tal como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 20040005678 y Martin et al. (2003) supra. El gen sintético se clonó en el vector pTrc99A (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315), tal como se ha descrito, y el plásmido inducible por IPTG se denominó pADS (SEQ ID NO 5).

[0226] A efectos de determinar la fuente de toxicidad causada por la mayor expresión del operón MevT, se amplificaron los genes individuales del operón MevT y las combinaciones de los mismos y se clonaron en vectores de expresión.

[0227] Se amplificó AtoB de pBAD24MevT utilizando protocolos de PCR estándar y cebadores complementarios a los extremos 5’ y 3’ del gen. Se clonó AtoB en los sitios Xmal-Sall de plásmido pBAD33, de bajo número de copias, inducible por arabinosa, mediante la digestión del vector vacío y el producto PCR con las enzimas de restricción Xmal y Sall y la unión con la T4 DNA ligasa. El plásmido resultante se denominó pAtoB (SEQ ID NO 6).

[0228] Se amplificó HMGS de pBAD24MevT utilizando protocolos de PCR estándar y cebadores complementarios a los extremos 5’ y 3’ del gen. Se clonó HMGS en los sitios Xmal-Sall de plásmido pBAD33, de bajo número de copias, inducible por arabinosa, mediante la digestión del vector vacío y el producto PCR con las enzimas de restricción Xmal y Sall y la unión con la T4 DNA ligasa. El plásmido resultante se denominó pHMGS (SEQ ID NO 7).

[0229] Se amplificó HMGR truncado de pBAD24MevT utilizando protocolos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y cebadores complementarios a los extremos 5’ y 3’ del gen. Se clonó HMGr truncado (tHMGR) en los sitios Xmal-Sall de plásmido pBAD33, de bajo número de copias, inducible por arabinosa, y el plásmido pBAD18 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriology 177:4121- 4130), número de medio de copias, inducible por arabinosa, mediante la digestión de vectores vacíos y el producto PCR con las enzimas de restricción Xmal y Sall y la unión con la T4 DNA ligasa. El plásmido con un bajo número de copias resultante se denominó pHMGR (SEQ ID NO 8) y el plásmido con un número de copias medio resultante se denominó pBAD18HMGR (SEQ ID NO 9).

[0230] Se creó un operón que contenía sólo HMGS y el HMGR truncado mediante la amplificación de los dos segmentos génicos de pBAD24MevT utilizando protocolos de PCR estándar y cebadores complementarios al extremo 5’ de HMGS y el extremo 3’ de HMGR. El fragmento de HMGS y HMGR se clonó en el sitio Sall de plásmido pBAD33, de bajo número de copias, inducible por arabinosa, mediante la digestión del vector vacío y el producto PCR con la enzima de restricción Sall y la unión con T4 DNA ligasa. EL plásmido resultante se denominó pHMGSR (SEQ ID NO 10).

[0231] Se destacan las secuencias de nucleótidos de los contractos de plásmidos descritos en los ejemplos y representados en las figuras 13A-C a figuras 24A-C; y varias características. Las secuencias codificantes, terminadores y orígenes se representan en texto negrita o texto negrita y subrayado. Las secuencias de promotor están encuadradas. El “origen pBR322 modificado” representado en las figuras 13A-C y figuras 21 A-C incluye un gen rop truncado, y de este modo, proporciona un plásmido con número de copias más elevado que el origen pBR322 (no modificado); el número de copias de plásmido de los plásmidos que contienen el origen pBR322 modificado se estima que es de aproximadamente 30 copias por célula a aproximadamente 50 copias por células. Véase, por ejemplo, Guzman et al. ((1995) J. Bacteriol. 177:4121-4130; y Ehrmann et al. ((1997) Proc. Natl. Acad. ScI USA 94:13111-13115).

Medición del crecimiento celular

[0232] El crecimiento celular de cultivos de E. coli se midió analizando la deNsidad óptica de los cultivos a 600 nm (DO600). La DO600 de muestras tomadas de cultivos en matraces con aireación se midió utilizando un Espectrofotómetro UV (Beckman) , mientras que la DO600 de cultivos en placas de microtitulación de 96 pocillos se midió utilizando un lector de placas de microtitulación (SpectraMax, Molecular Devices).

Medición de amorfa-4,11-dieno

[0233] Se determinó la concentración de amorfa-4,11-dieno mediante la extracción de muestras de 0,7 mL con 0,7 ml de acetato de etilo (Sigma- Aldrich) en viales de vidrio para cromatografía de gases (GC). A continuación, se agitaron las muestras a una velocidad máxima en un mezclador Fisher Vortex Genie 2 (Fischer Scientific) durante 3 minutos. Se dejaron reposar las muestras a efectos de separar las emulsiones de acetato de etilo-agua.

[0234] Se analizaron los extractos de cultivo en acetato de etilo en un cromatógrafo de gases/espectrómetro de masas (GC/MS) Hewlett-Packard 6890. Se programó el auto-inyector de tecnologías LEAP para extender la aguja de muestreo en la capa de acetato de etilo de la mezcla de dos fases. Se separó una muestra de 1 !L e el GC utilizando un columna DB-5 (disponible de, por ejemplo, Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, Calif.) y gas portador helio. El ciclo en el horno para cada muestra fue de 80 °C durante dos minutos, incrementando la temperatura a 30 °C/minuto hasta una temperatura de 160°C, incrementando la temperatura a 3°C/min hasta 170°C, incrementando la temperatura a 50°C/minuto hasta 300°C, y manteniendo a 300°C durante dos minutos. Las muestras separadas se analizaron mediante un detector selectivo de masas Hewlett-Packard modelo 5973 que monitorizó los iones de m/z 189 y 204. Los espectros de masa previos demostraron que el producto de amorfa-4,11-dieno sintasa era amorfadieno y que el amorfadieno tenía un tiempo de retención de 7,9 minutos utilizando este protocolo de GC.

Debido a que los patrones puros de amorfa-4,11-dieno no están disponibles, las concentraciones se deben cuantificar en términos de equivalencia de cariofileno. Previamente se ha determinado una curva estándar para cariofileno, en base a un patrón puro de Sigma (St. Louis, Mo.). La concentración de amorfa-4,11-dieno se basa en la abundancia relativa de los iones de m/z 189 y 204 con respecto a la abundancia de los iones totales en el experto de masas de los dos compuestos.

Medición de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA)

[0235] Se determinaron los niveles intracelulares de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) mediante la separación de células de E. coli del medio de cultivo, la detención del metabolismo celular y la extracción de HMG-CoA de las células con ácido tricloroacético (TCA) y la medición de las concentraciones de HMG-CoA mediante Cromatografía Líquida/Espectrómetro de Masas (LC/MS). A efectos de detener rápidamente el metabolismo celular y separar las células del medio de cultivo, se utilizó la extracción con TCA en capas. Antes de sacar muestras del cultivo celular, se preparó un tubo con TCA en capas y aceite de silicona. En un tubo Falcon de 15 ml (Fischer Scientific), se añadieron 500 1l de ácido tricloroacético al 10% en óxido de deuterio (ambos de Sigma-Aldrich) en la base del tubo seguido de una capa de 2 ml de aceite de Silicona (AR200 por Fluka). Los tubos de muestra preparados se colocaron en un baño de hielo/agua para permitir que la capa de aceite de silicona se volviera más viscosa a efectos de evitar la inversión de capas en el muestreo.

[0236] Se añadieron con precaución 10 ml de cultivo celular al tubo de muestra de 15 ml sobre la capa de aceite de silicona. Los tubos de muestra se centrifugaron rápidamente a 4°C a velocidad máxima utilizando una centrífuga Alegra durante 3 minutos. Durante este tiempo, la fuerza centrífuga mueve las células a través de la capa de aceite de silicona y en la capa de TCA, separando así las células del medio de cultivo y lisando simultáneamente las células y parando el metabolismo.

[0237] Después de centrifugar las células, se extrajo la capa del medio de cultivo mediante aspiración. A continuación, la capa de TCA se transfirió a un tubo de centrífuga de 2 ml y se neutralizó con 1 ml de Tri-n-octilamina 0,5 M en 1,1,2-Tricloro-1,2,2-trifluoroetano (ambos de Aldrich). Se extrajo la fase acuosa, se filtró y se analizó mediante LC/MS.

[0238] El extracto acuoso de TCA se analizó en un LC/MS Hewlett-Packard 1100. Se separó una muestra de 50 !L en una columna de HPLC de fase inversa C-18 (Varian) utilizando un sistema de disolventes en gradiente de dos componentes. El disolvente A era tampón de acetato de amonio 100 mM a pH 6 y el disolvente B era un 70% de tampón de acetato de amonio 100 mM y un 30% de acetonitrilo. La columna de HPLC se equilibró en cada uso con disolvente al 8% (92% de disolvente A) durante 10 minutos. El perfil de gradiente fue de 8% de disolvente B a tiempo 0 minutos hasta 100% de disolvente B a tiempo 15 minutos e isocrático a 100% de disolvente B hasta 28 minutos.

[0239] Las muestras de HMG-CoA separadas se analizaron mediante un detector selectivo de masa que monitorizó el ión de m/z 912. El tiempo de retención y el espectro de masas de HMG-CoA extraído se confirmaron utilizando HMG-CoA comercial (Sigma).

Medición del mevalonato (ácido mevalónico)

[0240] Se determinó la concentración de mevalonato (ácido mevalónico) en cultivos de E. coli codificados mediante un análisis GC/MS. Se mezclaron 560 !L de cultivo de E. coli con 140 !L de HCl 300 mM en un vial de vidrio de GC para convertir el mevalonato de la forma ácida a lactona, del ácido mevalónico a la lactona del ácido mevalónico. Se añadieron 700 1L de acetato de etilo a cada vial y a continuación se agitaron las muestras a velocidad máxima en un mezclador Fisher Vortex Genie 2 (Fischer Scientific) durante 3 minutos.

[0241] Los extractos en acetato de etilo de cultivo acidificado se analizaron en un cromatógrafo de gases/espectrómetro de masas (GC/MS) Hewlett-Packard 6890. El autoinyector de tecnologías LEAP se programó para extender la aguja de muestreo en la capa de acetato de etilo de la mezcla de dos capas. Se separó una muestra de 1 !L en el GC utilizando una columna DB-5 (disponible de, por ejemplo, Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, Calif.) y gas portador helio. El ciclo en el horno de cada muestra fue la versión modificada de B. H. Woollen et al. (B .H. Woollen et al. J Chromatogr. B. 760 (2001) 179-184). El ciclo del horno para cada muestra fue de 75ºC durante dos minutos, incrementando la temperatura a 20°C/minuto hasta una temperatura de 150°C, incrementando la temperatura a 15 °C/min hasta 250ºC, incrementando la temperatura a 50ºC/minuto hasta 300°C, y manteniendo a 300ºC durante dos minutos. Las muestras separadas se analizaron mediante un detector selectivo de masas Hewlett-Packard modelo 5973 que monitorizó el ión de m/z 71. El tiempo de retención y el espectro de masas de la lactona de ácido mevalónico extraído se confirmaron utilizando lactona de ácido DL-mevalónico comercial (Sigma).

RESULTADOS

[0242] La producción de isoprenoide en E. coli modificado para contener una ruta de mevalonato exógeno está limitada a menudo por la producción de mevalonato. Los incrementos en la producción de mevalonato pueden conducir a incrementos en el isoprenoide que la célula huésped se modifica para producir. La paliación de la toxicidad de HMG-CoA que conduce a la producción incrementada de mevalonato conduce por tanto a la producción incrementada de isoprenoide.

[0243] Para mejorar la producción de isoprenoide a partir de la ruta de mevalonato en E. coli, se tuvieron que determinar las etapas limitantes de la ruta heteróloga. Para ello, se transformaron los plásmidos pMevT, pMBIS, y pADS, descritos anteriormente, en una única cepa de E. coli DHlOB mediante métodos estándar. Se seleccionaron los transformantes en placas de agar LB que contenían 50 1g/ml de carbenicilina, 5 1g/ml de tetraciclina, y 25 1g/ml cloramfenicol. Se transfirió una única colonia de la cepa de la placa de agar LB a 5 ml de medio líquido LB que contenía los mismos antibióticos. Este cultivo de siembra se incubó mediante agitación a 37ºC hasta que el crecimiento alcanzó una fase estacionaria.

[0244] La inducción de la expresión de ambos operones y ADS e IPTG permite la producción de amorfadieno del suministro de E. coli de acetil-CoA. Para determinar qué operón estaba limitando la producción de amorfadieno, se incubó el E. coli que contenía los tres plásmidos en múltiples matraces de agitación que coNsistía en medio LB y glicerol al 1% (p/v) y antibióticos apropiados. Los matraces de agitación se inocularon a partir del cultivo de siembra de 5 ml. Los cultivos se incubaron a 37°C con agitación continua. Dos horas después de la inoculación, se añadieron IPTG 0,5 mM a cada cultivo para inducir la expresión de los operones. Además, se añadió mevalonato 10 mM y 20 mM a diferentes cultivos dos horas después de la inoculación. Los cultivos se incubaron a 37°C con agitación continua. En múltiples puntos de tiempo, se analizó el crecimiento celular de la cepa y la producción de amorfadieno.

[0245] Tal como se muestra en la figura 4, el incremento de la cantidad de mevalonato añadido a los cultivos incrementó la producción de amorfadieno de las células de E. coli que expresaban los tres operones. Este resultado demuestra que la producción in vivo de mevalonato por el operón MevT limita la producción del sesquiterpeno amorfadieno en estos sistemas de prueba.

[0246] Figura 4. Comparación de la producción de amorfadieno en la cepa de E. coli utilizando la ruta de mevalonato modificada [pMevT, pMBIS, pADS] de cultivos con concentraciones variantes de mevalonato exógeno. El medio LB con glicerol al 1% se complementó sin mevalonato (0 mM), mevalonato 10 mM o mevalonato 20 mM.

Ejemplo 2: Expresión incrementada del operón MevT a partir de sistemas de promotores más fuertes y vectores de plásmidos con un número de copias más elevado da lugar a la inhibición del crecimiento.

[0247] El siguiente ejemplo demuestra que el aumento de la sobreexpresión de la “mitad superior” (acetoacetil tiolasa, HMGS, y HMGR) de la ruta de mevalonato puede conducir a la inhibición del crecimiento de la célula huésped modificada.

[0248] Para incrementar la producción in vivo de mevalonato en E. coli, el operón MevT se transfirió a sistemas de expresión que producirían una expresión incrementada de los genes de MevT. Se transformó DH1OB de E. coli con los siguientes plásmidos de MevT, indicados en el orden de aumento de la expresión: pMevT y pTrc99A (donde ambos pMevT y pTrc99A se transformaron en la misma célula huésped), pBAD33MevT, y pBAD24MevT. Además, los correspondientes plásmidos de control vacíos se transformaron en DH10B de E. coli: pLac33 y pTrc99A (dos plásmidos en el mismo huésped), pBAD33, y pBAD24. pMevT y pLac33 se cotransformaron con pTrc99A para controlar el promotor PLAC modificado de pMevT y pLac33 con la copia de LacIQ en pTrc99A.

[0249] Se seleccionaron los transformantes de cepas que contenían pMevT y pTrc99A, o pLac33 y pTrc99A en placas de agar LB que contenían 50 1g/ml de carbenicilina y 50 1g/ml de cloramfenicol. Se seleccionaron los transformantes de las cepas restantes en placas de agar LB que contenían 50 1g/ml de cloramfenicol. Se transfirió una única colonia de cada cepa de la placa de agar LB a 5 ml de medio líquido LB que contenía los mismos antibióticos. Este cultivo de siembra se incubó mediante agitación a 37°C hasta que el crecimiento alcanzó una fase estacionaria. Se utilizaron seis cultivos de siembra para inocular placas de titulación de 96 pocillos que contenían medio LB más glicerol al 1% (p/v) con antibióticos. Después de 2 horas de agitación continua a 37ºC en un lector de placas de microtitulación, las cepas se indujeron con IPTG 0,5 mM (para la inducción de pMevT y pLac33) o arabinosa 2 mM (para la inducción de pBAD33MevT, pBAD24MevT, pBAD33, y pBAD24). Después de la inducción, los cultivos continuaron con agitación continua a 37°C. El desarrollo celular de cada cultivo de 0,2 mL se midió cada 10 minutos mediante un lector de placas de microtitulación.

[0250] Tal como se muestra en la figura 5, la inducción de MevT a partir del promotor PLAC modificado débil, contenido en pMevT, no provocó un cambio sustancial en el crecimiento celular en comparación con los controles de plásmido vacíos (pLac33/pTrc99A, pBAD33, y pBAD24). Sin embargo, la expresión del operón MevT a partir del sistema de promotores araC-pBAD de pBAD33MevT provoca la inhibición del crecimiento. Manteniendo el sistema de promotores araC-PBAD, pero incrementando el número de copias del plásmido, incrementando así adicionalmente la expresión total de MevT, tal como ocurre en pBAD24MevT, sólo exacerba el problema de la inhibición del crecimiento. Tal como demuestran estos datos, el incremento de la expresión del operón MevT desde un plásmido con un número medio de copas con un sistema de promotores de PLAC modificado hasta un plásmido con un número medio de copias con un sistema de promotores araC-PBAD y finalmente hasta un plásmido con un número de copias elevado con un sistema de promotores araC-PBAD provoca el aumento de la toxicidad a las cepas modificadas.

[0251] Figura 5. Efecto del incremento de la expresión del operón MevT en el crecimiento celular de E. coli. Comparación de E.coli que alberga plásmidos vacíos pLac33 + pTrc99A, pBad33, y pBAD24 con E. coli que alberga operones MevT pMevT + pTrc99A, pBAD33MevT, y pBAD24MevT (indicados en el orden de expresión creciente).

Ejemplo 3: La expresión incrementada de HMGS provoca la inhibición del crecimiento, pero no la expresión incrementada de HMGs y HMGR juntas.

[0252] El siguiente ejemplo muestra que la inhibición del crecimiento causada por una expresión incrementada de la mitad superior de la ruta del mevalonato, tal como se describe en el ejemplo 2, es debida a la expresión de HMGs, que cataliza la producción de HMG-CoA. La expresión de HMGR, que cataliza una reacción en la que HMG-CoA es un reactivo, junto con HMGS, tal como se proporciona por los métodos de la presente invención, evita esta toxicidad.

[0253] A efectos de determinar el origen de la toxicidad causada por la expresión incrementada del operón MevT, los genes individuales del operón MevT y las combinaciones de los mismos se amplificaron y clonaron en vectores de expresión. Se amplificó AtoB a partir de pBAD24MevT utilizando protocolos de PCT estándar y cebadores complementarios a los extremos 5’ y 3’ del gen. Se clonó AtoB en los sitios XmaI-SalI del plásmido pBAD33, de bajo número de copias, inducible por arabinosa, mediante la digestión del vector vacío y el producto PCR con las enzimas de restricción XmaI y SalI y la unión con T4 DNA ligasa. El plásmido resultante se denominó pAtoB (SEQ ID NO 6). Se amplificó HMGS a partir de pBAD24MevT utilizando protocolos de PCT estándar y cebadores complementarios a los extremos 5’ y 3’ del gen. Se clonó HMGS en los sitios XmaI-SalI del plásmido pBAD33, de bajo número de copias, inducible por arabinosa, mediante la digestión del vector vacío y el producto PCR con las enzimas de restricción XmaI y SalI y la unión con T4 DNA ligasa. El plásmido resultante se denominó pHMGS (SEQ ID NO 7). La HMGR truncada se amplificó a partir de pBAD24MevT utilizando protocolos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) estándar y cebadores complementarios a los extremos 5’ y 3’ del gen. Se clonó la HMGr truncada (tHMGR) en los sitios XmaI-SalI del plásmido pBAD33 de bajo número de copias, inducible por arabinosa, y el plásmido pBAD18 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriology 177:4121-4130), de número medio de copias, inducible por arabinosa, mediante la digestión de los vectores vacíos y el producto PCR con las enzimas de restricción XmaI y SalI y la unión con T4 DNA ligasa. El plásmido con un número bajo de copias resultante se denominó pHMGR (SEQ ID NO 8), y el plásmido con un número medio de copias resultante se denominó pBAD18HMGR (SEQ ID NO 9).

[0254] Se creó un operón que contenía sólo HMGS y la HMGR truncada mediante la amplificación de los dos segmentos génicos a partir de pBAD24MevT utilizando protocolos de PCR estándar y cebadores complementarios al extremo 5’ de HMGS y el extremo 3’ de HMGr. El fragmento HMGS y HMGR se clonó en el sitio SalI del plásmido pBAD33, con número bajo de copias, inducible por arabinosa, mediante la digestión del vector vacío y el producto PCR con la enzima de restricción SalI y la unión con T4 DNA ligasa. EL plásmido resultante se denominó HMGSR (SEQ ID NO 10).

[0255] Para determinar la causa de la inhibición del crecimiento asociada con la expresión incrementada del operón MevT, el operón se rompió en componentes individuales. Los plásmidos pAtoB, pHMGS, y pHMGR, que expresan cada uno de los genes individuales, y pHMGSR, que expresa la combinación de HMGS y HMGR, se construyeron tal como se ha descrito anteriormente. Estos cuatro plásmidos, junto con pBAD33 (plásmido vacío de control) y pBAD33MevT, se transformaron en DH10B de E. coli utilizando procedimientos estándar. Se seleccionaron los transformantes en placas agar LB que contenían 50 !g/ml de cloramfenicol. Se transfirió una única colonia de cada cepa desde la placa de agar LB a 5 ml de medio líquido LB que contenía el mismo antibiótico. Este cultivo de siembra se incubó por agitación a 37 °C hasta que el crecimiento alcanzó una fase estacionaria.

[0256] Los seis cultivos de siembra se utilizaron para inocular placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían volúmenes de 0,2 ml de medio LB, glicerol al 1% (p/v) y antibióticos. Los cultivos de las placas de 96 pocillos se agitaron continuamente a 37°C en un lector de placas de microtitulación y se indujeron con arabinosa 2 mM a las 2 horas después de la inoculación. El crecimiento celular de cada cultivo se muestra en la figura 6.

[0257] Tal como se muestra en la figura 6, en comparación con el plásmido vacío de control, la expresión incrementada de atoB y HMGR en E: coli (en cepas que albergan los plásmidos pAtoB y pHMGR, respectivamente), no presenta un efecto significativo en el crecimiento celular. Sin embargo, la expresión incrementada de HMGS (en una cepa que alberga pHMGS) provoca la inhibición sustancial del crecimiento. De forma destacada, con la coexpresión incrementada de HMGS y HMGr (como en una cepa que alberga pHMGSR), el crecimiento celular se restablece al del plásmido vacío de control. Esta paliación de la toxicidad se cree que es debida a la capacidad de HMGR de convertir la HMG-CoA que es producida por la HMGS (y no degradada por cualquiera de las enzimas conocidas en E. coli) en mevalonato. A continuación, el mevalonato se pasa a través de la membrana celular al medio, tal como se describe en Campos et al. (2001) Biochem. J. 353:59-67; y Martin et al. (2003) Nature Biotech. 21(7):796-802). Sin embargo, la expresión incrementada de los tres genes en el operón MevT (como en la cepa que alberga pBAD33MevT), inhibe de nuevo el crecimiento celular. Debido a que los datos muestran que la expresión incrementada de atoB solo no causa la inhibición del crecimiento, la toxicidad causada por la coexpresión incrementada de atoB con HMGS y HMGR es debida probablemente a la producción incrementada de acetoacetil-CoA por atoB. La producción incrementada de acetoacetil-CoA por la expresión incrementada de ceto tiolasa de E.

coli (atoB) proporciona HMGS con sustrato adiciona e incrementa significativamente la producción de mevalonato (T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(4): 931-934). Sin embargo, si la actividad total de HMGS es superior a la de HMGR, se acumulará HMG-CoA y probablemente causará la inhibición del crecimiento. Para verificar estas hipótesis, se midieron los intermedios de las rutas de acil-CoA en las cepas modificadas.

[0258] Figura 6. Comparación del crecimiento celular de E. coli que expresa genes de MevT individuales y combinaciones de los mismos a niveles elevados. El crecimiento celular de E. coli que alberga plásmidos pBad33 (plásmido vacío de control), pAtoB, pHMGR, pHMGS, pHMGSR, y pBAD33MevT.

Ejemplo 4: La toxicidad causada por la expresión incrementada de HMGS es debida a la actividad enzimática incrementada de la proteína y no simplemente de la producción incrementada de la propia proteína.

[0259] El siguiente ejemplo demuestra que la toxicidad observada en la expresión de HMGS no es debida a la expresión de la enzima, sino que es debida a su actividad – la producción de HMG-CoA a partir de acetoacetil-CoA y acetil-CoA. Es decir, la inhibición del crecimiento observada no es debida a la carga metabólica que tiene lugar en la producción de enzima adicional, sino más bien a través de la acción de la enzima en la célula.

Creación de HMGS de longitud completa, pero catalíticamente inactiva

[0260] La toxicidad causada por la expresión elevada de HMGS de S. cerevisiae sola en E. coli podría haber sido debida a la toxicidad causada por la producción a nivel elevado de una proteína heteróloga (B.R. Glick. (1995) Biotech Advances. 13(12): 247-261) en oposición a la actividad metabólica de HMGS. Para diferenciar entre las dos posibilidades, se creó una HMGS de longitud completa, pero catalíticamente inactiva. El sitio activo de la proteína HMGS de S. cerevisiae de tipo salvaje se determinó mediante la comparación de la secuencia proteica de la HMGS de levadura con las secuencias del sitio activo de varias proteínas HMGS de mamífero indicadas en L.L. Rokosz et al. ((1994) Arch. Biochem. Biophysics. 312(1), 1-13). Los residuos del sitio activo de HMGS de S. Cerevisiae fueron idénticos a los residuos de aminoácidos del sitio activo de las HMG-CoA cintazas de mamífero.

[0261] Rokosz et al. ((1994) supra) demostraron que cambiando el aminoácido cisteína catalítico de la HMGCoa sintasa humana por una alanina se creaba una proteína HMG-CoA sintasa de longitud completa que era catalíticamente inactiva. Por coNsiguiente, el aminoácido cisteína catalítico del sitio activo de HMGS de S. cervisiae en pBAD33MevT se sustituyó por un aminoácido alanina utilizando mutagénesis dirigida de sitio (kit de mutagénesis dirigida de sitio de cambio rápìdo, Stratagene). La cisteína en la posición de aminoácido 159 por un mutante de alanina de la HMGs de levadura, denominada HMGS(C159A), se verificó mediante la secuencia de ADN del operón completo. El plásmido pBad33MevT que contenía el mutante HMGS(C159A) se denominó pBAD33MevT(C159A) (SEQ ID NO 11). La expresión elevada de pBAD33MevT(C159A) en DH10B de E. coli no produjo mevalonato detectable medido mediante LC combinada con MS (cromatografía líquida combinada con espectrometría de mesas), o MHG-CoA, medida median cromatografía líquida-cromatografía de masas. Este resultado muestra que el mutante HMGS(C159A) también es catalíticamente inactivo.

[0262] Para construir un plásmido que expresaba la HMG-CoA sintasa mutante sola, se amplificó HMGS(C159A) a partir de pBAD33MevT(C159A) utilizando protocolos de PCR estándar y cebadores complementarios a los extremos 5’ y 3’ del gen. El gen de HMGS(C159A) se clonó en los sitios XmaI-SalI del plásmido pBAD33, de bajo número de copias, inducible por arabinosa, mediante la digestión del vector vacío y el producto PCR con las enzimas de restricción XmaI y SalI y la unión con T4 DNA ligasa. El plásmido resultante se denominó pHMGS(C159A) (SEQ ID NO 12).

[0263] Determinación de la causa de la inhibición del crecimiento

[0264] Para determinar porqué la expresión elevada de HMGS en E. coli causa la inhibición del crecimiento, se comparó el efecto de la expresión elevada de la HMGS de tipo salvaje con el efecto de la expresión elevada de la HMGS de longitud completa catalíticamente inactiva, HMGS(C159A). Los plásmidos pBAD33 (el plásmido vacío de control), pHMGS, pHMGS(C159A), pBAD33MevT y pBAD33MevT(C159A) se transformaron en DH10B de E. coli utilizando procedimientos estándar. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB que contenían 50 !g/ml de cloramfenicol. Se transfirió una colonia individual de cada cepa desde la placa de agar LB a 5 ml del medio líquido LB que contenía el mismo antibiótico. Este cultivo de siembra se incubó con agitación a 37°C hasta que el crecimiento alcanzó una fase estacionaria.

[0265] Se utilizaron cinco cultivos de siembra diferentes para inocular placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían volúmenes de 0,2 ml de medio LB, glicerol al 1& (p/v) y antibióticos. Los cultivos de placas de 96 pocillos se agitaron continuamente a 37°C en un lector de placas de microtitulación y se indujeron con arabinosa 2 mM a las dos horas después de la inoculación. El crecimiento celular de cada cultivo se muestra en la figura 7.

[0266] Tal como se muestra en la figura 7, en comparación con el control (cepa que alberga pBAD33), la expresión elevada de HMGS en E. coli (en cepa que alberga pHMGS) provoca la inhibición del crecimiento, mientras que la expresión elevada del mutante HMGS(C159A) en E. coli (en cepas que albergan pHMGS(C159A)) no lo hace.

Debido a que la única diferencia entre pHMGS y pHMGS(C159A) es la conversión de la cisteína catalítica en una alanina, este resultado demuestra que la toxicidad causada por la expresión elevada de HMGS de tipo salvaje es debido a la actividad enzimática de la proteína y no simplemente a la inhibición del crecimiento que puede estar causada por la expresión elevada de proteínas heterólogas (B.R. Glick. (1995) Biotech Advances. 13(12): 247-261). Además, el E. coli que expresa el operón MevT inactivo a niveles elevados (en cepa que alberga pBAD33MevT(C159A)) representa el mismo perfil de crecimiento que el control, mientras que la expresión elevada del operón MevT funcional (en cepa que alberga pBAD33MevT) inhibe el crecimiento celular. Este resultado demuestra que la inhibición del crecimiento causada por la expresión elevada de todos los genes en el operón MevT no es debida a la inhibición del crecimiento causada por la expresión elevada por la expresión elevada de proteínas heterólogas.

[0267] Además, la figura 7 demuestra que la toxicidad de la expresión elevada del operón MevT, causada por la acumulación intercelular de HMG-CoA (véase los ejemplos 5 y 6 anteriores), se puede aliviar mediante la reducción de la actividad de HMGS. Aunque la actividad de HMGS se reduzca a cero en este ejemplo, existen niveles reducidos de actividad de HMGS que aliviarán la inhibición del crecimiento, permitiendo a la vez la producción de mevalonato. La expresión elevada de una ruta equilibrada en la actividad de la enzima da lugar a una producción incrementada de mevalonato por volumen de cultivo celular.

[0268] Figura 7. Efecto de la expresión elevada de HMGS catalíticamente inactiva en el crecimiento de células de E. coli. Comparación del crecimiento celular de E. coli que alberga los plásmidos pBad33 (plásmido vacío de control), pBAD33MevT, pBAD33MevT(C159A) (contiene HMGS inactiva), pHMGS, y pHMGS(C159A) (contiene HMGs inactiva).

Ejemplo 5: La inhibición del crecimiento de E. coli que sobreexpresa el operón MevT es debido a la acumulación intracelular de HMGCoA.

[0269] Los siguientes ejemplos demuestran que la inhibición del crecimiento observada tras la expresión del operón MevT es debido a la acumulación de HMG-CoA.

[0270] Las cepas DH10B de E. coli que albergan los plásmidos pBAD33 (el plásmido vacío de control), pHMGS, pHMGSR, y pBAD33MevT se desarrollaron durante la noche a 37°C en 5 ml de medio LB y antibióticos bajo condiciones no inductoras. Los cultivos de la noche se utilizaron para inocular matraces de agitación con aireación que contenían 100 ml de medio LB, glicerol al 1% (p/v), y antibióticos. Los cultivos se agitaron continuamente a 37°C y se indujeron con arabinosa 2 mM a las 2 horas después de la inoculación. Se midieron los niveles intracelulares de HMG-CoA en cada cepa y el crecimiento celular de cada cultivo y los resultados se muestran en la figura 8 y la figura 9, respectivamente.

[0271] Tal como se muestra en la figura 8 y la figura 9, en comparación con el vector vacío de control (la cepa que alberga pBAD33), la expresión elevada de HMGS (en la cepa que alberga pHMGS) causa la acumulación de HMG-CoA y la inhibición del crecimiento. De manera destacada, la expresión a nivel elevado de HMGS y HMGR en conjunto (en la cepa que alberga pHMGSR) no causa inhibición del crecimiento y no acumula un nivel detectable de HMG-CoA, y en general es similar al control en estos aspectos. Sin embargo, la expresión elevada de atoB, HMGS y HMGR juntos en el operón MevT en E. coli (en la cepa que alberga pBAD33MevT) causa la inhibición del crecimiento y la acumulación de HMG-CoA a tiempos posteriores.

[0272] E. coli produce de forma natural acetoacetil-CoA a un nivel bajo a partir de la expresión nativa de atoB y la degradación de ácidos grasos de cadena corta. Los resultados mostrados en las figuras 8 y 9 demuestran que una expresión elevada de HMGS sola en E. coli produce HMG-CoA a partir del suministro nativo de acetoacetil-CoA. Debido a que la HMG-CoA no es nativa para E. coli, no se sabe que actúe por acción de alguna enzima de E. coli y no cruzará la membrana celular; por tanto, la HMG-CoA se acumula en la célula. A cierto nivel, la HMG-CoA inhibe los procesos celulares. Sin embargo, la expresión elevada de HMGS y HMGR juntas permite que la HMG-CoA que se produce a partir del suministro nativo de acetoacetil-CoA por HMGS se convierta en mevalonato. El mevalonato cruzará la membrana celular y se acumulará en el medio. Adicionalmente, las concentraciones extracelulares elevadas de mevalonato parecen no tener un efecto significativo en el crecimiento de E. coli (Martin et al. (2003) supra.

[0273] Figura 8. Niveles intracelulares de HMG-CoA de cepas de E. coli que expresan constructos de la ruta del mevalonato. Acumulación de HMG CoA en E. coli que alberga pBad33 (plásmido vacío de control), pHMGS, pHMGSR, y pBAD33MevT.

[0274] Figura 9. Crecimiento celular de cepas de E. coli que expresan constructos de la ruta del mevalonato. Comparación del crecimiento celular de E. coli que alberga los plásmidos pBad33 (plásmido vacío de control), pHMGS, pHMGSR, y pBAD33MevT.

[0275] La expresión elevada de atoB, junto con HMGS y HMGR, proporciona un sustrato incrementado para HMGS e incrementa sustancialmente la producción de mevalonato (T. Kuzuyama. (2004). Biosci. Biotechnol. Biochem.

68(4): 931-934); sin embargo, si la actividad total de HMGS es superior a la de HMGR, el intermedio HMG-CoA se acumulará de nuevo y provocará la inhibición del crecimiento. De este modo, en una realización, la presente invención proporciona un método para paliar la toxicidad de la inhibición del crecimiento por la acumulación de HMG CoA en una célula, cuyo método comprende modificar la célula para incrementar la expresión de HMGR, en relación con HMGS. En una realización, la actividad de HMGR se incrementa hasta un nivel aproximadamente igual a la actividad de HMGS. En otras realizaciones, la actividad de HMGR se incrementa hasta niveles 1,5, 2, 5, y 10 veces la actividad de HMGS.

Ejemplo 6: La expresión incrementada de HMGR alivia la inhibición de crecimiento causada por la expresión elevada de MevT, disminuye la acumulación de HMG-CoA, e incrementa la producción de mevalonato.

[0276] El ejemplo siguiente muestra cómo se puede incrementar la producción de mevalonato y superar el problema de toxicidad causada por la acumulación de HMG-CoA debida a la sobreexpresión de HMGR.

[0277] Para demostrar que la acumulación intracelular de HMG-CoA era tóxica para E. coli y para empezar la optimización de la ruta para corregir este problema, se incrementó la actividad de HMGR en cepas que expresaban el operón MevT a altos niveles. Se transformó DH10B de E. coli con las combinaciones siguientes de dos plásmidos para crear tres sistemas de plásmidos duales: pBAD33 y pBAD18 (cepa de plásmido vacío de control), pBAD33MevT y pBAD18, y pBAD33MevT y pBAD18HMGR. Se seleccionaron los transformantes en placas de agar LB que contenían 50 μg/ml de carbenicilina y 50 μg/ml de cloramfenicol. Se transfirió una colonia individual de cada cepa de la placa de agar LB a 5 ml de medio líquido LB que contenía el mismo antibiótico. Se incubó este cultivo de siembra mediante agitación a 37ºC hasta que el crecimiento alcanzó una fase estacionaria.

[0278] Se utilizaron los tres cultivos de siembra diferentes para inocular matraces de agitación con aireación que contenían 100 ml de medio LB, glicerol al 1% (p/v), y antibióticos. Se agitaron continuamente los cultivos a 37ºC y se indujeron con arabinosa 2 mM a las 2 horas tras la inoculación. El crecimiento celular de cada cultivo, los niveles intracelulares de HMG-CoA en cada cepa y el mevalonato producido en cada cultivo se midieron mediante los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. En las Figuras 10, 11 y 12, respectivamente, se muestran los resultados de los tres sistemas de plásmidos duales.

[0279] Tal y como se muestra en las Figuras 10 y 11, en comparación con la cepa de control (la cepa que alberga pBAD33 y pBAD18), la expresión elevada de MevT en la cepa que alberga pBAD33MevT y pBAD18 causa de nuevo la inhibición del crecimiento y la acumulación de HMG-CoA. No obstante, la expresión incrementada de HMGR en una cepa que expresa MevT a un nivel alto (la cepa que alberga pBAD33MevT y pBAD18HMGR), alivia la inhibición de crecimiento en parte y reduce la acumulación de HMG-CoA. Adicionalmente, tal y como se muestra en la Figura 12, la expresión incrementada de HMGR conduce a la producción incrementada de mevalonato. El incremento de la expresión de HMGR es sólo un método ilustrativo de la invención para incrementar la actividad de HMGR en las células de E. coli. Otros métodos de la invención para incrementar la actividad de HMGR conducirían a resultados similares.

[0280] La expresión de MBIS y ADS en al cepa con actividad incrementada de HMGR y expresión elevada de MevT, puede provocar una producción incrementada de amorfadieno. Además, el incremento de la actividad de HMGR y el alivio de la toxicidad causada por la expresión elevada de MevT pueden incrementar la producción de cualquier isoprenoide dado que se co-expresa una ruta enzimática de mevalonato al isoprenoide de interés.

[0281] Figura 10. Efecto de la expresión incrementada de HMGR sobre el crecimiento de la célula de E. coli que expresa el operón MevT. Crecimiento celular de E. coli que alberga los plásmidos pBad33+pBad18 (vector vacío de control), pBad33MevT+pBad18, y pBad33MevT+pBad18HMGR.

[0282] Figura 11. Efecto de la expresión incrementada de HMGR sobre los niveles de HMG-CoA de E. coli que expresa el operón MevT. Niveles de HMG-CoA intracelulares de E. coli que alberga los plásmidos pBad33+pBad18 (vector vacío de control), pBad33MevT+pBad18, y pBad33MevT+pBad18HMGR.

[0283] Figura 12. Efecto de la expresión incrementada de HMGR sobre los niveles de producción de mevalonato de

E. coli que expresa el operón MevT. Niveles de mevalonato en cultivos de E. coli que alberga los plásmidos pBad33+pBad18 (vector vacío de control), pBad33MevT+pBad18, y pBad33MevT+pBad18HMGR.

Ejemplo 7: Aplicación de un método en cuestión a una célula huésped productora de mevalonato

[0284] El presente ejemplo ilustra cómo pueden aplicarse los métodos de la invención a cualquier cepa huésped productora de mevalonato en la que se acumulan niveles de HMG-CoA hasta niveles tóxicos. En general, se modifica una célula huésped de alguna manera en un intento de conseguir niveles más altos de isoprenoide o precursor de isoprenoide (por ejemplo, mevalonato, IPP, un poliprenil difosfato, y similares), para generar una célula "original". Las modificaciones adecuadas incluyen, por ejemplo, modificaciones que incrementan el grupo intracelular de acetil-CoA, modificaciones que incrementan el nivel de actividad de la acetoacetil-CoA tiolasa, y modificaciones que incrementan el nivel de actividad de HMGS. Estas modificaciones podrían efectuarse mediante alteraciones genéticas o químicas o tratamientos dirigidos a modificar los niveles de transcrito, niveles de enzima, o actividad específica de enzimas.

[0285] Se observan las características de crecimiento de la célula huésped original, y se comparan con las características de crecimiento de la célula huésped no modificada. Si las células huésped originales crecen significativamente más lentamente que la célula huésped no modificada, entonces la inhibición de crecimiento observada puede estar causada por la toxicidad de HMG-CoA, y los niveles resultantes de producción de mevalonato o isoprenoide serían subóptimos.

[0286] Se determinan los niveles de HMG-CoA en la célula huésped y la célula original a través de una extracción establecida y técnicas LC-MS (ver Ejemplo 1) para verificar el motivo previsto para la inhibición de crecimiento. Si el nivel de HMG-CoA por unidad de biomasa (biomasa medida como peso celular en seco o mediante la medición de la deNsidad óptica a, por ejemplo, 600 nm) es más alto en la célula huésped modificada, entonces aquellas mediciones apoyan la conclusión de que la toxicidad se debe a la acumulación de HMG-CoA, y, en tal caso, disminuir los niveles dentro de la célula servirá para aliviar esta toxicidad e incrementar la producción total de mevalonato, IPP, o isoprenoide. Mientras que la medición de los niveles de HMG-CoA en una célula productora de HMG-CoA que es inhibida del crecimiento no es un paso requerido en un método en cuestión de paliación de toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA, dichas mediciones pueden realizarse de vez en cuando en ciertas realizaciones.

[0287] La toxicidad de HMG-CoA y la mejora de la producción de isoprenoide o de precursor de isoprenoide puede paliarse mediante la práctica de la presente invención. Por ejemplo, puede modificarse genéticamente la célula huésped original de varias maneras, dando lugar a una célula huésped modificada genéticamente que produce un nivel incrementado de HMGR en comparación con la célula huésped original. Por ejemplo, en la célula huésped original se incrementa el número de copias de un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR, por ejemplo, modificando genéticamente la célula huésped original con un plásmido con un número de copias elevado que expresa HMGR bajo el control de un promotor. Como otro ejemplo, se incrementa el nivel de ARNm de HMGR en la célula original, por ejemplo, modificando genéticamente la célula original con un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica HMGR que está bajo control de un promotor más fuerte. Como otro ejemplo, se modifica el sitio de unión a ribosoma en dirección 5’ de hmgR en la célula huésped original para generar una célula huésped modificada genéticamente que produce un nivel de HMGR incrementado. Mediante la observación de las características de crecimiento de la célula huésped modificada genéticamente y comparando éstas con las características de crecimiento de la célula huésped original, se puede determinar que el método ha sido satisfactorio cuando la célula huésped modificada genéticamente muestra menos o ninguna inhibición de crecimiento que la original. Se observará la paliación de la toxicidad de HMG-CoA como un incremento en la velocidad de crecimiento y/o un incremento en la deNsidad celular final del cultivo.

[0288] Como otro ejemplo, se genera una célula huésped original mediante el incremento del nivel de HMG-CoA en una célula que tiene una ruta del mevalonato endógena. Por ejemplo, el nivel de acetil-CoA intracelular dentro de una célula de levadura, como el Saccharomyces cerevisiae, se incrementa mediante la introducción de mutaciones en (modificando genéticamente) la célula de levadura, creando una célula huésped “original”. Por ejemplo, se incrementa el nivel de acetil-CoA intracelular mediante la introducción de una mutación en el gen de la piruvato descarboxilasa en el cromosoma. Esto se coNsigue utilizando la interrupción de genes de un solo paso (Rothstein,

R.J. (1983) Methods Enzymol. 101 202-211 One-step gene disruption in yeast) para alterar la piruvato descarboxilasa. De forma similar, se generan alelos inactivos o parcialmente activos de piruvato descarboxilasa mediante transformación de ADN integrador en levadura (Rothstein, R. (1991) Methods Enzymol. 194 281-301). Se coNsigue la interrupción basada en la PCR de la piruvato carboxilasa utilizando un knockout previo en una cepa de Saccharomyces cerevisiae diferente, como la cepa S288C (Reid et al. Yeast. 2002 Mar 15;19(4):319-28., Mehdi, K. Yeast 2002 Jun 30;19(9):803). Dichas alteraciones disminuyen el flujo de piruvato a etanol a través de acetaldehído e incrementan indirectamente los niveles de acetil-CoA.

[0289] El incremento en el nivel de acetil-CoA intracelular puede, a su vez, dar lugar a un incremento en los niveles de acetilacetil-CoA, que puede, a su vez, conducir a un incremento en los niveles de HMG-CoA intracelulares. Para conseguir niveles de HMG-CoA incrementados, puede modificarse adicionalmente una célula huésped para incrementar el nivel de actividad de acetoacetil-CoA tiolasa y/o el nivel de actividad de HMGS dentro de la célula para incrementar la conversión de acetil-CoA en HMG-CoA, generando una célula huésped de levadura original que muestra altos niveles intracelulares de HMG-CoA. Se utilizará cualquier vector diseñado para la replicación y la selección en levadura y que incorpore un promotor activo en levadura, incluyendo también típicamente un terminador en dirección 3’ del promotor, para expresar genes en levadura. Ejemplos de replicones de levadura incluyen los replicones 2μ o CEN somo CEN6/ARSH4; ejemplos de marcadores seleccionables incluyen los marcadores HIS3, TRP1, LEU2 o URA3; ejemplos de promotores de levadura incluyen los promotores CYC1, ADH, TEF o GPD; un ejemplo de un terminador de levadura es el terminador CYC1 de levadura. Se dan ejemplos de vectores de expresión en Mumberg D, Muller R, Funk M., Gene. 1995 Apr 14;156(1):119-22. Están disponibles una variedad de vectores de levadura para la expresión controlada de proteínas heterólogas en diferentes bases genéticas. Otro ejemplo de un vector de expresión de levadura es pYE2 (Invitrogen Corporation).

[0290] Se comparan las características de crecimiento de la célula de levadura huésped original con las de la célula de levadura huésped no modificada mediante el crecimiento de cada célula de forma separada bajo condiciones estándar en medios de crecimiento estándar con la selección del plásmido que expresa el gen de interés. Ejemplos de medios de levadura incluyen peptona dextrosa de extracto de levadura (YPD), Medio mínimo de dextrosa sintética (SD), Medio mínimo suplementado (SMM) y medio completo sintético (SC o CM) (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual. ISBN 0-87969-577-3).

[0291] Si la velocidad de crecimiento de la célula huésped original es significativamente más lenta que la velocidad de crecimiento de la célula de levadura huésped no modificada, la acumulación de HMG-CoA puede ser la causa de esta toxicidad/inhibición de crecimiento. Para superar la inhibición de crecimiento celular inducida por la acumulación de HMG-CoA, se modifica genéticamente la célula de levadura original, de acuerdo con los métodos de la invención. Por ejemplo, se modifica genéticamente una célula huésped de levadura original mediante la sustitución del gen de HMGR endógeno en el cromosoma de S. Cerevisae con un ácido nucleico que codifica HMGR que carece de la región reguladora N-terminal de la enzima (Donald et al. Appl Environ Microbiol. 1997 Sep;63(9):3341-4. Polakowski et al. Appl Microbiol Biotechnol. 1998 Jan;49(1):66-71), incrementando por tanto el nivel de actividad de HMG-CoA dentro de la célula. Si una comparación de las características del crecimiento de la célula de levadura huésped genéticamente modificada con las de la célula de levadura huésped original muestra un incremento significativo en la velocidad de crecimiento, puede atribuirse el incremento en la velocidad de crecimiento a la disminución en los niveles de HMG-CoA intracelulares tóxicos.

[0292] Como resultado, se incrementarán los niveles totales de isoprenoide o de precursor de isoprenoide producidos por la cepa huésped modificada genéticamente, en comparación con los niveles producidos por la cepa huésped original.

[0293] Por ejemplo, se manipulan la S. Cerevisae original y genéticamente modificada para expresar amorfadieno sintasa. Por ejemplo, se clona el gen para la amorfadieno sintasa (ya sea el gen de Artemisa annua nativo, el gen codón-optimizado de E.coli (Martin et al, 2003) o un gen codón-optimizado de levadura) dentro del sitio de clonación múltiple de pYES2, de manera que se transcribe el gen de la amorfadieno sintasa bajo el control del promotor GAL1. Se transforma una célula de levadura huésped con el plásmido recombinante, seleccionando para la auxotrofia de uracilo. Después del crecimiento en un medio carente de uracilo y glucosa, se induce la expresión de amorfadieno sintasa mediante la adición de galactosa. Se incrementa el nivel de HMG-CoA intracelular en la célula de levadura que produce amorfadieno sintasa mediante la introducción de una o más mutaciones, tal y como se describe anteriormente, generando una célula de levadura huésped original . Se modifica genéticamente la célula de levadura huésped original, tal y como se describe anteriormente, por ejemplo, para incrementar el nivel de HMGR en la célula. Se comparan la producción del amorfadieno en cultivos de célula de levadura huésped original y célula de levadura de huésped modificada genéticamente; el nivel de amorfadieno producido por la célula huésped modificada genéticamente es mayor que el nivel de amorfadieno producido por la célula huésped original. Se miden fácilmente los niveles de amorfadieno utilizando análisis GC-MS.

[0294] Como otro ejemplo, se observa la toxicidad de HMG-CoA en la célula de E. coli original manipulada para expresar la ruta del mevalonato. Se palia la toxicidad de HMG-CoA mediante la modificación genética de la célula original, por ejemplo, para incrementar el nivel de HMGR en la célula. Este ejemplo se resume en los ejemplos 1-6, anteriormente. Un experto en la materia apreciará que el método puede realizarse con cualquier célula huésped o cualquier constructo a la luz de la presente descripción.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA

<120> MÉTODO PARA AUMENTAR LA PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS ISOPRENOIDES

<130> AHB/FP6417893

<140> 05857432,.8

<141> 2005-05-20

<140> PCT/US2005/017874

<141> 2005-05-20

<150> 60/573,492

<151> 2004-05-21

<160> 13

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 8759

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> plásmido pBAD24MevT

<400> 1

atcgatgcat aatgtgcctg tcaaatggac gaagcaggga ttctgcaaac cctatgctac 60 tccgtcaagc cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg acaacttgac ggctacatca 120 ttcacttttt cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc tggccccggt gcatttttta 180 aatacccgcg agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat tgcgaccgac ggtggcgata 240 ggcatccggg tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga tacgttggtc ctcgcgccag 300 cttaagacgc taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg acagacgcga cggcgacaag 360 caaacatgct gtgcgacgct ggcgatatca aaattgctgt ctgccaggtg atcgctgatg 420 tactgacaag cctcgcgtac ccgattatcc atcggtggat ggagcgactc gttaatcgct 480 tccatgcgcc gcagtaacaa ttgctcaagc agatttatcg ccagcagctc cgaatagcgc 540 ccttcccctt gcccggcgtt aatgatttgc ccaaacaggt cgctgaaatg cggctggtgc 600 gcttcatccg ggcgaaagaa ccccgtattg gcaaatattg acggccagtt aagccattca 660 tgccagtagg cgcgcggacg aaagtaaacc cactggtgat accattcgcg agcctccgga 720 tgacgaccgt agtgatgaat ctctcctggc gggaacagca aaatatcacc cggtcggcaa 780 acaaattctc gtccctgatt tttcaccacc ccctgaccgc gaatggtgag attgagaata 840 taacctttca ttcccagcgg tcggtcgata aaaaaatcga gataaccgtt ggcctcaatc 900 ggcgttaaac ccgccaccag atgggcatta aacgagtatc ccggcagcag gggatcattt 960 tgcgcttcag ccatactttt catactcccg ccattcagag aagaaaccaa ttgtccatat 1020 tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct tctcgctaac caaaccggta 1080 accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca aagccatgac aaaaacgcgt 1140 aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg attatttgca cggcgtcaca 1200 ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg atcctacctg acgcttttta 1260 tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg ctagcaggag gaattcacca 1320 tggtacccgg ggatcctcta gagtcgacta ggaggaatat aaaatgaaaa attgtgtcat 1380 cgtcagtgcg gtacgtactg ctatcggtag ttttaacggt tcactcgctt ccaccagcgc 1440 catcgacctg ggggcgacag taattaaagc cgccattgaa cgtgcaaaaa tcgattcaca 1500 acacgttgat gaagtgatta tgggtaacgt gttacaagcc gggctggggc aaaatccggc 1560 gcgtcaggca ctgttaaaaa gcgggctggc agaaacggtg tgcggattca cggtcaataa 1620 agtatgtggt tcgggtctta aaagtgtggc gcttgccgcc caggccattc aggcaggtca 1680 ggcgcagagc attgtggcgg ggggtatgga aaatatgagt ttagccccct acttactcga 1740 tgcaaaagca cgctctggtt atcgtcttgg agacggacag gtttatgacg taatcctgcg 1800 cgatggcctg atgtgcgcca cccatggtta tcatatgggg attaccgccg aaaacgtggc 1860 taaagagtac ggaattaccc gtgaaatgca ggatgaactg gcgctacatt cacagcgtaa 1920 agcggcagcc gcaattgagt ccggtgcttt tacagccgaa atcgtcccgg taaatgttgt 1980 cactcgaaag aaaaccttcg tcttcagtca agacgaattc ccgaaagcga attcaacggc 2040 tgaagcgtta ggtgcattgc gcccggcctt cgataaagca ggaacagtca ccgctgggaa 2100 cgcgtctggt attaacgacg gtgctgccgc tctggtgatt atggaagaat ctgcggcgct 2160 ggcagcaggc cttacccccc tggctcgcat taaaagttat gccagcggtg gcgtgccccc 2220 cgcattgatg ggtatggggc cagtacctgc cacgcaaaaa gcgttacaac tggcggggct 2280 gcaactggcg gatattgatc tcattgaggc taatgaagca tttgctgcac agttccttgc 2340 cgttgggaaa aacctgggct ttgattctga gaaagtgaat gtcaacggcg gggccatcgc 2400 gctcgggcat cctatcggtg ccagtggtgc tcgtattctg gtcacactat tacatgccat 2460 gcaggcacgc gataaaacgc tggggctggc aacactgtgc attggcggcg gtcagggaat 2520 tgcgatggtg attgaacggt 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ttggttagcg atcccgctgg ttcggatgct ttgaacgttt 3420 tgaaatattt cgactacaac gttttccatg ttccaacctg taaattggtc acaaaatcat 3480 acggtagatt actatataac gatttcagag ccaatcctca attgttccca gaagttgacg 3540 ccgaattagc tactcgcgat tatgacgaat ctttaaccga taagaacatt gaaaaaactt 3600 ttgttaatgt tgctaagcca ttccacaaag agagagttgc ccaatctttg attgttccaa 3660 caaacacagg taacatgtac accgcatctg tttatgccgc ctttgcatct ctattaaact 3720 atgttggatc tgacgactta caaggcaagc gtgttggttt attttcttac ggttccggtt 3780 tagctgcatc tctatattct tgcaaaattg ttggtgacgt ccaacatatt atcaaggaat 3840 tagatattac taacaaatta gccaagagaa tcaccgaaac tccaaaggat tacgaagctg 3900 ccatcgaatt gagagaaaat gcccatttga agaagaactt caaacctcaa ggttccattg 3960 agcatttgca aagtggtgtt tactacttga ccaacatcga tgacaaattt agaagatctt 4020 acgatgttaa aaaataagga ggattacact atggttttaa ccaataaaac agtcatttct 4080 ggatcgaaag tcaaaagttt atcatctgcg caatcgagct catcaggacc ttcatcatct 4140 agtgaggaag atgattcccg cgatattgaa agcttggata agaaaatacg tcctttagaa 4200 gaattagaag cattattaag tagtggaaat acaaaacaat tgaagaacaa agaggtcgct 4260 gccttggtta ttcacggtaa gttacctttg tacgctttgg agaaaaaatt aggtgatact 4320 acgagagcgg ttgcggtacg taggaaggct ctttcaattt tggcagaagc tcctgtatta 4380 gcatctgatc gtttaccata taaaaattat gactacgacc gcgtatttgg cgcttgttgt 4440 gaaaatgtta taggttacat gcctttgccc gttggtgtta taggcccctt ggttatcgat 4500 ggtacatctt atcatatacc aatggcaact acagagggtt gtttggtagc ttctgccatg 4560 cgtggctgta aggcaatcaa tgctggcggt ggtgcaacaa ctgttttaac taaggatggt 4620 atgacaagag gcccagtagt ccgtttccca actttgaaaa gatctggtgc ctgtaagata 4680 tggttagact cagaagaggg acaaaacgca attaaaaaag cttttaactc tacatcaaga 4740 tttgcacgtc tgcaacatat tcaaacttgt ctagcaggag atttactctt catgagattt 4800 agaacaacta ctggtgacgc aatgggtatg aatatgattt ctaaaggtgt cgaatactca 4860 ttaaagcaaa tggtagaaga gtatggctgg gaagatatgg aggttgtctc cgtttctggt 4920 aactactgta ccgacaaaaa accagctgcc atcaactgga tcgaaggtcg tggtaagagt 4980 gtcgtcgcag aagctactat tcctggtgat gttgtcagaa aagtgttaaa aagtgatgtt 5040 tccgcattgg ttgagttgaa cattgctaag aatttggttg gatctgcaat ggctgggtct 5100 gttggtggat ttaacgcaca tgcagctaat ttagtgacag ctgttttctt ggcattagga 5160 caagatcctg cacaaaatgt tgaaagttcc aactgtataa cattgatgaa agaagtggac 5220 ggtgatttga gaatttccgt atccatgcca tccatcgaag taggtaccat cggtggtggt 5280 actgttctag aaccacaagg tgccatgttg gacttattag gtgtaagagg cccgcatgct 5340 accgctcctg gtaccaacgc acgtcaatta gcaagaatag ttgcctgtgc cgtcttggca 5400 ggtgaattat ccttatgtgc tgccctagca gccggccatt tggttcaaag tcatatgacc 5460 cacaacagga aacctgctga accaacaaaa cctaacaatt tggacgccac tgatataaat 5520 cgtttgaaag atgggtccgt cacctgcatt aaatcctaag tcgacctgca ggcatgcaag 5580 cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc 5640 agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac 5700 cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat 5760 gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 5820 ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg 5880 agcggatttg aacgttgcga 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gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc 8460 ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt 8520 tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc 8580 cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc 8640 ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc 8700 ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gaggatctgc tcatgtttga cagcttatc 8759

<210> 2

<211> 9573

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> plásmido pBAD33MevT

<400> 2 atcgatgcat aatgtgcctg tcaaatggac gaagcaggga ttctgcaaac cctatgctac 60 tccgtcaagc cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg acaacttgac ggctacatca 120 ttcacttttt cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc tggccccggt gcatttttta 180 aatacccgcg agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat tgcgaccgac ggtggcgata 240 ggcatccggg tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga tacgttggtc ctcgcgccag 300 cttaagacgc taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg acagacgcga cggcgacaag 360 caaacatgct gtgcgacgct ggcgatatca aaattgctgt ctgccaggtg atcgctgatg 420 tactgacaag cctcgcgtac ccgattatcc atcggtggat ggagcgactc gttaatcgct 480 tccatgcgcc gcagtaacaa ttgctcaagc agatttatcg ccagcagctc cgaatagcgc 540 ccttcccctt gcccggcgtt aatgatttgc ccaaacaggt cgctgaaatg cggctggtgc 600 gcttcatccg ggcgaaagaa ccccgtattg gcaaatattg acggccagtt aagccattca 660 tgccagtagg cgcgcggacg aaagtaaacc cactggtgat accattcgcg agcctccgga 720 tgacgaccgt agtgatgaat ctctcctggc gggaacagca aaatatcacc cggtcggcaa 780 acaaattctc gtccctgatt tttcaccacc ccctgaccgc gaatggtgag attgagaata 840 taacctttca ttcccagcgg tcggtcgata aaaaaatcga gataaccgtt ggcctcaatc 900 ggcgttaaac ccgccaccag atgggcatta aacgagtatc ccggcagcag gggatcattt 960 tgcgcttcag ccatactttt catactcccg ccattcagag aagaaaccaa ttgtccatat 1020 tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct tctcgctaac caaaccggta 1080 accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca aagccatgac aaaaacgcgt 1140 aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg attatttgca cggcgtcaca 1200 ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg atcctacctg acgcttttta 1260 tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg ctagcgaatt cgagctcggt 1320 acccggggat cctctagagt cgactaggag gaatataaaa tgaaaaattg tgtcatcgtc 1380 agtgcggtac gtactgctat cggtagtttt aacggttcac tcgcttccac cagcgccatc 1440 gacctggggg cgacagtaat taaagccgcc attgaacgtg caaaaatcga ttcacaacac 1500 gttgatgaag tgattatggg taacgtgtta caagccgggc tggggcaaaa tccggcgcgt 1560 caggcactgt taaaaagcgg gctggcagaa acggtgtgcg gattcacggt caataaagta 1620 tgtggttcgg gtcttaaaag tgtggcgctt gccgcccagg ccattcaggc aggtcaggcg 1680 cagagcattg 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<211> 6835

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> plásmido pHMGS(C159A)

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gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 3420 tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcag 3480 caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat 3540 ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat 3600 tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc 3660 agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga 3720 tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc 3780 agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttacgc gccctgtagc ggcgcattaa 3840 gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 3900 ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 3960 ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 4020 aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 4080 gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa acttgaacaa 4140 cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 4200 attggttaaa aaatgagctg 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catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt 5100 tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg 5160 tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg 5220 tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ttccggatga 5280 gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc 5340 tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga 5400 gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg 5460 gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac 5520 tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg 5580 tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg 5640 acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta ttcggcgcaa 5700 agtgcgtcgg gtgatgctgc caacttactg atttagtgta tgatggtgtt tttgaggtgc 5760 tccagtggct tctgtttcta tcagctgtcc ctcctgttca gctactgacg gggtggtgcg 5820 taacggcaaa agcaccgccg gacatcagcg ctagcggagt gtatactggc ttactatgtt 5880 ggcactgatg agggtgtcag tgaagtgctt catgtggcag gagaaaaaag gctgcaccgg 5940 tgcgtcagca gaatatgtga tacaggatat attccgcttc ctcgctcact gactcgctac 6000 gctcggtcgt tcgactgcgg cgagcggaaa tggcttacga acggggcgga gatttcctgg 6060 aagatgccag gaagatactt aacagggaag tgagagggcc gcggcaaagc cgtttttcca 6120 taggctccgc ccccctgaca agcatcacga aatctgacgc tcaaatcagt ggtggcgaaa 6180 cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctggc ggctccctcg tgcgctctcc 6240 tgttcctgcc tttcggttta ccggtgtcat tccgctgtta tggccgcgtt tgtctcattc 6300 cacgcctgac actcagttcc gggtaggcag ttcgctccaa gctggactgt atgcacgaac 6360 cccccgttca gtccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 6420 aaagacatgc aaaagcacca ctggcagcag ccactggtaa ttgatttaga ggagttagtc 6480 ttgaagtcat gcgccggtta aggctaaact gaaaggacaa gttttggtga ctgcgctcct 6540 ccaagccagt tacctcggtt caaagagttg gtagctcaga gaaccttcga aaaaccgccc 6600 tgcaaggcgg ttttttcgtt ttcagagcaa gagattacgc gcagaccaaa acgatctcaa 6660 gaagatcatc ttattaatca gataaaatat ttgctcatga gcccgaagtg gcgagcccga 6720 tcttccccat cggtgatgtc ggcgatatag gcgccagcaa ccgcacctgt ggcgccggtg 6780 atgccggcca cgatgcgtcc ggcgtagagg atctgctcat gtttgacagc ttatc 6835

<210> 13

<211> 1509

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia codificantes de HMGR truncada

<400> 13

atggttttaa ccaataaaac agtcatttct ggatcgaaag tcaaaagttt atcatctgcg 60 caatcgagct catcaggacc ttcatcatct agtgaggaag atgattcccg cgatattgaa 120 agcttggata agaaaatacg tcctttagaa gaattagaag cattattaag tagtggaaat 180 acaaaacaat tgaagaacaa agaggtcgct gccttggtta ttcacggtaa gttacctttg 240 tacgctttgg agaaaaaatt aggtgatact acgagagcgg ttgcggtacg taggaaggct 300 ctttcaattt tggcagaagc tcctgtatta gcatctgatc gtttaccata taaaaattat 360 gactacgacc gcgtatttgg cgcttgttgt gaaaatgtta taggttacat gcctttgccc 420 gttggtgtta taggcccctt ggttatcgat ggtacatctt atcatatacc aatggcaact 480 acagagggtt gtttggtagc ttctgccatg cgtggctgta aggcaatcaa tgctggcggt 540 ggtgcaacaa ctgttttaac taaggatggt atgacaagag gcccagtagt ccgtttccca 600 actttgaaaa gatctggtgc ctgtaagata tggttagact cagaagaggg acaaaacgca 660 attaaaaaag cttttaactc tacatcaaga tttgcacgtc tgcaacatat tcaaacttgt 720 ctagcaggag atttactctt catgagattt agaacaacta ctggtgacgc aatgggtatg 780 aatatgattt ctaaaggtgt cgaatactca ttaaagcaaa tggtagaaga gtatggctgg 840 gaagatatgg aggttgtctc cgtttctggt aactactgta ccgacaaaaa accagctgcc 900 atcaactgga tcgaaggtcg tggtaagagt gtcgtcgcag aagctactat tcctggtgat 960 gttgtcagaa aagtgttaaa aagtgatgtt tccgcattgg ttgagttgaa cattgctaag 1020 aatttggttg gatctgcaat ggctgggtct gttggtggat ttaacgcaca tgcagctaat 1080 ttagtgacag ctgttttctt ggcattagga caagatcctg cacaaaatgt tgaaagttcc 1140 aactgtataa cattgatgaa agaagtggac ggtgatttga gaatttccgt atccatgcca 1200 tccatcgaag taggtaccat cggtggtggt actgttctag aaccacaagg tgccatgttg 1260 gacttattag gtgtaagagg cccgcatgct accgctcctg gtaccaacgc acgtcaatta 1320 gcaagaatag ttgcctgtgc cgtcttggca ggtgaattat ccttatgtgc tgccctagca 1380 gccggccatt tggttcaaag tcatatgacc cacaacagga aacctgctga accaacaaaa 1440 cctaacaatt tggacgccac tgatataaat cgtttgaaag atgggtccgt cacctgcatt 1500 aaatcctaa 1509

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir un isoprenoide o precursor de isoprenoide a través de la ruta del mevalonato en Escherichia coli, comprendiendo el método:

(i)

cultivar en un medio adecuado una célula de E. coli modificada genéticamente para producir hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintasa (HMGS) heteróloga y HMG-CoA reductasa (HMGR) heteróloga, y en el que la célula de E. coli modificada genéticamente se modifica genéticamente adicionalmente para producir una o más enzimas heterólogas adicionales de la ruta del mevalonato seleccionadas entre:

(a)

una acetoacetil-CoA tiolasa;

(b)

una mevalonato quinasa;

(c)

una fosfomevalonato quinasa; y

(d)

una mevalonato pirofosfato descarboxilasa; en el que en ausencia de dicha HMGR heteróloga, los niveles de HMG-CoA producidos en la célula son tóxicos para la célula, y en el que el nivel de actividad relativo de la HMGR producida en la célula de E. coli modificada genéticamente es superior al nivel de actividad relativo de la HMGS producida en la célula de E. coli modificada genéticamente, de manera que el nivel de HMG-CoA presente en la célula no es tóxico para dicha célula y/o no inhibe sustancialmente el crecimiento celular; y

(ii) recuperar el isoprenoide o precursor de isoprenoide producido.
2.

Método según la reivindicación 1, en el que la acetoacetil-CoA tiolasa es heteróloga a la célula de E. coli modificada genéticamente.
3.

Método según la reivindicación 1, en el que la célula de E. coli modificada genéticamente comprende una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la HMGR.
4.

Método según la reivindicación 1, en el que la célula de E. coli modificada genéticamente comprende un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la HMGS.
5.

Método según la reivindicación 4, en el que dicha célula de E. coli modificada comprende un plásmido con un número de copias bajo que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica HMGS.
6.

Método según la reivindicación 1, en el que la célula de E. coli modificada genéticamente comprende un ácido nucleico heterólogo que ha sustituido el gen de HMGS heterólogo, y en el que dicho ácido nucleico heterólogo tiene un nivel de actividad inferior al del gen de HMGS endógeno.
7.

Método según la reivindicación 1, en el que la célula de E. coli modificada genéticamente comprende un constructo de expresión que comprende una versión modificada de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 1 en que el sitio de unión a ribosoma en dirección 5’ con respecto a HMGS ha sido alterado, de manera que se reduce la traducción en comparación con una E. coli en que la SEQ ID NO: 1 no está alterada.
8.

Método según la reivindicación 1, en el que la E. coli modificada comprende vectores que codifican HMGR y HMGS, en el que las regiones codificantes de HMGR y HMGS están bajo el control de diferentes promotores.
9.

Célula huésped modificada genéticamente que produce un isoprenoide o precursor de isoprenoide, en la que la célula huésped modificada genéticamente es una célula huésped procariota que no produce normalmente isopentenil pirofosfato a través de la ruta del mevalonato, en la que la célula huésped modificada genéticamente está modificada genéticamente para producir hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintasa (HMGS) heteróloga y HMG-CoA reductasa (HMGR) heteróloga, en la que la célula huésped modificada genéticamente está modificada adicionalmente genéticamente para producir una o más enzimas heterólogas adicionales de la ruta del mevalonato seleccionadas entre:

(a)

una acetoacetil-CoA tiolasa;

(b)

una mevalonato quinasa;

(c)

una fosfomevalonato quinasa; y

(d) una mevalonato pirofosfato descarboxilasa; en la que en ausencia de dicha HMGR heteróloga, los niveles de HMG-CoA producidos en la célula son tóxicos para la célula, y en la que el nivel de actividad relativo de la HMGR producida en la célula huésped modificada genéticamente es superior al nivel de actividad relativo de la HMGS producida en la célula huésped modificada genéticamente, de manera que el nivel de HMG-CoA presente en la célula no es tóxico para dicha célula y/o no inhibe sustancialmente el crecimiento celular
10.

Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que la célula huésped es una cepa de Escherichia coli.
11.

Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que la acetoacetil-CoA tiolasa es heteróloga a la célula huésped modificada genéticamente.
12.

Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que la célula huésped modificada genéticamente comprende una o más copias de un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la HMGR.

5 13. Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que dicha célula huésped modificada comprende un plásmido con un número bajo de copias que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica HMGS.
14. Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que dicha célula huésped modificada

10 comprende un ácido nucleico heterólogo que ha sustituido el gen de HMGS heterólogo, y en la que dicho ácido nucleico heterólogo tiene un nivel de actividad inferior al del gen de HMGS endógeno
15. Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que dicha célula huésped modificada comprende un constructo de expresión que comprende una versión modificada de las secuencias de nucleótidos

15 establecidas en SEQ ID NO: 1 en que el sitio de unión a ribosoma en dirección 5’ con respecto a HMGS ha sido alterado, de manera que se reduce la traducción en comparación con una E. coli en que la SEQ ID NO: 1 no está alterada.
16. Célula huésped modificada genéticamente según la reivindicación 9, en la que dicha célula huésped modificada

20 comprende vectores que codifican HMGR y HMGS, en la que las regiones codificantes de HMGR y HMGS están bajo el control de diferentes promotores.

FIG.10